专利名称：生物－合成基质及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及组织改造(tissue engineering)领域，并具体涉及包含适合体内使用的水凝胶的生物-合成基质(bio-synthetic matrix)。
背景技术：
组织改造是快速发展的领域，其包含许多以取代或恢复组织和器官功能为目的的技术。组织改造中的重要目的是通过利用可整合到现存组织中的物质而使缺陷组织再生，从而恢复正常组织功能。因此组织改造需要这样的材料，其可支持细胞过度生长，向内生长(in-growth)或进行包裹(encapsulation)，以及在很多情况下支持神经再生。
聚合物组合物在组织改造中有广泛的用途。天然生物-聚合物例如胶原蛋白，纤维蛋白，藻酸盐(酯)和琼脂糖已知是非细胞毒性的并且支持生活细胞的过度生长，向内生长和进行包裹。然而来自天然聚合物的基质通常不够坚固(robust)因此不能用于移植。反之，从合成聚合物制备的基质可以配制成显示预定的物理性质例如凝胶强度，以及生物性质例如降解能力。关于天然聚合物的合成类似物例如聚赖氨酸，聚(乙烯亚胺)等能显示细胞毒效应的报导(Lynn & Langer，J.Amer.Chem.Soc.，12210761-10768(2000))导致了用于组织改造的可选合成共聚物的发展。
水凝胶是交联的，水不溶性的，含水的聚合物，其提供了良好的生物相容性并且诱导血栓，结壳以及炎症的倾向降低，并由此为用于组织改造的理想候选物。水凝胶在细胞生物学中的应用是已知的(见例如，A.Atala和R.P.Lanza编辑，“Methods in Tissue Engineering”Academic Press，San Diego，2002)。已经描述了各种用于体内的水凝胶(见例如Jeong等，Adv.Drug Deliv.Rev.，5437-51(2002)的综述)。例如，基于N-异丙基丙烯酰胺(NiPAAm)的水凝胶以及其特定共聚物是非毒性的并能够在体外支持所包裹的细胞的生长(Vernon等，Macromol.Symp.，109155-167(1996)；Stile等，Macromolecules，327370-9(1999)；Stile等，Biomacromolecules 3591-600(2002)；Stile等，Biomacromolecules 2185-194(2001)；Webb等，MUSC Orthopaedic J.，318-21(2000)；An等，美国专利6,103,528)。已描述将温度敏感的NiPAAm聚合物用于免疫分析中(美国专利4,780,409)。然而，尽管对合成条件进行操纵和增强对生物相容性的改善，仍然难以获得密合的宿主植入物界面并实现将水凝胶植入物整合入宿主(Hicks等，SurvOphthalmol.42175-189(1997)；Trinkaus Randall和Nugent，J.ControlledRelease 53205-214(1998))。
已有关于利用第二天然衍生的聚合物修饰合成聚合物凝胶以产生互相贯穿的聚合物网络(“IPN”)结构的报道(例如，见Gutowska等，Macromelecules，27；4167(1994))；Yoshida等，Nature 374240(1995)；Wu&Jiang，美国专利6,030,634；Park等，美国专利6,271,278)。然而，这些结构的稳定性通常在通过培养基和通过生理液进行天然衍生成分的提取时被破坏。天然衍生聚合物在体内也倾向于快速发生生物降解从而导致体内植入物的稳定性被破坏。
也描述了包含交联的聚合物组合物的更稳定的水凝胶。例如美国专利6,388,047描述了含有亲水大分子单体和亲水聚合物的组合物，其中的组分通过自由基聚合反应相互交联而形成水凝胶。美国专利6,323,278描述了一种交联的聚合物组合物，其可在原位形成并包含两种合成聚合物，一种含有多个亲电子的基团而另一个含有多个亲核基团。美国专利6,388,047和6,384,105都描述了必须通过自由基化学法进行交联的系统，这需要利用已知为细胞毒性的引发剂(偶氮化合物，过硫酸盐(酯))，如果所述水凝胶用于组织或用于包裹细胞则可产生副作用。
美国专利6,384,105描述了可注射的、可生物降解的聚合物合成物，其包含聚(丙烯延胡索酸酯)和聚(乙二醇)-二甲基丙烯酸酯，其可以进行原位交联。本专利中所述的水凝胶主要基于具有聚环氧乙烷骨架聚合物的聚合物。虽然这些聚合物已知是生物相容的，其支持细胞生长的能力是不确定的。
美国专利6,566,406描述了生物相容的交联水凝胶，其从具有能在原位进行反应和交联的亲电子和亲核基团的水可溶性前体形成。所述前体被描述为聚烯化氧(polyalkylene oxide)和交联物。如上所述，聚烯化氧骨架聚合物支持细胞生长的能力是不确定的。
因此仍需要改良的基质，其是生物相容的、足够坚固以作为植入物起作用，并可在体内支持细胞生长。
提供该背景技术是为了公开本申请人认为与本发明可能有关的信息。无需承认或不应理解为任何前述信息构成与本发明相抵触的现有技术。
发明内容
本发明的目的是为了提供生物-合成基质及其用途。根据本发明的一个方面，提供了适合制备生物-合成基质的合成共聚物，其包含一或多种N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚单体，一或多种亲水性共聚单体以及经衍生含有能交联生物活性分子的侧(pendant)活性部分的一或多种丙烯酰基-或甲基丙烯酰基-羧酸共聚单体，所述合成共聚物的数均分子量为约2,000-约1,000,000。
本发明另一方面涉及生物-合成基质，其包含合成共聚物，生物-聚合物和含水溶剂，其中所述合成共聚物和生物-聚合物相互交联而形成水凝胶。
本发明另一方面涉及所述生物-合成基质作为组织再生中的支架的用途，其可用于取代动物中破坏的或去除的组织或包裹手术植入物。
本发明另一方面涉及一种组合物，其包含一或多种生物活性剂或多个细胞；本发明的合成共聚物；生物-聚合物；和含水溶剂。
本发明另一方面涉及用于组织改造中的包含预形成的生物-合成基质的植入物，所述基质包含含水溶剂和与本发明的合成共聚物交联的生物-聚合物。
本发明另一方面涉及所述植入物作为人工角膜的用途。
本发明另一方面涉及制备合成共聚物的方法，包括(a)在引发剂存在的条件下，将一或多种N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚单体，一或多种亲水性共聚单体以及经衍生含有侧(pendant)交联部分的一或多种丙烯酰基-或甲基丙烯酰基-羧酸共聚单体分散在溶剂中；(b)使得所述N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚单体，亲水性共聚单体以及丙烯酰基-或甲基丙烯酰基-羧酸共聚单体发生聚合以形成合成共聚物，和(c)可选地纯化所述合成共聚物；制备生物-合成基质的方法，包括制备合成共聚物，将所述合成共聚物以及生物共聚物分散到含水培养基中，并使得所述合成共聚物和生物聚合物发生交联以提供生物-合成基质。
附图简述
图1描述了根据本发明一个实施方案的三元共聚物的一般结构，所述三元共聚物包含N-异丙基丙烯酰胺(NiPAAm)，丙烯酸(AAc)和N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺(ASI)。
图2表示根据本发明一个实施方案将从生物-合成基质制备的人工角膜移植到猪中的临床后果。
图3显示根据本发明的一个实施方案从生物-合成基质制备人工角膜并将其移植到猪中后6周时，体内共聚焦显微镜检的结果。
图4显示根据本发明的一个实施方案从生物-合成基质制备人工角膜并将其移植到猪中后，在体内检测角膜敏感性的结果。
图5，6和7显示根据本发明的一个实施方案从生物-合成基质制备人工角膜并将其移植到猪中后，对所述人工角膜进行形态学和生物化学评估的结果。
图8显示(A)根据本发明的一个实施方案，含有交联的生物活性的三元共聚物的结构，(B)由交联的胶原蛋白和(A)中所示的三元共聚物组成的角膜支架；和(C)仅显示由热敏凝胶化的胶原蛋白组成的角膜支架。
图9和10显示根据本发明的一个实施方案将含有胶原蛋白和三元共聚物-生物活性剂的水凝胶递送到小鼠和大鼠脑中的结果。
图11显示根据本发明的一个实施方案，来自缝合拉开测验的模量(modulus)(A)和破裂应力(B)与水凝胶基质中N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺与胶原蛋白胺基之浓度比的函数关系。
图12显示根据本发明的一个实施方案，在可见光区的光的透射(A)和反向散射(back scattering)(B)与水凝胶基质中N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺与胶原蛋白胺基基团之浓度比的函数关系。
图13显示根据本发明的另一实施方案，在可见光区的光的透射(A)和反向散射(B)与水凝胶基质中N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺与胶原蛋白胺基基团之浓度比的函数关系。
图14显示根据本发明的一个实施方案包含水凝胶的猪角膜植入物的触觉敏感性恢复。
图15显示根据本发明的一个实施方案，通过薄层角膜成形术(lamellarkeratoplasty)进行猪角膜移植手术和包含水凝胶的6周植入物的临床体内共聚焦显微镜图像。D-F中的条(bar)＝25μm，G-O中的条＝15μm。
图16显示根据本发明的一个实施方案，接受含水凝胶的角膜植入物的猪的术后角膜再生。A-F，G-I，J-L，M-O，P-R的条分别为100μm，40μm，200nm，20μm，30μm。
图17显示根据本发明的一个实施方案，接受包含水凝胶的角膜植入物的猪在手术后6周的植入物-宿主术后整合。在各种情况下条均＝100μm。
图18显示根据本发明一个实施方案，接受含水凝胶的角膜植入物的猪中的植入物的角膜触觉敏感性。
图19显示对各种水凝胶基质的神经支配相容性检测的结果。
图20显示各种水凝胶的上皮细胞生长和分层。(A)水凝胶上的上皮生长的低倍放大图像(插入图像为高倍放大图像)和(B)在水凝胶上生长的上皮的细胞厚度计数。
发明内容应理解本发明不限于本文公开的具体处理步骤和材料，而是扩展到本领域技术人员认识到的其相当物。应理解所用术语是只为了描述具体实施例而非用于限定。
定义除非另有定义，本发明所用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。
本文所用的术语“水凝胶”指交联的聚合物质，其显示在水或含水溶液中膨胀而不溶解的能力，并在其结构内保持显著部分的水或含水溶液。
本文所用的术语“聚合物”指由连接在一起的各个单体组成的分子。在本发明中，聚合物可包含“尾对尾”连接形成线形分子的单体，或可包括互相连接形成分支结构的单体。
本文所用的术语“单体”指简单的有机分子，其能单独或与其它类似的有机分子一起形成长链，从而得到聚合物。
本文所用的术语“共聚物”指包含两种或多种不同单体的聚合物。共聚物可以是规则的，无规的，嵌段的或接枝的。规则的共聚物指其中的单体以规则的形式重复的共聚物(例如对于单体A和B，规则共聚物具有序列ABABABAB)。无规的共聚物是其中每个单独的聚合物分子中不同单体以随机或统计的方式排列的共聚物(例如对于单体A和B，无规共聚物可具有序列AABABBABBBAAB)。反之，嵌段共聚物是其中在每个单独的聚合物分子中不同单体分成离散的区的共聚物(例如对于单体A和B，嵌段共聚物具有序列AAABBBAAABBB)。接枝的共聚物指通过将聚合物或一种类型的聚合物连接到组成不同的另一种类型的聚合物分子上而形成的共聚物。
本文所用的术语“三元共聚物”指含有三种不同单体的共聚物。
本文所用的术语“生物-聚合物”指天然存在的聚合物。天然存在的聚合物包括，但不限于蛋白质和碳水化合物。术语“生物-聚合物”还包括天然存在的聚合物的衍生形式，其经过修饰以便于交联到本发明的合成聚合物上。
本文所用的术语“合成聚合物”指非天然存在、可通过化学或重组合成产生的聚合物。
本文所用的术语“烷基”和“低级烷基”可互换使用，指1-8个碳原子的直链或支链烷基基团或3-8个碳原子的环烷基基团。这些术语的实例还包括甲基，乙基，正-丙基，异-丙基，正-丁基，叔-丁基，1-丁基(或2-甲基丙基)，异-戊基，正-戊基，己基，环丙基，环丁基，环戊基，环己基等。
本文所用的术语“生物活性剂”指在体内显示生理、治疗或诊断效应的分子或化合物。生物活性剂可以是有机或无机的。代表性的实例包括蛋白，肽，碳水化合物，核酸及其片段，抗肿瘤和抗赘生物(anti-neoplastic)化合物，抗病毒化合物，抗炎化合物，抗生素化合物例如抗真菌和抗细菌化合物，降胆固醇化合物，止痛剂，医用诊断显像用的造影剂，酶，细胞因子，局部麻醉药，激素，抗血管生成剂，神经递质，治疗性寡核苷酸，病毒颗粒，载体，生长因子，类视色素(retinoids)，细胞粘附因子，细胞外基质糖蛋白(例如层粘连蛋白)，激素，成骨因子，抗体和抗原。
本文所用的术语“生物相容性”指掺入生物系统例如动物的器官或组织，而不刺激免疫和/或炎症反应、纤维化或其它不良组织反应的能力。
本文所用的术语“约”指与所示值偏差+/-10％。应理解无论具体说明与否，这种偏差总包括在本文提供的给定值中。
1.生物-合成基质本发明提供了包含水凝胶的生物-合成基质，其通过使合成聚合物与生物-聚合物交联而形成。生物-聚合物可以是天然存在的形式，或者可以经过衍生而便于交联到合成聚合物上。基质是坚固的、生物相容的且是非细胞毒性的。基质可以在中性pH在含水溶液中形成，并可经过修饰以进一步包含一或多种生物活性剂，例如生长因子，类视色素，细胞粘附因子，酶，肽，蛋白质，核苷酸，药物等。生物活性因子可与合成聚合物共价结合，或者可根据该基质的最终用途的需要而被包裹并分散在最终基质中。基质还可包含包裹并分散于其中的细胞，所述细胞可在将该基质置于体内时增殖和/或分化。
在本发明的一个实施方案中，生物-合成基质支持细胞生长。这种细胞生长可以是上皮和/或内皮表面的覆盖(即二维，2D，生长)和/或包括向基质本身内部生长的三维(3D)细胞生长。
在本发明的另一实施方案中，生物-合成基质支持神经向内生长。本领域已知，神经向移植的组织内部的生长在较长的时间内发生，通常是数月或数年。神经向基质内部的生长可能比神经向移植的组织内生长快得多，从而导致功能组织的快速再生，例如神经向内生长可在数周内发生。
生物-合成基质可经改造用于具体用途。例如，基质可用于组织改造应用，并为此目的预形成为具体的形状。该基质可用作药物递送载体以在动物机体的具体位点持续释放治疗或诊断化合物。
为了适合用于组织改造的体内移植，生物-合成基质必须在生理温度下保持其形状，在水中基本不溶，足够坚固并支持细胞生长。该基质支持神经的生长也是合乎需要的。
1.1合成聚合物根据本发明，可掺入生物-合成基质中的合成聚合物是这样的共聚物，其包含一或多种丙烯酰胺衍生物，一或多种亲水性共聚单体和含有侧可交联部分的一或多种衍生型(derivatised)羧酸共聚单体。
本文所用的“丙烯酰胺衍生物”指N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺。适合用于本发明的合成聚合物中的丙烯酰胺衍生物包括，但不限于N-甲基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺(NiPAAm)、N-辛基丙烯酰胺、N-环己基丙烯酰胺、N-甲基-N-乙基丙烯酰胺、N-甲基甲基丙烯酰胺、N-乙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、N，N-二甲基甲基丙烯酰胺、N，N-二乙基甲基丙烯酰胺、N，N-二环己基丙烯酰胺、N-甲基-N-环己基丙烯酰胺、N-丙烯酰吡咯烷、N-乙烯基-2-吡咯烷酮(pyrrolidinone)、N-甲基丙烯酰吡咯烷及其混合物。
本文的“亲水性共聚单体”指能够与丙烯酰胺衍生物和合成聚合物的衍生型羧酸组分发生共聚的亲水单体。选择亲水共聚单体以提供聚合用的适当溶解性、共聚物的水溶性并且最终的共聚物和水凝胶无需相转变。适宜的亲水性共聚单体例如亲水的丙烯酰基-或甲基丙烯酰基-化合物例如羧酸，包括丙烯酸、甲基丙烯酸及其衍生物、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、亲水的丙烯酰胺衍生物、亲水的甲基丙烯酰胺衍生物、亲水的丙烯酸酯、亲水的甲基丙烯酸酯、乙烯基乙醇及其衍生物和乙二醇。所述羧酸和衍生物可以是例如丙烯酸、甲基丙烯酸、2-羟乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)或其组合物。亲水性丙烯酰胺衍生物的实例包括但不限于N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、2-(N，N-二甲基氨基)乙基丙烯酰胺、2-(N，N-二乙基氨基)乙基丙烯酰胺、N，N-二乙基甲基丙烯酰胺、2-(N，N-二甲基氨基)乙基甲基丙烯酰胺、2-(N，N-二乙基氨基)乙基甲基丙烯酰胺、N-乙烯基-2-吡咯酮或其混合物。亲水性丙烯酸酯的实例包括但不限于2-(N，N-二乙基氨基)乙基丙烯酸酯、2-(N，N-二甲基氨基)乙基丙烯酸酯、2-(N，N-二乙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯、2-(N，N-二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯或其混合物。
本文所用的“衍生型羧酸共聚单体”指亲水的丙烯酰基-或甲基丙烯酰基-羧酸，例如，丙烯酸、甲基丙烯酸或其取代的形式，其经化学衍生以含有一或多种交联的部分，例如琥珀酰亚胺基团、咪唑、苯并三唑和对硝基苯酚。术语“琥珀酰亚胺基团”意图包括各种种类的琥珀酰亚胺基团，例如磺基琥珀酰亚胺基团。其它类似的结构例如2-(N-吗啉代)乙磺酸对于本领域熟练技术人员也是显而易见的。本发明中，选作交联部分的基团用于增加与之相连的羧酸基团对伯胺(即-NH2基团)和巯基(即-SH基团)的反应性。对用于合成聚合物中的羧酸共聚单体进行衍生的适宜基团的实例包括但不限于N-琥珀酰亚胺、N-琥珀酰亚胺-3-磺酸、N-苯并三唑、N-咪唑和对硝基苯酚。
本发明的一个实施方案中，所述合成聚合物包括(a)通式I的一或多种丙烯酰胺衍生物
其中R1，R2，R3，R4和R5独立地选自H或低级烷基；(b)具有通式II的一或多种亲水性共聚单体(可以和(a)相同或不同) 其中Y是O或不存在；R6，和R7独立地选自H或低级烷基；R8是H，低级烷基或-OR’，其中R’是H或低级烷基；且R9是H，低级烷基或-C(O)R10，且R10是-NR4R5或-OR”，其中R”是H或CH2CH2OH；和(c)具有通式III的一或多种衍生的羧酸 其中R11，R12和R13独立地选自H或低级烷基；且Q是N-琥珀酰亚胺基、3-磺基-琥珀酰亚胺(钠盐)、N-苯并三唑基，N-咪唑基或对-硝基苯基。
一个实施方案中，合成聚合物包含通式I的一或多种丙烯酰胺衍生物，通式II的一或多种亲水性共聚单体和通式III的一或多种衍生的羧酸，如上所述，其中术语“低级烷基”指具有1-8个碳原子的支链或直链烷基基团。
在另一实施方案中，合成聚合物包含通式I的一或多种丙烯酰胺衍生物，通式II的一或多种亲水性共聚单体和通式III的一或多种衍生的羧酸，如上所述，其中术语“低级烷基”指具有3-8个碳原子的环烷基基团，例如环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
共聚物可以是线形或分支的，规则，无规或嵌段的。根据本发明，最终合成聚合物包含许多可用于适当的生物分子的交联或接枝的侧反应性部分。
本领域技术人员理解术语“丙烯酰胺衍生物”包括的化合物组和术语“亲水性共聚单体”包括的化合物组基本上重叠，并且可选择单个单体以实现所述共聚物中这些组分的功能。因此，例如当选择具有充分亲水性的丙烯酰胺衍生物使得合成共聚物具有所需的性质时，可选择与所选丙烯酰胺衍生物相同的亲水性共聚单体成分，得到只含有两种不同的单体的共聚物(即，所述丙烯酰胺衍生物/亲水性共聚单体和衍生的羧酸共聚单体)。另一方面，当需要高于所选的丙烯酰胺衍生物的亲水性时，可选择一种或多种不同的亲水性共聚单体，得到包含至少三种不同的单体的共聚物。
本发明一个实施方案中，用于制备合成聚合物的丙烯酰胺衍生物和亲水性共聚单体是相同的。另一实施方案中，用于制备合成聚合物的丙烯酰胺衍生物和亲水性共聚单体是不同的。
控制共聚物的总体亲水性以便使其在0℃到生理温度具有水溶性而不发生沉淀或相转变。在本发明一个实施方案中，共聚物在约0℃-约37℃是水溶性的。
共聚物应当在含水溶液中具有充分的溶解度以促进水凝胶的形成。根据本发明的一个实施方案，术语“水溶性”指共聚物的水溶性为至少约0.5重量/体积(w/v)％。在另一实施方案中，共聚物的水溶性为约1.0w/v％-约50w/v％。在另一实施方案中，共聚物的水溶性为约5w/v％和约45w/v％并在约10％w/v-约35％w/v之间。
本领域已知大多数合成聚合物具有分子量分布，且分子量的各种不同平均值通常不同，例如数均分子量(Mn)和重均分子量(Mw)。合成聚合物的分子量通常通过其数均分子量(Mn)定义，数均分子量又由niMi之和除以ni之和定义，其中ni是质量Mi分布中的分子数。用于本发明的基质中的合成聚合物通常具有的数均分子量(Mn)为2,000-1,000,000。在本发明一个实施方案中，聚合物的Mn为约5,000-约90,000。本发明另一实施方案中，聚合物的Mn为约25,000-约80,000。另一实施方案中，聚合物的Mn为约30,000-约50,000。另一实施方案中，聚合物的Mn为约50,000-约60,000。
本领域还已知特定水溶性聚合物显示较低的临界溶解温度(LCST)或“浊点”。聚合物的LCST是相分离发生时的温度(即，聚合物开始从周围含水介质中分离)。通常，对于那些透明的聚合物或水凝胶，LCST还对应开始丧失透明性的点。很明显对于特定的组织改造应用，最终水凝胶中相分离的存在与否可能无关，条件是水凝胶仍支持细胞生长。但对于其他用途，最终水凝胶中缺乏相分离可能是重要的。例如，对于光学应用，透明性(且因此缺乏任何相转变)是重要的。
因此，根据本发明一个实施方案，选择LCST在约35℃-约60℃的共聚物用于水凝胶中。在另一实施方案中，选择LCST在约42℃-约60℃的共聚物用于水凝胶中。本领域还已知聚合物的LCST可受存在的多种溶质例如离子或蛋白质的影响，并受交联或附着到该聚合物的化合物的性质的影响。这种影响可使用标准技术通过经验确定，并且选择具有合适的LCST的合成聚合物用于特定应用中是本领域技术人员已知的。
为了使合成聚合物适当坚固和热稳定，重要的是当将不同单体用于这些组分中时，一或多种丙烯酰胺衍生物与一或多种亲水性共聚单体的比例的优化。相应地，一或多种丙烯酰胺衍生物以最高的摩尔比存在于合成聚合物中。此外，最终聚合物中的一或多种衍生型羧酸共聚单体的数目将决定合成凝胶与生物合成基质中的生物聚合物形成交联的能力。选择各种组分的适宜摩尔比以提供具有所需性质的最终合成聚合物是本领域技术人员已知的。
根据本发明一个实施方案，当不同单体用作丙烯酰胺衍生物和亲水性共聚单体组分时，聚合物中丙烯酰胺衍生物的量为50％-90％，亲水性共聚单体的量为5％-50％，衍生型羧酸共聚单体的量为0.1％-15％，其中丙烯酰胺衍生物、亲水性共聚单体和衍生型羧酸共聚单体的总量为100％，其中％值代表摩尔比。
本发明另一实施方案中，合成聚合物利用与丙烯酰胺衍生物以及亲水性共聚单体相同的单体制备，且丙烯酰胺衍生物/亲水性共聚单体的摩尔比为约50％-约99.5％，且衍生型羧酸共聚单体的摩尔比为约0.5％-约50％。
根据另一实施方案，丙烯酰胺衍生物和亲水性共聚单体的总摩尔比为约80％-约99％且衍生型羧酸共聚单体的摩尔比为约1％-约20％。
本领域技术人员将理解合成聚合物中组分的选择和比例将在不同程度上取决于所述生物合成基质的最终用途。例如，对于眼科用途，重要的是最终基质是透明的，而对于组织改造用途，基质的透明度可能不是重要的因素。
本发明另一实施方案中，合成聚合物是无规或嵌段共聚物，其包含一种丙烯酰胺衍生物、一种亲水性共聚单体和一种衍生型羧酸共聚单体(“三元共聚物”)。在另一实施方案中，合成聚合物是三元共聚物，其包含NiPAAm单体、丙烯酸(AAc)单体和衍生型丙烯酸单体。另一实施方案中，合成聚合物是三元共聚物，其包含NiPAAm单体、丙烯酰胺(AAm)单体和衍生型丙烯酸单体。另一实施方案中，所述衍生型丙烯酸单体是N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺。另一实施方案中，三元共聚物是通过以约85∶10∶5摩尔％的进料比例包含NiPAAm单体、AAc单体和N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺而制备的。
本发明另一实施方案中，所述合成聚合物是无规或嵌段共聚物，其包含一种丙烯酰胺衍生物/亲水性共聚单体和一种羧酸共聚单体。另一实施方案中，合成聚合物包含DMAA单体和衍生型丙烯酸单体。另一实施方案中，所述衍生型丙烯酸单体是N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺。另一实施方案中，合成聚合物是通过以约95∶5摩尔％的进料比例包含DMAA单体和N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺而制备的。
1.2生物-聚合物生物-聚合物是天然存在的聚合物例如蛋白质和碳水化合物。根据本发明，生物-合成基质包含生物-聚合物或其衍生形式，后者通过其中的侧交联部分与所述合成聚合物交联。因此，本发明的生物-聚合物含有一或多种能够与交联部分(例如伯胺或巯基)反应，或能经衍生化以包含这类基团的基团。本发明所用的适宜生物-聚合物的实例包括但不限于胶原蛋白(包括I，II，III，IV和V型)、变性的胶原蛋白(或凝胶)、重组胶原蛋白、纤维蛋白-纤维蛋白原、弹性蛋白、糖蛋白、藻酸盐(酯)、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素和粘多糖(或蛋白聚糖)。本领域技术人员将理解，需要对一些这样的生物-聚合物进行衍生化以使其含有上述适宜的反应性基团，例如葡糖胺聚糖需要被脱乙酰或脱硫酸以便具有伯胺基团。这种衍生化可通过标准技术实现并被认为是本领域技术人员已知的。
适宜用于本发明的生物-聚合物可购自各种来源或可通过标准技术从天然来源制备。
1.3生物活性剂如上所述，将包括在本发明的生物-合成基质之内的合成聚合物含有大量侧交联部分。明显地，可使合成和生物-聚合物发生充分的交联以获得适当坚固的基质，并且所有自由交联的基团不会发生发应。过量的基团因此可选地用于将所需生物活性剂与基质共价连接。可通过交联掺入基质中的生物活性剂的非限制性实例包括，例如，生长因子，类视色素，酶，细胞粘附因子，细胞外基质糖蛋白(例如层粘连蛋白，纤连蛋白，腱生蛋白等)，激素，成骨因子，细胞因子，抗体，抗原和其它生物活性蛋白，某些药物化合物以及肽，源自生物活性蛋白质的片段或基序(motifs)。
本发明一个实施方案中，交联基团为琥珀酰亚胺基团且用于接枝到聚合物上的适宜的生物活性剂含有伯胺或巯基，或者可容易被衍生化以含有这些基团的那些生物活性剂。
2.生物-合成基质的制备方法2.1合成聚合物的制备合成聚合物的组分的共聚作用可通过使用本领域已知的标准方法进行(例如，见A.Ravve“Principles of Polymer Chemistry”，Chapter 3，Plenum Press，New York 1995)。通常，适宜量的每种单体在引发剂的存在下分散在适宜的溶剂中。混合物保持在适宜的温度下，并使所述共聚作用进行预定的时间。可通过常规方法例如沉淀从混合物中纯化所得的聚合物。
共聚反应的溶剂在一或多种单体对水解敏感时可以是非水性溶剂，或可以是含水溶剂。适宜的含水溶剂包括，但不限于水、缓冲液和盐溶液。适宜的非水性溶剂通常为环酯(例如二噁烷)，氯化的烃(例如氯仿)或芳香烃(例如苯)。如需要，所述溶剂可以在使用前用氮净化。在本发明一个实施方案中，所述溶剂是非水性溶剂。在另一实施方案中，所述溶剂是二噁烷。
适宜的聚合反应引发剂是本领域已知的并通常为自由基引发剂。适宜的引发剂的实例包括但不限于，2，2′-偶氮二异丁腈(AIBN)，其它偶氮化合物，例如2，2′-偶氮二-2-乙基丙腈；2，2′-偶氮二-2-环丙基丙腈；2，2′-偶氮二环己腈；2，2′-偶氮二环辛腈，和过氧化物，例如联苯甲酰过氧化物及其取代的类似物，以及过硫酸盐，例如过硫酸钠、过硫酸钾等。
一旦制备了聚合物并在需要时进行纯化，可通过各种标准技术表征所述聚合物。例如，所述聚合物的摩尔比组成可通过核磁共振谱(质子和/或碳-13)测定，而键结构可通过红外光谱确定。分子量可通过凝胶渗透色谱和/或高压液相色谱确定。如需要，也可对所述聚合物进行热定性，可例如利用差示扫描热分析通过测定熔点和玻璃转变温度(glass transition temperature)进行。含水溶液性质例如胶束和凝胶形成，以及LCST可利用肉眼观察、荧光光谱、UV-可见光谱以及激光散射仪器测定。
本发明的一个实施方案中，合成聚合物通过在引发剂AIBN存在的条件下将单体分散在氮-净化的二噁烷中，并使得聚合反应在约60℃-70℃进行来制备。通过重复沉淀来纯化所得的聚合物。
2.2水凝胶的制备合成聚合物与生物-聚合物的交联可通过将适量的每种聚合物在室温、适当的溶剂中进行混合来实现。通常，所述溶剂是含水溶剂，例如盐溶液、缓冲溶液、细胞培养基，或其稀释或修饰形式。本领域熟练技术人员应理解，为保持聚合物例如胶原蛋白的三螺旋结构并防止水凝胶的原纤维形成和/或浑浊化，交联反应应在含水介质并严格控制pH和温度的情况下进行。用于细胞培养的营养培养基中的较高水平的氨基酸可能引起其与合成聚合物的交联部分发生副反应，从而导致这些基团不能进行交联反应。利用不含氨基酸和其它蛋白质物质的培养基可有助于防止这些副反应，并由此增加在合成聚合物和生物-聚合物之间形成交联的数目。在含水溶液中在室温或生理温度下进行交联反应使得发生交联和任何剩余交联基团的极为缓慢的水解。
可供选择的是，可包括终止步骤以使基质中任何剩余的交联基团进行反应。例如，在含有甘氨酸的适宜缓冲液中进行一或多步洗涤可终止(terminate)任何剩余的交联基团并去除任何在交联反应期间产生的副产物。未反应的交联基团也可用多官能胺例如赖氨酸或三亚乙基四胺终止，导致形成额外的短链间交联。如需要，也可仅使用缓冲液进行洗涤步骤以便去除任何来自交联反应的副产物。如果必要，在交联步骤以后，可升高交联的聚合物悬液的温度以使得水凝胶充分形成。
根据本发明，水凝胶的组分用化学方法进行交联以使其基本上不能被提取，即生物-聚合物和合成聚合物在生理条件下不从凝胶中渗出。根据本发明一个实施方案，在生理条件下，24小时之内可从基质中提取到含水介质中的生物-聚合物或合成聚合物的量低于每种组分的重量的5％。另一实施方案中，在生理条件下，24小时之内可从基质中提取到含水介质中的生物-聚合物或合成聚合物的量低于每种组分的重量的2％。另一实施方案中，24小时之内可提取的量低于每种组分的重量的1％，低于0.5％重量，和低于0.2％重量。
可从所述基质提取到含水介质中的生物-聚合物和/或合成聚合物的量可在体外利用标准技术(例如USP Basket法)测定。通常，基质置于预定pH例如约pH 7.4的含水溶液中以模拟生理条件。悬液可被搅拌或不被搅拌。含水溶液的样品可在预定的时间间隔取出并通过标准分析技术测定聚合物含量。
本领域技术人员应理解，水凝胶中包含的每种聚合物的量取决于所选的聚合物以及水凝胶的预期用途。通常，使用较高起始量的每种聚合物将导致形成更坚固的凝胶，这是由于水含量较低并且存在较大量的交联的聚合物。大量水或含水溶剂将导致水凝胶较软。根据本发明，最终水凝胶包含约20-99.6％重量的水或含水溶剂，约0.1-30％重量的合成聚合物，和约0.3-50％重量的生物-聚合物。
本发明一个实施方案中，最终水凝胶包含约40-99.6％重量的水或含水溶剂，约0.1-30％重量的合成聚合物以及约0.3-30％重量的生物-聚合物。另一实施方案中，最终水凝胶包含约60-99.6％重量的水或含水溶剂，约0.1-10％重量的合成聚合物和约0.3-30％重量的生物-聚合物。另一实施方案中，最终水凝胶包含约80-98.5％重量的水或含水溶剂，约0.5-5％重量的合成聚合物和约1-15％重量的生物-聚合物。其它实施方案中，最终水凝胶含有约95-97％重量的水或含水溶剂，约1-2％重量的合成聚合物和约2-3％重量的生物-聚合物；以及约94-98％重量的水或含水溶剂，约1-3％重量的合成聚合物和约1-3％重量的生物-聚合物。
类似地，包含在水凝胶中的每种聚合物的相对量取决于所用的合成聚合物和和生物-聚合物的类型以及水凝胶的预期用途。本领域熟练技术人员应理解，生物-聚合物和合成聚合物的相对量将在各方面影响最终凝胶的性质，例如较高量的生物-聚合物将产生很硬的水凝胶。本领域熟练技术人员应理解最终基质中每种聚合物的相对量可用生物-聚合物∶合成聚合物的重量重量比值或反应性基团的重量重量比描述。本发明中生物-聚合物∶合成聚合物的重量重量比为约1∶0.07～约1∶14。一种实施方案中，生物-聚合物∶合成聚合物的w/w比是1∶1.3～1∶7。另一实施方案中，生物-聚合物∶合成聚合物的w/w比是1∶1～1∶3。另一实施方案中，生物-聚合物∶合成聚合物的w/w比是1∶0.7～1∶2。
本发明另一可选实施方案中，基质包括蛋白型生物-聚合物和含有N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺侧基的合成聚合物。本发明该实施方案中，生物-聚合物∶合成聚合物之比描述为生物-聚合物中的游离胺基团与N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺基团摩尔当量之比，所述比值为1∶0.5～1∶20。另一实施方案中，所述比值是1∶1.8～1∶10。另一实施方案中，所述比值是1∶1～1∶5，和1∶1～1∶3。
2.3将生物活性剂掺入生物-合成基质中如需要，可通过侧交联部分将生物活性剂与合成聚合物共价结合(或“接枝”)，或者将其包裹在所述基质中，将生物活性剂掺入基质中。可与基质的合成聚合物组分共价连接的生物活性剂的实例在上文描述。如有必要，生物活性剂可首先通过标准方法进行衍生化以提供可与交联基团反应的适当的反应性基团。为与生物活性剂共价结合，首先将合成聚合物与生物活性剂反应，然后将这种修饰后的合成聚合物如上述与生物-聚合物进行交联。生物活性剂与合成聚合物的反应可在标准条件下进行，例如通过将生物活性剂和合成聚合物一起混合在非水性溶剂中，所述溶剂例如N，N-二甲基甲酰胺，二噁烷，二甲基亚砜和N，N-二甲基丙烯酰胺。使用非水性溶剂避免了在掺入生物活性剂的过程中反应性基团的水解。可供选择的是，所述反应可如上述在用于交联反应的含水溶液中进行。
不适合接枝到聚合物的生物活性剂可包埋(entrap)在最终基质中，所述生物活性剂例如不含有和合成聚合物中的可交联基团反应的伯胺或游离巯基基团，或者不被衍生为具有这种基团的那些生物活性剂。可包埋在基质中的生物活性剂的实例包括但不限于药物、诊断试剂、病毒载体、核酸等。为进行包埋，在混合所述合成聚合物和生物-聚合物以形成交联的水凝胶之前，将生物活性剂加入适当的溶剂中的合成聚合物溶液中。可供选择的是，生物活性剂可在交联步骤之前加入含有合成和生物-聚合物的溶液中。将生物活性剂混合到聚合物溶液中，使得它基本上均匀分散于其中，并且随后如上述形成水凝胶。用于生物活性剂的适当溶剂取决于所述试剂的性质，并可由本领域技术人员容易确定。
2.4细胞在生物-合成基质中的包埋本发明的生物-合成基质还可包含包埋于其中的细胞，并使得将所述细胞递送到体内的组织或器官。多种不同细胞类型可利用所述生物基质递送，例如肌细胞，视觉细胞(例如来自不同角膜层)，脂肪细胞，纤维肌肉母细胞，外胚层细胞，肌肉细胞，成骨细胞(即骨细胞)，软骨细胞(即软骨的细胞)，内皮细胞，成纤维细胞，胰腺的细胞，肝细胞，胆管的细胞，骨髓细胞，神经细胞，生殖泌尿细胞(包括肾细胞)，或其组和。基质还可用于将全能干细胞，多能或定向的祖细胞或重新定向(reprogrammed)(去分化的)的细胞递送到体内位点，使得与组织类型相同的细胞得以产生。间充质干细胞的实例包括可发生多样化以产生成骨细胞(以产生新的骨组织)，软骨细胞(以产生新的软骨组织)和成纤维细胞(以产生新的结缔组织)的那些细胞。可供选择的是，可使用这样的定向祖细胞，其能够增殖以提供和体内位点存在的细胞同一类型的细胞，所述祖细胞例如成肌细胞，成骨细胞，成纤维细胞等。
可在将合成聚合物与生物-聚合物进行混合以前，通过将细胞加入合成聚合物的溶液中而将细胞包埋于最终基质内。可供选择的是，可在交联步骤之前，将所述细胞加入含有合成聚合物和生物-聚合物的溶液中。如需要，可在与细胞混合之前，将合成聚合物和生物活性剂反应。通常，为将细胞包埋在基质中，将各种成分(细胞，合成聚合物和生物-聚合物)分散在含水培养基中，例如细胞培养基或其稀释或修饰的形式。细胞悬液可温和地混合到聚合物溶液中，直到所述细胞基本均匀地分散到所述溶液中，随后如上述形成水凝胶。
2.5其它要素本发明还考虑在生物-合成基质中可选包含一或多种增强材料以改善所述基质的机械性质，例如强度，弹性，柔性和/或抗撕性。因此，基质可以用柔性或刚性纤维，纤维网，纤维布等加强。这种增强材料的使用是本领域已知的，例如将由胶原蛋白原纤维、氧化的纤维素或聚合物诸如聚乳酸，聚乙醇酸，或聚四氟乙烯等制成的纤维、布或薄片用在可移植的医疗用途中是已知的。
所述增强材料可以使用标准方案掺入所述基质中。例如，可将合成聚合物和生物聚合物在适当缓冲液中的含水溶液加入纤维布或网，例如Interceed(EthiconInc.，New Brunswick，N.J.)。所述含水溶液将在进行交联前流入所述布或网的空隙中，并由此将形成其中包埋有布或网的水凝胶。可使用适当的模具以保证在需要的时候纤维或纤维网整个包含在水凝胶中。这种合成结构可进一步被洗涤以去除在交联反应中形成的任何副产物。通常，所用纤维在性质上是亲水的，以保证其被聚合物的含水溶液完全湿润。
本领域熟练技术人员将理解，对于需要高光学透明度的用途，应当选择所述增强材料的结构以防止光从最终合成基质中散射的那些，例如通过使用纳米-纤维和/或小心使增强材料与水凝胶的折射率匹配。
3.检测生物-合成基质根据本发明，生物-合成基质包含加入或没有加入生物活性剂和/或包裹的细胞的水凝胶。为了适合用于组织改造目的的体内植入，生物-合成基质必须在生理温度保持其形式，充分坚固，并基本上不溶于水，并支持细胞的生长。基质能支持神经的生长也是合乎需要的。可容易理解对于某些具体的用途，所述基质可能需要其它特性。例如，对于外科目的，基质可能需要是相对柔性并且其强度足以支持外科手术中缝线和针的操作，且对于眼科应用诸如角膜修复或置换，基质的光学透明度将是重要的。
3.1物理/化学检测当用于组织改造时，生物-合成基质需要满足必要的机械参数，从而防止基质用于外科手术时被撕裂或破裂，并适当支持细胞在该位置生长。基质抵抗撕裂的能力与其内在机械强度，基质的形成和厚度以及所用的压力有关。
生物合成基质耐受剪切力或撕裂的能力可通过利用两对镊子以相反的方向对试样施力来粗确定。可供选择的是，可使用适当的工具来定量测定基质耐受剪切力的能力。用于该目的的张力计可从市场上购得，例如购自MTS，Instron和Cole Parmer。
为进行检测，基质可形成薄片并切成大小适宜的条。可供选择的是，基质可制成组织改造所需的形状并且可检测整个成形的基质。为计算可拉伸强度，用该基质在破裂时的力或“破裂(failure)力”除以检测样品的横截面积，得到以力(N)/单位面积表示的值。基质的硬度(模量)可从应力/应变(stess/strain)曲线的线性部分的斜率算出。应变是在实验中长度的实时变化除以检验开始前待测样品的初始长度。破裂时的强度是检测样品在破裂时的最终长度减去初始检测样品的长度，除以该初始长度。
本领域熟练技术人员应理解，由于水凝胶的柔软性以及含水组分在受夹时渗出，难以从水凝胶获得有意义的拉伸数据。例如，可通过对成型的基质样品进行缝合拉开测定获得水凝胶拉伸强度的定量表征。通常，使缝合在离测试样品边缘约2mm处，并测量为扯裂样品上的缝合而需要施加的峰值力。例如，对于用于眼科用途的基质的测试样品，其成型为人角膜的形状和厚度，将两个正相反的缝合插入基质，这也是眼部植入手术所需的第一步。这两处缝合可随后以约10mm/min在适宜的仪器例如Instron TensileTester上拉开。计算基质破裂时的强度，以及在断裂时的伸长率和弹性模量(见例如，Zeng等人，J.Biomech.，34533-537(2001))。本领域熟练技术人员应理解，对于用于手术用途的那些生物合成基质，基质无需与哺乳动物组织强度一样(即具有相同的抗撕裂能力)。在这种用途中，基质强度的决定因素是它是否是由有经验的医师仔细地在该位置进行缝合。
如需要，生物合成水凝胶基质的LCST可利用标准技术测定。例如，LCST可通过以约0.2℃每分钟加热基质样品并目测浊点来计算(见例如H.Uludag，等人，J.Appl.Polym.Sci.75583-592(2000))。
生物合成基质的渗透性可利用标准技术例如PBS渗透性评估使用渗透性小室(permeability cell)和/或原子力显微镜通过评估基质的葡萄糖渗透性系数和/或平均孔径来测定。根据本发明一个实施方案，生物合成基质的平均孔径为约90nm-约500nm。另一实施方案中，所述基质的孔径为约100nm-约300nm。
也可利用可测定透射和散射的定制的仪器测定眼科用途的基质的光透射和光散射(见例如，Priest and Munger，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.39S352(1998))。
3.2体外检测容易理解，生物合成基质必须是非细胞毒性的并是生物相容的以适于体内应用。所述生物合成基质的细胞毒性可利用标准技术来评估，所述标准技术例如用于筛选诱变活性的Ames检测，用于筛选基质在哺乳动物细胞系中诱导基因突变的能力的小鼠淋巴瘤检测，以及体外染色体异常检测，其利用例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)来筛选基质诱导的任何DNA重排或损伤。其它检测包括姊妹染色单体检测，其测定基质诱导的任何染色体臂之间的交换；以及体外小鼠微核检测，其测定对染色体或有丝分裂纺锤体的任何损害。这些以及其它标准检测的方案是本领域已知的，例如见OECDGuidelines for the Testing of Chemicals和ISO开发的方案。
基质支持细胞生长的能力可在体外通过使用标准技术评估。例如，来自适当的细胞系的细胞，如人上皮细胞，可直接接种在基质上或基质周围的适当材料上。在适当培养基中生长适当时间段后，对基质进行共聚焦显微镜和组织学检测以确定细胞是否在基质表面和/或其内部生长。
基质支持神经细胞向内生长的能力也可在体外评估。例如，诸如背根神经节这样的神经源可包埋在基质周围的适当材料中或直接插入基质中。适当的材料的实例可以是基于软胶原蛋白的凝胶。来自适当细胞系的细胞可直接种植于基质上或基质周围的适当材料上，而且基质可在适当培养基的存在下保温预定的时间长度。检测基质的神经生长将表明基质支持神经细胞向内生长的能力，所述检测可以是直接和/或在神经特异性标记物的存在下进行，例如通过免疫荧光法使用神经特异性荧光标记物和共聚焦显微镜进行。
在测定基质支持细胞生长能力的实验中，可将生长添加剂(growthsupplements)加入培养基和/或基质中。所用的具体生长添加剂取决于被评估的细胞的类型，并可由本领域熟练技术人员容易测定。神经细胞的适当添加剂例如包括层粘连蛋白、视黄基乙酸酯、视黄酸和神经细胞的神经生长因子。
3.3体内实验为检测生物合成基质的生物相容性以及其支持细胞在体内生长的能力，可将基质移植到用于免疫原性、炎症、释放和降解研究的适当哺乳动物模型中并测定细胞生长。适宜的对照动物可包括在评估中。适宜的对照包括，例如，没有经过手术的动物，接受了来自供体动物的类似大小的同种异体移植物的动物和/或接受了与标准的、被接受的植入材料类似大小的植入物的动物。
移植后的各个阶段，可取活检来评估细胞在植入物表面和/或其中的生长，并可用组织学检测和免疫组织化学技术来确定神经向内生长是否出现以及炎性或免疫细胞是否存在于植入位点。例如，可使用本领域已知的各种细胞特异性染色来评估存在的多种类型的细胞以及各种细胞特异性抗体，例如可用来表明神经细胞的存在或不存在的抗神经丝抗体。此外，利用标准技术测定神经作用电位将表明神经是否有功能。体内共聚焦显微镜检可用来在选定的术后时间监测动物中的细胞和神经生长。适当的时候，可通过本领域已知的技术，例如使用触觉测量计(esthesiometer)测定触觉敏感性。触觉敏感性恢复表明有功能神经的再生。
4.应用本发明提供了一种生物合成基质，其是坚固的、生物相容的和非细胞毒性的，且由此适合用作体内组织再生的支架。例如，生物合成基质可植入患者体内来取代已经被破坏或去除的组织，例如伤口覆盖，作为组织封闭剂或粘合剂，作为皮肤代替品或角膜代替品，或者作为角膜护片。基质可在移植前制成适合的形状，例如其可被预成型以填满组织被破坏或去除而留下的空间。可供选择的是，当用作植入物时，可通过将其组分注入破坏的组织并使聚合物在生理温度进行交联并形成凝胶而在原位形成基质。
本发明的一个实施方案中，所述基质被预制成用于组织改造目的的适当形状。在另一实施方案中，所述基质被预制成整体厚度人工角膜或者适合作为角膜护片的部分厚度的基质。
生物-合成基质可单独使用，并可支持新细胞在原位的向内生长。可供选择的是，基质可在移植前接种细胞，并支持这些细胞在体内向外生长以修复和/或取代周围组织。所述细胞可来自患者，或者可以在来源上是同种异体或异种的。例如，可从患者收获细胞(在修复组织的手术前或期间)并在无菌条件下处理以提供具体的细胞类型例如多能干细胞，干细胞或前体细胞。这些细胞可如上述接种到基质中，并且基质可随后移植到患者体内。
基质可用来包衣外科植入物以帮助密封组织或者帮助将植入物粘附于组织表面，所述用途例如可通过使水凝胶的合成聚合物组分上的未反应的交联基团和组织中存在的伯胺或巯基形成交联来实现。例如，可利用基质层来填补角膜穿孔，或用于导管或乳腺植入物来减少纤维化。基质也可用于血管移植物或支架，以使血液或血清流体渗漏最小化，用作人工补丁或网以使纤维化最轻，并用于帮助植入物粘附于组织表面。
基质也可用作递送系统，来将生物活性剂递送到患者体内的特定区域。生物活性剂可作为溶液和合成聚合物及生物聚合物一起递送，使得含有生物活性剂的基质可在原位形成，或者含有生物活性剂的基质可预形成并被植入。一旦进入体内，生物活性剂可例如通过扩散控制的工艺从基质中释放出来，或如果所述生物活性剂与基质共价结合，其通过酶的作用从基质裂解下来并随后通过扩散控制的工艺释放出来。可供选择的是，生物活性剂可在基质内显示其作用。
本发明一个实施方案中，生物合成基质用作人工角膜。对于这种用途，所述基质可预制成整体厚度的人工角膜或者作为适用于角膜护片的部分厚度基质。根据该实施方案，设计水凝胶以使其具有高的透光度和低光散射性。例如，包含与胶原蛋白交联的合成p(NiPAAm-共-AAc-共-ASI)三元共聚物或p(DMAA-共-ASI)共聚物的水凝胶具有高透光性，低光散射性，并能够在高达55℃的温度下保持透明。
5.试剂盒本发明还涉及包含生物合成基质的试剂盒。试剂盒包含“成品”形式的基质，并且它们可包含制备基质所需的适当比例的各种组分(即合成聚合物和生物聚合物)。试剂盒可选还包含一或多种生物活性剂，其可与合成聚合物预连接或者作为可在基质制备过程中连接于合成聚合物的单独组分。试剂盒还可包含使用说明，一或多种适宜的溶剂，一或多种用于辅助将最终基质组分注入或置于动物体内的工具(例如注射器，吸液管，镊子，滴眼器(eye dropper)或类似的可医用递送载体)，或其组合。试剂盒的各个成分可包装在分开的容器中。试剂盒还可包含管理生物产品的工业生产、使用或销售的政府机构要求的形式的注意事项，其反映了政府机构对用于人或动物用途的工业生产、使用或销售的许可。
为更好理解本发明，给出以下实施例。应理解这些实施例仅用于说明。因此，它们不应以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例中所述所有凝胶基质都使用无菌胶原蛋白I，例如端胶原蛋白(大鼠尾腱，RTT)或非末端胶原蛋白(atelocollagen)(牛或猪)，其可在实验室中制备并更方便地可购得(例如，牛和猪胶原蛋白可购自Becton Dickinson，浓度为3.0-3.5mg/ml，在0.02N乙酸和0.012N盐酸中)。这种胶原蛋白可在4℃保存许多月。此外，可小心地浓缩这种胶原蛋白溶液以产生光学透明的、非常粘的溶液，其含有3-30wt/vol％胶原蛋白，并适合制备更坚固的基质。
可通过使用氢氧化钠水溶液在磷酸盐缓冲的盐水(PBS)存在的条件下，将胶原蛋白溶液调节到生理条件，即盐水离子强度和pH 7.2-7.4。使用不含氨基酸和其它营养物质的PBS，来防止通过与含有-NH2的分子发生副反应而消耗交联反应性，使得可利用最小浓度的交联基团并使细胞毒性的任何危险最小化。
pNiPAAm均聚物粉末可购买(例如，购自Polyscience)。所有其它聚合物如下合成。
实施例1制备pNiPAAm-胶原蛋白水凝胶制备pNiPAAm-胶原蛋白水凝胶以提供备选的水凝胶，可将该备选水凝胶与本发明的水凝胶的性质进行比较。
将ddH2O中的1wt/vol％pNiPAAm均聚物溶液通过高压灭菌来消毒。在无菌试管中，于4℃将该溶液与无菌RTT胶原蛋白溶液(3.0-3.5mg/ml(w/v)，乙酸水溶液(0.02N)中)(1∶1 vol/vol)通过注射器泵入以在无气泡形成的条件下进行彻底混合。冷混合可避免胶原蛋白形成任何预成熟的凝胶或原纤维。胶原蛋白-pNiPAAm可随后倾到入塑料盘(未处理的培养皿)或模具(例如接触透镜模具)，并在层流通风柜中，于室温在无菌条件下在空气中干燥至少2-3天。干燥至恒重后(约7％水剩余)，将形成的基质从模具中取出。将基质从模具中取出可通过将所述模具在室温在无菌PBS中浸泡而方便地进行。继续在该溶液中浸泡游离样品得到在生理温度，pH和离子强度下的凝胶，并可随后进行细胞生长检测和体内动物检测(见实施例6和7)。
实施例2制备合成三元共聚物胶原蛋白-反应性三元共聚物，聚(NiPAAm-co-AAc-co-ASI)(图1)是通过将以下三种单体进行共聚反应合成的N-异丙基丙烯酰胺(NiPAAm，0.85摩尔)、丙烯酸(AAc，0.10摩尔)和N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺(ASI，0.05摩尔)。进料摩尔比为85∶10∶5(NiPAAm∶AAc∶ASI)，自由基引发剂为AIBN(0.007摩尔/单体总摩尔数)，溶剂为二噁烷(100ml)，在加入AIBN前用氮净化。反应在65℃进行24小时。
通过反复沉淀去除微量均聚物进行纯化以后，通过THF-D8中的质子NMR发现所述合成的三元共聚物(82％产量)的组成为84.2∶9.8∶6.0(摩尔比)。通过含水GPC测定三元共聚物的Mn和Mw分别为5.6×104Da和9.0×104Da。
D-PBS中的2mg/ml的三元共聚物溶液直到55℃仍保持澄清，这与高LCST一致。D-PBS中的10mg/ml的溶液在43℃仅变得略有混浊。不从三元共聚物中去除分批聚合反应中形成的均聚物(由于NiPAAm的反应性系数高于AAc或ASI)导致水溶液和水凝胶在-32℃及以上变混浊。
实施例3制备含有生物活性剂的合成聚合物通过将实施例2中制备的三元共聚物(1.0g)与2.8μg层粘连蛋白五肽(YIGSR，得自Novabiochem)在N，N-二甲基甲酰胺中混合来合成含有五肽YIGSR(神经细胞附着基序)的三元共聚物。在室温(21℃)反应48小时后，将聚合物产物从二乙醚中沉淀出并在真空条件下干燥。在与五肽反应后保持的ASI基团可用于随后与胶原蛋白进行反应。该聚合物的结构显示于图8A。
实施例4制备胶原蛋白-三元共聚物水凝胶交联的三元共聚物-胶原蛋白水凝胶是通过用注射器将中和后的4％牛非端胶原蛋白(1.2ml)与实施例2中制备的三元共聚物(0.34ml(100mg/ml，D-PBS中))在4℃进行混合(胶原蛋白∶三元共聚物为1.4∶1 w/w)来制备。小心用注射器泵入以产生均质、无气泡的溶液以后，将等分试样注入塑料的接触透镜模具，并在室温(21℃)保温24小时，以使得胶原蛋白的-NH2基团与ASI基团反应并使剩余的ASI基团缓慢水解成AAc基团。成型的样品随后在37℃、100％湿度的环境下保温24小时，以得到最终水凝胶。所述水凝胶含有95.4±0.1％的水，2.3％的胶原蛋白和1.6％的三元共聚物。将基质进行成型为最终厚度为150-200μm或500-600μm。每种生成的水凝胶基质均可在PBS溶液中从其模具中取出，并随后浸入含有1％氯仿和0.5％甘氨酸的PBS中。该洗涤步骤去除了交联反应中产生的N-羟基琥珀酰亚胺，通过转化成丙烯酸基团终止了该基质中任何未反应的ASI基团，并对该水凝胶基质进行灭菌。作为选择，成型的凝胶也可用含水甘氨酸处理以保证所有的ASI在接触细胞前被终止。
留在从胶原蛋白和三元共聚物制备的凝胶中的琥珀酰亚胺残基在洗涤后均低于IR检测限。
实施例5制备包含生物活性剂的水凝胶包含YIGSR细胞粘附因子的胶原蛋白-三元共聚物的交联水凝胶是通过将粘性的、中和后的4％牛胶原蛋白(1.2ml)与和层粘连蛋白五肽(YIGSR)共价结合的三元共聚物(来自实施例3；0.34ml，100mg/ml)在4℃、按实施例4所述的步骤进行彻底混合而制备。
充分洗涤的凝胶的YIGSR含量为4.3×10-11摩尔/ml(2.6×10-8g/ml)含水凝胶，所述含水凝胶通过用Iodogen法利用125I标记酪氨酸(带有伯胺)基团并用标准化的γ-计数器(Beckman，Gamma 5500)测定放射活性来定量。每种含水的、PBS-平衡的水凝胶中的最终总聚合物浓度为3.4w/v％(包含的胶原蛋白和YIGSR三元共聚物分别为2.0和1.4w/v％)。
实施例6水凝胶基质的物理性质比较胶原蛋白热敏凝胶(thermogel)是脆的并容易坍陷和断裂，并明显是不透明的(见图8C)。胶原蛋白热敏凝胶通过中和胶原蛋白并在如实施例4和5所述的相同模具中成型。然后将成型的胶原蛋白保温，先在21℃保温24小时，然后在37℃保温，以自发形成透明的热敏凝胶(通过胶原蛋白三螺旋自结合成微原纤维来制备)。
PBS(pH 7.4)中的葡萄糖对实施例5制备的水凝胶的渗透性系数是通过在渗透小室中如下进行测定来计算间断性取出透过物等分试样，加入三磷酸腺苷并利用己糖激酶将葡萄糖转化成葡萄糖-6-磷酸酯。后者和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在脱氢酶的存在下反应，并通过测定所得还原的二核苷酸溶液在340nm的UV吸收来测定其量(Bondar，R.J.& Mead，D.C.(1974)ClinChem 20，586-90)。完全浸在PBS溶液中的水凝胶表面特征通过原子力显微镜(Molecular Image Co.，USA)以“接触”模式来检测。将该技术产生的孔径与根据从前述水凝胶的PBS渗透性计算的平均孔直径进行比较(Bellamkonda，R.，Ranieri，J.P.& Aebischer，P.(1995)J Neurosci Res 41，501-9)。所述水凝胶的折射率为(1.343±0.003)，而人眼的泪膜折射率为(1.336-1.357)(Patel，S.，Marshall，J.& Fitzke，F.W.3rd(1995)J Refract Surg11，100-5)。它们与只含有胶原蛋白的基质相比显示高光学透明度(图8B和C)。所述水凝胶的孔径为140-190nm(来自原子力显微镜和PBS渗透性)，且其葡萄糖扩散渗透性系数为2.7×10-6cm2/s，该值高于天然基质的葡萄糖扩散渗透性系数(约0.7×10-6cm2/s，由公开的扩散(2.4×10-6cm2/s)和溶解度(0.3)系数计算(McCarey，B.E.& Schmidt，F.H.(1990)Curr Eye Res 9，1025-39))。
实施例4和5中制备的水凝胶的如下性质表明它们是交联的●不溶于水，●强度足以支持利用缝线和针的手术操作，并附着于人角膜环●处理时相对柔韧●在拉伸测试中显示破裂应力和表观模量增加超过x2，来自ASI/-NH2的当量比为0.5-5。
如上制备所述基质，但合成聚合物中胶原蛋白胺基与ASI基团的比例不同的基质在可见光区域具有高透光性和低散射(图8B，12和13)。相反，从上述胶原蛋白制备的胶原蛋白热敏凝胶具有低透光性和高散射性，这与其不透明的外观一致(图8C，12)。这种具有高至3wt/vol胶原蛋白的热敏凝胶基质很脆弱而不能进行缝合拉开实验。
所述水凝胶的定量表征通过在制成人角膜形状和厚度的样品上进行缝合拉开测定来进行。这涉及插入两个正相反的缝合(这也是眼部植入所需的第一步)，然后在Instron Tensile Tester上以10mm/min拉开这两处缝合(这是用于评估心脏瓣膜成分的良好确定的方法)。所用缝合为10-0尼龙缝线。计算凝胶的破裂强度以及断裂伸长率和弹性模量。来自缝线拉开测定的模量和断裂应力在特定胶原蛋白胺与ASI基团之比时达最大(图11)。
利用测定透射和散射的定制仪器进行测定显示，与人角膜相比，实施例4和5中制备的水凝胶具有高透射性和非常低的光散射(Priest and Munger，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.39S352-S361(1998))。在可见光区光在实施例4制备的水凝胶的反向散射(back scattering)和透射显示极好的性能，但高三元共聚物浓度时除外(高胶原蛋白胺与三元共聚物ASI比，图12)。类似地，热敏凝胶(无交联的合成聚合物)具有非常低的透射率和高反向散射(图12)。实施例5中的水凝胶在该分析中也显示极好的性能，如图12所示(1∶1的胶原蛋白∶三元共聚物-五肽用实心方块表示)。
反之，胶原蛋白-pNiPAAm均聚物凝胶(实施例1所述；1.0∶0.7-1.0∶2.0wt/wt)在37℃是不透明的。此外，将胶原蛋白和pNiPAAm从该水凝胶中提取到PBS中(48小时内超过50wt％损失)。
实施例7不同生物合成基质的体内检测将实施例1，4和5中形成的水凝胶成型以制成人工角膜并植入猪的眼睛(图2)。
作为体内角膜植入物，实施例1的凝胶在植入猪眼5-6天后渗出了白色残留物。
如实施例5所述从4％的胶原蛋白和五肽-三元共聚物制备的水凝胶显示出较好的生物相容性，正如实施例4所述制备的胶原蛋白-三元共聚物水凝胶那样。当使用前一种水凝胶时出现了完整上皮细胞过度生长并形成多层，而胶原蛋白-三元共聚物水凝胶则显示较慢的、连续性较差的上皮细胞生长并没有形成多层。
在体内，从胶原蛋白和五肽-三元共聚物(来自实施例5；最终浓度胶原蛋白2.3wt％；三元共聚物+五肽1.6wt％)制备并植入猪眼的整体厚度水凝胶的共聚焦显微镜图像显示，在该基质上上皮细胞的生长以及分层。基底膜(basement membrane)和半桥粒(hemidesmosomes)都得以再生，表明存在稳定固定的上皮。发现仅在3周后基质细胞就分散在所述基质内。在植入3周内，所述植入物变得对触觉敏感(Cochet-Bonnet Aesthesiometer)，表明有功能的神经长入(图4和14)。神经长入也可通过共聚焦显微镜和组织学直接观察。在植入后8周内没有观察到不良炎症或免疫反应的临床症状。见图2，3和5-7。
更详细的描述图5显示移植后3周猪角膜的切片的形态和生化评估。(A)胶原蛋白的picro-sirius染色，和(B)细胞的H & E染色。图7显示(A)用picro-sirius red染色的移植后3周猪角膜的切片，其显示基质-植入物界面(箭头)。植入物界面已经被分层的上皮再覆盖(re-covered)。(B)移植后8周的类似切片。基质细胞进入植入物，且所述植入物显示被上皮下组织取代(箭头)。(C)上皮(H&E染色)高倍放大图像，显示再生的基底膜(箭头)。(D)用抗VII型胶原蛋白抗体染色的对应切片，所述抗体识别附着于基底膜的半桥粒(箭头)。(E)附着于下方基底膜的半桥粒(箭头)通过透射电子显微镜(TEM)清楚地显示。(F)猪角膜平埋切片(flat mount)，显示植入物中的神经(箭头)，所述切片用抗神经丝抗体染色。
图3显示术后6周的猪角膜的全层共聚焦显微镜图像，其显示植入物表面上再生的角膜上皮和基底膜。显示了胶原蛋白-三元共聚物合成物中、其下方的宿主基质中以及向内生长的基质细胞中的体外神经生长模式。
触觉敏感性的恢复很快(＜术后14天)，而相同时间段内对于接受了类似大小的供体猪角膜的同种异体移植物的另外6只动物而言，移植后的同种异体移植物中的触觉敏感性恢复得最慢(图14)。
实施例8将胶原蛋白-三元共聚物基质的放置在啮齿动物脑中麻醉后，切下所用每只小鼠或大鼠的全脑并置于sterotaxic框架中。将2毫升(2ml)或3毫升(3ml)含有胶原蛋白、三元共聚物-五肽(0.33％胶原蛋白-0.23％三元共聚物或0.63％胶原蛋白-0.44％三元共聚物)的水凝胶分别在6-10分钟内注入每只小鼠的脑内，在如下位置进行离前囟0.3mm，3.0mm深且离中线2.0mm。对于大鼠，将4-6毫升的水凝胶在10分钟内注入各自的脑，位置在离前囟0.7-0.8mm，6mm深且离中线4mm。水凝胶样品和考马斯蓝染料混合用于显色。
这些样品中的结果显示成功地直接且精确地将少量水凝胶递送到脑的各层中(图9和10)。这表明可利用水凝胶作为递送系统将很小体积的细胞或药物递送到具体位置。
实施例9包含生物活性剂的水凝胶如实施例5所述制备的无菌水凝胶在移植前用PBS彻底冲洗。根据Research in Vision and Ophthalmology协会对于在动物中使用的指南，将每种组织改造的(TE)角膜基质(直径5.5mm，厚度为200±50μm)植入Yucatanmicro-猪(Charles River Wiga，Sulzbach，Germany)的右角膜中(见图15A-C)。对侧未接受手术的角膜作为对照。在普通的麻醉下，利用Barraquer trephine(Geuder，Heidelberg，Germany)作部分厚度的、直径5.0mm的环形切口。去除宿主角膜组织并用比其直径大0.50mm的植入物取而代之，所述植入物允许适当地填补在植入物和宿主组织之间的切口。手术后，将羊膜缝合在整个角膜表面并保持一周，以便使植入物保持在适当的位置。在缝合的样品中，用8根不连续10-0尼龙缝线将植入物缝合到宿主组织内。术后给药包括给予地塞米送松(qid)和庆大霉素(qid)21天。n＝3只猪接受缝合和3只猪没有接受缝合。
每天对每只猪进行随诊直到术后7天，并随后每周进行一次随诊。检查包括裂隙灯(slit-lamp)检查以保证角膜在光学上透明，荧光素钠染色以评估上皮完整性和屏障功能(Josephson，J.E.& Caffery，B.E.(1988)InvestOphthalmol Vis Sci 29，1096-9)，眼内压测定以保证角膜不阻挡房水流动，以及体内共聚焦显微镜检(ConfoScan3，Nidek，Erlangen，Germany)以评估细胞和神经向内生长。角膜触觉敏感性用Cochet-Bonnet触觉计(Handaya Co.，Tokyo，Japan)在每个角膜的植入区内的5个点(4个在周围，1个在中心)如前述(Millodot，M.(1984)Ophthalmic Physiol Opt 4，305-18)检测。也对接受猪供体角膜的同种异体移植物的动物进行类似评估。
对于免疫组织化学和组织病理学检测，将组织和构建体固定在0.1MPBS中的4％PFA中。对于神经免疫定位，用清洁剂混合物(Brugge，J.S.&Erikson，R.L.(1977)Nature 269，346-8)(150mM NaCl，1mM乙二胺四乙酸，50mM Tris，1％Nonidet P-40，0.5％去氧胆酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠)使平埋切片可通透化，用PBS中的4％胎牛血清进行非特异性染色而封闭并在抗神经丝(anti-neurofilament)200抗体(Sigma，Oakville，Canada)中保温。然后将它们用FITC或Cy3-结合的二抗(分别来自Sigma；Amersham，Baie D’Urfe，Canada)中保温，并通过共聚焦显微镜观察。
对于组织学和进一步的免疫组化，将样品加工，用石蜡包埋并切片。用苏木精和伊红(H & E)对切片进行染色，以进行组织病理学检测(Jumblatt，M.M.& Neufeld，A.H.(1983)Invest Ophthalmol Vis Sci 24，1139-43)。如上述对脱石蜡的切片进行免疫荧光实验，以检测半桥粒标记物(Gipson，I.K.，Spurr-Michaud，S.J.& Tisdale，A.S.(1988)Dev Biol 126，253-62)VII型胶原蛋白(Sigma，Munich，Germany)的表达。利用过氧化物酶-二氨基联苯胺(DAB)显色用如下物质进行免疫组织化学染色作为上皮标记物的AE1/AE3抗体(Chemicon，Temecula，CA，USA)，用于基质成纤维细胞的抗-波形蛋白(antivimentin)抗体(Roche，Laval，Canada)，用于活化基质成纤维细胞(肌肉成纤维细胞)的抗平滑肌肌动蛋白抗体，1A4(Cell Marque，Austin，TX)，和用于原胶原蛋白1合成的SP1-D8抗体(DHSB，Iowa，USA)(用于定位重新合成胶原蛋白的位点)。利用ARK过氧化物酶试剂盒(DAKO，Mississauga，Canada)进行免疫细胞的CD15和CD45染色(Becton-Dickinson，Oakville，Canada)以将一级抗体预结合于它们各自的二级抗体和过氧化物酶上以显示。对于抗波形蛋白，抗平滑肌肌动蛋白和SP8-D1抗体，在一级抗体中保温之前通过用蛋白酶-K(2mg/ml)在37℃预处理30分钟进行抗原募集(antigen retrieval)。利用Ulex europaeus血凝素(UEA)凝集素染色显示泪膜粘蛋白沉积(Shatos，M.A.，Rios，J.D.，Tepavcevic，V.，Kano，H.，Hodges，R.& Dartt，D.A.(2001)Invest Ophthalmol Vis Sci 42，1455-64)。将样品与生物素化的UEA(Sigma)一同保温，并随后与抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶反应，并用DAB显示。对于透射电子显微镜(TEM)，所有样品用传统的固定剂，染色剂和填充(potting)树脂处理(Kamovsky’s，OsO4，尿烷乙酸酯(uranyl acetate)，环氧树脂)。
植入生物合成基质或者猪角膜以后，临床检查没有观察到不良的炎症或免疫反应。上皮细胞向整个植入物内的生长在术后4天完成。到1周时，再生的上皮显示荧光素钠染料的排出，表明所述上皮是完整的并具有重新建立的屏障性质。眼内压在术前为10-14mm汞柱(Hg)，并在整个高达6周的术后研究中保持在10-16mm Hg，表明所述植入物不阻挡房水在眼中的流动。植入物保持光学透明(窄缝-灯活组织显微镜)且在术后3周所有动物中观察到上皮再分层。植入的基质在术后3周的临床体内共聚焦显微镜检中显示再生的上皮(图15D)，新长入的神经(图15G)，和基质(图15J)以及上皮细胞(图15M)，所述细胞的形态与未接受手术的对照的细胞形态相似(图15F，I，L，O)。同种异体移植物中的上皮和内皮细胞形态(图15E，N)与对照中的相似。手术后3周，在同种异体移植物中没有观察到上皮下和基质神经(图15H，K)。
更具体地，图15显示(A-C)对Yucatan micro-猪进行层状角膜成形术(LKP)。(A)用圆锯在角膜上切出预定深度(250μm)的环形切口。去除现有的角膜层，(B)并用生物-合成基质植入物(箭头，250μm厚)置换，缝合所述植入物(C)。缝合用箭头表示。
(D-O)植入的生物-合成基质的体内共聚焦显微镜检。(D)共聚焦图像，显示植入物表面再生的角膜上皮。相应的同种异体移植物对照(E)含有供体上皮，而未接受手术的对照(F)具有完整的上皮。(G)再生的神经(箭头)存在于植入物和其上覆盖的再生上皮之间的界面处。这些对应未接受手术的对照中的上皮下神经(I)。但在同种异体移植物(H)中，不存在上皮下神经。(J-L)具有植入物、同种异体移植物(K)的角膜下方的基质深处以及对照(L)的相应区域中的基质细胞和分支的神经束(箭头)。(M-O)具有植入物(M)，同种异体移植物(N)以及未接受手术的对照(O)的角膜的内皮是完整的并显示相似的形态。
具有移植物的角膜的组织切片显示明显的但平滑的植入物-宿主界面(图16A)，这与接受同种异体移植物的对照角膜类似(图16B)。在具有植入物或同种异体移植物的角膜中，再生的上皮都分层。详细检测显示完全分化的上皮，其被AE1/AE3抗体标记物(图16D，E)染色是阳性的，所述上皮细胞覆盖在VII型胶原蛋白阳性的再生基底膜上，其中所述VII型胶原蛋白是位于基底膜-上皮界面的半桥粒的标记物(图16G，H)。TEM观察显示与半桥粒存在相一致的形态(图16J，K)。在植入物中，神经丝-阳性的内向生长神经已经开始再建立上皮下网状结构并显示延伸到上皮细胞中(图16M)。然而，在同种异体移植的角膜中没有上皮下神经(图16N)。在具有移植物的角膜中恢复了泪膜(图16P)，具有同种异体移植物的角膜也如此(图16Q)。
更具体地，图16显示术后角膜再生。
(A-F)显示了H & E染色的切片。基质细胞存在于植入物(A)和同种异体移植物对照(B)中，并均显示与宿主之间的整合没有缝隙。(标志如下e，上皮；i，植入物；g，同种异体移植物；s，基质)。(C)未接受手术的对照。植入物(D)的再生上皮和同种异体移植物对照(E)的供体上皮表达细胞角蛋白分化标记物，这与未接受手术的对照(F)相似。
(G-1)半桥粒标记物VII型胶原蛋白在植入物(G)，同种异体移植物(H)和对照(I)的上皮-植入物界面(箭头)处的免疫定位。
(J-L)上皮-植入物界面的TEM。半桥粒斑(箭头)和锚定型原纤维(箭头)在生物-合成基质中上皮细胞和下方的植入物(J)之间形成，这与同种异体移植物(K)和对照(L)中所示通常在上皮-基质界面上所见的结构相似。
将显示神经纤维(箭头)的角膜平埋于植入物(M)，未接受手术的对照(O)中，但不存在于同种异体移植物(N)中，用抗神经丝抗体染色。UEA与植入物(P)，和同种异体移植物(Q)上的上皮表面结合(箭头)表明所有情况中泪膜的恢复。未接受手术的对照(R)免疫组织化学结果表明植入物和同种异体移植物中的细胞可合成I型原胶原蛋白。然而，更多的原胶原蛋白合成出现在同种异体移植物中，这可由同种异体移植物的染色比植入物的染色更深显示(图17G，H)。同种异体移植物和植入物都具有波形蛋白阳性的基质细胞(图17A，B)，表明其为成纤维型表型。这两种植入物还显示平滑肌肌动蛋白染色并因此存在活化的基质成纤维细胞，但植入物的阳性细胞少于同种异体移植物的阳性细胞(图17D，E)。
更具体地，图17显示术后6周时的植入物-宿主整合。
(A-C)I型原胶原蛋白染色。在植入的生物合成基质(A)和同种异体移植物对照(B)的基质中观察到阳性染色，显示出新的胶原蛋白沉积位点。未接受手术的对照(C)没有新胶原蛋白合成。
(D-F)在整个基质中进行波形蛋白染色鉴别了基质成纤维细胞。对整个植入的生物合成基质(D)染色显示细胞浸入。细胞也可见于植入的同种异体移植物(E)和整个未接受手术的对照(F)中。
(G-I)平滑肌肌动蛋白染色显示活化的肌成纤维细胞以及疤痕形成的可能性。在生物合成基质植入物(G)中，染色偶然见于生物合成基质中，但不见于宿主基质以及宿主和移植物之间的过渡区中。植入角膜的同种异体移植物中的阳性染色(H)见于同种异体移植物和过渡区中，但不存在于宿主基质中。(I)未接受手术的对照。
利用Cochet-Bonnet触觉测量计在手术前和手术后的3只猪的角膜植入物中的5个点测定的角膜触觉敏感性显示手术后触觉敏感性急剧降低。然而，在术后7-14天之间出现恢复，且到术后21天时，敏感性回到手术前水平(图18；所有组，n＝3。通过用Tukey双向比较反复测定ANOVA得到*P＜0.01)。在植入物上检测的所有周围和中心点的触觉敏感性回到相同速率和相同的平台水平。但在接受供体角膜同种异体移植物的对照动物中，角膜在6周之内保持感觉缺失态(图18)。
6周后在体内回收的植入物通过红外线分光镜(Midac M，FTIR分光计，ZnSe聚光镜和金刚石池(diamond cell))检测并明确显示三元共聚物的存在。
实施例10制备合成共聚物聚(DMAA-co-ASI)共聚物通过单体N，N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)和N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺(ASI)的共聚反应合成。加料摩尔比为95∶5(DMAA∶ASI)。自由基引发剂AIBN和溶剂二噁烷在使用前用氮净化并在70℃进行聚合反应24小时。
通过反复沉淀以去除微量均聚物来进行纯化以后，通过质子NMR发现合成共聚物的组成(70％产量)为94.8∶5.2(摩尔比)。通过含水GPC测定分子量(Mn)为4.3×104。多分散性(PD；Mw/Mn)＝1.70也通过GPC确定。
实施例11制备胶原蛋白-共聚物水凝胶交联的胶原蛋白-共聚物水凝胶通过用注射器将中和过的5％牛胶原蛋白(1.0ml)与实施例9中制备的合成共聚物(0.2ml(200mg/ml，D-PBS中))进行混合来制备。小心用注射器泵入以产生均质的、无气泡的溶液以后，将等分试样注入塑料的、接触透镜模具中，并在室温下保温24小时以使胶原蛋白-NH2基团与所述共聚物中的ASI基团进行反应，并允许剩余的ASI基团缓慢水解成AAc基团。
然后将成型的样品在100％湿度的环境中、在37℃保温24小时以产生最终水凝胶。凝胶化时，水凝胶合有94.8％的水、2.9％的胶原蛋白和2.3％的合成共聚物。将基质成型以使其最终厚度为150-200μm或500-600μm。每种产生的水凝胶基质都在PBS溶液中从其模具中取出，并随后浸入含有1％氯仿和0.5％甘氨酸的PBS中。该洗涤步骤去除了交联反应中产生的N-羟基琥珀酰亚胺，并通过将ASI基团转化成丙烯酸基团而终止了基质中任何剩余的ASI基团。
由胶原蛋白和共聚物制备的凝胶中剩余的琥珀酰亚胺残基在洗涤后低于IR检测限。
实施例12胶原蛋白-共聚物水凝胶的物理性质图13A和B中示出了可见光和白光在实施例10中制备的水凝胶中的光反向散射和光透射和胶原蛋白胺与共聚物ASI比例的函数关系。
实施例10的共聚物及其水凝胶在60℃没有检测到浊点(LCST)。
实施例13各种水凝胶的生物性质11.1生物相容性将三个直径12mm、厚650μm的圆盘在PBS中浸泡30分钟，所述圆盘分别由胶原蛋白-聚(DMAA-co-ASI)，胶原蛋白-聚(NiPAAm-co-AAc-co-ASI)-五肽和3％胶原蛋白水凝胶制成。它们分别置于12mm的可购得的培养皿用的膜插入物上，并通过薄层凝胶附着于该膜。干燥10分钟以后，将悬在含有上皮生长因子的无血清培养基(角质细胞无血清培养基(KSFM；Life Technologies，Burlington，Canada))中的1×104人角膜上皮细胞(HCEC)加到凝胶顶上，并将不含细胞的KSFM加入下方的孔中。在5％CO2存在的条件下，在37℃保温所述培养物。
在12小时内，在所有样品中，细胞都附着于基质表面。每两天换培养基，同时将KSFM加入插入物和外部的孔中。HCEC在凝胶上生长至满底，并在同一天达到满底(5天)。插入物和周围的孔中的培养基用含血清的培养基(改良的SHEM培养基(Jumblatt，M.M.& Neufeld，A.H.(1983)InvestOphthalmol Vis Sci 24，1139-43))置换。再过2天后，从插入物中除去培养基，并将下方的孔中的SHEM的体积减少到0.5ml。再放置7天使上皮分层并观察各个细胞层。
7天以后，在4℃在含4％多聚甲醛的PBS中固定所述膜30分钟。通过在含30％蔗糖的PBS中平衡，然后按含30％蔗糖的PBS与OCT为1∶1混合物的比例进行急骤冻结，由此制备样品用于低温切片(cryosectioning)。样品在低温切成13μm的切片，并通过HandE染色显示其结构。分层上皮中的细胞层数通过计数细胞核和鉴定细胞边界来确定。胶原蛋白热敏凝胶中的上皮厚度为约2层细胞，这与人角膜上皮中含有的5-7层细胞相比而言很少。但培养HCEC并诱导其在胶原蛋白-p(DMAA-co-ASI)和胶原蛋白-p(NiPAAm-co-AAc-co-ASI)-五肽上分层得到的上皮厚度为4.5层细胞，其中包括明显角质化的外层，这表明上皮出现适当的分化(图20)。
11.2.水凝胶的神经分布(innervation)直径12mm、厚650μm的圆盘分别由胶原蛋白-p(DMAA-co-ASI)，胶原蛋白-p(NiPAAm-co-AAc-co-ASI)-五肽和3％胶原蛋白热敏凝胶制成，将其浸于PBS中30分钟。将所述圆盘置于6cm的培养皿上，并在每个圆盘上钻4个1mm的孔。所述孔的1/3用与戊二醛进行交联的0.3％胶原蛋白填充并用甘氨酸骤冷。10分钟后，将E8小鸡的背根神经节浸入同种胶原蛋白混合物，并置于所述孔中。所述孔余下的部分用交联的胶原蛋白填充，并在37℃放置30分钟。将培养物在补充了B27，N2，和1nM视黄酸的KSFM中生长4天，并通过明视野显微镜监测神经突的延长。含神经分布(innervated)的圆盘在含4％多聚甲醛的PBS中在室温固定30分钟，染色以测定NF200免疫反应性，并通过免疫荧光显色。在聚合物圆盘的表面和中心观察有定位。虽然一些神经突在胶原蛋白热敏凝胶表面延伸，没有神经突延伸到热敏凝胶本身中。在水凝胶中，可看见神经突延伸到基质中。此外，在两种水凝胶中，可看到在基质表面上大量的神经分布，表明其表面的神经分布比胶原蛋白热敏凝胶中出现的神经分布好(图19；A表示胶原蛋白热敏凝胶，B表示胶原蛋白-p(NiPAAm-co-AAc-co-ASI)-五肽水凝胶且C表示胶原蛋白-p(DMAA-co-ASI)水凝胶)。左侧一列的小图表示用神经丝标记物-NF200进行染色，在聚合物的中间部分观察到的免疫荧光。中间一列的小图显示了聚合物表面的明视野图，其中神经突从神经节源延伸出。右侧一列小图显示了进行NF200免疫-反应性染色的聚合物的相同表面视图的免疫荧光显示。箭头表示在聚合物中间延伸的神经突。完整的人角膜显示上皮表面和深部神经，表明这些基质既与神经生物相容，又可效仿角膜基质。
已经描述了本发明，但显然本发明可在许多方面变化。这种变化不应认为背离了本发明的精神和范围，且所有这种修饰对于本领域技术人员而言都是明显的并包括在本发明的范围内。
权利要求
1.一种合成共聚物，其包含一或多种N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚单体，一或多种亲水性共聚单体和经衍生而含有侧可交联部分的一或多种丙烯酰基-或甲基丙烯酰基-羧酸共聚单体，所述合成共聚物的数均分子量为约2,000-约1,000,000。
2.权利要求1的合成共聚物，其中(a)所述N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚单体具有式I的结构 其中R1，R2，R3，R4和R5独立地选自H或低级烷基；(b)所述亲水性共聚单体具有式II的结构 其中Y是O或不存在；R6，和R7独立地选自H或低级烷基；R8是H，低级烷基或-OR’，其中R’是H或低级烷基；且R9是H，低级烷基或-C(O)R10，且R10是-NR4R5或-OR”，其中R”是H或CH2CH2OH；和(c)所述丙烯酰基-或甲基丙烯酰基-羧酸共聚单体具有式III的结构； 其中R11，R12和R13独立地选自H或低级烷基；且Q是N-琥珀酰亚胺基，3-磺基-琥珀酰亚胺(钠盐)，N-苯并三唑基，N-咪唑基或对-硝基苯基。
3.权利要求1或2的合成共聚物，其中所述一或多种N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚单体和所述一或多种亲水性共聚单体是相同的。
4.权利要求1或2的合成共聚物，其中所述一或多种N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚单体和所述一或多种亲水性共聚单体是不同的。
5.权利要求1-4之一的合成共聚物，其中所述烷基或低级烷基是具有1-8个碳原子的直链或直链烷基基团；权利要求1-4之一的合成共聚物，其中所述烷基或低级烷基是具有3-6个碳原子的环烷基基团。
6.权利要求2的合成共聚物，其中N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚单体和亲水性共聚单体的总摩尔比为约50％-约99.5％，且衍生的丙烯酰基或甲基丙烯酰基-羧酸共聚单体的摩尔比为约0.5％-约50％，其中所述摩尔比的总和是100％。
7.权利要求3的合成共聚物，其中N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚单体的摩尔比为约50％-约90％，且亲水性共聚单体的摩尔比为约5％-50％，且衍生的丙烯酰基或甲基丙烯酰基-羧酸共聚单体的摩尔比为约0.1％-约15％，其中所述摩尔比的总和是100％。
8.权利要求1-8之一的合成共聚物，其中所述一或多种N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚单体选自N-甲基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺(NiPAAm)、N-辛基丙烯酰胺、N-环己基丙烯酰胺、N-甲基-N-乙基丙烯酰胺、N-甲基甲基丙烯酰胺、N-乙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、N，N-二甲基甲基丙烯酰胺、N，N-二乙基甲基丙烯酰胺、N，N-二环己基丙烯酰胺、N-甲基-N-环己基丙烯酰胺、N-丙烯酰吡咯烷、N-乙烯基-2-吡咯烷酮、N-甲基丙烯酰吡咯烷及其混合物。
9.权利要求1-9之一的合成共聚物，其中所述一或多种亲水性共聚单体选自丙烯酸、甲基丙烯酸、2-羟乙基异丁烯酸酯(HEMA)、N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、2-(N，N-二甲基氨基)乙基丙烯酰胺、2-(N，N-二乙基氨基)乙基丙烯酰胺、N，N-二乙基甲基丙烯酰胺、2-(N，N-二甲基氨基)乙基甲基丙烯酰胺、2-(N，N-二乙基氨基)乙基甲基丙烯酰胺、2-乙烯基-N-吡咯烷酮、2-(N，N-二乙基氨基)乙基丙烯酸酯、2-(N，N-二甲基氨基)乙基丙烯酸酯、2-(N，N-二乙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯、2-(N，N-二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯及其混合物。
10.权利要求1-10之一的合成共聚物，其中所述一或多种丙烯酰基-或甲基丙烯酰基-羧酸共聚单体选自丙烯酸、甲基丙烯酸、或其取代后的形式，且所述可交联的部分是琥珀酰亚胺基团、咪唑、苯并三唑、对硝基苯酚或2-(N-吗啉代)乙磺酸。
11.权利要求2的合成共聚物，其包含N，N-二甲基丙烯酰胺和N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺。
12.权利要求3的合成共聚物，其包含N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸和N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺。
13.一种生物-合成基质，其包含(a)权利要求1-13之一的合成共聚物；(b)生物聚合物；和(c)含水溶剂，其中所述合成共聚物和所述生物聚合物通过所述侧可交联部分进行交联而形成水凝胶。
14.权利要求14的生物-合成基质，其中合成共聚物的量为约0.1％-约30％重量，生物聚合物的量为约0.3％-约50％重量，且含水溶剂的量为约20％-约99.6％重量。
15.权利要求14或15的生物-合成基质，其中所述生物聚合物选自胶原蛋白、变性的胶原蛋白、重组胶原蛋白、凝胶、纤维蛋白-纤维蛋白原、弹性蛋白、糖蛋白、藻酸盐(酯)、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、粘多糖(蛋白聚糖)及其衍生物。
16.权利要求14-16之一的生物-合成基质，其进一步包含一或多种生物活性剂。
17.权利要求17的生物-合成基质，其中所述一或多种生物活性剂通过所述侧可交联部分与所述合成共聚物共价结合。
18.权利要求18的生物-合成基质，其中所述生物活性剂包含具有YIGSR序列的五肽。
19.权利要求17的生物-合成基质，其中所述一或多种生物活性剂分散于所述基质中。
20.权利要求14-20之一的生物-合成基质，其还包含许多分散在所述基质中的细胞。
21.权利要求14-21之一的生物-合成基质在需要的动物中作为组织再生的支架的用途。
22.权利要求14-21之一的生物-合成基质在需要的动物中取代损坏的或去除的组织中的用途。
23.权利要求23的用途，其中所述组织是皮肤或器官的一部分。
24.权利要求23的用途，其中所述组织是角膜或角膜的一部分。
25.权利要求14-21之一的生物-合成基质在包衣手术植入物中的用途。
26.一种组合物，其包含(a)一或多种生物活性剂；(b)权利要求1-13之一的合成共聚物；(c)生物聚合物；和(d)含水溶剂。
27.一种组合物，其包含(a)多个细胞；(b)权利要求1-13之一的合成共聚物；(c)生物聚合物；和(d)含水溶剂。
28.权利要求27或28的组合物，其中合成聚合物的量为约0.1％-约30％重量，生物聚合物的量为约0.3％-约50％重量，且含水溶剂的量为约20％-约99.6％重量。
29.权利要求27-29之一的组合物，其中所述生物聚合物选自胶原蛋白、变性的胶原蛋白、重组胶原蛋白、凝胶、纤维蛋白-纤维蛋白原、弹性蛋白、糖蛋白、藻酸盐(酯)、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、粘多糖(蛋白聚糖)及其衍生物。
30.权利要求27-30之一的组合物，其中所述合成共聚物和所述生物聚合物是交联的。
31.权利要求27-31之一的组合物，其中所述生物活性剂通过所述侧可交联部分与所述合成共聚物共价结合。
32.权利要求27-30或32之一的组合物，其被配制成可注射的溶液，其中所述合成共聚物和所述生物-聚合物能进行交联而在体内形成水凝胶。
33.权利要求27-32之一的组合物，其是预形成的水凝胶。
34.用于组织改造的植入物，其包含预形成的生物-合成基质，所述基质包含含水溶剂和与权利要求1-13之一的合成共聚物交联的生物聚合物。
35.权利要求35的植入物，其中所述生物-聚合物选自胶原蛋白、变性的胶原蛋白、重组胶原蛋白、凝胶、纤维蛋白-纤维蛋白原、弹性蛋白、糖蛋白、藻酸盐(酯)、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、粘多糖(蛋白聚糖)及其衍生物。
36.权利要求35或36的植入物，其中合成聚合物的量为约0.1％-30％重量，生物-聚合物的量为约0.3％-50％重量，且含水溶剂的量为约20％-99.6％重量。
37.权利要求35-37之一的植入物，其中所述生物-合成基质支持神经向其内生长。
38.权利要求35-38之一的植入物，还包含一或多种生物活性剂。
39.权利要求39的植入物，其中所述生物活性剂通过所述侧可交联部分与所述合成共聚物共价结合。
40.权利要求35-40之一的植入物，还包含许多分散在所述基质中的细胞。
41.权利要求41的植入物，其中所述细胞是干细胞或前体细胞。
42.权利要求35-40之一的植入物作为人工角膜的用途。
43.制备合成共聚物的方法，包括(a)在引发剂存在的条件下，将一或多种N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚单体、一或多种亲水性共聚单体以及经衍生含有侧可交联部分的一或多种丙烯酰基-或甲基丙烯酰基-羧酸共聚单体分散在溶剂中；(b)使所述一或多种N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚单体、一或多种亲水性共聚单体以及一或多种丙烯酰基-或甲基丙烯酰基-羧酸共聚单体发生聚合以形成合成共聚物，和(c)可选地纯化所述合成共聚物。
44.制备生物合成基质的方法，包括以下步骤(a)通过权利要求44的方法制备合成共聚物；(b)将所述合成共聚物和生物-聚合物分散到含水培养基中；和(c)使得所述合成共聚物和所述生物-聚合物交联以提供所述生物-合成基质。
45.权利要求44或45的方法，其中所述N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚单体和亲水性共聚单体是相同的。
46.权利要求44或45的方法，其中所述N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚单体和亲水性共聚单体是不同的。
47.权利要求45的方法，还包括在步骤(b)之前混合所述合成共聚物与一或多种生物活性剂，并使得所述生物活性剂通过所述侧可交联部分与所述合成共聚物发生交联。
48.权利要求45的方法，还包括将所述合成共聚物和所述生物聚合物与步骤(b)的许多细胞混合。
49.通过权利要求44的方法制备的合成共聚物。
50.通过权利要求45的方法制备的生物-合成基质。
全文摘要
一种包含水凝胶的生物－合成基质，其通过将合成聚合物与生物－聚合物进行交联而形成。所述基质是坚固、生物相容且是非细胞毒性的，并且能够在体内支持细胞向内生长。所述基质还可经改造以进一步包含一或多种生物活性剂。所述基质还包含包裹或分散于其中的细胞，所述细胞能在将所述基质置于体内时增殖。还提供了制备所述生物合成的基质的方法以及所述基质在体内组织改造或药物递送中的用途。
文档编号A61L27/34GK1688622SQ03824050
公开日2005年10月26日 申请日期2003年8月11日 优先权日2002年8月9日
发明者梅·格里菲斯, 戴维·J·卡尔森, 李凤富 申请人:渥太华健康研究所, 加拿大国立研究院