专利名称：由丹参水提物或丹参素制备防治骨质疏松症新药的制作方法
技术领域：
本发明涉及由唇形科植物丹参salvia miltiorrhiz Bge的水提物，或丹参的水溶性成分丹参素制备防治骨质疏松症的新药。丹参的水提物包括原儿茶醛(ProtocateChualdehyde)、丹参素(Danshen Su)等。由丹参的水溶性成分提取的丹参素，也称为D(+)β-(3，4-二羟基苯基)乳酸。
背景技术：
原发性骨质疏松症(包括绝经期后骨质疏松和老年性骨质疏松)是一种以骨量减少、骨组织微细结构退化(松质骨骨小梁变细、断裂，数量减少；皮质骨多孔、变薄)为特征的，以致骨的脆性增加，骨折危险性增加的全身性的老年性骨骼疾病。骨质疏松症是一种疾病，表现为骨量减少伴有在正常身体活动下骨骼脆性增加和骨骼疼痛等临床表征。由于骨量减少、骨的微细结构退化和骨的脆性增加，造成骨的生物力学强度下降，难以承载原有的或相对增加的载荷，可悄然发生微细骨折或完全骨折，严重影响老年人的生活质量，给患者、家庭和社会带来极大负担。骨质疏松症的流行病学研究表明，女性49岁绝经，52--60岁可患骨量减少，62--76岁可患骨质疏松，72--86岁可患严重骨质疏松症。除原发性骨质疏松外，继发性骨质疏松，特别是皮质类固醇性骨质疏松也面临严峻的现实，在接受皮质类固醇治疗的慢性疾病的病人中，最终也有30～50％发展为骨质疏松[1]，更严重的是导致股骨头坏死及股骨骨折，是不容忽视的医原性疾病问题。随时国民经济的发展，人民生活水平的提高，人口寿命逐渐延长，未来的社会将成为老年性社会。我国60岁以上老年人口已增长到1.34亿人，按照国际标准，我国已进入了老年社会。如果再加上60岁以下的中老年人口，其数量更为可观。作为老年性疾病之一的骨质疏松症和骨质疏松性骨折，已使越来越多的人深受其害，并已成为世界性关注的严重社会问题，我国已将它列为三大重点攻关研究的老年性疾病之一。WHO已对骨质疏松症制订出全球性战略目标，改善全世界对骨质疏松的诊断和处理，在各大学、研究所、制药公司已纷纷大副度增加经费以加速抗骨质疏松新药的研究与开发，因此防治老年性骨质疏松是保证人们身体健康，提高生活质量的一项十分迫切的研究课题。
目前认为骨质疏松是一种多病因的疾病，其基本病理机理是在骨代谢过程中骨吸收和骨形成的平衡出现缺陷，导致人体内的钙磷代谢失调，使骨密度逐渐减少而引起临床症状、其病因主要与年龄，内分泌紊乱，钙吸收不良，肢体废用以及免疫，营养、遗传等因素有关。在晚近20年，骨质疏松的药物治疗策略和途径主要是二大类，一为抗骨吸收的药物，二为促成骨药。临床使用中90％以上为抗骨吸收药物，如雌激素替代疗法，是治疗绝经后骨质疏松症的经典疗法。但雌激素引起生殖系统肿瘤的危险性已被肯定[2]，美国已宣称雌激素为致癌物之一；二磷酸盐类可有效治疗骨吸收所致骨量丢失，但长期应用副作用大，也不易作为预防用药；降钙素对溶骨性骨痛和骨质疏松作用显著，但治疗需个体化，也受到给药途径限制，且价格昂贵；目前关注的雌激素受体调节剂(ERMs)，由于保留了对骨骼的雌激素样作用而阻断对生殖系统的刺激作用，具有优势，已有2-3个新药进入临床III期试验(美国)。所有这些抗骨吸收剂，均抑制了因骨吸收而增加耦联的骨形成，使旧骨和新骨的转换率减少，长期应用影响骨的质量及力学性能[3]。目前促骨形成药已逐渐成为研究热点，短链甲状旁腺激素(PTH)是非常明显的促骨形成药，在美国也进入II期临床，但实验研究结果发现PTH可增加皮质骨多孔性(因同时增加皮质骨哈佛氏管的吸收)，降低骨折的远期疗效并未肯定[4]；活性VitD长期应用易致高血钙及尿钙症；氟化物是较早用于骨质疏松症的促骨形成药，但它易使类骨质增加而伴有骨矿化缺陷，限制了在临床广泛应用，主要源于它的安全范围窄，副作用大，疗效需进一步考证。
丹参为唇形科植物丹参salvia miltiorrhiza Bge的干燥根，近代已从中分离得多种化学成分，有脂溶性和水溶性两类，脂溶性成分有丹参酮I、丹参酮IIa、丹参酮IIb、隐丹参酮等；水溶性成分有原儿茶醛、丹参素(丹参酸甲)、丹参酸乙等。近年来对丹参的作用研究主要集中在改善心、肝、肺的缺血再灌注损伤、调节免疫应答和抗感染等方面，丹参的抗氧化作用，降血脂作用，抗凝、促纤溶作用，保肝作用，对肾脏的保护等作用已取得了重要的研究进展，在临床上已广为应用。从1934年至1976年间，国内外对丹参进行了大量研究工作，先后从中分离得到15种成分，测定了结构式，并依次命名为丹参酮(tanshinone，Tan)I、IIa、IIb，隐丹参酮，异丹参酮I、IIA，异隐丹参酮，羟基丹参酮IIa，丹参酸甲酯，miltirone，salviol，二氢丹参酮I，丹参新醌甲、乙和丙。研究表明，丹参酮类均含有邻醌或对醌结构。由于醌类成分易被还原为二酚类衍生物，后者再被氧化又易转变为醌，在转变过程中起电于传递作用；同时、它们在生物体内的代谢产物容易参与机体的多种生物化学反应，并作为生物反应的辅酶对某些生化反应起促进或干扰作用，因此表现出多种药理作用[12]。近年来研究已证明丹参酮IIa是一种新的有效的天然抗氧化剂，能消除心肌线粒体膜脂质过氧化过程中产生的脂类自由基，使线粒体呼吸功能不受影响。药理实验还证明了丹参酮IIa有抗动脉粥样硬化作用，抗菌消炎作用，抗肿瘤作用，其抗肿瘤作用机制可能与诱导肿瘤细胞分化、凋亡有关。丹参酮IIa作为新药已经上市，临床上主要用于治疗冠心病、痤疮、痛经、失眠症及抗菌消炎，如扁桃体炎、耳疖、化脓性骨髓炎、烧伤中的金葡菌感染，效果显著。丹参的水溶性提取物丹参注射液已广泛应用于临床治疗心脑血管病已达20多年。从丹参水溶性部分分离得到有效成分丹参素，即D(+)β-(3，4-二轻基苯基)乳酸。丹参素是丹参中的主要有效成分，且丹参素在丹参水溶性部分中含量较高，对丹参素的实验药理研究证明[13]丹参素能扩张心脑血管，抵抗血小板粘附聚集，清除氧自由基的作用。丹参素具有抑制细胞内源性胆固醇(Ch)合成的作用，具有抗脂蛋白氧化的作用，从而防止氧化蛋白对细胞的损伤。丹参素的药理作用研究还表明，丹参素可增加心血管系统的冠脉流量，降低心肌兴奋性和传导性，并保护心肌缺血缺氧，缩小心肌梗死范围。同时还有改善微循环，加速血液流速，抵抗血小板凝聚和血栓形成的作用。具有提高机体抗凝和纤溶活性的作用。丹参素可使收缩的冠状动脉扩张，用于拮抗吗啡镇痛时冠脉的收缩作用。丹参素还可用于皮肤病治疗。丹参素亦已初步试用于临床治疗冠心病，且有一定疗效。
发明内容
我们通过大量的动物实验研究和筛选，我们发现了唇形科植物丹参salviamiltiorrhiza Bge的干燥根丹参的水提取物，包括原儿茶醛(Protocate Chualdehyde)、丹参素(Danshen Su)等成分，特别是丹参素具有明显的防治骨质疏松的作用，丹参这种防治骨质疏松的用途径骨质疏松的治疗难题将具有重要的作用。
本发明的任务是用科学的工艺把丹参及其有效成份丹参素的提取物做成制剂，使该制剂用于人类防治骨质疏松症，该制剂既能阻止骨质的丢失，又能促进新骨的形成，为解决骨质疏松的难题提供新的用途。
解决这一任务的途径是这样实现的，选取唇形科植物丹参salvia miltiorrhiza Bge的干燥根，即中药称为丹参的药用部份，按传统的工艺加15倍水，分别蒸煮三次，每次2小时，过滤，合并三次滤液，浓缩至一定的浓度，作为丹参的水提物，同时，按已知的工艺提取丹参素和丹参酮，然后用本研究室建立大白鼠骨质疏松模型进行给药研究，比较观察这些受试品抗骨质疏松的药效学功能。
研究结果丹参的水提物，丹参素和丹参酮三个品种均有显著的预防实验动物骨质疏松的作用，效果最好的是丹参素，丹参的水提物和丹参酮也有较好的作用。丹参素可使去卵巢大鼠骨量显著增加，不发生骨质疏松，同时，对长期大量应用肾上腺糖皮质激素造成的大鼠骨质疏松也有很好的预防和治疗作用，丹参的水提物和丹参酮也有相同的作用。
具体实施例方式长期超生理剂量应用糖皮质激素可导致继发性骨质疏松以及由此引起的自发性骨折、无菌性坏死严重影响人们的生活质量。据Lane[1]等报道，在接受糖皮质激素慢性治疗的患者中，不论任何年龄，均有30-50％的可能性并发骨质疏松。目前治疗糖皮质激素性骨质疏松并没有理想的方法，原因是由此引起的骨质疏松机理复杂[1]。经典的骨吸收抑制药如雌激素、二磷酸盐类等副作用又大。因此，寻找有效防治糖皮质激素所致骨质疏松的药物有重要意义。
丹参是著名的传统中药，具有抗氧化、改善微循环防止血栓形成等多种功能，近年来又发现丹参可促进骨愈合[2]，预防股骨头坏死[3]，有效降低绝经期妇女骨质疏松血中骨吸收生物指标[4]，这些报道提示丹参可能是预防糖皮质激素导致骨代谢不良反应的有效药物。丹参的水溶性成份和脂溶性成份在化学结构上不同；前者主要含丹参素、儿茶醛A和B等，后者有丹参酮IIA和隐丹参酮等。不同提取方法及临床不同制剂其作用各异。为探讨丹参的水提成份是否具有调节骨代谢，防治骨质疏松的作用，我们通过建立长期应用糖皮质激素所致骨质疏松的大鼠体内模型，用骨组织形态计量学定量研究方法观察丹参水提物的作用效应，同时在体外采用大鼠成骨细胞的实验探讨丹参水提物和丹参素的作用机制及时效和量效关系，为阐明丹参是否具有抗骨质疏松新用途提供实验依据。
1材料与方法1.1材料1.1.1药物与试剂 丹参水提物(DWE)，由本天然药物实验室提取提供，经高效液相色谱(HPLC)测定，其中丹参素含量为0.25％，即每克生药得2.5mg纯丹参素。丹参素对照品(danshensu，SU)购自中国药品生物制品检定所，北京。醋酸泼尼松(广东仙居制药股份有限公司生产，批号981220)，Tetracyclin，Calcein荧光标记物(Sigma Chemical Co.，USA)，司坦唑醇(广西南宁百会药业集团有限公司，批号010214)，维生素D3(上海第九制药厂，批号010703)，葡萄糖酸钙(广西南宁百会药业集团有限公司，批号010901)，I型胶原酶(Sigma Co，USA)，透明质酸酶(Sigma Co，USA)，胰酶(Sigma Co，USA)，胎牛血清(Hyclone Laboratories)，Dulbecco’s modified Eagle’s medium培养基(DMEM，GibcoBRL)均购自括号所示地方。1.1.2实验动物4月龄SD雄性大鼠32只，体重228±10g(SPF级，由广东医学院实验动物中心提供，广东省实验动物质量合格证编号2002A014；广东省实验动物环境合格证编号2002B011)，喂养饲料中钙含量为1.33％，磷含量为0.96％，饲养于室温24℃-26℃，相对湿度67％的清洁环境中。
1.2方法1.2.1给药与分组 大鼠随机分为4组，对照组灌服溶剂对照溶液(Intact+Veh)，其余3组先清晨用醋酸泼尼松以2.7mg·kg-1·d-1灌胃，然后下午分别给予溶剂对照溶液(Pred+Veh)、丹参水提物5.0g·kg-1·d-1、丹参素12.5mg·kg-1·d-1，和综合治疗阳性组(司坦唑醇0.5mg·kg-1·d-1+维生素D3250IU·d-1+葡萄糖酸钙0.5g·kg-1·d-1，Pred+SDC)，所有动物灌胃给药，给药时间为12周。在动物处死(取骨标本)前14天和13天皮下注射tetracyclin(25mg·kg-1)，处死前4天和3天皮下注射Calcine(10mg·kg-1)进行体内双荧光标记，以观察骨形成的动态参数。
1.2.2骨成分测定及骨形态学标本制备 大鼠心脏抽血刺死，分离血清作血清Ca测定。取左侧尺骨，除净肌肉和软组织，80℃烘烤48h至恒重得骨干重，然后于6mol·L-1HCl，108℃温度下消化16h后过滤取过滤液，用ICP(电感偶合等离子体直读光谱仪)测定骨中钙(Ca)、磷(P)含量，以及骨羟脯氨酸(Hyp)含量(羟脯氨酸试剂盒为南京建成生物工程公司产品)。分离右侧胫骨，用慢速锯在近端作矢状打开髓腔，放入10％福尔马林缓冲液固定，然后脱水，脱脂作塑料包埋。用硬组织切片机分别切下不脱钙4μm和8μm切片，4μm切片用Goldner’sTrichrome染色[5]封片，进行骨计量学静态参数(static parameters)测量。8μm切片不染色封片作荧光观察进行骨计量学动态参数(dynamic parameters)测量。
1.2.3胫骨近端松质骨组织形态计量学参数测量及统计 用全自动图象分析系统(OsteoMeasureOsteoMetrics，Inc，USA)，按国际骨形态计量参数测量的定义和计算标准[6]，对右侧胫骨上段矢状面骨骺线下1mm和4mm之间的松质骨进行定量分析。静态参数包括骨组织面积(TV，mm2)、骨小梁面积(BV，mm2)、骨小梁表面周长(BS，mm)、破骨细胞数目(OC.N)和周长(OC.Pm)及其相应计算参数骨小梁面积百分率(BV/TV，％)、骨小梁数目(TbN，#/mm2)、骨小梁厚度(TbTh，μm)、骨小梁分离度(TbSp，μm)、破骨细胞数目指数(OC.N/BV，mm-2)和破骨细胞周长指数(OC/BS，％)。动态参数包括单荧光周长(SL.Pm)、双荧光周长(DL.Pm)和二次荧光标记间距(IrL.Wi，μm)及其计算参数矿化表面周长百分率(荧光标记周长百分率，MS/BS，％)、矿化沉积率(MAR，μm/day)、骨形成率BFR/BS(表示骨表面形成率，μm/d×100)、骨形成率BFR/BV(表示骨转换程度，％/year)和骨形成率BFR/TV(表示骨组织形成率，％/year)。所有数据以均数±标准差表示，用方差分析和q检验，P＜0.05有显著性差别。
1.2.4大鼠成骨细胞原代培养及药物对成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性测定 无菌条件下分离新生大鼠颅盖骨，用0.2％I型胶原酶和0.1％透明质酸酶系列消化后收集细胞，置于含10％胎牛血清的DMEM培养基培养。细胞融合后，用0.25％胰酶消化传代。将传一代的细胞按4×105个/ml浓度接种于48孔板，继续培养2天后，换含1％胎牛血清的DMEM培养液，同时加入不同浓度的药物(丹参水提物DWE的浓度单位是g·L-1，纯品丹参素SU的浓度单位是mg·L-1)，对照组加不含血清的DMEM或溶剂对照。分别于药物作用第2、10天测定细胞碱性磷酸酶活性(PNPP法)。测定时，去掉培养液，PBS冲洗，加入Triton-X100 100μl裂解细胞，然后加入含25mmol·L-1二乙醇胺，2mmol·L-1氯化镁和2mmol·L-1的PNPP(Sigma，Co.USA)反应液，37℃保温0.5小时后用0.1mol·L-1的NAOH 100μl终止反应，在酶标仪于405nm波长下测定OD值。酶活性增加百分率(％changes of control)＝(给药组OD值-对照组OD值)/对照组OD值×100％。
2结果2.1丹参水提物和丹参素对泼尼松干预的大鼠体重、骨成份及血钙的影响 由表1(Tab 1)可见，泼尼松降低大鼠体重(p＜0.05)、尺骨钙(Ca)含量(p＜0.05)和尺骨羟脯氨酸(HyP)含量(p＜0.01)，同时升高血钙(p＜0.05)。丹参水提物预防组和丹参素组全对抗泼尼松所造成的变化增加体重，增加尺骨Ca，骨HyP含量(p＜0.05)，降低血钙(p＜0.05)，特别是明显增加尺骨干重，高于正常对照组(p＜0.05)。综合治疗组可对抗泼尼松所造成的体重降低和血钙增加，但不能增加骨HyP的含量及骨干重。
表1丹参水提物和丹参素对泼尼松干预大鼠的体重、骨成分和血钙的影响组别体重 骨干重骨钙含量骨磷含量骨胶元含量 血清钙(g) (mg) (mg/g) (mg/g) (mg/g) (μg/ml)对照组 287±19 137±7.1 29.1±1.4 12.3±0.5 5.56±0.57 2.73±0.17泼尼松组250±20*130±1126.4±2.2*12.9±1.34.48±0.76**3.16±0.28*丹参水提物组298±26Δ202±11*Δ#28.9±2.0Δ12.9±0.65.91±1.4Δ#2.71±0.10Δ丹参素组299±23Δ205±10*Δ#29.3±2.1Δ12.8±0.55.89±1.3Δ#2.69±0.11Δ综合治疗组 308±22Δ144±8.2 27.8±1.5 13.8±1.34.35±0.46**2.77±0.12Δ与对照组比较，*p＜0.05**p＜0.01；与模型组比较，Δp＜0.05ΔΔp＜0.01；与综合组比较，#p＜0.05##p＜0.01。
2.2丹参水提物和丹参素对泼尼松干预的大鼠胫骨松质骨骨形态计量学参数的影响 由表2、3(Table2、3)可见，泼尼松使骨小梁面积降低了43％(p＜0.01)，伴随骨小梁数目减少(p＜0.01)、骨小梁厚度减少(p＜0.05)和骨小梁间隙增加(p＜0.01)，同时破骨细胞数目和周长明显增多(p＜0.01)。动态参数显示泼尼松有降低矿化骨形成的趋势，但差别无显著性(p＞0.05)，但可明显降低骨形成率参数BFR/TV(p＜0.01)。与泼尼松组比较，丹参水提物和丹参素预防组增加了75％的骨小梁面积(p＜0.01)，已与正常组大鼠骨量相当。同时增加骨小梁数目和厚度(p＜0.01)，减少间隙距离(p＜0.01)，减少破骨细胞数目和周长(p＜0.01)，增加骨形成率BFR/TV(p＜0.05)。综合预防组也可对抗泼尼松所致骨丢失和增加BFR/TV，但骨量的增加(57％)略比DWE组(75％)低。
表2丹参水提物和丹参素对泼尼松干预大鼠胫骨上段骨组织形态静态参数的影响骨小梁面积骨小梁数目 骨小梁厚度 骨小梁间隙 破骨细胞数目破骨细胞周长组别(％)(mm-1) (μm)(μm) (mm-2) (％)对照组 15.07±1.70 2.92±0.2351.86±6.48 292.88±25.5211.42±1.460.873±0.09泼尼松组8.83±0.98**1.98±0.20**44.47±2.43*463.53±54.54**38.38±8.65**2.54±0.34**
丹参水提物 15.47±2.87ΔΔ3.08±0.41ΔΔ50.13±5.84ΔΔ278.85±41.28ΔΔ14.72±2.14*ΔΔ1.12±0.15*ΔΔ丹参素组 14.67±2.56ΔΔ2.98±0.43ΔΔ49.85±5.32ΔΔ265.86±42.35ΔΔ14.36±2.22*ΔΔ1.10±0.13*ΔΔ综合治疗组 13.93±2.48ΔΔ2.83±0.50ΔΔ49.02±1.92ΔΔ311.03±56.31ΔΔ16.14±3.33*ΔΔ1.15±0.26*ΔΔ与对照组比较，*p＜0.05**p＜0.01；与模型组比较，Δp＜0.05ΔΔp＜0.01；与综合组比较，#p＜0.05##p＜0.01。I-％与对照组比较百分率变化；P-％与模型组比较百分率变化；S-％与综合组比较百分率变化。
表3丹参水提物和丹参素对泼尼松干预大鼠胫骨上段骨组织形态动态参数的影响双荧光周长百分率矿化沉积率骨表面骨形成率 骨转换率骨组织骨形成率组别(％)(μm/d) (μm/d×100) (％/year) (％/year)对照组 31.88±8.19 0.85±0.1610.28±3.98 336.6±140.849.3±17.7泼尼松组 29.81±9.02 0.81±0.258.91±3.97 332.8±142.529.6±13.2*丹参水提物组 28.70±9.51 0.90±0.159.52±3.47 312.0±94.0 50.0±23.0Δ丹参素组 27.85±9.36 0.89±0.149.45±3.52 316.0±96.4 49.3±22.0Δ综合治疗组 31.67±5.41 0.92±0.1110.81±2.85 366.1±89.0 51.3±15.6Δ与对照组比较，*p＜0.05**p＜0.01；与模型组比较，Δp＜0.05ΔΔp＜0.01；与综合组比较，#p＜0.05##p＜0.01。I-％与对照组比较百分率变化；P-％与模型组比较百分率变化；S-％与综合组比较百分率变化。
2.3丹参水提物和丹参素对体外培养的成骨细胞活性的影响 丹参水提物的浓度在0.5-10.0g·L-1范围可随浓度增加而刺激成骨细胞分泌碱性磷酸酶(p＜0.01)，以1.0、2.0g·L-1作用最强，浓度增加到10.0g·L-1时作用减弱，50g·L-1时可抑制成骨细胞。丹参素的浓度在0.1-5.0mg·L-1的范围内可刺激成骨细胞分泌碱性磷酸酶(p＜0.01)，低于0.01mg·L-1和高于10mg·L-1均无作用。丹参素促进ALP作用随时间延长作用明显增加，从第2天增加27％至第10天增加101％。结果表明丹参素对成骨细胞碱性磷酸酶活性有浓度依赖性和时间依赖性。丹参水提物的作用与丹参素作用相吻合，说明丹参水提物的作用物质很可能是丹参素。
2.4丹参水提物和丹参素能有效预防大鼠中枢毒性作用 本研究还观察到丹参水提物和丹参素制剂对泼尼松长期应用所造成的大鼠大脑功能下降有明显的预防作用。研究证明应用泼尼松可使大鼠海马结构发生形态学改变，特定区域单位面积神经锥体细胞数目下降，大锥体细胞发生明显核固缩性坏死，脑组织切片检查发现，对照组大鼠海马CA2和CA3区交界处神经元大小分布规则，细胞结构和层次清晰，呈C状排列。泼尼松组大鼠海马大锥体细胞数量下降，其中CA2和CA3区交界处362.5um长度范围内单位面积神经锥体细胞数下降9％；海马细胞结构紊乱、排列分散，胞体肿胀或皱缩，部分可见核固缩深染，甚至可见神经元坏死，大锥体细胞层中可见出现较多胶质细胞。一般情况下，神经元细胞核固缩现象极少见，而神经元细胞核发生固缩是细胞死亡前的表现，泼尼松组大鼠海马细胞发生明显的变化提示泼尼松长期应用可造成海马神经细胞死亡或加速神经元退化，提示糖皮质激素长期应用导致的机体衰老、记忆力衰退可能与海马细胞的凋亡有关。丹参水提物和丹参素组大鼠的单位面积海马神经元计数均有上升趋势，大鼠海马特定区域单位面积神经锥体细胞数目分别比泼尼松组上升11％和9％，镜下可见大锥体细胞排列规则，变性少，比泼尼松组明显改善，提示丹参水提物和丹参素可有效保护由糖皮质激素长期应用所导致的海马神经元损伤。
3讨论本实验结果显示，糖皮质激素在大鼠可引起类似人类的骨质疏松，表现为骨的无机物(Ca)和有机质物(HyP)均降低，骨量降低，伴随松质骨的骨结构异常，血钙增加，骨吸收增加和骨形成率减少。目前认为糖皮质激素造成的骨质疏松机制大致有三方面，(1)抑制成骨细胞的功能从而抑制骨基质的形成；(2)钙平衡失调引起继发性甲状旁腺激素(PTH)增高导致骨吸收增加，血钙增加；(3)对抗雄激素的作用。综合因素最终可导致骨形成减降，骨吸收增加，骨量丢失及骨结构的破坏，从而易致骨折的产生[1]。还有学者认为，激素可造成骨髓脂肪代谢紊乱，脂肪在骨细胞内沉积而导致成骨细胞死亡，并认为可引起骨髓微循环障碍和供血不足，两者可导致股骨骨质疏松和股骨头无菌性坏死[7，8]。因此，本实验选择能改善骨的脂质代谢和改善骨髓微循环的药物丹参为候选药物，目的是寻找能对抗糖皮质激素所致骨质疏松的新型药物。
研究结果表明丹参水提物和丹参素能完全对抗由泼尼松所致骨指标和血清钙的异常，表现为明显增加骨干重，骨钙和骨羟脯氨酸的含量，骨形态计量学分析发现能提高骨量和改善骨结构，降低骨小梁表面破骨细胞的数目和周长，增加骨形成率。骨有机质中骨胶原占90％以上，主要由成骨细胞分泌产生，羟脯氨酸(HyP)是骨胶原中特殊成分，约占12.5％，测定HyP含量则可反映骨有机质的相对含量，丹参水提物和丹参素均可使HyP增加比Ca增加更明显。此外，丹参水提物和丹参素均明显降低了骨小梁表面的破骨细胞数目和周长，降低血钙，可推测丹参水提物和丹参素纠正了由泼尼松引起的继发性甲状旁腺素(PTH)增加导致破骨细胞功能升高而引起增加血钙。这些结果表明丹参水提物和丹参素防止骨质丢失与增加骨有机质合成和抑制骨吸收有关。
研究结果还显示，丹参水提物和丹参素可刺激大鼠原代培养的成骨细胞分泌碱性磷酸酶，引起酶活性增加的丹参水提物中丹参素含量与纯品丹参素的浓度相对应，说明丹参水提物的作用物质可能就是丹参素。丁寅[9，10]等报导了丹参注射液有促进小鼠成骨细胞样细胞MC3T3-E1的碱性磷酸酶活性，并抑制小鼠骨髓培养中破骨细胞的生成。已有许多研究证实丹参素具有抗脂质氧化、扩张血管、改善微循环作用[11]，丹参的水溶性成份儿茶醛B可上调血管内皮生长激素及其受体的表达刺激微血管生成，促进微循环[12]，儿茶醛A还可抑制低密度脂蛋白(LDL)的氧化从而抗动脉粥样硬化[13]。因此，丹参水提物和丹参素保护糖皮质激素对骨的作用，可能与这些水溶性成份密切相关，它们可改善与骨重建相密切交流的骨髓微循环环境，提高成骨细胞功能和可能抑制骨髓脂质代谢，从而改善骨结构。
本实验还根据临床对糖皮质激素引起骨质疏松的预防原则设计了综合预防阳性组，药物包括司坦唑醇、VitD3和钙剂。目的检验造模的成功与否，及比较丹参水提物的疗效。结果显示综合组也有预防作用，但在增加骨量，骨质量(骨干重，骨钙，骨有机质)方面，丹参水提物超过综合组。对长期大量应用糖皮质激素引起的脑损害丹参水提物和丹参素有保护作用，综合预防阳性组没有。提示丹参水提物作用更优，为临床应用提供了充分依据。
综上所述，丹参水提物有效预防糖皮质激素所造的大鼠骨质疏松，其机制与促进成骨细胞活性，促进骨基质形成和抑制骨吸收有关。
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1.丹参的水提物在制备防治骨质疏松症的制剂中的应用。
2.丹参素在制备防治骨质疏松症的制剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了本发明涉及由唇形科植物丹参salvia miltiorrhiz Bge的水提物，或丹参的水溶性成分丹参素制备防治骨质疏松症的新药。丹参的水提物包括原儿茶醛(Protocate Chualdehyde)、丹参素(Danshen Su)等。由丹参的水溶性成分提取的丹参素，也称为D(+)β一(3，4一二羟基苯基)乳酸。本研究证明了丹参的水提物，丹参的水溶性成分丹参素制备的制剂对实验动物骨质疏松模型有明显的防治作用。对长期大量应用糖皮质激素引起骨质疏松，丹参的水提物和丹参素有明显的防治作用，该作用比综合预防阳性组(药物包括司坦唑醇、VitD3和钙剂)更好，综合组也有较好的预防作用，但在增加骨量，骨质量(骨干重，骨钙，骨有机质)方面，丹参水提物和丹参素的作用超过综合组，对长期大量应用糖皮质激素引起的脑损害丹参水提物和丹参素有保护作用，综合预防阳性组没有。本发明对丹参的水提物和丹参素用于防治人类骨质疏松症提出了新的思路。
文档编号A61K31/185GK1543940SQ20031011628
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月17日 优先权日2003年11月17日
发明者崔燎, 吴铁, 邹丽宜, 刘钰瑜, 艾春媚, 吴怡, 崔 燎 申请人:广东医学院