专利名称：可自发绿色荧光能转移的人肝癌细胞系的制作方法
技术领域：
本发明属微生物动物细胞系领域，具体涉及可自发绿色荧光，具转移能力的人肝癌细胞系，及其建立方法。
背景技术：
我国是全球肝癌高发区，每年约20万人死于肝癌，占全球肝癌死亡人数的一半左右。现代医学对肝癌进行科学研究一百多年，虽然取得了不少成绩，但肝癌人群的总体5年生存率至今仍只有3％左右，而提高肝癌预后的最大障碍是其极高的侵袭和转移率，即使是根治性手术切除，仍有50％的病人会在5年内出现转移或复发。因此，深入研究肝癌转移复发的内在机制及其相应的干预治疗，已成为进一步改善肝癌预后的关键。为此目的，必须建立适宜的人肝癌研究模型。目前普遍应用的人肿瘤转移模型，是将人肿瘤接种于免疫缺陷动物，主要是指在裸小鼠体内形成的人癌裸小鼠转移模型，和能在免疫缺陷动物体内发生转移的人肿瘤细胞系。复旦大学肝癌研究所曾建立了人肝细胞癌裸小鼠模型(肿瘤1986，610-13)、高转移人肝细胞癌裸小鼠模型(Int J Cancer 1996，66239-243)、高转移人肝细胞癌细胞系(Br JCancer 1999，81814-21)，不同转移潜能的人肝癌细胞克隆株(WorldJ Gastroenterol 2001，7630-636)。这些为研究肝癌转移提供了可贵的实验材料。然而，纵观国内外的人肝癌模型，均无法早期发现肝癌的复发、转移及对转移灶进行示踪，也无法实时观察肿瘤的生长、复发转移及与之密切相关的肿瘤血管形成等情况，在评估药物或其他干预治疗的效果上也较为困难。
发明内容
本发明的目的是建立稳定表达自发性绿色荧光的高、低转移人肝癌细胞系。
本发明采用从高转移人肝癌细胞系，(MHCC97，Br J Cancer 1999，81814-21)中分出的高转移人肝癌细胞系MHCC97-H、和低转移人肝癌细胞系MHCC97-L(World J Gastroenterol 2001，7630-636)为母细胞，通过脂质体转染法(DOSPER转染试剂，Cat.No.1811169，罗氏公司，德国)将pIRES2-EGFP质粒(PT3267-5，Clontech公司，美国)，分别转染上述细胞株中，经新霉素(G418)体外连续筛选，得到可稳定表达绿色荧光的细胞克隆，按常规方法分别扩增建系，得绿色荧光高、低转移人肝癌细胞系，分别命名为MHCC97-HG(保藏号CGMCC No1063)和MHCC97-LG(保藏号CGMCC No1062)。
经体内外荧光表达检测、基本生物学特性及体内外转移能力系列实验检测，本发明的细胞系具有以下特点1.在体外常规培养下，MHCC97-HG与MHCC97-LG细胞均能稳定发出绿色荧光，激发波长530nm，种植到裸鼠皮下及肝脏原位后，肝脏原位肿瘤及其转移灶均可在活体荧光显微镜下观察到发出的绿色荧光。
2.MHCC97-HG与MHCC97-LG的一般生物学特性基本一致，细胞均呈多边形上皮样，贴壁生长，接触性生长抑制丧失，亚三倍体核型，染色体数目50-58条，在裸鼠皮下及肝脏原位均可成瘤。
3.MHCC97-HG与MHCC97-LG的侵袭、转移能力有明显差别，MHCC97-HG细胞侵袭转移能力较MHCC97-LG显著增高，其S期细胞的比例提高了7.5％；细胞生长明显加快，细胞倍增时间缩短4小时；浸润、迁徙能力是后者的2-4倍；种植于肝脏原位后出现100％的肝内和肺转移，而MHCC97-LG仅为10-30％，转移率提高3倍以上，发生肝内及肺转移时间早，转移灶大且数目多；肿瘤血管形成活跃，新生血管数明显增多。
结果表明，本发明人肝癌细胞系稳定整合绿色荧光蛋白基因，可稳定表达绿色荧光，种植到裸鼠皮下或肝脏原位种植后，可容易地在活体荧光显微镜下观察到肿瘤组织及肿瘤转移灶发出的绿色荧光；因其母细胞取自同一个肝癌病人的肿瘤组织，故遗传背景高度相似，但MHCC97-HG比MHCC97-LG转移能力却明显为高，且较之其母细胞MHCC97-H显示出更高的转移能力，为人肝癌的基因比较研究提供了依据。本发明带自发荧光的人肝癌高、低转移细胞系，在肝癌转移复发、肿瘤血管形成及抗转移药物筛选等肝癌基础及临床研究方面有着广阔的应用前景。
图1是荧光显微镜下MHCC97-HG和MHCC97-LG细胞及其原位肿瘤可稳定表达绿色荧光。
图2是体外侵袭实验和体内自发性肺转移实验结果，其中，左侧均为MHCC97-HG，右侧MHCC97-LG，A、B为Borden小室，箭头示穿膜细胞，光镜，200×；C、D为肺HE染色，箭头所示为肺转移灶，光镜，200×；E、F为肺冰冻切片，箭头所示为肺转移灶，光镜及荧光显微镜，200×。
图3是肿瘤微血管密度检测及肝脏原位荷瘤裸鼠腹部皮肤窗活体观察肿瘤血管形成及肿瘤转移结果，其中，A/BMHCC97-HG/MHCC97-LG，抗CD31免疫荧光染色，箭头所示为肿瘤血管，荧光显微镜，200×；C活体观察肿瘤血管形成，箭头所示为肿瘤血管；D活体观察肿瘤转移，箭头所示为肝内转移灶，活体荧光显微镜，80×。
具体实施例方式
实施例1建立绿色荧光高、低转移人肝癌细胞系。
1.将MHCC97-H及MHCC97-L细胞按3×105细胞/每孔分别加入六孔板，每孔加2ml含10％FCS(Hyclone，Utah，USA)的DMEM培养液(GIBCOBRL，Grand Island，NY，USA)，孵育至细胞有60～80％汇聚；2.转染当天更换1ml DMEM(加5％FCS)培养液，37℃孵育1h；3.准备转染液溶液A1.5ug的pIRES2-EGFP(PT3267-5，ClontechLaboratories Inc.，Palo Alto，CA，USA)质粒DNA用HBS缓冲液稀释至50ul(30ug/ml)/每孔；溶液B6ulDOSPER(Cat.No.1811169，Roche Molecular Biochemical s，Germany)用HBS缓冲液稀释至50ul(120ug/ml)/每孔；混合A液与B液，轻柔振荡，15～25℃孵育15min；4.每孔逐滴加入转染液，边振荡混匀；37℃孵育6h；5.吸出培养液，每孔加2～3ml新鲜DMEM(加10％FCS)培养液，37℃常规培养24h。
6.G418筛选在培养液中加入G418，起始浓度450ng/ml，在3周时间内浓度逐渐递增到800ng/ml，直到细胞逐渐单克隆化，取残余克隆分别扩增培养，选取荧光显微镜下发光强度最高的两个克隆分别命名为MHCC97-HG(源自MHCC97-H)及MHCC97-LG(源自MHCC97-L)。
7.在无G418筛选压力下常规培养36天后鉴定其荧光细胞百分率及其他一般生物学特性。常规冻存后复苏成活良好，荧光强度稳定。
8.取MHCC97-HG及MHCC97-LG细胞各5×106/0.2毫升接种于裸小鼠皮下。裸小鼠为BALB/C-nu/nu，雄性，4-6周龄，购于中国科学院上海药物研究所，无特殊病原体环境下饲养。2周后皮下瘤生长至直径约1.0cm，取皮下瘤切成直径1mm的瘤组织小块原位接种于裸鼠肝脏，5周后取出肿瘤，观察结果表明，原位肿瘤及转移灶有绿色荧光。
表1是细胞基本特性比较，表2是原位肿瘤自发性转移能力比较。
表1.
MHCC97-HG MHCC97-LG36天荧光细胞百分率 99.6％ 99.5％中期染色体数(主要范围/比例) 52-58(57％)50-56(59％)细胞周期(G0-G1/S/G2-M，％) 68.5/22/9.577/14.5/8.5细胞倍增时间(h) 32.0 36.1运动/侵袭能力(穿膜细胞数/HP)48.8/58.2 24.9/12.1表2.
MHCC97-HG MHCC97-LG35天后原位肿瘤大小(cm) 1.47±0.20 1.00±0.18a腹壁侵犯8/10 3/10b血性腹水2/10 0/10肝内转移10/10 1/10b横膈转移6/10 1/10b局部淋巴结转移 9/10 2/10b肺转移 10/10 3/10b
权利要求
1.可自发绿色荧光能转移的人肝癌细胞系(CGMCC No1063，1062)，其特征是能稳定发出绿色荧光，细胞呈多边形上皮样，贴壁生长，接触性生长抑制丧失，亚三倍体核型，染色体数目50-58条，在裸鼠皮下及肝脏原位可成瘤，肝内和肺转移率高，转移时间早，转移灶大且数目多，肿瘤血管形成活跃。
2.按权利要求1所述的可自发绿色荧光能转移的人肝癌细胞系，其特征是包括绿色荧光高转移人肝癌细胞系，命名为MHCC97-HG(CGMCCNo1063)和绿色荧光低转移人肝癌细胞系，命名为MHCC97-LG(CGMCCNo1062)。
3.权利要求1所述的人肝癌细胞系，其特征是通过下述方法建立，采用从高转移人肝癌细胞系中分出的高转移人肝癌细胞系MHCC97-H和低转移人肝癌细胞系MHCC97-L为母细胞，通过脂质体转染法将pIRES2-EGFP质粒，分别转染上述细胞株，经新霉素体外连续筛选，得到可稳定表达绿色荧光的细胞克隆，按常规方法分别扩增建系。
4.权利要求1所述的人肝癌细胞系，其特征是在体外常规培养下，MHCC97-HG与MHCC97-LG细胞均激发波长530nm，种植后，可观察活体发出的绿色荧光。
5.权利要求1所述的人肝癌细胞系，其特征是所述MHCC97-HG与MHCC97-LG的一般生物学特性基本一致。
6.权利要求1所述的人肝癌细胞系，其特征是其中MHCC97-HG细胞其S期细胞比例提高7.5％，细胞倍增时间缩短4小时，肝脏原位种植100％肝内和肺转移。
全文摘要
本发明属微生物动物细胞系领域，具体涉及可自发绿色荧光，具转移能力的人肝癌细胞系。本发明从高转移人肝癌细胞系中分出高、低转移母细胞，通过脂质体转染法将pIRES2－EGFP质粒转染上述细胞株，经新霉素体外连续筛选，得到可稳定表达绿色荧光的高、低转移细胞系，命名为MHCC97－HG(CGMCC No1063)和MHCC97－LG(CGMCC No1062)，本发明人肝癌细胞系种植后，可容易地在活体荧光显微镜下观察肿瘤组织及肿瘤转移灶，为人肝癌的基因比较研究提供了依据，在肝癌转移复发、肿瘤血管形成及抗转移药物筛选等肝癌基础及临床研究方面有着广阔的应用前景。
文档编号A61L27/38GK1546655SQ20031010929
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月11日 优先权日2003年12月11日
发明者徐泱, 孙惠川, 汤钊猷, 徐 泱 申请人:复旦大学附属中山医院