专利名称：成肌细胞转移治疗心力衰竭的机理的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及梗死心肌层的治疗，且更具体而言涉及应用细胞疗法通过相伴随的的血管生成和肌生成来修复心肌梗死。
背景技术：
心肌退化是人类衰弱和死亡的主要原因。它依次导致活的心肌细胞、收缩丝、和心脏功能的丧失。心肌细胞不会显著地再生是因为这些末端分化细胞中的端粒DNA重复1极小。
退化心脏传输生化信号，从而征募干细胞以修复肌肉损害。多能的胚胎或成人干细胞显示出不受控制的分化成各种谱系而产生骨、软骨、脂肪、结缔组织、骨骼肌和心肌(
图1)。受损的心肌层需要其它活的肌原细胞使收缩丝(contractile filaments)沉积，从而恢复心脏功能，优选在导致瘢痕形成的成纤维细胞浸润前。然而，在科学家可准确定义特异性转录因子和途径以指导干细胞分化成心肌细胞前，将干细胞注射到人心脏中的应用较之成肌细胞的应用具有更高的危险-效益比。
因为幼小的心肌细胞和成肌细胞渐渐定型且从干细胞分化，因此它们是相似的，即它们是没有收缩丝的单核化细胞。在有神经营养因子存在的条件下，成肌细胞融合成肌管，肌管发育成肌纤维。在心脏激素的影响下，幼小的心肌细胞融合为成熟的心肌细胞。心肌细胞和肌纤维是肌原细胞，可产生收缩蛋白，从而提供收缩性。
像心肌细胞一样，成肌细胞是注定变为肌肉的分化细胞。然而与心肌细胞不同的是，成肌细胞具有较长的端粒DNA亚单位且能够大量有丝分裂。进行有丝分裂及融合的能力在单核化卫星细胞中是保守的，所述单核化卫星细胞是成人肌肉中主要的成肌细胞储备。卫星细胞是分化的细胞。它们不是干细胞。成肌细胞在胞间液中存活并增殖。它们的存活不依赖于血管生成或神经支配。
因为成肌细胞的这些理想性质，已经尝试用它们修复肌肉组织。如Law等人的研究所示，在这点上的重要特征是用于细胞移植的成肌细胞制品应当相对不含成纤维细胞，重要点已经被本领域很多工作人员认识到。见，例如，Law等人，Gene Therapy and Molecular BiologyVol.1，345-363，特别是350-351页，描述了用于骨骼肌疾病的矫正和改善的肌原细胞移植疗法。另一点在于一旦引入，成肌细胞经历巨嗜细胞的清除猎食，通常达3周。因此，必须移植大量成肌细胞才能使移植的细胞有效。
第一次将人成肌细胞转移到猪心脏中揭示了共20次在左心室内的不同位置，通过Myostar导管(Biosense Webster，Inc.)以100×106/ml注射10亿个成肌细胞是安全的2。确定了0.3ml-0.5ml是每次注射的最佳体积。该医学领域已经变得非常活跃。然而，通常可接受且成功的结果仍然是难以获得的。更需要以矫正损害的方式将细胞成功转移到受损心脏中。
发明概述本发明的实施方案涉及患病心脏组织的细胞疗法。在其中一个实施方案中，提供一种含有转基因表达VEGF的经分离成肌细胞的组合物。另一实施方案提供一种组合物，其中成肌细胞数以100∶1超过成纤维细胞数。另一实施方案提供一种含有用编码上皮细胞刺激物或血管生成刺激物的基因和第二种标记基因共转染的分离成肌细胞的组合物。另一实施方案提供一种用于减轻充血性心力衰竭的组合物，它含有至少10亿个转基因表达至少一种血管生成因子的肌原细胞。在另一实施方案中，所述细胞转基因表达VEGF 165。在另一实施方案中，所述细胞还表达VPF。
另一实施方案提供一种治疗个体充血性心力衰竭的方法，包括采集个体骨骼肌的活检样品以形成培养物；用编码血管生成因子的至少一种外源基因转化培养物中的细胞；形成足以修复个体心脏的适当纯度的细胞培养物；并将培养物中的细胞引入到个体的患病心脏中。
附图描述图1.使用成肌细胞治疗心力衰竭比使用干细胞的优势。MTT＝成肌细胞转移疗法图2.成肌细胞纯度所用的人结蛋白免疫染色。(A)平滑肌肉瘤的阳性对照，结蛋白染色为棕色。(B)阴性对照。(C)用结蛋白染色的纯人成肌细胞。(D))培养物中的纯人成肌细胞。
图3.(A)人成肌细胞注射后12周，猪心肌层中人肌球蛋白的棕色免疫染色。(B)具有Lac-Z-阳性核及人肌球蛋白染色的心肌细胞，表示供体或成肌细胞来源。(C)没有成肌细胞假注射的猪心肌层中人肌球蛋白的阴性免疫染色(灰色)。
图4.(A)来源于猪心肌细胞与人成肌细胞融合体的异核体在异核合胞体中显示Lac-Z阳性人成肌细胞核(蓝绿色)及猪心肌细胞核(紫色)。(B)这些异核体表达人肌球蛋白的重链。
图5.注射成肌细胞的猪心肌层电子显微镜检查表示(A)具有中心核及肌原纤维(myfibril)(ML)沉积物的肌管，和(B)具有卫星细胞(SC)及核(N)的骨骼肌纤维。卫星细胞位于基底膜(黑色箭头)和质膜(白色箭头)之间。肌原纤维节表示新形成的收缩丝的适当排列。
图6.(A)相对于vWF VIII免疫染色并用伊红复染色以显示毛细管的对照心肌层。(B)VEGF165转导的成肌细胞可增加血管密度。(C)与B相同，但没有进行伊红复染色。
发明详述本发明实施方案的肌原细胞优选自体的和由组织活检样品获得的，例如在U.S.Nos.6,099,832、5,833,978、6,284,242和5,130,141中所述。在优选实施方案中，组合物是从肌原细胞或肌原细胞前体制备的，它们具有最小的成纤维细胞污染。术语“最小的成纤维细胞污染”是指以总细胞数为基础，少于5％、2％、1％、0.5％、0.2％甚或少于0.1％的细胞是成纤维细胞。该改进组合物的纯度可以各种方式获得。例如，在其中一种方式中，成纤维细胞优选被培养基中所含的一种或多种物质抑制或杀死。在另一种方式中，使用细胞分类器每次分离一个细胞。在另一种方式中，非-成纤维细胞特异性启动子，如肌肉特异性启动子用于控制基因表达，该基因产生使得构成该产物的细胞在细胞培养物中存活的产物。在这种方式中，转化的肌原细胞优选存活且成纤维细胞的百分比减小。在另一种方式中，肌原细胞是在有巨噬细胞的细胞因子存在的条件下培养的，如Giurisato等人在BasicAppl.Myol.8(5)381-388(1998)中所述，该细胞因子刺激肌原细胞的增殖，但不刺激成纤维细胞的增殖。所述细胞因子可通过在没有血清的培养基中培养巨噬细胞，然后采集培养基以获得细胞因子的粗制品而生产。在优选实施方案中，利用非常纯(低成纤维细胞污染)的培养物进行的基本细胞转移治疗技术通过向培养物中加入由巨噬细胞分泌的50-10KDa细胞因子的粗品或部分纯化的制品，并生长至少2、3、5、8或10代或更多代肌原细胞而使其可行。
在各种情况下，某些细胞分裂可用于在使用细胞前增加细胞数。更优选培养并转移至少10、20、50、100、250、500甚或超过1千亿个细胞。当细胞不是自体的时，通常优选在接受该细胞的动物或患者中用使异种移植物排斥最小或消除的药剂，如环孢菌素。还可向再次引入的细胞中加入其它药剂，如粘度调节物质、粘合剂等，以在细胞转移过程中或转移后，帮助细胞在心肌层内安置和定位。
肌原细胞、或肌原细胞前体被激活或转化以表达一种或多种基因，该基因刺激血管内皮细胞的生长和/或发育。根据本发明的实施方案，在细胞转移到患病心脏中前，在适宜启动子的控制下，用一种或多种表达内皮细胞生长和/或血管生成蛋白的基因转化该细胞。例如，酸性和碱性成纤维细胞生长因子分子是内皮细胞和其它细胞类型的促分裂原，且优选被稳定整合入到细胞中，所述细胞是或变为肌原细胞。促血管素和血管生成素可诱导血管生成，如Folknan，J.，CancerMedicine，Lea and Febiger Press，pp.153-170(1993)所描述的。血管内皮细胞的高度选择性促分裂原是血管内皮生长因子或VEGF(Ferrara，N.等人，Endocr.Rev.1319-32(1992))，其也被称作血管通透因子(VPF)。在最优选的实施方案中，VEGF转基因表达。然而，在某些实施方案中，通过同源性重组打开所需基因。最优选VEGF转基因表达。在其中一个实施方案中，至少两种不同基因被转基因表达，如VEGF与促血管素或血管生成素。在另一实施方案中，超过两种不同的基因被转基因表达。多个基因可在同一细胞中表达，或处于同一组合物内由不同细胞表达。在某些情况下，两种不同因子的表达，如两种不同的血管生成因子协同导致更多移植细胞在靶患病心肌内的建立。
细胞转化可通过本领域技术人员已知的各种方法获得。通常，编码所需多肽的核酸序列，如VEGF165基因受到适宜启动子的控制。可使用的适宜启动子包括，但不限于，腺病毒启动子，如腺病毒主要晚期启动子；或异源启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞病毒(RSV)启动子；诱导型启动子，如MMT启动子，金属硫蛋白启动子；热激启动子；白蛋白启动子；ApoA1启动子；人珠蛋白启动子；病毒胸腺嘧啶核苷激酶启动子，如单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶启动子；逆转录病毒LTR(包括上文所述的修饰逆转录病毒LTR)；β-肌动蛋白启动子；和人生长激素启动子。所述启动子还可以是控制编码多肽的基因的天然启动子。
在其中一个实施方案中，逆转录病毒质粒载体用于转导包装细胞系以形成生产细胞系。可被转染的包装细胞系的例子包括，但不限于，PE501、PA317、.psi.-2、.psi.-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、.psi.CRE、.psi.CRIP、GP+E-86、GP+envAm112、和DAN细胞系，如Miller在Human Gene Therapy 15-14(1990)中所述，其整体引入此处作为参考。所述载体可通过本领域已知的任何方式转导包装细胞。这种方式包括，但不限于，电穿孔、脂质体的使用、以及CaPO4沉淀。在其中一个可选择性实施方案中，可将所述逆转录病毒质粒载体包裹在脂质体中，或与脂类偶联，然后施用于宿主。在该实施方案中，生产细胞系产生感染性逆转录病毒载体颗粒，其包括编码多肽的核酸序列。然后使用这种逆转录病毒载体颗粒，以转导肌原细胞或肌原细胞前体。所转导的细胞表达编码多肽的核酸序列。
在优选实施方案中，用VEGF转化细胞。VEGF由于可选择性剪接而具有121、165、189和206个氨基酸这4种不同的形式，例如在U.S.No.6,040,157中所述。VEGF121和VEGF165是可溶性的且能够促进血管生成，而VEGF189和VEGF206与细胞表面含蛋白聚糖的肝素结合。VEGF的时间和空间表达与血管的生理性增殖有关(Gajdusek，C.M.和Carbon，S.J.，Cell Physiol 139570-579(1989)；McNeil，P.L.等人，J Cell.Biol.109811-822(1989))。它的高亲和性结合位点仅位于组织切片中的内皮细胞上(Jakeman，L.B.等人，Clin.Invest.89244-253(1989))。在本发明的实施方案中，将至少两种类型的细胞移植到心脏的不同区。其中一个类型的细胞表达VEGF(和任选另一血管生成因子)且优选被移植到最需要血管生长的区中。将第二种类型的细胞移植到不太需要血管生长的区中。心脏病专家可很容易地确定用于移植两种(或多种)类型细胞的最佳位置。
已经发现血管通透因子(VPF)是造成损伤停止后血浆蛋白持续的微血管超透性的原因，其是正常伤口愈合的特征。这表明VPF在心肌层伤口愈合中是一种重要的因子。Brown，L.F.等人，J.Exp.Med.1761375-1379(1992)。VEGF表达水平在血管化组织中较高(例如，肺、心脏、胎盘和实体瘤)，且与血管生成在时间和空间方面有关。VEGF还显示出诱导体内血管生成。因为血管生成对于正常组织，特别是血管组织的修复而言十分重要，因此VEGF已被建议用于促进血管组织修复(例如，在动脉粥样硬化中)。
于1991年12月17日授予Chen等人的美国专利号5,073,492中公开了一种协同增强内皮细胞在适宜环境中生长的方法，该方法包括向环境中加入VEGF、效应子和血清衍生的因子。且，已经通过聚合酶链反应技术制备了血管内皮细胞生长因子C亚单位DNA。该DNA编码以异二聚体或同二聚体形式存在的蛋白。所述蛋白是哺乳动物血管内皮细胞促分裂原且，本身，可用于促进血管发育和修复，参见1992年9月30日公开的欧洲专利申请92302750.2。在本发明的实施方案中，在同一细胞或细胞的同一组合物中使用VEGF165与VPF和/或血管内皮细胞生长因子C的共同表达，用于所需的协同作用。
所制备的转基因肌原细胞组合物还可包含细胞刺激剂和促进细胞在心肌层沉积和附着的其它物质。通常，通过注射将浓稠悬浮液形式的细胞引入到受损心肌层中。
实施例描述了临床试验，该临床试验以明确证据证实了cGMP-产生的纯人成肌细胞和心脏细胞疗法的概念的证据。
人成肌细胞存活并整合到猪缺血性心肌层中，使细胞疗法和基因疗法能够共存。而新形成的肌纤维具有卫星细胞且给予心肌再生能力，心肌细胞通过成肌细胞基因组转移在体内基因转化为再生的异核体构成最终的心脏修复。再生的心脏3还包括成肌来源的心肌细胞。在所有3个方案中，新的收缩丝沉积，从而改善了心脏收缩性。该后者可被转化为改善心脏病患者的生活质量并预防心脏病发作。
因此，纯的(即，至少95％、97％、98％、99％、99.5％甚或至少99.7％的纯度)VEGF165成肌细胞，当心肌内注射时，是用于共存的血管生成和肌生成以治疗心力衰竭的潜在治疗性转基因载体。使用环孢菌素免疫抑制6周对于异种移植物或同种异体移植物的长期存活是有效的。
此处引证的每篇文献均特别整体引入此处作为参考。提出下列实施例只为举例说明而不是对本发明的限制。
实施例该实施例说明使用转基因表达VEGF165的肌原细胞对心肌层损害进行的细胞疗法。在该肌生成的实施例中，用携带Lac-Z报道基因的逆转录病毒载体转导来源于人股直肌活检样品的卫星细胞的经培养成肌细胞。慢性局部缺血的猪心脏模型(n＝9；对照＝3；植入成肌细胞的＝6)是通过夹住左旋冠状动脉周围的ameroid环而产生的。四周后，通过左胸廓切开术使各心脏暴露。向左心室中20次心肌内注射3亿个成肌细胞(每次0.25ml)，或作为对照的5ml总体积的基础DMEM。注射前一周和注射后第6周使用MIBI-Tc99mSPECT扫描评价左心室功能以证实心肌梗死。
从细胞移植前5天开始直到细胞移植后6周，使动物维持每kg体重5mg的环孢菌素。在手术后6周到5个月无痛处死动物，对心脏进行处理用于组织学、免疫细胞化学和超微结构研究。进行激光核捕获及单一的核RT-PCR以描绘宿主和供体的核。使用对人Y-染色体和猪染色体1&10特异的荧光DNA探针进行原位杂交。
在血管生成研究中，用分别携带Lac-Z和人VEGF165基因的逆转录病毒载体和腺病毒载体转导人成肌细胞。通过免疫染色、ELISA、免疫印迹和RT-PCR描述细胞的VEGF165转导和表达效率。通过左旋动脉结扎在8只母猪中建立猪心脏梗死模型。将动物分为对照组(n＝3)和植入成肌细胞组(n＝5)。进行血管造影术以保证血管完全闭塞。梗死是用MIBI-Tc99mSPECT扫描加以证实的。4周后，将5ml不含或含有携带VEGF165和Lac-Z基因的3×108个人成肌细胞的基础DMEM心肌内注射到左心室中。手术后，使动物维持环孢菌素(5mg/kg体重)6周。然后移出心脏并处理用于免疫细胞化学研究。
制备通过人结蛋白免疫染色测定具有99％纯度的人成肌细胞。用携带Lac-Z基因的逆转录病毒成功转导约75％的肌核(myonuclei)。注射前立即进行的台盼蓝染色揭示了＞95％的细胞生存力。
12周后，注射成肌细胞的心肌层的组织学检查显示含有(供体来源的)Lac-Z阳性核的心肌细胞(图3B)。超过80％的Lac-Z阳性心肌细胞对于人肌球蛋白重链阳性免疫染色(图3A)。没有注射成肌细胞的对照组心脏既没有显示出Lac-Z阳性肌核也没有显示出人肌球蛋白(图3C)。注射成肌细胞的心肌的三重染色显示多核化异核体含有表达人肌球蛋白的人核及猪核(图4)。电子显微镜检查证实了猪心肌层中具有带卫星细胞的人肌管和骨骼肌纤维(图5)。
Lac-Z和VEGF165的转导效率分别为75-80％和＞95％。转导的成肌细胞继续分泌VEGF165超过18天，显著高于(37±3ng/ml)非-转导组(200±30pg/ml)。染料排斥试验揭示注射时＞95％的细胞生存力。组织学检查显示表达Lac-Z基因的移植成肌细胞在梗死中和梗死周围广泛存活。与VEGF165成肌细胞移植组(28.31±1.84)相比，在12个低放大率视野(×200)中平均计算的对照动物心脏的血管密度(平均值±SEM)为(4.18±0.42)(图6)。SPECT扫描显示梗死区中灌注改善。6周后环孢菌素的停止仍使得在长达20周的时段没有异种移植排斥。
其它参考文献1 F lshikawa，M J Matunis，G Dreyfuss，and T R Cech.“Nuclear Proteinsthat Bind the Pre-mRNA 3′Splice Site Sequence r(UUAG/G) and the HumanTelomeric DNA Sequence d(TTAGGG)n”，Molecular Cell Biology，(1993)，13，4301-4310.
2 P K Law，et al.，“World’s First Human Myoblast Transfer Into the Heart”，Frontiers in Physiology，(2000)，p.A85.
3 P K Law，“The Regenerative Heart”，Pharma Tech 2002，65-70.
当然，在阅读了本说明书之后，本领域技术人员可很容易地理解此处提出的实施方案的变化和改进，且这种变化和改进落在权利要求的范围之内。
权利要求
1.一种含有经分离的成肌细胞的组合物，所述成肌细胞转基因表达上皮细胞刺激物或血管生成刺激物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述成肌细胞数以100∶1超过成纤维细胞数。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述上皮细胞刺激物或血管生成刺激物是VEGF。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述VEGF选自VEGF2、VEGF121、VEGF165、或其生物活性片段。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述成肌细胞还转基因表达至少第二种上皮细胞刺激物或血管生成刺激物因子。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述第二种因子选自酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、促血管素、血管生成素、和VPF。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述成肌细胞是与编码上皮细胞刺激物或血管生成刺激物的基因和第二种标记基因共转染的。
8.根据权利要求1所述的组合物，它含有至少十亿个转基因表达至少一种血管生成因子的肌原细胞。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述至少一种血管生成因子包含VPF。
10.一种用于治疗个体充血性心力衰竭的方法，包括1)采集个体骨骼肌的活检样品以形成培养物；2)用编码血管生成因子的至少一种外源基因转化培养物中的细胞；3)形成足以修复个体心脏的适当纯度的细胞培养物；并4)将培养物中的细胞引入到个体的患病心脏中。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述步骤3的培养物是至少99％纯度的成肌细胞。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述至少一种外源基因包含VEGF多肽。
13.根据权利要求10所述的方法，其中通过每次注射至少1亿个细胞而将所述细胞引入到患病心脏中。
14.根据权利要求10所述的方法，其中将至少十亿个细胞引入到患病心脏中。
15.一种用于治疗个体充血性心力衰竭的方法，包括1)提供肌细胞的培养物；2)用编码血管生成因子的至少一种外源基因转化培养物中的细胞；3)形成足以修复个体心脏的适当纯度的细胞培养物；并4)将培养物中的细胞引入到个体的患病心脏中。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述步骤3的培养物是至少99％纯度的成肌细胞。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少一种外源基因包含VEGF多肽。
18.根据权利要求15所述的方法，其中通过每次注射至少1亿个细胞而将所述细胞引入到患病心脏中。
19.根据权利要求15所述的方法，其中将至少十亿个细胞引入到患病心脏中。
20.根据权利要求15所述的方法，其中在步骤4之前用环孢菌素治疗所述个体。
全文摘要
对再生心脏进行生物工程改造可为心力衰竭提供一种新疗法。在2002年5月14日，一名55岁患有缺血性心肌梗死的男性在冠状动脉旁路移植后接受了25次含有4.65亿个cGMP－产生的纯成肌细胞的心肌层注射。以环孢菌素作为免疫抑制剂，用17个人/猪异种移植物说明了三种肌生成机理。某些成肌细胞发育成心肌细胞。其它则通过天然的细胞融合将它们的核转移到宿主心肌细胞中。另外一些则形成具有卫星细胞的骨骼肌纤维。收缩丝的从头产生使心脏的收缩性增加。用VEGF165基因转导的人成肌细胞在猪心肌层中产生的毛细管比对照组的多6倍。尽管在6周时停止了注射环孢菌素，但直到20周时仍然没有观察到异种移植物排斥。
文档编号A61K38/19GK1688701SQ03824045
公开日2005年10月26日 申请日期2003年8月6日 优先权日2002年8月9日
发明者彼得·K·罗 申请人:彼得·K·罗