在肾过滤和肾通道中显示出溶酶体降解抗性的抗微生物带电聚合物、组合物和其使用方法

专利名称：在肾过滤和肾通道中显示出溶酶体降解抗性的抗微生物带电聚合物、组合物和其使用方法
1.发明领域本发明涉及使用硫酸化多糖治疗或预防哺乳动物中微生物感染的方法。更特别地，本发明涉及将治疗有效量的具有一定硫酸化百分比范围的带电和柔性硫酸化多糖导入病人的血流、淋巴系统和/或细胞外间隙以治疗、预防或处理微生物感染的方法。具体地，其中该范围对硫酸根基团和导致感染的微生物之间的最大相互作用是有效的，并且其中该硫酸化的多糖基本上不通过哺乳动物细胞受体结合而被内吞或降解，并从而在体内保持抗微生物活性。
2.发明背景带电的多糖，尤其是硫酸化多糖，已经在体外表现出强烈的抗微生物活性(Baba等人，Antiviral Res 9335-343，1988；Ito等人，Antiviral Res.7(36)1-367，1987)。例如，已经报导在体外硫酸化多糖如硫酸葡聚糖、肝素和多硫酸戊聚糖是HIV、副粘病毒、巨细胞病毒、流感病毒、semlikiviruses(Liische-Mattti等人，ArchYirol 130317-326，1993)和单纯疱疹病毒(Baba等人，Antimicrob.Agents Chemotherapy 321742-45，1988；Pancheva，AntiviralChem Chemotherapy 4189-191，1993)的强力抑制剂。然而，这些已知的化合物在体内具有令人失望的弱活性。
Ito.等人，Antiviral Res.7361-367，1987、Deringer等人(US5,153,181)和Ueno和Kuno，Lancet 2796-97，1987首先报导硫酸葡聚糖和肝素体外抑制HIV的复制。后来，一些其他硫酸化的多肽在认为是它们各自的毒性阈值下的浓度表现出抑制HIV复制，例如，硫酸戊聚糖(Baba等人，Antiviral Res 9335-343，1988；Biesert等人，Aids 2(6)449-57，1988)、岩藻依聚糖(Baba等人，Antiviral Res9335-343，1988)、λ-、κ-和ι-角叉藻聚糖(Baba等人，AntiviralRes 9335-343，1988)、硫酸蘑菇多糖(Yoshida等人，Biochem.Pharmacol.37(15)2887-91，1988)、硫酸甘露聚糖(Ito等人，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.8191-193，1989)、硫酸糊精(Ito等人，Antiviral Chem.Chemother.，241-44，1991)、sulfoevernan(Weiler等人，J Gen Virol 711957-1963，1990)、和硫酸环糊精(Schols等若那，J Acquired Immune Def.Syndr4677-BS，1991.)。然而，已经证明这些化合物在体内都是无效的，并且在高浓度导致血小板减少、中枢神经系统副作用、脱发、胃肠道疼痛、抗-凝固，等(Flexner等人，Antimicrob Agents Chemotherapy352544-2550，1991；Abrams等人，Annals of Internal Medicine(1989)110183-188；Hiebert等人，J.Lab & Clin.Med.133161-170(1999))。
一些硫酸化多糖化合物也已经表现出抗细菌活性(Dalton等人，Bur J Biochem 195179-184，1991；Zarcha等人，CurrentMicrobiol.346-11，1997；Pancake等人，J Cell Biol1171251-1257，1992；Clark等人，Glyco J 14473-9，1997)、抗衣原体活性(Herold等人，Antimicrobial Agents andChemotherapy 412776-2780，1997，和Su和Caldwel，Infectionand Immunity 661258，1991)和抗寄生虫活性。再次，在体外观察到抗微生物活性和抗寄生虫活性，但是证明这些化合物在体内是无效的(Dalton等人，Eur J Biochem 195179-184，1991；Pancake等人，J Cell Bil 1171251-1257，1992；Clark等人，Glyco J14473-9，1997)。
常规的或者商业的硫酸葡聚糖的硫酸化百分比为约17-22％。已公认增加硫含量就增加该物质的活性。例如，增加硫含量增加抗-凝固活性(Hirata等人.，Biosci.Biotech.Biochem.58(2)406-407，1994)。类似地，已公认增加硫酸化多糖的硫含量增加了它们的体外抗细菌活性。见，例如，Witvrouw等人.，General Pharmacology 29(4)497-512，1997；Nakashima等人，Jpn. J.CancerRes.(Gann)781164-6，1987；和Baba等人，J AIDS 493-499，1990。这些研究再次证明随着硫酸化的增加，硫酸化多糖的体外活性的显著增加，尽管仍然缺乏体内效能。实际上，体内效能的缺少和高程度硫酸化化合物的体内毒性已经是到现在为止无法解决的问题。
尽管对用于特定用途的低硫酸化百分比的硫酸化多糖的研究已有一定数量，但是还没有对这些物质的分子量和它们的硫酸化百分比进行表征。重要的是，已经报导这些物质抗逆转录病毒的活性比用17-22％硫酸化的多糖的活性弱。此外，已经在动物中研究了未良好表征(如果表征)的低分子量制剂抗疱疹病毒的活性，如BP申请0 066 379A2中，取得了有限的成功。还见，Pancheva SN.Antiviral ChemChemotherapy 4189-191，1993。
硫酸葡聚糖在体内无活性的一个主要原因是该物质是不稳定的。以前已经公布了该原因的某种迹象。氚标记的硫酸葡聚糖mw8,000在大鼠的血液循环中6-24小时内似乎被解聚(Hartman NR，Johns DG，Mitsuya H.AIDS Res Hum Retroviruses 6805-811，1990)。碘化的肝素和多硫酸戊聚糖从人体循环被快速清除并返回去硫酸化形式(MacGregor IR，Dawes J，Paton L，Pepper DS，Prowse CV，SmithM.，Thromb Haem 51321-325，1984)。
大量的努力集中在通过增加硫酸葡聚糖的硫酸化提高其体内抗病毒活性或者改变常规物质的用途。在一个研究中，考虑到所报导的口服硫酸葡聚糖的差吸收，将硫酸葡聚糖通过连续灌输以最大耐受剂量施用于有HIV感染症状的受试者长达14天(Flexner等人，AntimicrobAgents Chemotherapy 352544-2550，1991)。发现硫酸葡聚糖的连续静脉内灌输是有毒的。作者断定由于其毒性和缺乏具有体内有益效果的任何证明，硫酸葡聚糖在HIV的治疗中不可能具有有益效果。实际上，作者警告“肠胃外硫酸葡聚糖作为症状性HIV感染的治疗的进一步临床研究是没有正当理由的并且可以证明是有害的。基于该研究的结果，建议在其他多硫酸化聚阴离子的临场评价中要小心”(Id.2549)。
在肾小球内皮细胞处理硫酸葡聚糖的一个主要研究中，申请人发现硫酸葡聚糖结合一种细胞表面受体，该受体将通常识别高度硫酸化的多糖如类-肝素的多糖。结合时，硫酸葡聚糖被内吞、被溶酶体硫酸酯酶去硫酸化但是不被解聚，并作为去硫酸化的硫酸葡聚糖被胞吐(Vyas等人，Arch Biochem Biophys.332(2)205 12，1996)。发现硫酸葡聚糖被细胞吸收和内吞严重依赖于硫含量或者每个葡萄糖残基硫酸化置换的程度。被肾小球上皮细胞高于13％的硫吸收是显著的而低于13％的硫吸收和内吞是最小的。这表示沿着多肽链具有尤其临界硫含量或者临界硫酸置换电荷密度的带电多糖可能被循环所暴露的细胞不同地加工。如果身体中，尤其是HIV产生占优势的淋巴管中的任何器官模拟细胞受体识别、内吞和降解过程，那么该器官将在体内使作为抗病毒药物的硫酸葡聚糖失活。高度硫酸化物质，如含有17-20％硫的商业硫酸葡聚糖，可被细胞快速吸收，去硫酸化并使得失去抗病毒活性，而更低的硫酸化物质可能不被细胞吸收并保留它们的抗病毒活性。
总之，尽管商业化硫酸葡聚糖以前已经在日本被用于抗凝固和高脂血症，但是其已经表现出体内抗HIV的弱活性或者，已经报导硫酸葡聚糖在哺乳动物和HIV患者中有严重毒性(Mathis等人.，Antimicrobial Agents & Chemotherapy 2147-2150，1991；Flexner等人，Id.2544-2550；Abrams等人，Annals of Internal Medicine110183-188(1989)；Hiebert等人.，J Lab & Clin.Med.133161-170(1999))。从而，仍然需要体内激活硫酸葡聚糖抗病毒和其他感染的活性的方法。
虽然过去广谱体外活性使得硫酸化多糖有吸引力作为抗微生物候选药物，但是仍然需要对治疗或预防病毒感染、细菌感染和寄生虫感染体内有效的硫酸化多糖。
3.发明概述本申请人已经发现降低和控制柔性多糖的硫酸化程度，和任选控制分子量，产生了一种同时具有体外和体内抗微生物活性的组合物。这种组合物可用于方法中以治疗、预防或处理微生物感染而减少或避免不利作用，例如，与常规硫酸化多糖的口服或肠胃外施用有关的毒性。更特别地，本申请人已经发现具有受控的硫酸化范围，例如，％硫高于6％和低于13％的硫酸化α-1，6-多糖的制剂具有体内抗微生物感染的活性。
这样，本发明包括治疗的新方法和利用与常规硫酸葡聚糖相比具有低硫酸化百分比的这种硫酸化多糖的新药物组合物。例如，本发明包括硫酸化多糖，其相对于简单糖残基的硫百分比大于6％并且小于13％，优选大于约7％并且小于13％，更优选大于约9％并且小于13％，最优选6％、7％、8％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.2％、12.5％、12.8％或12.9％。硫酸化多糖优选为具有α-1，6-糖苷键的硫酸化葡聚糖。
本发明还包括分子量为500到1,000,000，优选高于5,000；更优选高于25,000；最优选高于40,000，尤其用于经口或肠胃外施用的硫酸化多糖。本发明还包括5,000到1,000,000、25,000到500,000和40,000到300,000的范围。然而，对于局部施用，在一个优选的实施方案中，该硫酸化多糖可以具有高于500,000的分子量。在备选的实施方案中，该组合物的分子量仅有约10％的可变性，优选约5％的可变性。
在本发明的优选实施方案中，该硫酸化多糖不是硫酸纤维素、硫酸糊精或环糊精，而是α-1，6-硫酸化多糖，如具有受控的硫酸化范围，任选特定分子量范围的硫酸化葡聚糖。在备选实施方案中，该硫酸化多糖关于分子量、硫酸化百分比或两者是均一的。
在本发明的一方面提供了将治疗有效量的硫酸化多糖或者其盐导入哺乳动物的血流、淋巴系统和/或胞外空间组织的方法，该方法包括对该哺乳动物施用具有体外抗微生物活性并且具有足够保持体内抗微生物活性的硫酸化百分比的至少一种硫酸化多糖或者其药学上可接受的盐或其水合物。优选地，该多糖的硫酸化范围有效使得组成性硫酸根基团与导致感染的微生物之间的相互作用最大，并且其中在哺乳动物中硫酸化多糖基本上不通过细胞受体结合而被内吞或降解，从而在体内保持抗微生物活性。
在本发明的另一方面，提供了治疗或预防微生物感染的方法，该方法包括对患者施用治疗有效量的硫含量大于6％并且低于13％的硫酸化葡聚糖。在优选的实施方案中，硫酸化葡聚糖的硫酸化百分比高于或者约6％或高于6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.2％、12.5％、12.8％或小于13％。在优选的实施方案中，该方法用于治疗或预防病毒感染，包括但不限于DNA病毒和RNA病毒，尤其是有包膜的DNA或RNA病毒。在另一优选的方法中，所要治疗的病毒包括但不限于双链DNA病毒、DNA逆转录病毒、RNA逆转录病毒、双链RNA病毒、负义单链RNA病毒，和正义单链RNA病毒。
在本发明的另一方面，提供了合成多糖，或者减少或增加硫酸化程度从而硫酸化多糖适于体内施用并且体内有效抵抗病毒感染的方法。该方法包括提供具有一定硫酸化百分比的硫酸化多糖，该硫酸化百分比足够消除或减小被高电荷密度的聚阴离子细胞受体结合和内化，或者体内使这些化合物失活，但是足够提供抗微生物活性；和将该硫酸化多糖施用于哺乳动物。换句话说，本发明包括将天然发生的或者通过商业途径可得到的硫酸化多糖的硫酸化修饰至使得与微生物的相互作用最大化并且其中该硫酸化多糖基本上不通过细胞受体结合而被内吞或降解的硫酸化范围。
本发明的单独方面包括适于肠胃外施用于患者的药物组合物，其含有治疗上或者药学上可接受量的本发明的硫酸化多糖；还涉及含有治疗上或者药学上可接受量的本发明的硫酸化多糖的适于经口施用于患者的药物组合物；和分子量大于500,000含有治疗上或者药学上可接受量的本发明的硫酸化多糖的适于局部施用于患者的药物组合物。
应该指出本发明还包括本发明的硫酸化多糖作为消毒剂的用途，其可用于医院、实验室、厕所、礼堂、体育场、会议中心、餐馆、健康中心、地铁终点站、公共汽车总站、机场、邮局、办公室、污水处理设施、下水道、水处理设施、泵站、汽车、飞机、火车、家庭、柜和家具中无生命物体的消毒以防止病毒或疾病的扩散。本发明还包括消毒组合物如含有一种或多种此处描述的硫酸化多糖的溶液剂、喷雾剂、肥皂、泡沫液。
下面详细描述本发明的方法包括的微生物感染，尤其是所要治疗的特定病毒和所要使用的特定硫酸化葡聚糖。
3.1定义如此处所用的，术语“患者”或“受试者”指动物(例如，奶牛、马、绵羊、猪、鸡、火鸡、鹌鹑、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠，等)，优选哺乳动物如非灵长类和灵长类(例如，猴和人)，最优选人。在一些实施方案中，患者是婴儿、儿童、青少年、成人或老年患者。此外，患者包括无免疫应答的患者如HIV阳性患者、癌症患者和经历免疫治疗的患者。
如这里所用的，“治疗有效量”指本发明化合物或其他活性成分的量，该量在疾病的治疗或处理中足够提供益处，以延迟或最小化与该疾病相关的症状，或者治疗或改善该感染或疾病或者其原因。具体地，治疗有效量指足够提供体内治疗益处的量。此外，治疗有效量指本发明化合物单独或者与其他治疗剂组合的量，该量在疾病的治疗或处理中足够提供益处，以延迟或最小化与该疾病相关的症状，或者治疗或改善该感染或疾病或者其原因。另外，治疗有效量指在疾病的治疗或处理中足够提供益处而对患者没有毒性的治疗剂的量。与本发明的化合物的量关联使用，该术语包括改善总的治疗，减少或者避免疾病的症状或原因，或者增强另一种治疗剂的功效或者与该治疗剂协同作用的量。
如此处所用的，“预防有效量”指足够导致感染或疾病的复发或扩散的预防的本发明化合物或者其他活性成分的量。预防有效量可以指足够防止患者(包括但不限于易患该疾病的那些人)中首次感染或首次疾病或者感染或疾病的复发或扩散或者该疾病的发生的量。具体地，关于本发明化合物的预防有效量指在体内足够导致感染或疾病的复发或扩散的预防的量。预防有效量还可以指在感染或疾病的预防中提供益处而对患者无毒的量。此外，关于本发明化合物的预防有效量指在单独，或者与其他试剂组合，在感染或疾病的防止中提供预防益处的量。与根据本发明的化合物的量关联使用，该术语包括改善总的预防或者增强另一种预防剂或治疗剂的预防性效能或者与其协同作用的量。
如此处所用的，“组合”指同时或顺序地使用一种或一种以上的预防和/或治疗剂并且以它们各自的效果是相加的或协同的方式使用。
如此处所用的，术语“处理”指延缓或防止疾病的发展或恶化但不治愈该疾病。
如此处所用的，术语“防止”指由于疾病或感染发生前使用活性组分而导致该疾病的发作、复发、或扩散的防止。
如此处所用的，术语“治疗”指消灭或改善疾病或感染自身、该疾病的原因，或者与该疾病相关的症状。在一些实施方案中，该术语指由于对患有这种疾病或感染的受试者施用一种或多种预防剂或治疗剂而最小化疾病或感染的扩散或恶化。
如此处所用的，术语“药学上可接受的盐”指从药学上可接受的无毒酸或碱制备的盐，这些酸或碱包括无机酸和碱与有机酸和碱。本发明化合物的适宜的药学上可接受的碱加成盐包括，但不限于，铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制备的金属盐或者赖氨酸、N，N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、乙二醇胺、乙二胺、甲葡胺(N-甲基葡糖胺)和普鲁卡因制备的有机盐。
如这里所用的并且除非另外说明，术语“光学纯”或者“立体异构纯”指含有化合物的一种立体异构体并且基本没有该化合物的其他立体异构体的组合物。例如，具有一个手性中心的立体异构纯的化合物基本上没有该化合物的相反对映异构体。典型的立体异构纯的化合物含有按重量计约80％以上的该化合物的一种立体异构体和按重量计约20％以下的该化合物的其他立体异构体，更优选按重量计约90％以上的该化合物的一种立体异构体和按重量计约10％以下的该化合物的其他立体异构体，甚至更优选按重量计约95％以上的该化合物的一种立体异构体和按重量计约5％以下的该化合物的其他立体异构体，最优选按重量计约97％以上的该化合物的一种立体异构体和按重量计约3％以下的该化合物的其他立体异构体。由于本发明的化合物有可以以D或L形式存在的糖制成的多糖，所以本发明包括D或L糖或者D和L糖。同样地，例如，立体异构纯的D糖将基本无L形式。在备选的实施方案中，硫酸化葡聚糖的L形式的使用允许使用约6％到约20％的更宽的控制硫酸化范围。从而，在备选实施方案中此处公开的方法和组合物包括使用这种左旋糖或者从其制成的聚合物。
如此处所用的，术语“硫酸化多糖”指具有10个单位以上简单糖的硫酸化物质。优选地，硫酸化多糖是α(1，6)连接的多糖。本发明的硫酸化多糖还优选足够具有体外和体内活性而无显著毒性的硫百分比。
如此处所用的，术语“葡聚糖”指含有主要通过α-D(1，6)连接的D-葡萄糖单元的骨架的多糖，其仅由仅仅在分枝程度和链长度上不同的α-D-吡喃葡萄糖基单元组成。
如此处所用的，术语“硫酸葡聚糖钠”或“硫酸葡聚糖”、“常规硫酸葡聚糖”或“商业的硫酸葡聚糖”除非另外限制，指含有每个葡萄糖分子具有17％硫高达3个硫酸根基团，具有可变的分子量范围，例如4,000-500,000Da的α1，6-多聚葡萄糖。
如此处所用的，术语“硫酸化百分比”、“硫酸根取代的百分比”或者“硫酸化”指按分子量计，相对于所讨论的多糖(任选包括平衡离子)内每个简单糖残基的硫的百分比，任选包括平衡离子，例如，组合物中硫酸化的分子量/总重量。在优选实施方案中，硫的百分比被计算为关于以钠作为平衡离子的所讨论多糖内硫酸化糖残基的按分子量计硫的百分比。通过物质的元素分析可以确定硫酸化的百分比，该物质已经被透析以除去游离的硫，该物质优选为在真空中60℃干燥至恒重的无水分/挥发物的物质。确定硫酸化百分数的其他方法是通过水分含量分析和滴定。硫酸化将有别于“取代程度”或“当量”，“取代程度”或“当量”是对每个糖部分硫酸根基团数目的量度。然而，本领域技术人员将认识到硫酸化百分比可被转化成取代程度或当量并且反之亦然。
如此处所用的，术语“共带电的葡聚糖聚阴离子”是被羧甲基基团、硫酸根基团和磺酸根基团的任何组合不同程度取代的葡聚糖。
如此处所用的，术语“高碘酸盐处理的阴离子多糖”指已经用高碘酸盐处理打开糖环而不解聚或者增加多糖的柔性以增加与微生物的相互作用的阴离子多糖。
如此处所用的，术语“抗微生物的”包括抗病毒的、抗细菌的，如，例如，抗衣原体、抗寄生虫的，如抗疟原虫属或抗真菌的。
4.附图简述

图1显示随着时间变化，Sprague-Dawley大鼠血浆(n＝3)中循环血浆商业硫酸葡聚糖的脱硫酸化的量。长达24小时的值是基于在0时间大丸剂静脉内注射后血浆中存在的硫酸葡聚糖。168小时处的平均值从皮下植入Sprague-Dawley大鼠中的稳定态渗透泵得到。
图2显示了在时间0处大丸剂静脉内注射(172mg/kg)后对时间的多糖物质的有效抗病毒活性浓度。组1商业硫酸葡聚糖，mw＝40,000(n＝1-3)；组2商业硫酸葡聚糖，mw＝500,000(n＝3)；组3硫酸化葡聚糖12.6％(DES 6 40k)(N＝4-6)；组4硫酸化葡聚糖12.2％(DES6 500k)(N＝6)；组5DES 6 40k以172/kg/天每日注射，持续6天(n＝4)。
图3是描述制备具有特定硫酸化百分比和分子量的硫酸化葡聚糖的示意性流程图。
图4是用线性氯化钠梯度从阳离子交换树脂洗脱的离子交换层析的40,000mw的氚标记的硫酸化葡聚糖层析图谱，其显示出硫酸盐取代程度的高度均一性。
图5是用线性氯化钠梯度从阳离子交换树脂洗脱的离子交换层析的500,000mw的氚标记的硫酸化葡聚糖层析图谱，其显示出硫酸盐取代程度的高度均一性。
5.发明详述在本发明的一个实施方案中，本申请人已经发现怎样显著增加某些硫酸化多糖抗微生物感染，尤其是病毒感染的体内效能，而减少或避免常规硫酸化多糖的不利的、不需要的或毒性作用。通过控制多糖的硫酸化百分比从而其处于大于6％但是低于13％的范围内部分完成了该目的。此外，本发明在备选实施方案中还包括控制分子量和/或硫酸化百分比以得到具有显著的体内效能而无显著毒性的硫酸化多糖。本发明的最优选组合物或方法使用了具有所希望的硫酸化百分比和/或分子量的硫酸化α-1，6-连接的多糖或者硫酸化葡聚糖，它们具有柔性并从而可用于抵抗各种病毒。在最优选的实施方案中，硫酸化百分比的范围能使得组成性硫酸根基团与导致感染的微生物之间能够最大相互作用，并且其中硫酸化多糖基本上不通过哺乳动物中细胞受体结合而被内吞或降解，并从而保持体内抗微生物活性。
本申请人还发现合成更低硫酸化多糖或者降低硫酸化多糖如常规硫酸葡聚糖的电荷密度的程度，消除了或者至少显著降低了高电荷密度聚阴离子的细胞受体(例如，肾中)对硫酸化多糖的结合和内化，并从而消除或显著减少了这些化合物体内脱硫酸化。结果，具有低电荷密度的这些硫酸化多糖保持它们的体内抗微生物活性。这第一次使得能够在人体中全身性、局部、经口或直肠地体内使用稳定的硫酸化多糖(其具有显著的体外抗微生物活性)以治疗或防止微生物疾病或感染。
从而，本发明包括使用硫酸化多糖或其药学上可接受的盐、水合物或其立体异构体体内治疗、预防或处理微生物感染，尤其是病毒感染、细菌感染、寄生虫感染或者真菌感染的方法，与常规的硫酸葡聚糖相比，该硫酸化多糖或其药学上可接受的盐、水合物或其立体异构体具有结构柔性、受控的硫酸化程度和任选关于其分子量的均一性，以及低程度的硫酸化。
本发明还提供了治疗、预防或处理微生物感染的方法，该方法包括对需要该治疗、预防或处理的患者施用治疗或预防上有效量的具有大于6％到低于13％硫酸化的硫酸化多糖或其药学上可接受的盐、水合物或立体异构体。如上面所提到的，这种硫酸化多糖在感染性疾病或病症的治疗中尤其有效，这些感染性疾病或病症包括，但不限于，病毒感染、细菌感染、寄生虫感染，或真菌感染。
不被任何理论限制，用于根据本发明的方法和组合物中的硫酸化多糖和其药学上可接受的盐、水合物或异构体具有足够产生人体中该化合物的体内抗微生物活性的硫酸化百分比，但是该硫酸化百分比被控制而使得化合物能够在穿过肾之后逃脱高电荷密度聚阴离子的细胞受体的结合和脱硫酸化。这导致保持体内抗微生物活性而没有毒性或副作用。
不被任何特定理论限制，本申请人相信有一个硫酸化多糖的电荷密度范围，在该范围内硫酸化多糖显示出体外抗微生物活性并保留它们的体内抗微生物活性。在本发明的优选实施方案中，本发明的硫酸化多糖具有大于6％并低于13％，优选大于约7％并低于13％，更优选大于约8％和12.5％，最优选9％、9.5％、10％，10.5％、11％、11.5％、12％、12.2％、12.5％或12.8％，±1％以内。
用于本发明方法中的优选的硫酸化多糖是硫酸化葡聚糖，或者α-1，6-连接的多糖，其已经被修饰而具有适宜的硫酸化百分比。本发明的硫酸化葡聚糖含有小于13％，并且可含有小于12％、小于11％、小于约10％、小于9％、小于8％、小于7％，但是大于6％的硫。在优选的实施方案中，该硫酸化葡聚糖变体的硫酸化小于13％并大于6％，更优选地，从约7.0％到约12.8％，甚至更优选从约8.5％到约12.8％，最优选地，从约9.5％到小于13％。具有约12.2％和约12.5％的硫酸化的硫酸化葡聚糖对抗逆转录病毒感染尤其有效。
本发明的硫酸化多糖，尤其是硫酸化葡聚糖，可以使用公知的合成技术和试剂制备。可以修改本领域中公知的一些方法从而实现适当程度的硫酸化。这些方法包括图3中描述的那些方法。然而，如上面提到的，可以控制分子量以及硫酸化程度。申请人已经合成了具有受控的硫含量和受控的硫酸盐取代程度的硫酸化葡聚糖，从而它们不被针对高度带电的多糖的细胞受体摄取。这些多糖显示出与体外基本相同的高体内抗病毒活性并且在体内具有更强的稳定性和更长的寿命，由于它们不易被细胞吸收，所以它们的毒性也更小。具有受控的硫含量的硫酸化葡聚糖尤其适于作为病毒细胞附着抑制剂，因为该硫酸化葡聚糖具有独特结构(由α-1，6-糖苷键组成的基本线性链使得其成为更有柔性的多糖)，其使得组成性硫酸根基团与病毒蛋白上的正电荷能够最大相互作用但是不显著结合包括白蛋白的血浆蛋白。
在另一个备选实施方案中，本发明包括使用均一的硫酸化多糖。就是说根据这里描述的方法施用或者用于药物组合物和剂型中的硫酸化多糖显示出大体上相同的硫酸化百分比或分子量或两者。
在分开的实施方案中，本发明包括治疗或预防哺乳动物中微生物感染的方法，该方法包括对有这种需要的哺乳动物施用治疗有效量的含有硫酸化多糖的组合物，该多糖中每个葡萄糖残基的硫酸盐取代百分比为大于6％到小于13％，其中硫酸化百分比范围能使得组成性硫酸根基团与导致感染的微生物之间能够最大相互作用，并且其中在哺乳动物中硫酸化多糖基本上不通过细胞受体结合而被内吞或降解，从而保持体内抗微生物活性。优选地，硫酸化多糖是硫酸化葡聚糖。
本发明还包括抗炎性疾病或失调、间质性膀胱炎和抗关节炎疾病的治疗、预防或处理。本发明还包括使用本发明的硫酸化多糖作为抗蛋白尿剂(在肾病中发生的蛋白尿)。
本发明还包括治疗或防止哺乳动物中微生物感染的方法，该方法包括对需要这种治疗或预防的哺乳动物施用有效量的左旋硫酸化多糖，该左旋硫酸化多糖具有从约6％到约20％；优选从约6％到约13％；更优选从约9％到约13％的硫酸化百分比。
在另一实施方案中，本发明包括治疗或防止哺乳动物中微生物感染的方法，该方法包括对需要这种治疗或预防的哺乳动物施用有效量的高碘酸盐-处理的阴离子多糖。优选地，高碘酸盐处理的阴离子多糖是高碘酸盐处理的硫酸化葡聚糖。
在本发明的另一实施方案中，本发明包括本发明包括治疗或防止哺乳动物中微生物感染的方法，该方法包括对需要这种治疗或预防的哺乳动物施用有效量的共带电的阴离子多糖，其硫酸化百分比使得与微生物的相互作用最大，并且其在哺乳动物中基本上不通过细胞受体结合而被内吞或降解，从而保持体内抗微生物活性。在优选的实施方案中，共带电的阴离子多糖通过羧甲基、磺酸根基团、硫酸根基团或它们的组合共带电；更优选地，通过羧甲基使共带电的阴离子多糖共带电。在特定实施方案中，共带电的阴离子多糖是羧甲基硫酸葡聚糖或羧甲基纤维素。
5.1治疗、预防和处理微生物感染的方法在一个实施方案中，用本发明的化合物和方法治疗、预防或处理的微生物感染是病毒感染。可以通过本发明的方法治疗、预防或处理的病毒感染包括，但不限于DNA和RNA病毒。在本发明范围内的DNA和RNA病毒包括，但不限于双链DNA病毒、单链DNA病毒、DNA逆转录病毒、RNA逆转录病毒、双链RNA病毒、负义单链RNA病毒、正义单链RNA病毒，和双义RNA病毒。在一个特定实施方案中，该方法和组合物可用于治疗、预防或处理无包膜病毒的感染，这些无包膜病毒，包括但不限于，细小核糖核酸病毒、杯状病毒、星状病毒、呼肠孤病毒、双RNA病毒、圆环病毒、细小病毒、乳多空病毒、和腺病毒。
在优选的特定实施方案中，该方法和组合物可用于治疗、预防或处理包膜病毒的感染，这些包膜病毒包括但不限于，披膜病毒、黄病毒、弹状病毒、线状病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼亚病毒、沙粒病毒、逆转录病毒、嗜肝DNA病毒、疱疹病毒、痘病毒、虹彩病毒、和动脉病毒。
通过本发明的方法可以治疗、预防或处理的特定包膜双链DNA病毒包括，但不限于，疱疹病毒B病毒(猴疱疹病毒1)、牛痘病毒、Epstein-Barr病毒(人疱疹病毒4)、乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和-2)、人巨细胞病毒(人疱疹病毒5)、人疱疹病毒6A、6B和7、传染性软疣病毒、猴痘病毒、假牛痘病毒、塔纳痘病毒、痘苗病毒、水痘-带状疱疹病毒、天花病毒(天花病毒)、非洲猪热病病毒、牛mamillities病毒、牛丘疹性口炎病毒、蛇头素疱疹病毒1、牛痘病毒、缺肢病毒(鼠痘病毒)、马流产病毒(EHV1)、马性交疹病毒、马鼻肺炎病毒(EHV4)、纤维瘤病毒(兔、野兔和松鼠的)、蛙病毒1-3、5-24、L2、L4和L5、禽痘病毒、金鱼病毒1-2、传染性牛鼻气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒(家禽)、淋巴囊肿病病毒(鱼)、马立克氏病病毒(家禽)、Movar疱疹病毒、粘液瘤病毒、口疮病毒(传染性小脓疱皮炎病毒)、假牛痘病毒(挤奶者结节病毒)、假狂犬病病毒、绵羊痘病毒、猪痘病毒、亚巴痘病毒，和旱獭肝炎病毒。
通过本发明的方法可以治疗、预防或处理的特定无包膜双链DNA病毒包括，但不限于，腺病毒1-49、猿腺病毒1-27、牛腺病毒1-9、猪腺病毒1-4、绵羊腺病毒1-6、马腺病毒1-2、鼠腺病毒1-2、BK病毒、JC病毒、K病毒(兔)、兔肾空泡病毒、乳多空病毒1-60、猿病毒12(SV12)、猿病毒40(SV40)、牛乳多空病毒1、2和4、犬口乳多空病毒、犬腺病毒2、马乳多空病毒、绵羊乳多空病毒、马腺病毒、胎恒河猴肾病毒、传染性犬肝炎病毒、小鼠多瘤病毒、非洲绿猴B-嗜淋巴细胞多瘤病毒，和Shope乳多空病毒。
通过本发明的方法可以治疗、预防或处理的特定无包膜单链DNA病毒包括，但不限于，细小病毒B-19、RA-1病毒、阿留申貂病病毒、犬细小病毒、貂肠炎病毒、小鼠小病毒、鸡贫血病毒、鹦鹉喙和羽毛病病毒，和猪圆环病毒。
通过本发明的方法可以治疗、预防或处理的特定无包膜单链正义RNA病毒包括，但不限于，柯萨奇病毒A1-21和A24、柯萨奇病毒B1-6、艾可病毒1-7、9、11-27和29-34、肠道病毒68-71、甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、诺沃可和类似病毒(如南安普敦、雪山、夏威夷和Taunton病毒)、脊髓灰质炎病毒1-3、鼻病毒1-113、1A和1B、牛肠病毒1-7、脑心肌炎病毒、猫杯状病毒、口蹄疫病毒、小鼠脊髓灰质炎病毒(泰勒病毒)、鼠脑脊髓炎病毒、猪肠道病毒1-8、牛肠道病毒1-7、猿肠道病毒1-18、兔出血病病毒、猪泡状病病毒、水疱疹病毒1-12(猪)、黑猩猩杯状病毒(Pan-1)、San Miguel海狮病毒1-8、欧洲棕兔病病毒、猫杯状病毒、犬杯状病毒、牛肠杯状病毒、猪肠杯状病毒、貂杯状病毒、爬行动物杯状病毒、海象杯状病毒、鸡杯状病毒、人星状病毒1-5、牛星状病毒1-2、绵羊星状病毒、猪星状病毒、犬星状病毒、和鸭星状病毒。
通过本发明的方法可以治疗、预防或处理的特定包膜单链正义RNA病毒包括，但不限于，Barmah森林病毒、中欧脑炎病毒、屈曲病毒、登革病毒1-4、东方马脑炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒1和2、人T-嗜淋巴细胞病毒1和2、Igbo Ora病毒、日本脑炎病毒、Kyasanur森林病毒、Mayaro病毒、墨累河谷脑炎病毒、O′nyong-nyong病毒、鄂木斯克出血热病毒、Rocio病毒、罗斯河病毒、风疹病毒、俄国春夏脑炎病毒、Semliki森林病毒、Sindbis病毒(和变种Ockelbo和Babanki病毒)、圣路易斯脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西尼罗河病毒、西方马脑炎病毒、黄热病病毒、鸟网状内皮细胞增生病病毒、鸟肉瘤和白血病病毒、边缘病病毒(绵羊)、牛免疫缺陷病毒、经典猪热病毒、东部马脑炎病毒、马流行性贫血病毒、猫免疫缺陷病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒、Getah病毒、猪瘟病毒、日本脑炎病毒、乳酸脱氢酶鼓起病毒(小鼠)、羊/魅敌病病毒(绵羊)、小鼠肝炎病毒、小鼠乳癌病毒、粘膜病病毒(牛)、鼠白血病病毒(包括Abelson、AKR、Friend)、Maloney白血病病毒、绵羊进行性肺炎病毒、劳斯肉瘤病毒、Rauscher鼠白血病病毒、猿免疫缺陷病毒(包括非洲绿猴、SootyMangabey、残尾猕猴、猪尾猕猴、猕猴、黑猩猩，和Mandrill病毒)、猿D型逆转录病毒、猿T-细胞嗜淋巴细胞病毒、蜱传脑炎病毒(包括欧洲和远东蜱传脑炎病毒、Louping ill病毒，和Powassan病毒)、Venezuelan马脑炎病毒、Wesselsbron病毒，和西方马脑炎病毒、卷毛猴肉瘤病毒。
通过本发明的方法可以治疗、预防或处理的特定包膜单链负义RNA病毒包括，但不限于，Alagoas病毒、布尼奥罗病毒、Bwamba病毒、加利福尼亚脑炎病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、流感病毒A、B和C、Isfahan病毒、Jamestown峡谷病毒、Junin病毒(阿根廷出血热病毒)、Lagos蝙蝠病毒、La Crosse病毒、拉沙病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCM病毒)、Machupo病毒、Maraba病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、Mokola病毒、Muerto峡谷病毒、Oriboca病毒、Oropouche病毒、副流感病毒1(仙台病毒)、2、3、4a和4b、Pichinde病毒、Piry病毒、Punto toro病毒、Puumala病毒、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、山谷热病毒、白蛉热病毒、Sandfly fever-Sicilian病毒、Seoul病毒、Sin Nombre病毒、Tacaribe病毒、Tahyna病毒、Tamiami病毒、疱疹性口腔炎病毒(包括新泽西合印第安纳株系)、Akabane病毒、Aino病毒、鸟副粘病毒2(Yucaipa病毒)、3、4、5(Kunitachi病毒)、6、7、8和9、牛短生热病毒、牛呼吸合胞病毒、犬瘟病毒、海豚瘟热病毒、Ebola病毒(包括亚型Zaire、Sudan、和Reston)、马麻疹病毒、传染性造血坏死病毒(鱼)、猪、马、海豹和禽流感病毒、Kotonkan病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、Obodhiang病毒、Peste-des-petis-ruminants病毒(绵羊和山羊)、小鼠肺炎病毒、猪rubula病毒(la-Piedad-Michoacan-Mexico病毒)、狂犬病毒、山谷热病毒、牛瘤病毒、猿副流感病毒10，和水泡性口炎病毒。
通过本发明的方法可以治疗、预防或处理的特定双链RNA病毒包括，但不限于，科罗拉多蜱热病毒、呼肠孤病毒1-3、Orungo病毒、Kemerovo病毒、轮状病毒组A-F、Eyach病毒、Ibaraki病毒、金色发光病毒、Chub呼肠孤病毒、非洲马疾病病毒1-9、动物流行性出血热病病毒(鹿)、传染性囊病病毒(家禽)、传染性胰坏死病毒(鱼)、人轮状病毒，和呼肠孤病毒1-3。
在一个实施方案中，本发明包括治疗、预防或处理导致癌症或与癌症相关的病毒。此外，本发明包括抗或者显示出抗常规抗病毒疗法的病毒株系的治疗、预防或处理。在特定实施方案中，优选方法包括使用硫酸葡聚糖的变体抗乙型肝炎、HIV-1、HIV-2、HCMV、MCMV、VZV、EBV、麻疹病毒、Punto Toro a、VEE、西尼罗河病毒、痘苗、牛痘、腺病毒1型、HPIV、人肺炎后病毒、出血性败血症病毒、丙型副流感病毒、pichinde和鼻病毒。
在本发明的特定实施方案中，所治疗的病毒不是疱疹病毒，或者更特别地，所要治疗的病毒不是HSV-1或HSV-2。此外，在另一备选实施方案中，所要治疗的病毒不是逆转录病毒，或者更特别地，所要治疗的病毒不是HIV-1、HIV-2或HTLV。
在另一实施方案中，被本发明的化合物和方法治疗、预防或处理的微生物感染是细菌或寄生虫感染。可以被此处描述的方法治疗、预防或处理的特定细菌和寄生虫包括，但不限于，沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、乳酸菌(Lactobacilli)、疟原虫变种(Plasmodium sp.)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、Staphylococcushemolyticus、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophlila)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhea)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、诺氏疟原虫(Plasmodiumknowlesi)、和恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)。
本发明提供了将治疗有效量的硫酸化多糖或这种硫酸化多糖的组合导入患者的血液、淋巴系统、和/或组织的细胞外间隙，以治疗和/或预防微生物感染，如病毒感染、细菌感染或者寄生虫感染的方法。该方法包括对哺乳动物施用至少硫酸化多糖，其显示出体外抗微生物活性，该硫酸化多糖具有导致该带电多糖的抗微生物活性在体内保持的硫酸化，例如，最小化被具有高带电密度细胞受体的细胞摄取的硫酸化。
不被理论束缚，本申请人认为本发明的硫酸化多糖具有对淋巴结的高亲和性从而具有抵抗在淋巴系统中居住或繁殖的病毒的增强的活性。这样，本发明包括将本发明的硫酸化多糖直接施用于或者靶定患者的淋巴系统。
然而，用于疾病的急性或慢性处理的本发明的硫酸化多糖或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或立体异构体的预防性或治疗性剂量大小将随着疾病或感染的本质或严重性以及活性成分所施用的途径而变。剂量，和可能地剂量频率，也将根据所要治疗的疾病或感染、年龄、体重和个体患者的应答而变。本领域技术人员适当考虑这些因素后可以容易地选择适宜的剂量给药方案。
本发明的方法尤其适于人类患者。具体地，本发明的方法和剂量可用于无免疫应答的患者，包括但不限于癌症患者、HIV感染的患者、患有免疫退行性病的患者。此外，该方法可用于当前处于缓解状态的免疫受损的患者。本发明的方法和剂量还用于经历其他抗病毒治疗的患者。本发明的发明方法尤其用于处于微生物感染危险之中的患者。这些患者包括，但不限于健康护理工人，例如，医生、护士、救济院照料人员、军队人员、教师、育儿工人、旅行到或者居住在外国场所的，尤其是第三世界场所的患者，包括社会援助工人、传教士和外交官。最后，本发明方法和组合物包括难治愈患者或者对治疗具有抗性如对逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等具有抗性的患者的治疗。
5.1.1剂量通过标准药理学方法在细胞培养物或实验动物中可以确定本发明化合物的毒性和效能，例如，确定LD50(对50％的群体致命的剂量)和ED50(对50％群体治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比例是治疗指数并且其可以表达为比例LD50/ED50。
从细胞培养和动物研究得到的数据可用于制定用于人的化合物的剂量范围。这种化合物的剂量优选位于包括ED50而几乎没有或者无毒性的循环浓度范围。在该范围内剂量可以依赖于所用剂型和所用施用途径而变。对于用于本发明方法的任何化合物，可以最初从细胞培养物测定法估计治疗有效剂量。可以在动物模型中设计剂量以实现循环血浆浓度范围，其包括如在细胞培养物中确定的IC50(即，实现症状的半数最大抑制的受试化合物浓度)。这种信息可用于更准确地确定在人中有用的剂量。通过例如，高效液相层析可以测量血浆中的水平。
在人中使用前，优选体外然后体内试验本发明的方案和组合物的所希望的治疗或预防活性。例如，可用于确定是否指出特定治疗方案的施用的体外测定法包括体外细胞培养物测定法，其中易受所要治疗、预防或处理的微生物感染的细胞(例如，原代细胞、被转化的细胞系、患者组织样品，等)或者所要治疗、预防或处理的微生物可以在其上生长的生长培养基(例如，LB肉汤/琼脂、YT肉汤/琼脂、血液琼脂，等)被暴露于或者被施用本发明的化合物并且评定该化合物对微生物生长能力的影响。用于本发明的化合物在人中试验前可以在适宜的动物模型系统中试验，这些动物模型系统包括但不限于，大鼠、小鼠、鸡、奶牛、猴、兔、仓鼠等。这些化合物然后可用于适宜的临床试验中。
用于疾病或状况的急性或慢性处理的本发明的硫酸化多糖或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或立体异构体的预防性或治疗性剂量大小将随着疾病或感染的本质或严重性以及活性成分所施用的途径而变。剂量，和可能地剂量频率，也将根据所要治疗的感染、年龄、体重和个体患者的应答而变。本领域技术人员适当考虑这些因素后可以容易地选择适宜的剂量给药方案。在一个实施方案中，施用的剂量依赖于所用的特定化合物，和患者的体重和状况而变。通常，日剂量为从约0.001到500mg/kg，优选约0.01到200mg/kg，更优选约0.005到100mg/kg。对于被病毒感染的人的治疗，每天施用约0.1mg到约15g，分成每天约1到4次。此外，所推荐的每日的小剂量可以循环地作为单剂或者与其他治疗剂组合施用。在一个实施方案中，以单剂或者均分的剂量施用日剂量。
如本领域技术人员将容易理解的，不同治疗有效量可应用于不同感染。类似地，足够治疗或预防这些感染，但是不足以导致、或足够减小与常规疗法相关的副作用的量也包括在上述剂量和剂量频率方案中。
5.1.2组合疗法本发明的特定方法还包括施用额外的治疗剂(即，不同于本发明化合物的治疗剂)。在本发明的一些实施方案中，本发明的化合物可以与至少一种其他治疗剂组合。该治疗剂包括，但不限于抗生素、抗呕剂、抗抑郁剂、抗真菌剂、消炎剂、抗病毒剂、抗癌剂、免疫调节剂、β-干扰素、烷基化剂、激素或细胞因子。
本发明的硫酸化多糖可以与抗生素组合施用或配制。例如，它们可以与大环内酯物(例如，托普霉素(Tobi))、头孢菌素(例如，头孢氨苄(Keflex)、芑氨基乙酰去乙酸头孢菌素(Velosef)、头孢醋呋肟(Ceftin)，头孢罗齐(Cefzil)、氯头孢菌素(Ceclor)、头孢克肟(Suprax)或头孢羟氨苄(Duricef))、克拉霉素(例如，克拉霉素(Biaxin))、红霉素(例如红霉素(EMycin))、青霉素(例如，青霉素V(V-CillinK或PenVeeK))或喹诺酮(例如，氧氟沙星(Floxin)、卷须霉素(Cipro)或氟哌酸(Noroxin))、氨基糖苷类抗生素(例如阿泊拉霉素、阿拜卡霉素、班贝霉素，丁酰苷菌素、双去氧卡那霉素、新霉素、十一碳烯酸盐、乙基西梭霉素、巴龙霉素、硫酸核糖霉素、西梭霉素、壮观素、amphenicol抗生素(例如，叠氮氯霉素、氯霉素、florfenicol、和甲砜氯霉素)、安沙霉素(例如，利福霉素b和利福平)、carbacephems(例如，loracarbef)、carbapenems(例如，biapenem和imipenem)，头孢菌素类(例如，氯头孢菌素、头孢羟氨苄、头孢羟唑、头孢曲秦、头孢吡酮、头孢唑兰、头孢咪唑、头孢吡四唑、和头孢匹罗)、头霉素(例如，头孢拉宗、头孢氰唑、和头孢米诺)、单菌霉素(例如，氨曲南、卡卢莫南、和泰格莫南)、oxacephems(例如，flomoxef和羟羧氧酰胺菌素)、青霉素(例如，美西林、匹美西林、阿莫西林、氨苄西林甲戊酯、苄基青霉素酸、苄基青霉素钠、依匹西林，苯氧苄青霉素、氟氯青霉素、青霉素G双酯、喷沙西林、青霉素o-苯明西林、青霉素O、青霉素V、苄星青霉素、哈胺青霉素V、青四环素和两性霉素钾)、lincosamide(例如，氯洁霉素、和linocomycin)、两性霉素、杆菌肽、缠霉素、粘菌素、持久杀菌素、结核放射菌素-N、四环素类(例如，羟哌二甲胺四环素、氯四环素、氯摩四环素、和脱甲四环素)、2、4-二氨基嘧啶(例如，嗅莫普林)、硝基呋喃(例如，呋吗唑酮、和氯化呋噻咪唑)、喹诺酮及其类似物(例如，噌恶星、克林沙星、氟甲喹、和grapagloxacin)，磺胺类(例如，乙酰基磺胺甲氧吡嗪、苄基磺酰胺、苯丙磺胺二磺酸钠，邻苯二甲酰磺胺噻唑、偶氮磺胺，和磺胺西汀)，砜(例如，百里砜，葡萄糖砜钠、和苯丙砜)、环丝氨酸、莫匹罗星和抗结核菌素。
本发明的硫酸化多糖可以与抗呕剂组合施用或配制。适宜的抗呕剂包括，但不限于，胃复安、哌双咪酮、氯拉嗪、异丙嗪、氯丙嗪、曲美苄胺、奥丹西隆、格雷西隆、羟嗪、乙酰亮氨酸单乙醇胺、阿利必利、阿扎西隆、苯喹胺、氨醇醋茶碱、溴必利、氯苯丁嗪、氯波必利、苯甲嗪、氯茶碱苯海拉明、二苯哌啶丁醇、多拉司琼、美其敏、美沙拉妥、甲磺哌丙嗪、拉必酮、奥昔喷地、哔哌吗嗪、莨菪胺、舒必利、四氢大麻酚、硫乙哌丙嗪、硫丙拉嗪、托烷司琼、和它们的混合物。
本发明的硫酸化多糖可以与抗抑郁剂组合施用或配制。适宜的抗抑郁剂包括，但不限于，碧来达宁、卡罗沙宗、西酞普兰、二甲氨乙茶碱、苯乙胺甲嘌呤、吲达平、盐酸茚氯嗪、镇痛醚、诺米芬辛、5-羟色氨酸、奥泼定、帕罗西汀、舍曲林、盐酸硫西新、曲唑酮、苯莫新、异丙氯肼、异丙烟肼、异唑肼、丙酰苄氨、辛肼、苯乙肼、可铁宁、环丙胺、麦普替林、metralindole、mianserin、米氮平、阿的那唑仑、阿米替林、氨基噻唑霉素、阿莫沙平、丁替林、盐酸氯丙米嗪、地美替林、去甲丙咪嗪、二苯氮、二甲丙吖、度硫平、多虑平、fluacizine、丙咪嗪、丙咪嗪N-氧化物、伊普吲哚、lofepramine、美利蒽、甲氨甲咪嗪、去甲替林、肟替林、奥匹哌醇、苯噻啶、丙吡西平、普罗替林奎核氮、噻萘普丁、三甲丙咪嗪、阿屈非尼、苯乃静、丁氨苯丙酮、丁醋苯胺、二苯噁啶、度洛西汀、依托哌酮、苯甲氨酯、法莫克西汀、氯苯己二醇、氟西汀、氟握肟氨、血卟啉、金丝桃素、苯基六氢吡啶甲醇乙酸酯、甲二苯氧氨、milnacipran、米那普林、摩氯普胺、奈法唑铜、盐酸奥沙氟生匹帕拉林、prolintane、吡啶琥醇、利坦色林、罗新朵、氯化铷、山呕灵、坦多吡酮、苯噁唑氨、二苯甲氧氨、托落沙酮、反苯环丙胺、L-色氨酸、万拉法新溴苯丙啶、乙氧苯氧甲基吗啉和齐美立啶。
本发明的硫酸化多糖可以与抗真菌剂组合施用或配制。适宜的抗真菌剂包括但不限于两性霉素B、伊曲康唑、复方酮康唑、氟康唑、intrathecal、5-氟胞嘧啶、双氯苯咪唑、布康唑、克霉唑、制霉菌素、曲康唑、噻康唑、环己吡酮乙醇胺、益康唑、氯酚醚、奈呋替芬、氯化乙酰胆碱、十一碳烯酸盐、和griseofuldin。
本发明的硫酸化多糖可以与消炎剂组合施用或配制。适宜的消炎剂包括但不限于，水杨酸、乙酰基水杨酸、水杨酸甲酯、二氟苯水杨酸、双水杨酯、奥沙拉嗪、柳氮磺胺吡啶、醋氨酚、消炎痛、苏灵大、依托度酸、甲灭酸、氯灭酸钠、甲苯酰吡酸、酮咯酸、扶他林、布洛芬、甲氧萘丙酸、甲氧萘丙酸钠、苯氧苯丙酸钙、酮丙酸、氟比洛芬、奥沙普嗪、吡氧噻嗪、美洛昔康、安吡昔康、卓喜康、炎痛喜康、替诺昔康、萘普酮、保泰松、羟保泰松、安替比林、氨基比林、阿扎丙酮和尼美舒利；白三烯拮抗剂，包括，但不限于，苯噻羟脲、金硫代葡萄糖、金硫丁二钠和醋硫葡金；类固醇类，包括，但不限于，阿氯米松、安西缩松、氯地米松双丙酸酯、倍他米松、苯甲酸倍他米松、倍他米松双丙酸酯、磷酸倍他米松钠、戊酸倍他米松、丙酸氯倍他索、氯可托龙、特戊酸氯可托龙、氢化可的松、氢化可的松衍生物、丙缩羟强龙、去羟米松、地塞米松、氟尼缩松、flucoxinolide、flurandrenolide、halcinocide、甲羟孕酮、甲基强的松龙、乙酸甲基强的松龙、琥珀酸甲基强的松龙钠、糠酸莫美达松、乙酸对氟米松、强的松龙、乙酸强的松龙、磷酸强的松龙钠、tebuatate强的松龙、强的松、醋酸去炎松、醋酸去炎松丙酮化合物、双乙酸去炎松和triamcinolone hexacetonide；和其他消炎剂包括，但不限于，氨甲蝶呤、秋水仙素、别嘌呤醇、丙璜舒、苯磺唑酮和苯溴香豆酮。
本发明的硫酸化多糖可以与另一种抗病毒剂组合施用或配制。有用的抗病毒剂包括但不限于，蛋白酶抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂、非-核苷逆转录酶抑制剂和核苷类似物。抗病毒剂包括但不限于叠氮胸苷、无环鸟苷、gangcyclovir、阿糖腺苷、碘苷、三氟尿苷、利巴伟林、以及磷酸胆碱钙磷甲酸、金刚胺、金刚乙胺、沙奎那韦、吲哚那韦、安泼那韦、lopinavir、利托那韦、α-干扰素、阿德福韦、clevadine、entecavir、pleconaril。
本发明的硫酸化多糖可以与免疫调节剂组合施用或配制。免疫调节剂包括，但不限于，methothrexate、来氟洛米环磷酰胺、环孢霉素A、mycophenolatemofetil、瑞帕霉素、咪唑立宾、白瑞夸尔、malononitriloamindes(例如，来氟洛米)、T细胞受体调节剂、细胞因子受体调节剂、肽模拟物，和抗体(例如，人的、人源化的、嵌合的、单克隆的、多克隆的、Fvs、ScFvs、Fab或F(ab)2片段或表位结合片段)、核酸分子(例如，反义核酸分子和三螺旋)、小分子、有机化合物，和无机化合物。T细胞受体调节剂的实例包括，但不限于，抗-T细胞受体抗体(例如，抗-CD4抗体(例如，cM-T412(Boeringer)、IDEC-CE9(IDEC和SKB)、mAB4162W94、Orthoclone和OKTcdr4a(Janssen-Cilag))、抗-CD3抗体(例如，Nuvion(Product DesignLabs)、OKT3(Johnson & Johnson)、或Rituxan(IDEC))、抗-CD5抗体(例如，抗-CD5蓖麻毒素-连接的免疫缀合物)、抗-CD7抗体(例如，CHH-380(Novartis))、抗-CD8抗体、抗-CD40配体单克隆抗体(例如，IDEC-131(IDEC))、抗-CD52抗体(例如，CAMPATH1H(Ilex))、抗-CD2抗体、抗-CD11a抗体(例如，Xanelim(Genentech))，和抗-B7抗体(例如，IDEC-114(IDEC))和CTLA4-免疫球蛋白。细胞因子受体调节剂的实例包括，但不限于，可溶的细胞因子受体(例如，TNF-α受体的胞外结构域或其片段、IL-1β受体的胞外结构域或其片段、和IL-6受体的胞外结构域或其片段)、细胞因子或其片段(例如，白介素(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、TNF-α、干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ，和GM-CSF)、抗细胞因子受体抗体(例如，抗IFN受体抗体、抗IL-2受体抗体(例如，Zenapax(Protein Design Labs))、抗IL4-受体抗体、抗IL-6受体抗体、抗IL-10-受体抗体、抗IL-12受体抗体)、抗细胞因子抗体(例如，抗IFN抗体、抗TNF-α抗体、抗IL-1β抗体、抗IL-6抗体、抗IL-8-抗体(例如，ABX-IL-8(Abgenix))、和抗IL-12抗体)。
本发明的硫酸化多糖可以与细胞因子组合施用或配制。细胞因子的实例包括，但不限于，白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-7(IL-7)、白介素-9(IL-9)、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)、白介素15(IL-15)、白介素-18(IL-18)、血小板衍生生长因子、促红细胞生成素(Epo)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、促乳素，和干扰素(IFN)，例如，α-IFN、γ-IFN)。
本发明的硫酸化多糖可以与激素组合施用或配制。激素的实例包括，但不限于，黄体生成素释放激素(LHRH)、生长激素(OH)、生长激素释放激素、ACTH、促生长素抑制素、促生长素、生长调节素、甲状旁腺激素、下丘脑释放因子、胰岛素、胰高血糖素、脑啡肽、后叶加压素、降钙素、肝素、低分子量肝素、类肝素、合成的和天然的依托尼唑、胰岛素甲状腺刺激激素，和内啡肽。
本发明的硫酸化多糖可以与β-干扰素组合施用或配制。β-干扰素包括，但不限于，β-1a干扰素和β-1b干扰素。
本发明的硫酸化多糖可以与吸收增强剂，尤其是靶定淋巴系统的吸收增强剂组合施用或配制。吸收增强剂包括，但不限于，甘胆酸钠、癸酸钠、N-月桂基-y-D-吡喃麦芽糖苷、EDTA、混合的微团、和Muranishi Crit. Rev.Ther.Drug Carrier Syst.，7-1-33中报导的那些，该文献在此处被完整并入作为参考。也可以使用其他公知的吸收增强剂。从而，本发明还包括含有本发明的一种或多种硫酸化多糖和一种或多种吸收增强剂的药物组合物。
本发明的硫酸化多糖可以与烷基化剂组合施用或配制。烷基化剂的实例包括，但不限于，氮芥、氮丙啶、甲基蜜胺、磺酸烷基酯、亚硝基脲、三氮烯、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、hexamethylmelaine、硫替派、白消安、卡氯芥、链脲霉素、氮烯咪胺、和temozolomide。
本发明的化合物和其他治疗剂可以相加地或者，优选协同地作用。在优选的实施方案中，含有本发明的化合物的组合物与另一种治疗剂同时施用，该另一种治疗剂可以是相同组合物的一部分或者处于与含有本发明化合物的组合物不同的组合物中。在另一实施方案中，本发明的化合物在另一治疗剂施用之前或随后施用。在单独的实施方案中，本发明的化合物被施用于以前没有使用或者当前没有使用的另一种治疗剂，尤其是抗病毒剂的治疗的患者。
在一个实施方案中，本发明的方法包括施用一种或多种本发明的硫酸化多糖而无额外的治疗剂。在特定实施方案中，本发明的方法包括施用一种或多种本发明的硫酸化多糖而无成纤维细胞生长抑制剂。
5.2 高碘酸盐处理的和共带电的阴离子多糖本发明包括硫酸化多糖，其已经被操作而减少被细胞受体的内吞和增加多糖主链的柔性而能够有效呈递阴离子带电基团以与靶定微生物上的区域相互作用。
本发明包括的一种操作是用高碘酸盐处理硫酸化多糖。高碘酸盐处理的阴离子多糖由于一些或所有糖残基的高碘酸盐氧化而具有增加的柔性。该处理使得聚合物的旋转自由度和构象柔性增加并提供了柔性连接以方便生物学相互作用。本发明的高碘酸盐处理的硫酸化多糖可以有平衡离子以确保可溶性，该平衡离子包括，但不限于钠、钙、季铵、和钾。
可以被高碘酸盐处理并用于此处描述的方法和组合物中的物质也包括下面的表1中的多糖。
其他变通方案包括掺入非-硫酸根基团，如羧甲基基团和磺酸根基团。通过用磺酸根或羧甲基基团降低多糖上电荷的取代程度，多糖被高电荷受体内吞的能力被极大地降低，因此增加了其血浆稳定性。使用别人使用的制备方法的改良方法(McLaughlin和Hirbst，Can.J.Res.28B；731-736，1950；Brown等人，Arkiv Kemi 22189-2061964)可以制备羧甲基硫酸葡聚糖。将约20g葡聚糖在异丙醇(350ml)和3.85M NaOH(40ml)的混合物中调成浆并在搅拌机中5℃下搅拌5分钟。加入氯乙酸钠(18g)，并在氮气下5℃下搅拌全部混合物5分钟，从搅拌机除去混合物并将其保存于25℃3天。通过将25℃的时间从1天改变成3天以及ClCH2COONa与无水葡萄糖的摩尔比从1改为4并使ClCH2COONa与NaOH的摩尔比从1变为保持1.4，可以调节羧甲基取代的程度。中和后，将样品用80％乙醇洗涤并干燥。
在优选的实施方案中，本发明包括哺乳动物微生物感染的预防或治疗方法，该方法包括对需要这种治疗或预防的哺乳动物使用有效量的共带电的阴离子多糖，其硫酸化百分比使得能与微生物最大相互作用并且其基本上不通过与哺乳动物中的细胞受体结合而被内吞或降解从而保持体内抗微生物活性。在特定实施方案中，用羧甲基基团、磺酸根基团、硫酸根基团或其组合使共带电的阴离子多糖共带电；更优选地，用羧甲基基团使共带电的阴离子多糖共带电。在特定实施方案中，共带电的阴离子多糖是羧甲基硫酸葡聚糖或羧甲基纤维素。
5.3活化体内使用的硫酸多糖的方法在单独的实施方案中，本发明包括增加或减少用于体内施用的天然发生的硫酸化多糖的硫酸化的方法，该方法包括提供具有一定硫酸化的多糖，该硫酸化足够消除或减少高电荷密度聚阴离子细胞受体对该硫酸化多糖的结合和为该硫酸化多糖提供抗微生物活性。通过制备具有所希望的硫酸化百分比的组合物可以达到该硫酸化范围。备选地，可以用化学或酶的方法改变或控制天然发生的物质到该硫酸化程度范围，在该范围内硫酸化对组成性硫酸根基团与导致感染的微生物之间的最大相互作用是有效的，并且其中该硫酸化多糖基本不通过与哺乳动物中细胞受体结合而被内吞或降解，从而保持体内抗微生物活性。
下面表1中所列为硫酸化多糖(不包括硫酸葡聚糖)的实例，这些硫酸化多糖的抗微生物活性已经在体外阐明，但是以前还没有表明这些硫酸化多糖在低于这些化合物的毒性水平的剂量具有体内抗微生物活性。
表1具有体内抗病毒或抗细菌活性的硫酸化多糖
ASFV非洲猪热病毒；HHV-7人疱疹病毒；HSV单纯疱疹病毒；CMV巨细胞病毒可以修饰上面所列的每种硫酸化多糖，以及具有体外抗微生物活性的任何其他硫酸化多糖，使得它们的硫酸化程度或者离子电荷到达适于它们用于本发明的方法和组合物的水平。
本发明还包括治疗或防止哺乳动物中微生物感染的方法，该方法包括将选自硫酸纤维素、(14)-2-脱氧-2-硫酰胺-3-O-硫-(14)-β-D-吡喃葡萄糖(壳聚糖的衍生物)、2-乙酰胺基-2-脱氧-3-O-硫(14)-β-D-吡喃葡萄糖(壳聚糖的衍生物)、Achranthese bidentata硫酸多糖、Aurintricarboxylic acid、spirulan钙、羧甲基几丁质、化学降解的肝素(Org 31733)、多硫酸软骨素、磺酸和二苯基二磺酸脲的共聚物(MDL10128)、硫酸Curdlan、Cyanovirin-N(来自藻氰菌)、岩藻多糖、硫酸半乳聚糖、葡糖胺-6-硫酸(单糖)、硫酸甘草皂甙、肝素、六硫酸肌醇、硫酸蘑菇多糖、硫酸甘露聚糖、N-酰化肝素缀合物、N-羧甲基壳聚糖-N，O-硫酸、寡核苷酸-聚(L-赖氨酸)-肝素复合物、多硫酸戊聚糖(xylanopolyhydrogen sulfate)、肽聚糖DS-4152、高碘酸盐降解的肝素、Phosphorothioate寡脱氧核苷酸、多硫酸聚缩醛、聚肌苷酸-聚胞嘧啶核苷酸、来自Indocalamus tesselatus(竹叶)的多糖、夏枯草皂苷、硫酸Rhamnan、硫酸呋喃核聚糖、十二烷基硫酸钠、硫酸十二烷基昆布戊糖苷(烷基寡糖)、硫酸化细菌粘多糖、硫酸化十二烷基昆布寡聚体(烷基寡糖)、硫酸化神经节苷脂、从昆布-丁糖、昆布-戊糖、昆布-己糖合成的硫酸化昆布寡糖葡萄糖苷、硫酸化N-去乙酰基壳多糖、硫酸化十八烷基麦芽己糖苷(烷基寡糖)、硫酸化十八烷基呋喃核糖、硫酸寡木聚糖(肝素模拟物)、硫酸化木半乳聚糖、硫脑苷脂(3′硫酸半乳糖基酰基鞘氨醇)、Sulfoevenan、和硫酸化木甘露聚糖，其中所述化合物的硫酸化百分比已经被修饰或控制使得组成性硫酸盐基团与导致感染的微生物能最大相互作用，并且其中该化合物基本上不通过与哺乳动物中的细胞受体结合而被内吞或降解，从而保持体内抗微生物活性。
5.4药物组合物和剂型本发明还包括含有本发明的硫酸化多糖，或者其药学上可接受的盐、水合物或其异构体的药物组合物和单个单位剂型。本发明的单个剂型可适于经口、粘膜(包括舌下、口、直肠、鼻或阴道)、肠胃外(包括皮下、肌内、弹丸注射、动脉内或静脉内)、透皮，或局部施用。本发明的药物组合物和剂型典型地还含有一种或多种药学上可接受的赋形剂。还考虑无菌剂型。
在备选的实施方案中，该实施方案所包括的药物组合物包括本发明的硫酸化多糖，或者其药学上可接受的盐、水合物或其异构体，和至少一种额外的治疗剂。额外的治疗剂的实例包括，但不限于，上面的5.1.2中所列的治疗剂。
本发明的组合物、形状和剂型的类型将通常根据它们的用途而变。例如，用于疾病或相关疾病的急性治疗的剂型可含有比用于相同疾病的慢性治疗中的剂型更大量的一种或多种活性成分。类似地，肠胃外剂型可含有比用于相同疾病或失调的口服剂型更小量的一种或多种活性成分。这些方法和其他方法中，本发明所包括的特定剂型将互不相同，这些方法对于本领域技术人员将是显而易见的。见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing，Easton PA(1990)。剂型的实例包括，但不限于片剂、囊片、胶囊，如软弹性明胶胶囊、扁囊剂、锭剂、糖锭剂、散剂、栓剂、软膏剂、糊剂(泥敷剂)、膏剂、粉剂、敷料剂、霜剂、石膏剂、溶液剂、贴剂、气溶胶(例如，鼻喷雾剂或吸入剂)、凝胶剂；适于经口或粘膜施用于患者的液体制剂形式，包括悬浮剂(例如，水性或非水性液体悬浮剂、水包油乳剂，或油包水液体乳剂)、溶液剂和酏剂；适于肠胃外施用于患者的液体剂型、和无菌固体(例如，晶体状或无定形固体)，其可以被重构而提供适于肠胃外施用于患者的液体剂型。
典型的药物组合物和剂型包括一种或多种载体、赋形剂或稀释剂。适宜的赋形剂是药学领域中技术人员熟知的，并且在此处提供了适宜的赋形剂的非-限制性实例。特定赋形剂是否适于掺入药物组合物或剂型依赖于本领域中熟知的各种因素，这些因素包括，但不限于，剂型将施用于患者的方法。例如，口服剂型如片剂可含有不适于肠胃外剂型的赋形剂。特定赋形剂的适宜性还依赖于剂型中的特定活性成分。
本发明还包括无水药物组合物和含有活性成分的剂型，因为水可以促进一些化合物的降解。例如，在药学领域中水的加入(例如5％)被广泛接受为模拟长期保存以确定如货架期或者制剂随着时间的稳定性的特征的一种方法。见，例如，Jens T.Carstensen，药物稳定性；原理和实践(Drug Stability；Principles & Practice)，第二版，Marcel Dekker，NY，NY，1995，379-80页。实际上，水和热加速某些化合物的分解。这样，水对制剂的影响可以是非常重要的，因为在制剂的生产、操作、包装、保存、运输和使用过程中通常遇到水分和/或湿气。
使用无水或含有低水分的成分和在低水分或低湿度的条件可以制备本发明的无水药物组合物和剂型。
应该制备和保存无水药物组合物使得其无水性质被保存。因此，优选使用公知的材料包装无水组合物以防止暴露于水从而它们可以被包括在适宜的配方药盒中。适宜的包装的实例包括，但不限于，密封的箔、塑料、单位剂量容器(例如，小瓶)、泡罩包装和条形包装(strippack)。
本发明还包括含有降低活性成分分解速度的一种和多种化合物的药物组合物和剂型。这些化合物在这里被称为“稳定剂”，它们包括但不限于，抗氧化剂，如抗坏血酸、pH缓冲剂、或者盐缓冲剂。
如同赋形剂的量和形式，剂型中的活性成分的量和特定类型可依赖于某些因素而不同，这些因素为如，包括，但不限于，其将被施用于患者的途径。然而，含有本发明的硫酸化多糖，或者其药学上可接受的盐、水合物或其立体异构体的本发明的典型剂型含有0.1mg到1500mg/单位以提供约0.01到200mg/kg的日剂量。
5.4.1口服剂型适于经口施用的本发明的药物组合物可以以分散的剂型给出，包括，但不限于，片剂(例如，可咀嚼的片剂)、囊片、胶囊剂和液体(例如，增味糖浆剂)。这些剂型含有预定量的活性成分，并且可以通过本领域技术人员熟知的药学方法制备。一般见，Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing，EastonPA(1990)。
根据常规药物复合技术，通过将充分混合的混合物中的一种或几种活性成分与至少一种赋形剂组合制备本发明的典型口服剂型。根据施用所希望的制剂形式，赋形剂可以采取各种形式。适于用于口服液体或气溶胶剂型的赋形剂包括但不限于，水、乙二醇、油、醇、增味剂、防腐剂和着色剂。适于用于固体口服剂型(例如，粉剂、片剂、胶囊剂和囊片)中的赋形剂的实例包括，但不限于，淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、粒化剂、润滑剂、结合剂，和崩解剂。
片剂和胶囊因为易于施用，所以代表最有利的口服剂量单位形式，在这种情况中使用固体赋形剂。如果希望，通过标准水性或非水性技术可以将片剂包衣。这种剂型可以通过任何药学方法制备。通常，通过均一并充分混合活性成分与液态载体、细分的固态载体，或者两者，然后如果需要使产物形成所希望的外观，制备药物组合物和剂型。
例如，通过压缩和成型可以制备片剂。通过在适宜的机器中压缩任选与赋形剂混合的自由流动形式的活性成分如粉剂或粒剂，可以制备压缩片剂。通过在适宜的机器中将用惰性液态稀释剂湿润的粉状化合物的混合物成型可以制备成型片剂。
可用于本发明的口服剂型的赋形剂的实例包括，但不限于，结合剂、填充剂、崩解剂，和润滑剂。适宜用于药物组合物和剂型的结合剂包括，但不限于，玉米淀粉、马铃薯淀粉，或其他淀粉、明胶、天然的和合成的树胶，如阿拉伯树胶、藻酸钠、藻酸，和其他藻酸盐、粉状西黄蓍胶、瓜尔树胶、纤维素及其衍生物(例如，乙基纤维素、乙酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、预明胶化淀粉、羟丙甲基纤维素、(例如，Nos.2208、2906、2910)、微晶纤维素，和它们的混合物。
适宜用于此处公开的药物组合物和剂型的填充剂的实例包括，但不限于，滑石、碳酸钙(例如，粒剂或粉剂)、微晶纤维素、粉状纤维素、dextrates、高岭土、甘露醇、硅酸、山梨糖醇、淀粉、预明胶化淀粉，和它们的混合物。本发明的药物组合物中的结合剂和填充剂典型地以药物组合物或剂型的约50到约99重量百分比存在。
微晶纤维素的适宜形式包括，但不限于，以AVICEL-PH-101、AVICEL-PH-103、AVICEL RC-581、AVICEL-PH-105(可从FMCCorporation，American Viscose Division，Avicel Sales，MarcusHook，PA得到)出售的物质，和它们的混合物。特定结合剂是以AVICELRC-581出售的微晶纤维素和羧甲基纤维素的混合物。适宜的无水或低水分赋形剂或添加剂包括AVICELPH-103TM和淀粉1500LM。
崩解剂用于本发明的组合物中以提供当暴露于水性环境时崩解的片剂。含有太多崩解剂的片剂可以在保存中崩解，而含有太少崩解剂的那些片剂可能不会以所希望的速度或者在所希望的条件下崩解。这样，为了形成本发明的固态口服剂型，使用的崩解剂的足够量应该既不太多又不太少，从而不会有害地改变活性成分的释放。所用的崩解剂的量基于制剂的类型而变，并且可以由本领域普通技术人员容易地辨别。典型的药物组合物含有约0.5到约15重量百分比的崩解剂，特别从约1到约5重量百分比的崩解剂。
可用于本发明的药物组合物和剂型的崩解剂包括，但不限于，琼脂-琼脂、褐藻酸、碳酸钙、微晶纤维素、croscarmellose钠、crospovidone、polacrilin钾、淀粉glycolate钠、马铃薯或木薯淀粉、预-明胶化淀粉、其他淀粉、粘土、其他藻胶、其他纤维素、树胶，和它们的混合物。
可以用于本发明的药物组合物和剂型中的润滑剂包括，但不限于，硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻矿物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其他乙二醇、硬脂酸、十二烷基硫酸钠、滑石、氢化植物油(例如，花生油、棉籽油、向日葵油、芝麻油、橄榄油、玉米油，和大豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂，和它们的混合物。其他的润滑剂包括，例如，syloid硅胶(AEROSIL 200，W.Ri GraceCo.，Baltimore，MD生产)、合成二氧化硅的凝结气溶胶(Degussa Co.of Plano，TX上市)、CAB-O-SIL(Cabot Co.of Boston，MA出售的致热二氧化硅产品)，和它们的混合物。如果使用，通常润滑剂所使用的量为它们所掺入的药物组合物或剂型的小于约1的重量百分比。
5.4.2缓释剂型通过本领域普通技术人员熟知的控释方法或者递送设备施用本发明的活性成分。实施例包括，但不限于，美国专利号3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、和4,008,719、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556和5,733,566中描述的那些，这些专利的每一篇都在此处被并入作为参考。这些剂型可用于提供一种或多种活性成分的缓释或控释，使用，例如，氢丙甲基纤维素、其他聚合物基质、凝胶、可渗透的膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体、微球，或者它们组合以提供各种比例的所希望的释放模式。可容易选择本领域普通技术人员公知的适宜的控释制剂(包括此处描述的那些控释制剂)与本发明的活性成分使用。从而，本发明包括适于口服施用的单个单位剂型，包括，但不限于，适于控释的片剂、胶囊剂、gelcap和囊片剂。
所有控释药物产品的共同目标是改善它们的非控释对应产品所实现的药物治疗。理想地，医学治疗中最佳设计的控释制剂的使用的特征是在最短的时间内最少的药物被用于治疗或控制状况。控释制剂的优点包括药物的长期活性、减小的剂量频率，和增加的患者依从性。此外，控释制剂可用于影响作用开始的时间和其他特征，如药物的血液水平，并从而可影响副(例如，不利的)作用的发生。
多数控释制剂被设计成最初释放快速产生所希望的疗效的一定量药物(活性成分)，并缓慢并持续地释放其他量的药物以长期保持该治疗或预防效果的水平。为了保持身体中药物的该恒定水平，药物必须以一定速度从剂型释放，所释放的药物将代替被代谢和从身体排泄的药物的量。活性成分的控释可以被各种条件刺激，这些条件包括，但不限于，pH、温度、酶、水或其他生理条件或化合物。
5.4.3肠胃外剂型可通过各种途径施用于患者的肠胃外剂型包括，但不限于，皮下、静脉内(包括，弹丸注射)、肌内，和动脉内。因为它们的使用通常绕过了患者的抗污染物的天然防御，肠胃外剂型优选是无菌的或者能够在施用于患者前灭菌。肠胃外剂型的实例包括，但不限于，易于注射的溶液、容易溶解或悬浮在药学上可接受的注射赋形剂中的干燥的和/或冻干的产品(可重构的粉剂)、易于注射的悬浮剂，和乳剂。
可用于提供本发明的肠胃外剂型的适宜的媒介物(Vehicle)是本领域技术人员熟知的。实例包括，但不限于注射用水USP、水性媒介物(Vehicle)如，但不限于，氯化钠注射剂、Ringer’s注射剂、右旋糖注射剂、和右旋糖和氯化钠注射剂，和乳酸盐Ringer’s注射剂；水混溶的媒介物(Vehicle)如，但不限于，乙醇、聚乙二醇，和聚丙二醇；和非水性媒介物(Vehicle)如，但不限于，玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯，和苯甲酸苯甲酯。
增加此处公开的一种或多种活性成分的溶解性的化合物也可以并入本发明的肠胃外剂型中。
5.4.4透皮剂型透皮剂型包括“储存型”或“基质型”贴剂，其可应用于皮肤并携带特定时间段以允许所希望量的活性成分渗透。
可用于提供本发明包括的透皮和局部剂型的适宜的赋形剂(例如，载体和稀释剂)和其他材料是药学领域中技术人员熟知的，并且依赖于给定药物组合物或剂型将应用的特定组织。考虑这一事实，典型的赋形剂包括，但不限于，水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、丁-1，3-二醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油，和它们的混合物。
根据所要治疗的特定组织，在用本发明的活性成分治疗之前，同时，或者之后使用额外的组分。例如，可以使用渗透增强剂辅助递送活性成分到达组织。适宜的渗透增强剂包括，但不限于丙酮；各种醇如乙醇、油烯基和四氢呋喃基；烷基亚砜如二甲亚砜、二甲乙酰胺、二甲基甲酰胺、聚乙二醇、吡咯烷酮如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮级(聚烯吡酮，Polyvidone)、尿素、和各种水可溶的或不可溶的糖酯如吐温80(聚山梨醇酯80)和Span 60(单硬脂酸山梨聚糖)。
也可以调节药物组合物或剂型，或者药物组合物或剂型所要应用的组织的pH以改善一种或多种活性成分的递送。类似地，可以调节溶剂载体、其离子强度或张力以改善递送。化合物如硬脂酸盐可以加到药物组合物或剂型中以有利地改变一种或多种活性成分的亲水性或亲脂性从而改善递送。关于这一点，硬脂酸盐可作为制剂的脂类媒介物，作为乳化剂或表面活性剂，和作为递送增强或渗透增强剂。活性成分的不同盐、水合物或溶剂化物可用于进一步调节所得组合物的性质。
5.4.5局部剂型本发明的局部剂型包括，但不限于，霜剂、洗剂、软膏剂、凝胶剂、溶液剂、乳剂、悬浮剂，或本领域技术人员公知的其他形式。见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，MackPublishing，Easton PA(1990)；和Introduction toPharmaceutical Dosage Form，第4版，Lea &Febiger，Philadelphia(1985)。在本发明的优选实施方案中，本发明的硫酸化多糖局部施用时具有大于约500,000的分子量。
可用于提供本发明包括的透皮和局部剂型的适宜赋形剂(例如，载体和稀释剂)和其他物质是药学领域中技术人员熟知的，并且依赖于给定药物组合物或剂型将要应用的特定组织。考虑到这一事实，典型的赋形剂包括，但不限于，水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、丁-1，3-二醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油，和它们的混合物。
依赖于所要治疗的特定组织，在用本发明的活性成分治疗之前、共同，或随后只用额外的组分。例如，可以使用渗透增强剂辅助递送活性成分到达组织。适宜的渗透增强剂包括，但不限于丙酮；各种醇如乙醇、油烯基和四氢呋喃基；烷基亚砜如二甲亚砜、二甲乙酰胺、二甲基甲酰胺、乙二醇、吡咯烷酮如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮级(聚烯吡酮，Polyvidone)、尿素、和各种水可溶的或不可溶的糖酯如吐温80(聚山梨醇酯80)和Span 60(单硬脂酸山梨聚糖)。
5.4.6粘膜剂型本发明的粘膜剂型包括，但不限于，眼科溶液、喷雾剂和气溶胶，或者本领域技术人员公知的其他形式。见，例如，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing，EastonPA(1990)；和Introduction to Pharmaceutical Dosage Form，第4版，Lea &Febiger，Philadelphia(1985)。适于治疗口腔中粘膜组织的剂型可以制备成漱口水或口凝胶。在一个实施方案中，气溶胶含有载体。在另一实施方案中，气溶胶不含载体。
本发明的硫酸化多糖可以通过吸入直接施用于肺。为了通过吸入施用，通过许多不同设备可以将适宜多糖方便地递送到肺。例如，带刻度的剂量吸入器(“MDT”)，其利用了含有适宜的低沸点推进剂的罐，这些低沸点推进剂为例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或可用于将硫酸化多糖直接递送到肺的其他适宜的气体。MDI设备可从许多供应商，如3M公司、Aventis、BoehringerIngleheim、Forest Laboratories、Glaxo-Wellcome、ScheringPlough和Vectura得到。
备选地，干粉吸入器(DPI)设备可用于将硫酸化多糖递送到肺(见，例如，Raleigh等人，Proc.Amer.Assoc.Cancer ResearchAnnual Meeting，1999，40，397，其在此处被并入作为参考)。DPI设备通常施用如喷气的机理在容器中产生一片干粉，其然后可被患者吸入。DPI设备是本领域中熟知的并且可从许多卖主购买，这些卖主包括，例如，Fisons、Glaxo-Wellcome、Inhale Therapeutic Systems、ML Laboratories、Qdose和Vectura。一种普遍的变通方案是多剂量DPI(“MDDPT”)系统，其允许递送一个以上的治疗剂量。MDDPI设备可从如AstraZeneca、Glaxo Wellcome、IVAX、Schering Plough、SkyePharma和Vectura的公司购买。例如，所制备的用于吸入器或吹入器中的胶囊和明胶药筒可以含有化合物和适宜的粉剂基质如用于这些系统的乳糖或淀粉的粉剂混合物。
可用于将硫酸化多糖递送到肺的另一种类型的设备是例如，Aradigm Corporation提供的液体喷雾设备。液体喷雾系统使用极小的喷嘴孔以雾化液体药物制剂，其可被直接吸入肺中。
在优选的实施方案中，使用雾化器设备将硫酸化多糖递送到肺中。雾化器通过使用例如，超声能量从液体药物制剂产生气溶胶以形成容易吸入的细颗粒(见，例如Verschoyle等人，British J.Cancer，1999，80，Suppl 2，96，其在此处被并入作为参考)。雾化器的实例包括Sheffield/Systemic Pulmonary Delivery Ltd(见，Armer等人，美国专利号5,954,047；van der Linden等人，美国专利号5,950,619；van der Linden等人，美国专利号5,970,974，它们在此处被并入作为参考)、Aventis和Batelle PulmonaryTherapeutics提供的设备。
在尤其优选的实施方案中，电氢动力(“EHD”)气溶胶设备被用于将硫酸化多糖递送到肺。EHD气溶胶设备使用电能量以气溶胶化液体药物溶液或悬浮液(见，例如，Noakes等人，美国专利号4,765,539；Coffee，美国专利号，4,962,885；Coffee，PCT申请，WO94/12285；Coffee，PCT申请，WO94/14543；Coffee，PCT申请，WO95/26234，Coffee，PCT申请，WO95/26235，Coffee，PCT申请WO95/32807，它们在此处被并入作为参考)。当用EHD气溶胶设备递送硫酸化多糖制剂到肺中并且本领域技术人员常规地进行这种优化时，硫酸化多糖制剂的电化学性质可以是重要的优化参数。EHD气溶胶设备可以比现有的肺递送技术更有效地将药物递送到肺。硫酸化多糖的肺内递送的其他方法将是技术人员公知的并且在本发明的范围内。
适于用雾化器和液体喷雾设备和EHD气溶胶设备使用的液体药物制剂将通常包括硫酸化多糖与药学上可接受的载体。优选地，药学上可接受的载体为液体如醇、水、聚乙二醇或者全氟碳。任选地，可加入另一种物质以改变硫酸化多糖的溶液或悬浮液的气溶胶性质。优选地，该物质为液体如醇、乙二醇、聚乙二醇或脂肪酸。制备适宜用于气溶胶设备的液体药物溶液或悬浮液的其他方法是本领域中技术人员公知的(见，例如，Biesalski，美国专利号5,112,598；Biesalski，5,556,611，它们在此处被并入作为参考)。硫酸化多糖也可以制备成直肠或阴道组合物如栓剂或保留灌肠剂，其例如，含有常规栓剂基质如可可油或其他甘油酯。
除了以前描述的制剂，还可以将硫酸化多糖制备成储存制剂。这种长效制剂可以通过植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射施用。从而，例如，这些化合物可以与适宜的聚合性或疏水材料(例如，作为可接受的油中的乳剂)或者离子交换树脂配制，或者作为难溶性衍生物，例如，作为难溶性盐。
备选地，可以使用其他药物递送系统。脂质体和乳剂是可用于递送硫酸化多糖的递送媒介物的熟知的实例。可以使用某些有机溶剂如二甲亚砜，尽管通常产生更大毒性。也可以在控释系统中递送硫酸化多糖。在一个实施方案中，可以使用泵(Sefton，CRC Crit.Ref BiomedEng.，1987，14，201；Buchwald等人，Surgery，1980，88，507；Saudek等人，N.Engl.J.Med.，1989，321，574)。在另一实施方案中，可以使用聚合材料(见“控释的医学应用”，Langer和Wise(编者)，CRC Pres.，Boca Raton，Fla.(1974)；“控释药物生物利用度、药品设计和性能”，Smolen和Ball(eds.)，Wiley，纽约(1984)；Ranger和Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.，1983，23，61；还见Levy等人.，Science，1985，228，190；During等人，Ann.Neurol.，1989，25，351；Howard等人，1989，J.Neurosury.71，105)。在另一实施方案中，控释系统可以置于本发明的化合物靶标附近，例如，肺，从而仅仅需要全身性剂量的一小部分(见，例如，Goodson，Medical Applications of ControlledRelease，如前，卷2，115页(1984))。可以使用其他控释系统(见，例如，Langer，Science，1990，249，1527)。
可用于提供本发明的粘膜剂型的适宜的赋形剂(例如，载体和稀释剂)和其他物质是药学领域中技术人员熟知的，并且依赖于给定的药物组合物或剂型将施用的特定部位或方法。考虑到之一事实，典型的赋形剂包括，但不限于，水、乙醇、乙二醇、丙二醇、丁-1，3-二醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油，和它们的混合物，它们是无毒并且药学上可接受的。这种额外成分的实例是本领域中熟知的。见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，MackPublishing，Easton PA(1990)。
也可以调节药物组合物或剂型，或者药物组合物或剂型所要应用的组织的pH以改善一种或多种活性成分的递送。类似地，可以调节溶剂载体、其离子强度或张力以改善递送。化合物如硬脂酸盐可以加到药物组合物或剂型中以有利地改变一种或多种活性成分的亲水性或亲脂性从而改善递送。关于这一点，硬脂酸盐可作为制剂的脂类媒介物，作为乳化剂或表面活性剂，和作为递送增强或渗透增强剂。活性成分的不同盐、水合物或溶剂化物可用于进一步调节所得组合物的性质。
5.4.7避孕套和预防性装置在本发明的优选实施方案中，本发明的硫酸化多糖可用作避孕套或其他预防装置的涂层。类似地，硫酸化多糖可用作手术器械和保护性装置的涂层，这些手术器械和保护性装置包括，但不限于，橡胶手套、手术口罩、CPR助听器、舌压板、绷带、纱布、餐巾、牙科设备和体温计探头盖。当本发明的硫酸化多糖被用作如此处描述的涂层时，其优选具有高于500,000的分子量。在优选的实施方案中，本发明的硫酸化多糖与用于手术手套的滑石润滑粉剂组合。使用本发明的硫酸化多糖作为涂层的方法将是技术人员熟知的。类似的方法可以在美国专利号4,869,270中发现，该专利在这里被并入作为参考。
5.4.8消毒剂和洗涤剂在本发明的一个实施方案中，本发明的硫酸化多糖可用于医院、实验室、厕所、礼堂、体育场、会议中心、餐馆、健康中心、地铁终点站、公共汽车总站、机场、邮局、办公室、污水处理设施、下水道、水处理设施、泵站、汽车、飞机、火车、家庭、柜和家具中无生命物体的消毒以防止病毒或疾病的扩散。
消毒组合物含有本发明的一种或多种硫酸化多糖，其为粉剂、糊剂、浓缩物、溶液剂、喷雾剂、皂、泡沫液、凝胶剂、洗剂、霜剂、洗手剂、漱口水、预处理的毛巾、预处理的小毛巾、预处理的棉签或者预处理的衬垫的形式。
在特定实施方案中，本发明的硫酸化多糖可用于消毒生物液体，包括，但不限于，血液、血浆、卵、精液或精子。本发明的硫酸化多糖可直接加到生物液体中或者偶联到固体支持物，其包括，但不限于塑料珠、玻璃珠或者置于与生物液体接触的滤器。
5.4.9营养品和饮食补充品该硫酸多糖可被掺入到包括，但不限于，食品组合物、非处方药、和饮食补充剂的营养品中。硫酸化多糖可加到各种食物中以被同时消费。作为食物添加剂，本发明的硫酸化多糖可以以与常规食品添加剂相同的方式使用，从而，仅仅需要与其他组分混合以增强味道。味道增强包括，但不限于，对食物内在味道赋予提神、活力、清洁、精细或令人振奋的味道。
将认识到饮食补充剂可以不使用与药物组合物相同的配方成分或者相同的无菌和其他FDA要求。饮食补充物可以为液体形式，例如，溶液剂、糖浆剂或悬浮剂，或者可以是用于使用前与水或任何其他适宜的液体重构的产品。通过常规方式如茶、健康饮料、dietary shake、液体浓缩物或者液体可溶的片剂、胶囊剂、丸剂，或者粉剂制备这种液体制剂从而通过将液体可溶的片剂、胶囊、丸剂、或粉剂溶解在液体中制备饮料并消费所得饮料。备选地，饮食补充物可以采取通过常规方法制备的片剂或胶囊剂并且任选包括其他饮食补充物，其包括维生素、矿物质、其他草药补充物、结合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂，或者湿润剂，如上面公开的那些。通过本领域中熟知的方法可以包衣片剂。在优选实施方案中，饮食补充物可以采取可以溶解在经口消费的液体中的胶囊剂或粉剂。
饮料或者掺入到食品中的硫酸化多糖的量将依赖于饮料、食品的种类和所希望的效果。通常，一份饮料(食物)含有食品组合物的约0.1％到约50％，优选约0.5％到约20％的量。更优选地，食品含有硫酸化多糖的量为按重量计食品组合物的约1％到约10％。
食物的实例包括，但不限于，甜食如糖果(冰糖、果冻、果酱等)、树胶、豆酱、烘焙甜食或成型甜食(小甜饼、饼干，等)、蒸煮的甜食、可可或可可产品(巧克力和可可粉)、冰冻的甜食(冰淇淋、冰，等)、饮料(果汁、软饮、碳酸饮料)、健康饮料、健康棒，和茶(绿茶、红茶，等)。
5.5测定法和动物模型通过本领域中公知的各种方法可以体外或体内检测本发明的硫酸化多糖、组合物和剂型以试验抗微生物活性。见，例如，下面讨论并且在所有实施例中使用的方法。
为了确定本发明的混合物的抗微生物活性的程度，根据本发明可以使用许多测定法，如细胞培养、动物模型，和施用于人受试者。此处描述的测定法可用于测定随着时间微生物的生长，以确定存在本发明化合物时微生物的生长特征。
在一个实施方案中，本发明的微生物和化合物被加到允许细胞系(例如，原代细胞、转化细胞系、患者组织样品，等)或者生长培养基(例如，LB肉汤/琼脂、YT肉汤/琼脂，血琼脂，等)。微生物的生长/感染可以与不存在本发明化合物时微生物的生长/感染相比较。通过存在本发明化合物时微生物生长/感染的降低来证明本发明化合物的抗微生物活性。本领域的任一方法都可用于确定生长/感染，包括，但不限于，免疫荧光染色、免疫印迹或微生物特异核酸的检测(例如，通过原位杂交，或者细胞裂解后通过DNA印迹或RT-PCR分析)、生长/感染的致细胞病变效应的视觉/显微镜检测(例如，病毒细胞变圆、细胞脱落、细胞裂解、多核体的形成)、微生物效价(例如，噬菌斑形成单位、菌落形成单位，等)、噬菌斑/菌落的数目。在特定实施方案中，本发明的微生物和化合物被同时加到细胞或生长培养基中。在另一特定实施方案中，微生物被在本发明的化合物之前加到细胞或生长培养基中。在另一特定实施方案中，本发明的化合物被在微生物之前加到细胞或生长培养基中。
在另一实施方案中，本发明的微生物和化合物被施用于易受该微生物感染的动物受试者。感染的发病率、严重性、时间长短、微生物负荷、和死亡率等可以与当受试者仅施用该微生物时(无本发明的化合物)所观察到的感染的发病率、严重性、时间长短、微生物负荷、和死亡率等比较。通过存在本发明化合物时感染的发病率、严重性、时间长短、微生物负荷、和死亡率等的降低来证明本发明化合物的抗微生物活性。在特定实施方案中，本发明的微生物和化合物被同时施用于动物受试者。在另一特定实施方案中，该微生物在本发明的化合物之前被施用于动物受试者。在另一特定实施方案中，本发明的化合物在该微生物之前施用于动物受试者。
在另一实施方案中，通过存在或不存在本发明的化合物下感染后的多个时间点处采集细胞培养基或者从人或动物受试者采集生物液体/临床样品(例如，鼻吸出物、咽棉拭、痰、支气管-肺泡灌洗、尿、唾液、血，或血清)可以检验微生物的生长速度。在特定实施方案中，通过施用本领域中熟知的一种方法评估生长在细胞培养物、生长在容许生长培养基、或生长在受试者中后样品中微生物的存在来测定微生物的生长速度，该熟知的方法包括，但不限于，免疫测定法(例如，ELISA；关于ELISA的讨论见，例如，Ausubel等人，编者，1994，CurrentProtocol in Molecular Biology，卷1，John Wiley & Sons，Inc.，纽约11.2.1)、免疫荧光染色，或者免疫印迹分析，其使用免疫特异识别所要测定的微生物的抗体或者检测微生物特异性核酸(例如，通过DNA印迹或者RT-PCR分析，等)。
在其他特定实施方案中，微生物的生长速度在受试者中生长后测定。在一个实施方案中，微生物为病毒。体内抗病毒活性的标准模型包括，但不限于，primo-感染猕猴模型(Le Grand等人，Symp.NonhumPrimate Models AIDS.1993年9月19-22，11)；和《感染动物模型手册》(Zak和Sande编者，Academic Press；第一版(1999)，包括，但不限于巨细胞病毒感染豚鼠模型、巨细胞病毒感染大鼠CMV模型、人巨细胞病毒感染SCID-hu(thy/liv)小鼠模型、眼巨细胞病毒感染SCID-hu小鼠模型、猿水痘模型、T细胞和皮肤的水痘带状疱疹感染的SCID-hu小鼠模型、流感病毒感染的小鼠模型、流感病毒感染的白鼬模型、呼吸道合胞病毒的棉鼠模型、HBV感染的转基因小鼠模型、乙型肝炎感染的鸭模型、乙型肝炎病毒感染的美洲旱獭模型、轮状病毒的成年小鼠模型、SIV感染的猕猴模型、HIV感染的SCID-huthy-liv小鼠模型、HIV-1感染的黑猩猩模型。
在特定实施方案中，通过从受感染的细胞或受感染的受试者得到细胞培养基或生物液体/临床样品，制备样品的连续稀释液并感染易受该病毒感染的细胞单层(原代细胞、转化的细胞系、患者组织样品，等)，该病毒稀释液使得可以出现单个噬菌斑。然后计数噬菌斑并将病毒效价表达为每毫升样品噬菌斑形成单位。
在另一实施方案中，微生物为寄生虫。体内抗寄生虫活性的标准模型包括，但不限于，《感染动物模型手册》(Zak和Sande编者，Academic Press；第一版(1999)中描述的那些模型，包括但不限于，阴道滴虫(Trichomonas vaginalis)感染的阴道内小鼠模型。
在另一实施方案中，微生物是真菌。体内抗真菌活性的标准模型包括，但不限于，《感染动物模型手册》(Zak和Sande编者，AcademicPress；第一版(1999)中描述的那些模型，包括但不限于，脓毒症念珠菌的啮齿动物模型、大鼠的全身性白色念珠菌(candida albicans)感染模型、小鼠中口咽和胃肠道念珠菌感染模型、局部念珠菌病的手爪水肿模型、过敏性支气管肺曲霉病的鼠模型、小鼠中肺隐球菌感染模型、大鼠中新型隐球菌感染模型、侵入性肺曲霉病大鼠模型、角膜真菌病念株菌的兔模型、隐球菌脑膜炎的兔模型、白色念珠菌导致的上行性肾盂肾炎的大鼠模型、念珠菌阴道感染的大鼠模型，和念珠菌阴道感染的鼠模型。
在另一实施方案中，微生物是细菌。体内抗细菌活性的标准模型包括，但不限于，《感染动物模型手册》(Zak和Sande编者，AcademicPress；第一版(1999)中描述的那些模型，包括但不限于，小鼠腹膜炎/败血症模型、鼠大腿感染模型、小鼠皮下棉线模型、小鼠腹膜炎模型、涉及外来体的腹膜炎鼠模型、大鼠多微生物腹膜炎感染模型、空肠弯曲杆菌(campylobacter jejun)感染的小鼠模型、产肠毒素大肠杆菌感染的乳鼠模型、志贺氏菌病的兔模型、肠霍乱弧菌感染的RITARD兔模型、幽门螺旋杆菌感染的小鼠模型、螺旋杆菌的白鼬模型、梅毒的仓鼠模型、获得性和先天性梅毒的豚鼠模型、军团病的豚鼠模型、肺结核的鼠模型、发散性mycobacterium avuim复合体感染的浅棕色小鼠模型、犰狳麻风病模型、麻风病小鼠模型、莱姆关节炎的仓鼠模型、细菌性结膜炎的兔模型、细菌性角膜炎的鼠模型、细菌性角膜炎的兔间质注射模型、急性中耳炎的栗鼠模型、急性中耳炎的豚鼠模型、细菌性附睾炎的大鼠模型、支原体生殖器感染的小鼠模型、上行性尿道感染的小鼠模型、涉及短期和长期内置导管的上行性UTI的小鼠模型、亚临床肾盂肾炎的大鼠模型、慢性膀胱炎的大鼠模型、小鼠肺炎球菌性肺炎模型、支原体肺部感染的仓鼠模型、胫骨细菌性骨髓炎的大鼠模型、造血骨髓炎的大鼠模型、胫骨细菌性骨髓炎的兔模型、关节成型术的大鼠模型、关节成型术的兔模型、streptococcalfasciitis的小鼠模型、细菌性心内膜炎的兔模型、脑膜炎的成年大鼠模型、细菌性脑膜炎的兔模型。
在一个特定实施方案中，通过抗受试者中微生物的抗体的效价估计受试者中微生物的生长速度。通过本领域中熟知的一种方法可以确定抗体血清效价，例如，但不限于，通过例如，ELISA可以定量血清样品中抗体或抗体片段的量。此外，通过将化合物直接施用于受试动物，收集生物液体(例如，鼻吸出物、咽棉拭、痰、支气管-肺泡灌洗液、尿、唾液、血，或血清)并试验该液体的抗微生物活性，可以确定硫酸化多糖的体内活性。
在用于测定微生物水平的样品是生物液体/临床样品(例如，鼻吸出物、咽棉拭、痰、支气管-肺泡灌洗、尿、唾液、血，或血清)的实施方案中，样品可以含有或者不含有完整细胞。来自含有完整细胞的受试者的样品可被直接处理，而无完整细胞的分离物可以或不可以在容许细胞系(例如，原代细胞、转化细胞系、患者组织样品，等)或生长培养基(例如，LB肉汤/琼脂、YT肉汤/琼脂，血琼脂，等)上首先培养。细胞悬浮物可以例如，300×g室温下离心5分钟，然后在相同条件下用pH7.4的PBS(无Ca++和Mg++)洗涤。可将细胞沉淀重悬在小体积PBS中待分析。含有完整细胞的原代临床分离物可以与PBS混合并在室温下以300×g离心5分钟。以无菌吸量管头从界面除去粘液并可以在相同条件下再用PBS洗涤细胞沉淀一次。沉淀可以重悬在小体积PBS中待分析。
在另一实施方案中，本发明的化合物被施用于感染微生物的人受试者。感染的发病率、严重性、时间长短、病毒负荷、和死亡率等可以与不存在本发明化合物或存在安慰剂时用微生物感染的受试者中所观察到的感染的发病率、严重性、时间长短、病毒负荷、和死亡率等比较。通过存在本发明化合物时感染的发病率、严重性、时间长短、病毒负荷、和死亡率等的降低来证明本发明化合物的抗微生物活性。可以使用本领域中公知的一种方法，如前面描述的那些方法，确定受试者中抗微生物活性。
此外，通过将化合物直接施用于动物或人受试者，收集生物液体/临床样品(例如，鼻吸出物、咽棉拭、痰、支气管-肺泡灌洗、尿、唾液、血，或血清)并试验该生物液体/临床样品的抗病毒活性(例如，加入存在微生物的培养物中的细胞)，可以确定硫酸化多糖的体内活性。
通常，体内稳定性可通过技术人员公知的各种模型确定。具体地，可通过肾灌注测定法确定体内稳定性。对于任一种类型的分析，可以用例如氚标记受试化合物。肾灌注技术在Tay等人，(Am.J.Physiol.，(1991)，260F549-F554)中详述。简言之，将大鼠肾(例如，来自雄性Sprague-Dawley大鼠)用含有氨基酸的改良KrebsHenseleit缓冲液中的5％牛血清白蛋白(BSA)灌注并用95％O2-5％CO2连续通气。已被灌注的样品可进行离子交换层析，其使用，例如，19×1/cm2sepharose Q柱。将样品加到6M尿素、0.05MTris、0.005％(w/v)Chaps，pH7.0中的柱子并用相同缓冲液中的0.15-2.5M NaCl的线性梯度以0.5ml/分钟的流速洗脱。使用该技术的回收非常好。
前面已经阐明了本发明的相关的和重要的特征。本领域技术人员将明白可以设计许多修改和实施方案。因此，考虑所附权利要求覆盖所有这些修改和实施方案。
6.工作实施例下面的实施例仅用于阐明的目的并且不打算作为对本发明范围的限制。
6.1实施例1具有9.5％硫酸化的硫酸化葡聚糖的合成在真空中60℃过夜干燥葡聚糖T20(平均分子量20,000)。干燥的化合物(100g)溶于640ml甲酰胺(FA)中。将氯磺酸(CSA)80ml加到3-颈烧瓶中最高45℃的FA 200ml中，然后在冰-水中冷却。CSA的量决定了硫酸化葡聚糖的最终硫酸化(180ml CSA加到200ml FA产生约17％硫)。将CSA/FA混合物缓慢(2小时内)加到40℃温度的葡聚糖。加入所有CSA/FA之后，在45℃搅拌混合物15分钟。将混合物冷却到25℃并缓慢加入28％NaOH以得到pH7.5-8.5，最大温度50℃。对于第一次沉淀，搅拌下加入3L乙醇。停止搅拌并让混合物静置。倒出上清液并将沉淀重溶于1.5L水中。对于第二次沉淀，搅拌下加入1.5L乙醇并让混合物静置2小时。倒出上清液并将沉淀重溶于900ml水中，向其中加入17g NaCl。对于第三次沉淀，搅拌下加入800ml乙醇并让混合物静置2小时。测量最大旋光度。倒出上清液并将沉淀重新溶于500ml水中。加入2.8g Na2HPO4和2.6g NaH2PO4。对于最后的沉淀，加入5L乙醇并在玻璃过滤器上过滤沉淀并将其在真空中50℃下干燥。
6.2实施例2高碘酸盐氧化按照Sandy JD.Biochem J.177569-574，1979所用的Smith降解的改良方法，室温下将硫酸软骨素(240mg)溶于0.25MNaClO4(47ml)中。加入5ml 0.5M NaIO4并将KOH用于调节混合物到pH5。允许反应在黑暗中进行72小时。然后在visking tubing中透析混合物以除去高碘酸盐。
6.3实施例3将阴离子硫基团导入羧甲基葡聚糖具有9.5％硫含量的羧甲基葡聚糖(平均分子量20,000)的硫酸化形式将羧甲基葡聚糖(CMD)在真空中60℃下干燥过夜。CMD(100g)溶于640ml甲酰胺(FA)中。将氯磺酸(CSA)80ml加到3-颈烧瓶中最大45℃的FA 200ml中，然后在冰-水中冷却。CSA的量将决定CMD的最终硫含量(180ml CSA加到200ml FA产生约17％硫)。将CSA/FA混合物缓慢(2小时内)加到40℃的CMD。加入所有之后，在45℃搅拌混合物15分钟。将混合物冷却到25℃并缓慢加入28％NaOH以得到pH7.5-8.5，最大温度50℃。对于第一次沉淀，搅拌下加入3L乙醇。倒出上清液并将沉淀重溶于1.5L水中。对于第二次沉淀，搅拌下加入1.5L乙醇并让混合物静置2小时。倒出上清液并将沉淀重溶于900ml水中，向其中加入17g NaCl。对于第三次沉淀，搅拌下加入800ml乙醇并让混合物静置2小时。最大旋光度应为0.3。倒出上清液并将沉淀重新溶于500ml水中。加入2.8g Na2HPO4和2.6g NaH2PO4。对于最后的沉淀，加入5L乙醇并在玻璃过滤器上过滤沉淀并将其在真空中50℃下干燥。
羧甲基葡聚糖的磺酸化形式(平均分子量20,000)步骤1. 5g葡聚糖溶于水，加入100mg硼氢化物，室温下搅拌30分钟。
步骤2.加入氢氧化钠颗粒(10g)并搅拌直到溶解然后加入磺酸盐(12g)。
步骤3. 70℃加热7小时。3小时后再加入3g磺酸盐。继续加热4小时。
步骤4.以5M HCl中和到pH7.5(总体积(T)＝75ml)并在良好搅拌下缓慢加入200ml乙醇。停止搅拌并静置1h。
步骤5.倒出上清液；重溶于水(T＝60ml)并在良好搅拌下缓慢加入150ml乙醇。并静置1h。
步骤6.重复步骤5。
步骤7.倒出上清液，将残渣重溶于60ml水中并将ppte溶于600ml乙醇。可将一些浓缩的氯化钠溶液加入混合物中帮助沉淀。
步骤8.过滤并真空干燥，产量约6g。
6.4实施例4体内抗病毒活性在药物动力学研究中评估硫酸葡聚糖和硫酸化葡聚糖变体的体内抗微生物活性，该研究包括给予3只雄性大鼠和3只雌性大鼠商业途径可得到的(～17％硫)40,000mw的硫酸葡聚糖(DS)(组1)、DS 500,000mw(组2)、硫酸葡聚糖(12.2％硫酸根)(DES6)40,000mw(组3)、DES6500,000mw(组4)的60mg/kg的单次静脉内剂量和给予3只大鼠的额外组(组5)的60mg/kg DES6 500,000mw的多天注射。大鼠为事先在腔静脉中插入导管的Sprague-Dawley。注射后在各个时期抽血并在急性感染细胞保护测定系统中评估抗-HIV活性，该测定系统利用HIV-1RF病毒与CEN-SS细胞使用MTS染色方法确定细胞生存力(基于Witvrouw等人，J.Acqur.Immun.Def.Syndr.，3343-347，1990)。图2中的显示的结果指出DS，如预期的，在这些剂量下，具有高毒性，仅有一只大鼠存活超过24小时。相反，在DES6处理的大鼠中观察到注射后长达120小时的良好存活和循环抗-HIV活性。
图2代表来自5组动物的总结性数据。每个数据点代表注射后不同时期的循环抗病毒活性的浓度。通过确定血液中化合物的IC50计算浓度。如可以从原始数据计算的，两种分子量的DES6表现出血液中更长的半寿期(12到18小时)，和更长的抗病毒活性(高于IC50的循环浓度)(超过72小时)。对组5动物的3次重复注射达到了稳定态浓度。结果在图2中表达。
数据指出与DES6相关的任何死亡可能是由于与导管插入术相关的并发症，因为未插入导管的动物中MTD为＞850mg/kg。
6.5实施例5对凝血酶原/凝血酶和活化的部分促凝血酶原激酶时间的影响如上面所指出的，凝固抑制已经是硫酸化多糖处理，尤其用常规硫酸化多糖处理的反复观察到的副作用。该研究的目的是评价与商业途径可得到的DS相比，DES6对凝血酶原时间(PT)和活化的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)的影响。在递交给临床病理学实验室前所有标本都用受试化合物“穿刺”(spike)。将标本和重构的从Sigma购买的人血浆一起递交。在分析即刻前将600μl Sigma人血浆加到每个标本中。
使用Bio-Merieux Coag-A-Mate MTXII分析仪测量凝血酶原时间(PT)和活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)。所用的PT试剂为Simplastin L，所用的ATPP试剂为Platelin L；所有试剂都从Bio-Merieux得到。所有样品一式两份地进行。试验即刻之前分析凝固对照样品。
标本处置从一些标本没有得到凝固时间。PT测量时间在第5秒开始并在第60秒停止。APTT测量时间在第5秒开始并在第130秒停止。在这些时间段中没有检测到凝固。结果在下面的表2中给出。
表2数据总结-凝固
血小板减少和凝固进行确定所注射的具有各种分子量的DS和DES6对凝固参数的影响的实验。在连续作业日给予大鼠5或50mg/kg(i.v.)每种化合物，持续10天。在第11天，剂量从5mg/kg改为1mg/kg和从50mg/kg改为100mg/kg并继续每日连续静脉内注射。在第0、5、10和15天抽血并评估aPTT和血小板数。结果在下面的表3中提供。
表3
*标记血小板聚集的值；评价了涂片并且没有看见聚集。
最大耐受剂量在一系列实验中评估了DES6的多种毒性剂量(MTD)，实验中，对每组5只大鼠给以DES6 mw＝500,000的100或200mg/kg剂量。注射后5天内确定体重和总的行为评估。通过观察和体重测量没有明显的中毒迹象。随后，对大鼠给予500mg/kg注射并再观察5天，也没有中毒迹象。最后，动物被给予850mg/kg剂量。结果在表4中提供。
表4最大耐受剂量(MTD)
6.6实施例6硫酸化多糖的体外抗病毒评估研究包括人外周血单核细胞(PBMC)中500μg/ml的高试验浓度下5种受试化合物的评估。
方法将所有受试化合物#3(硫酸葡聚糖17-20％)、#4(硫酸葡聚糖，9.5％硫，分子量30,000)，和#6(硫酸葡聚糖，12.2％硫，分子量36,000)以40mg/ml溶于H2O中。这些化合物在视觉上完全溶解并且无色。将化合物避光保护并以最小化偶然进入光线的方式实施测定法。化合物溶解后在-20℃保存。
病毒低传代儿科分离物RoJo来自南方研究所(Southern ResearchInstitute)的实验室。RoJo是推测的B亚型病毒。
PBMC分离和胚化(Blasting)通过ficoll hypaque梯度分离从正常肝炎和HIV-1阴性供体得到外周血单核细胞(PBMC)。将这些单核细胞洗涤以除去残留的分离介质、计数、确定生存力并以1×106个细胞/mL重悬在补加15％FBS(热失活的)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/ml链霉素、和10μg/ml庆大霉素与2μg/ml植物凝集素(PHA)的RPMI 1640培养基中。在37℃，5％CO2中培养细胞48到72小时。孵育后，细胞通过离心收集，洗涤并重悬在补加15％FBS(热失活的)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/ml链霉素、和10μg/ml庆大霉素与20U/ml重组IL-2(R&D Systems，Minneapolis，MN)的RPMI 1640培养基中。IL-2被包含在培养基中用以保持PHA促有丝分裂刺激启动的细胞分裂。通过每3天用新鲜的含有IL-2的培养基替换1/2培养物体积来保持培养物，直到使用。
PBMC测定法将已经用PHA和IL-2胚化的来自最少两个供体的人外周血单核细胞计数，通过锥虫蓝染料排斥确定生存力并以等比例混合。使用合并的供体以便使由于HIV感染和原代淋巴细胞群体对PHA和IL-2的总体应答中的定量和定性差异导致的个体供体之间所观察到的变化性最小。将细胞以1×106个细胞/mL重悬在补加15％胎牛血清(热失活的)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/ml链霉素、和10μg/ml庆大霉素与IL-2(20U/ml，R&D Systems，Minneapolis，MN)，而没有酚红的RPMI 1640培养基中。以南方研究所的传染性疾病研究部(Infectious Disease Research department)开发的标准格式将50微升细胞分布于96孔圆底微量滴定培养板的内部60个孔中。每个板含有细胞对照孔(仅细胞)、病毒对照孔(细胞加病毒)，和实验孔(药物加细胞加病毒)。向微量滴定板加入连续稀释的化合物，然后加入适当的预滴定的HIV-1 RoJo稀释液。所有样品都一式三份地测定，无病毒的复板用于确定化合物毒性。每孔的终体积为200μL。测定在湿润空气中37℃，5％CO2中孵育6天，之后收集上清液，分析RT活性并通过MTS染料还原分析姐妹板的细胞生存力。还通过显微镜检查孔并记录任何异常。
细胞生存力的MTS染色测定结束时将测定板用可溶的基于四唑的染料MTS(CellTiter96试剂，Promega)染色以确定细胞生存力和定量化合物毒性。MTS被代谢活性细胞的线粒体酶代谢成可溶的甲产物，使得可以快速定量分析细胞生存力和化合物细胞毒性。该试剂是单稳定溶液，其不需要使用前制备。在测定结束时每孔加入20μL MTS试剂并在37℃孵育4小时。用粘性板密封器代替盖子，将密封的平板倒转几次以混合可溶性甲产物，并用分子设备Vmax平板读出器(Molecular DevicesVmax plate reader)在490nm通过分光光度法读数。
培养上清液的反转录酶测定法在无细胞的上清液中测量反转录酶(RT)活性。将氚化的三磷酸胸苷(NEN)(TTP)以5Ci/mL重悬在蒸馏水中。制备多聚rA和寡聚dT作为母液，将其在-20℃保存。RT反应缓冲液每天新鲜制备并由125μL1.0M EGTA、125μL dH2O、110μL 10％SDS、50μL 1.0M Tris(pH7.4)、50μL 1.0M DTT，和40μL 1.0M MgCl2组成。这三种溶液以两份TTP、一份多聚rA寡聚dT、和一份反应缓冲液的比例一起混合。将10微升这种反应混合物置于圆底微量滴定板中并加入15μL含有病毒的上清液并混合。平板在37℃水浴中孵育，使用固体支持物以防止平板浸没并孵育60分钟。反应后，将反应体积点到几片DE81纸上，用5％磷酸钠缓冲液洗涤5次，每次5分钟，在蒸馏水中洗涤2次，每次1分钟，在70％乙醇中洗涤两次，每次1分钟，然后干燥。将Opti-Fluor O加入每个样品并使用Wallac 1450 Microbetaplus液体闪烁计数器定量所掺入的放射性。
数据分析提供了IC50(病毒复制的50％抑制)、TC50(细胞存活性的50％减少)和治疗指数(TI，TC50/IC50)。
结果通过线性回归计算IC50和TC50值。TI代表TC50/IC50，并用于确定化合物之间的相对潜能。图解表示显示了抗病毒效能(％VC)和化合物毒性(％CC)之间的关系，其分别表达为对照、病毒无化合物或细胞无化合物的百分比。
用于评价受试化合物的所有PBMC测定法都满足它们各自的测定标准和内部测定法生效标准，包括一式三份之间变化和总病毒复制。对照化合物AZT(RT抑制剂)和常规硫酸葡聚糖(病毒进入/附着抑制剂)以预期的效能抑制HIV复制(AZTIC501到10nM；硫酸葡聚糖IC500.1到2μg/ml)。从而所给出的评估是有效的并且代表受试化合物的抗病毒活性。
数据在表5中概述。
表5抗病毒活性
表5比较了PBMC中以前的和当前的抗病毒评价。在这些实验中证实了以前鉴定的IC50和DES 17-20％硫酸化的抗病毒效能，其IC50为0.5μg/ml。这处于为PBMC测定法预测的标准3-倍误差之内。此外，第二个实验证明化合物#3在500μg/ml下对PBMC是无毒的。
在该评估设定下进行了DES 9.5％硫酸化和DES 12.5％硫酸化的最初抗病毒评估。两种化合物在500μg/ml时都是无毒的并且得到50％抑制浓度。基于所计算的IC50，DES 12.5％硫酸化显示了等于DES 17-20％硫酸化的抗病毒活性，分别为1.6对0.5μg/ml。此外，抗病毒效能曲线的检查表明这两种化合物具有相等的潜能。相反，DES 9.5％硫酸化比DES 17-20％硫酸化的活性小39倍并且比DES 12.5％硫酸化的活性小12倍。
6.7实施例7硫酸化多糖的体外抗病毒评估已经实验了下面化合物的体外抗病毒活性样品3(硫酸葡聚糖，17-20％硫，分子量39,700)、样品4(硫酸葡聚糖，9.5％硫，分子量30,000)和样品6(硫酸葡聚糖，12.2％硫，分子量36,000)。所有三种化合物都表现出针对HIV-1 RoJo病毒的显著抗病毒活性。
还针对一系列HIV-1临床分离物，包括亚型代表性分离物SIV和HIV-2，评估了DES 9.5％硫酸化和DES 12.5％硫酸化。还评估了单核细胞/巨噬细胞中HIV-1 ADA和BaL复制的抑制。
如上在实施例4中描述的制备了DES 9.5％硫酸化和DES 12.5％硫酸化。
6.7.1病毒从NIAID AIDS Research和Reference Reagent Program得到1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)株系Ba-L、ADA、SIVmac251、HIV-2(CDC310319)和亚型代表性菌株(表6)。低传代儿科分离物SLKA、WeJo和TeKi来自南方研究所的实验室。多种药物抗性病毒MDR-769来自一名有丰富经验的抗逆转录病毒患者并显示出表7中概述的抗性谱和基因型。
表6亚型代表性病毒
表7MDR 769病毒的表型和基因型
表7中粗体型突变代表所示基因中的关键抗性突变。
PBMC分离和胚化如实施例6中描述的得到外周血单核细胞(PBMC)。
PBMC测定法如实施例6中描述的实施PBMC测定法。
单核细胞分离、培养和感染如上面关于PBMC所描述的，通过ficoll hypaque纯化淡黄色膜，然后通过塑料粘附从正常HIV-1阴性供体分离外周血单核细胞。在许多情况中，使用与产生PBMC群体相同的供体产生单核细胞/巨噬细胞，然而，不像PBMC群体，单核细胞/巨噬细胞供体永不合并。在补加10％人混合AB血清(热失活的)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/ml链霉素、和10μg/ml庆大霉素且没有酚红的RPMI 1640培养基中附着2小时后，洗涤培养物以除去未附着的细胞。通过用无Ca2+和Mg2+的PBS剧烈移液(pipetting)，从塑料释放单核细胞。附着的细胞通过非特异酯酶染色(α-丁酸萘酯特异性酯酶，Sigma ChemicalCo.)评定纯度，和/或通过锥虫蓝染料排斥确定生存力，计数并以1×106个单核细胞/ml重悬在补加10％胎牛血清(热失活的)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/ml链霉素、和10μg/ml庆大霉素的RPMI 1640中。然后培养单核细胞(1×105个/0.2cm孔)6天，让细胞成熟到类似巨噬细胞的表型。在第6天，培养物被洗涤3次以除去任何未附着的细胞并加入系列稀释的受试化合物，然后如果孔的显微观察表明单核细胞/巨噬细胞单层的70％或更大的汇合，那么加入预-滴定量的HIV-1病毒。感染后24小时通过除去培养基最后一次洗涤培养物，加入新鲜化合物并继续培养6天。使用标准化的微量滴定板格式进行测定，该格式仅使用96孔板的内部60个孔用于测定目的。外面的行含有培养基并作为蒸发屏障。每板含有细胞对照孔(仅细胞)、病毒对照孔(细胞加病毒)，和实验孔(药物加细胞加病毒)。测定结束时通过无细胞的上清液的商业途径可得到的p24 ELISA测定法(Coulter)测量HIV p24抗原含量以评估病毒复制，并通过MTS染料还原测定化合物细胞毒性。AZT、HIV-1反核苷转录酶抑制剂和硫酸葡聚糖，一种附着抑制剂，用作阳性对照化合物并在每次测定中平行运行。在测定结束时，从培养箱除去培养板并显微观察。记录任何独特的发现。
细胞生存力的MTS染色如实施例6中描述的实施MTS染色。
培养上清液的逆转录酶测定法如实施例6中描述的测量无细胞上清液逆转录酶(RT)活性。
P24抗原ELISAELISA试剂盒购买于Coulter Electronics。根据生产商的教导实施测定法。在每个测定中产生对照曲线以准确定量每个样品中的p24抗原的量。使用Molecular Devices Vmax平板读出器通过450nm处的分光光度分析得到数据。使用Molecular Devices Soft Max软件包从光密度值计算终浓度。
结果计算IC50(病毒复制的50％抑制)、TC50(细胞生存力的50％减少)和治疗指数(TI，TC50/IC50)，结果在表8中总结。
每个试验的抗病毒数据包括来自病毒复制的一式三份试验(对于PBMC的RT(cpm)，对于单核细胞的p24(pg/ml))和MTS染料还原测量细胞生存力(OD490)的相关原始数据值。通过线性回归计算IC50和TC50值。TI代表TC50/IC50的比，并用于确定化合物之间的相对潜能。图解表示显示了抗病毒效能(％VC)和化合物毒性(％CC)之间的关系，其分别表达为对照、病毒无化合物或细胞无化合物的百分比。
表8作用试验范围的总结
1硫酸葡聚糖(μg/ml)用作对照化合物。
表8表明DES 12.5％硫酸化是比DES 9.5％硫酸化更强的HIV-1复制抑制剂。DES 9.5％硫酸化的IC50为5.1到＞100μg/ml(19倍)，DES12.5％硫酸化的IC50为0.6到11.7μg/ml(19倍范围)，从而，它们的抗病毒的潜能范围是相当的。尽管两种化合物之间的活性存在基本差异，但是两种化合物通常都具有抗宽范围的受试HIV-1分离物的活性，以及表现出抗多种药物抗性病毒SIV和HIV-2的活性。因而这些化合物是广谱抗逆转录病毒的。
DES 12.5％硫酸化具有抗所有受试病毒的活性。其抗C亚型(IC5010.3μg/ml)和G亚型病毒(IC5010.3μg/ml)的活性最小。其还有效抑制HIV-1 ADA的复制。使用HIV-2的临床分离物和SIV的SIVmac251分离物，DES 12.5％硫酸化也表现出良好的抗病毒活性。其还表现出针对多种药物抗性病毒分离物MDR769的显著活性。从而，DES 12.5％硫酸化具有抗HIV-1临床分离物、多种药物抗性病毒和其他逆转录病毒的广谱活性。
DES 9.5％硫酸化表现出对各种受试病毒的不同种类的应答(IC50的变化性)，活性为无活性到有活性。以前已经阐明了在HIV-1 RoJo感染的PBMC中DES 9.5％硫酸化比DES 12.5％硫酸化的活性更小，该差异在这里再次得到证明(活性低37倍)。DES9.5％硫酸化对一些病毒(ADA和Ba-L和G亚型病毒)无活性，对这些病毒的抗病毒曲线的检查表明在更高的受试浓度将有活性。DES 9.5％硫酸化还具有抗MDR769HIV-1株系(IC5013μg/ml)和HIV-2临床分离物(IC505.1μg/ml)的活性。从而，尽管低于所有潜能，但是其仍然具有抗多种药物抗性HIV-1和HIV-2的高潜能。
针对临床分离的HIV-1和两种其他逆转录病毒(HIV-2和SIV-1)试验了DES 9.5％硫酸化和DES 12.5％硫酸化并发现它们是广谱抗逆转录病毒的。此外，这些结果表明这些化合物具有抗携带对RT抑制剂的多种药物抗性的T215Y突变的抗性临床分离物的活性。该数据还表明尽管基于IC50，DES 12.5％硫酸化比DES 9.5％硫酸化更有效，但是针对所列病毒它们的IC50范围是相当的。从而，可能两者通过类似作用机理抑制病毒复制。最后，这两种化合物具有抗HIV-2和SIV-1的活性这一论证表明它们可应用于其他逆转录病毒。
6.8本发明化合物的生物分布通过静脉内blus或经口管饲法施用对来自Charles River实验室的雄性Sprague-Dawley大鼠(Raleigh，NC；约377-402g)服用[3H]Des6 40K。在给药后6或12小时收集的样品中定量血浆、淋巴和颈部淋巴结中的氚含量分布。
研究设计在表9中概述。大鼠被分成三个治疗施用组。在磷酸缓冲液媒介物(pH＝7.4)中制备剂量以将它们以大约1.8ml/kg(iv)和2.1mL/kg(经口管饲法)的适当体积递送。
给药后在第6或12小时收集生物样品的时间之前，将动物用开他敏/甲苯噻嗪(7∶1，Ca.120mg/kg)麻醉，并且如Waynforth，H.B.和Flecknell，P.A.(1992)大鼠实验和手术技术(Experimental andSurgical Technique in the Rat)，第二版，Academic Press，NewYork中描述的将导管插入胸淋巴管。样品分析时，通过心脏穿刺收集血液并通过淋巴管导管收集淋巴。将血液在Ca.1000g离心10分钟以得到血浆。在表9中指定的时间从每只动物收集颈部淋巴结。除了另外指出，对收集的所有生物样品通过液体闪烁光谱测定法一式两份地定量总放射性。
表9.研究设计和给药
ND-由于受试物品不足量而没有给药的动物。
研究结果在表10中描述。除了列出血浆、淋巴和淋巴结中总放射标记含量，还提供了每只动物的淋巴∶血浆和淋巴结∶血浆比。总之，与经口施用相比，在静脉内施用处理的动物中[3H]Des6 40K相关的总放射性浓度最高，与12小时处相比，血浆和淋巴中最高浓度在6小时处。12小时处的血浆和淋巴[3H]Des6 40K-eq浓度为6小时处所得浓度的约1-2％。然而，静脉内施用后，淋巴结中的总放射性浓度在这两个时间点是类似的。组2中的动物G961在麻醉后和胸管的导管插入术以收集淋巴之前死亡。不能从该动物收集淋巴；然而，收集了血浆和淋巴结以定量总放射性。发现在这些收集的生物介质中的总放射性比从手术幸存下来的其他两只大鼠的大的多。观察到该动物中的淋巴结比组2中的其他两只动物的大。
经口施用[3H]Des6 40K后，血浆总放射性的浓度与静脉施用后12小时处所得的可以相比。经口施用后淋巴中的平均总放射性约为静脉内施用后12小时处所得平均总放射性的约63％；而淋巴结中总放射性仅为静脉内施用后那些所得的约0.4％。
静脉内施用后6-和12-小时时间点之间大鼠中淋巴∶血浆比增加(分别比较6和12-小时时间点的0.14和0.64对照1.7和1.3)，而血浆总放射性显著降低了。经口施用后淋巴/血浆比约为1，表明在12小时处这两种介质中总放射性的均等分布。
12-h时间点的淋巴结血浆比例与6h处所得比例相比增加很大程度。这种随着时间的增加比在相同时间段内在淋巴中所得的大的多。这些数据表明[3H]Des6 40K相关的放射性更大程度地分布到淋巴结并且从该组织清除的速度缓慢。
相比，经口施用后淋巴结中的分布谱是不同的，其中淋巴结∶血浆仅为约0.50-0.82，并证明通过经口途径，较少的总放射性分布到淋巴结。
表10.生物样品中总放射标记含量
a仅有足够剂量可对组1中的两只大鼠给药。
b大鼠G961接受麻醉后死亡。没有得到淋巴液；然而收集了血浆和淋巴结。
c仅得到用于分析一个等分试样的足够淋巴。大鼠G958中颈部淋巴结没找到，并且没有被收集。
ND-未确定。
前面已经阐明了本发明的相关和重要的特征。本领域中技术人员将理解可以设计许多修改和实施方案。因此，所附权利要求计划覆盖所有这些修改和实施方案。
权利要求
1.治疗或预防人微生物感染的方法，该方法包括对需要该治疗或预防的人施用治疗有效量的硫酸化多糖，所述硫酸化多糖的硫含量相对于简单糖残基高于6％并且低于13％，其中分子量高于5,000g/mol并且感染不是疱疹感染。
2.治疗或预防人微生物感染的方法，该方法包括对需要该治疗或预防的人施用治疗有效量的硫酸化多糖，所述硫酸化多糖的硫含量相对于简单糖残基高于6％并且低于13％，其中分子量高于40,000g/mol。
3.权利要求1的方法，其中硫含量高于7％且低于13％。
4.权利要求3的方法，其中硫含量高于8％且低于13％。
5.权利要求4的方法，其中硫含量高于9％且低于13％。
6.权利要求1的方法，其中微生物感染是病毒感染、细菌感染、寄生虫感染或真菌感染。
7.利要求6的方法，其中病毒感染由DNA病毒导致。
8.权利要求6的方法，其中病毒感染由RNA病毒导致。
9.权利要求7的方法，其中DNA病毒是双链DNA病毒或单链DNA病毒。
10.权利要求8的方法，其中RNA病毒是双链RNA病毒、负义单链RNA病毒、正义单链RNA病毒，或者双义RNA病毒。
11.权利要求9的方法，其中双链DNA病毒是嗜肝DNA病毒、疱疹病毒、痘病毒、虹彩病毒、乳多空病毒，或腺病毒。
12.权利要求9的方法，其中单链DNA病毒是圆环病毒或细小病毒。
13.权利要求10的方法，其中双链RNA病毒是呼肠孤病毒或双RNA病毒。
14.权利要求10的方法，其中负义单链RNA病毒是弹状病毒、线状病毒、副粘病毒，正粘病毒、布尼亚病毒、或沙粒病毒。
15.权利要求10的方法，其中正义单链RNA病毒是细小RNA病毒、杯状病毒、星状病毒、披膜病毒、黄病毒、逆转录病毒或动脉病毒。
16.权利要求6的方法，其中病毒感染由有包膜的病毒导致。
17.权利要求6的方法，其中病毒感染不是疱疹病毒感染。
18.权利要求6的方法，其中病毒感染不是HSV-1或HSV-2感染。
19.权利要求6的方法，其中病毒感染不是逆转录病毒感染。
20.权利要求6的方法，其中病毒感染不是HIV-1或HIV-2感染。
21.权利要求6的方法，其中病毒感染是HIV-1或HIV-2感染。
22.权利要求2的方法，其中病毒感染是逆转录病毒感染。
23.权利要求22的方法，其中逆转录病毒感染是HIV-1或HIV-2感染。
24.权利要求2的方法，其中病毒感染是疱疹病毒感染。
25.权利要求24的方法，其中疱疹病毒感染是HSV-1或HSV-2感染。
26.权利要求1的方法，其中硫酸化多糖是共带电的阴离子多糖。
27.权利要求26的方法，其中通过羧甲基基团、磺酸根基团、硫酸根基团或它们的组合使共带电的阴离子多糖共带电。
28.权利要求26的方法，其中病毒感染是逆转录病毒感染。
29.权利要求28的方法，其中逆转录病毒感染是HIV-1或HIV-2感染。
30.权利要求26的方法，其中病毒感染是疱疹病毒感染。
31.权利要求30的方法，其中疱疹病毒感染是HSV-1或HSV-2感染。
32.权利要求1的方法，其中硫酸化多糖是左旋的。
33.权利要求1的方法，其中硫酸化多糖具有约5,000到约1,000,000的分子量。
34.权利要求1的方法，其中硫酸化多糖具有高于25,000的分子量。
35.权利要求34的方法，其中硫酸化多糖具有高于40,000的分子量。
36.权利要求1的方法，其中硫酸化多糖具有高于500,000的分子量并且局部施用。
37.权利要求1的方法，其中硫酸化多糖含有通过α-1，6键连接的D-吡喃葡萄糖残基。
38.权利要求1的方法，其中硫酸化多糖含有L-吡喃葡萄糖残基。
39.权利要求1的方法，其中硫酸化多糖是硫酸化葡聚糖。
40.权利要求1的方法，其中硫酸化多糖不是硫酸糊精、环糊精或角叉菜胶。
41.治疗或预防人微生物感染的方法，该方法包括对需要该治疗或预防的人施用治疗或预防可接受量的硫含量高于6％并且低于13％的硫酸化葡聚糖。
42.治疗或预防人微生物感染的方法，该方法包括对需要该治疗或预防的人施用治疗或预防可接受量的分子量高于40,000并且硫含量高于6％并且低于13％的硫酸化葡聚糖。
43.权利要求41的方法，其中硫酸化葡聚糖具有高于5,000的分子量。
44.权利要求43的方法，其中硫酸化葡聚糖具有高于25,000的分子量。
45.权利要求41的方法，其中硫酸化葡聚糖的硫百分比高于7％并且低于13％。
46.权利要求41的方法，其中硫酸化葡聚糖的硫百分比高于8％并且低于13％。
47.权利要求41的方法，其中硫酸化葡聚糖的硫百分比高于9％并且低于13％。
48.权利要求41的方法，其中通过羧甲基基团、磺酸根基团、硫酸根基团或它们的组合使硫酸化葡聚糖共带电。
49.权利要求41的方法，其中微生物感染是病毒感染、细菌感染、寄生虫感染或真菌感染。
50.权利要求49的方法，其中病毒感染由DNA病毒导致。
51.权利要求49的方法，其中病毒感染由RNA病毒导致。
52.权利要求49的方法，其中病毒感染由有包膜的病毒导致。
53.权利要求50的方法，其中DNA病毒是双链DNA病毒或单链DNA病毒。
54.权利要求51的方法，其中RNA病毒是双链RNA病毒、负义单链RNA病毒、正义单链RNA病毒，或者双义RNA病毒。
55.权利要求53的方法，其中双链DNA病毒是嗜肝DNA病毒、疱疹病毒、痘病毒、虹彩病毒、乳多空病毒，或腺病毒。
56.权利要求53的方法，其中单链DNA病毒是圆环病毒或细小病毒。
57.权利要求54的方法，其中双链RNA病毒是呼肠孤病毒或双RNA病毒。
58.权利要求54的方法，其中负义单链RNA病毒是弹状病毒、线状病毒、副粘病毒，正粘病毒、布尼亚病毒、或沙粒病毒。
59.权利要求54的方法，其中正义单链RNA病毒是细小RNA病毒、杯状病毒、星状病毒、披膜病毒、黄病毒、逆转录病毒或动脉病毒。
60.权利要求49的方法，其中病毒感染不是疱疹病毒导致。
61.权利要求60的方法，其中病毒感染不是HSV-1或HSV-2导致。
62.权利要求49的方法，其中病毒感染不是由逆转录病毒导致。
63.权利要求62的方法，其中病毒感染不是由HIV-1或HIV-2导致。
64.权利要求49的方法，其中病毒感染由HIV-1或HIV-2导致。
65.治疗或预防哺乳动物中微生物感染的方法，该方法包括对需要该治疗或预防的哺乳动物施用治疗有效量的组合物，所述组合物包括硫酸化多糖，该多糖中每个葡萄糖残基硫取代百分比高于6％并且低于13％，其中硫百分比范围对于组成性硫酸根基团与导致感染的微生物之间的最大相互作用是有效的，并且其中该硫酸化多糖基本上不通过哺乳动物中细胞受体结合而被内吞或降解，从而在体内保持抗微生物活性。
66.权利要求65的方法，其中硫酸化多糖是硫酸化葡聚糖。
67.权利要求65的方法，其中微生物感染是病毒感染、细菌感染、寄生虫感染或真菌感染。
68.权利要求65的方法，其中所述哺乳动物是人。
69.权利要求65的方法，其中所述组合物是无菌的。
70.治疗或预防哺乳动物中微生物感染的方法，该方法包括对所述哺乳动物施用治疗有效量的高碘酸盐处理的阴离子多糖。
71.权利要求70的方法，其中高碘酸盐处理的多糖是硫酸化多糖。
72.权利要求70的方法，其中硫酸化多糖是硫酸化葡聚糖。
73.权利要求70的方法，其中所述哺乳动物是人。
74.权利要求70的方法，其中微生物感染是逆转录病毒感染。
75.权利要求74的方法，其中逆转录病毒感染是HIV-1或HIV-2感染。
76.权利要求70的方法，其中微生物感染是疱疹病毒感染。
77.权利要求76的方法，其中疱疹病毒感染是HSV-1或HSV-2感染。
78.权利要求1、2、41、42、65、或70的方法，其还包括施用额外的治疗剂或吸收增强剂。
79.权利要求1的方法，其中治疗或预防有效量为每天约0.001到200mg/kg。
80.权利要求79的方法，其中多糖的治疗或预防有效量为每天约0.005到100mg/kg。
81.权利要求1的方法，其中硫酸化多糖的治疗或预防有效量为约0.1mg/kg/天到约1,500mg/kg/天。
82.权利要求1的方法，其中人是无免疫应答的人。
83.权利要求1的方法，其中治疗或预防有效量的硫酸化多糖通过肠胃外施用。
84.权利要求1的方法，其中治疗或预防有效量的硫酸化多糖经口施用。
85.权利要求1的方法，其中治疗或预防有效量的硫酸化多糖经局部施用。
86.控制将要全身性施用于哺乳动物的硫酸化多糖的硫酸化的方法，该方法包括提供硫酸化多糖，该多糖的硫酸化足够消除或减少该硫酸化多糖被高电荷密度聚阴离子细胞受体结合而保持抗微生物活性；和将该硫酸化多糖施用于哺乳动物。
87.治疗微生物感染的药物组合物，其含有治疗有效量的硫百分比大于6％并且小于13％的硫酸化多糖和适宜的载体。
88.治疗微生物感染的药物组合物，其含有治疗有效量的硫百分比大于6％并且小于13％并且分子量大于25,000的硫酸化多糖和适宜的载体。
89.治疗微生物感染的药物组合物，其含有治疗有效量的硫百分比大于6％并且小于13％并且分子量大于40,000的硫酸化多糖和适宜的载体。
90.权利要求87、88或89的药物组合物，其中硫酸化多糖关于硫百分比、分子量或者两者是均一的。
91.预防性装置，其涂有硫含量高于6％并且低于13％的硫酸化多糖。
92.消毒组合物，其含有凝胶剂、泡沫液、洗剂、霜剂、溶液剂、糊剂或粉剂形式的硫含量大于6％并且小于13％的硫酸化多糖。
全文摘要
本发明提供了用硫酸化多糖治疗或预防哺乳动物中微生物感染的方法和组合物，其中该多糖的硫酸化程度对于组成性硫酸根基团与导致感染的微生物之间的最大相互作用是有效的，并且其中该硫酸化多糖基本上不通过哺乳动物中细胞受体结合而被内吞或降解，从而在体内保持抗微生物活性。
文档编号A61K31/737GK1688320SQ03824188
公开日2005年10月26日 申请日期2003年4月24日 优先权日2002年8月13日
发明者W·D·康珀 申请人:蒙纳什大学