用于治疗中枢神经系统损伤与疾病的nogo,caspr,f3,nb－3的制作方法

专利名称：用于治疗中枢神经系统损伤与疾病的nogo,caspr,f3,nb－3的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗中枢神经系统(CNS)损伤和疾病的新方法与新物质。具体是，但不局限于，本发明提供用于使脊髓损伤(SCI)、卒中(stroke)或诸如多发性硬化(MS)和癫痫(epilepsy)等疾病后的脊髓再生和髓鞘再形成的方法和物质。
背景技术：
在美国超过250,000人，在全世界超过几百万人由于过去的脊髓损伤(慢性SCI)而永久致残，并且在美国每年有大约12,000人新受到损伤(急性SCI)。此外，由SCI导致的瘫痪是年轻人中的主要状况60％的脊髓损髓发生于30岁以下，最频繁的发生率是在19岁。大多数损伤是由于摩托车、运动或工作相关的事件、或由于暴力。估计仅在美国SCI患者的护理费用每年超过九十亿美元，在每个患者一生中超过一百五十万美元。
在哺乳动物的成熟中枢神经系统(CNS)外伤后，受伤的神经元不再重建它们横断的轴突。目前，在脊髓损伤中治疗的主要依靠仍是康复。对原发损伤人们无能为力。脊髓损伤后，已经确定有三种主要类型的损伤1.神经元细胞死亡。因为神经细胞成熟为构成我们神经系统的高度分化的细胞，并因而失去进行细胞分裂的能力，所以因损伤导致的神经细胞死亡成为一个困难的问题。一些细胞在外伤过程中死亡，其它在损伤后的数小时，数天或者甚至数周后死亡。无论细胞死亡发生于何时，如果神经细胞不再存在则功能联系不能建立。神经胶质的死亡也干扰神经功能。治疗的第一目的是尽可能多的保存细胞，也称为神经保护。在SCI中即使使用了神经保护性药物或治疗，一些神经细胞死亡仍可能发生。因此，可能需要补充神经细胞。
2.神经通路中断。在损伤后脊髓的上行束和下行束中长的轴突发生华勒氏(wallerian)变性。必须有轴突再生以重建神经回路。
3.脱髓鞘。髓鞘使长而细的轴突绝缘以利于神经冲动的传导。在一些类型的SCI及卒中和癫痫中，神经细胞和轴突可能没有丧失或中断；神经元的无功能可能由于失去了髓鞘。这类损伤可能是最可修复的治疗，因为重新接通(rewiring)复杂的回路可能不是必需的，而已知轴突的再髓鞘化是可能的。
可能的治疗1.神经细胞的替代成熟的神经细胞不能分裂以愈合伤口。替代损失的神经细胞需要向损伤部位中移植，被移植的神经细胞有希望成熟并整合到宿主神经系统中。在一些研究中使用人类胎儿组织证明是有希望的，但是，这存在关于供体组织的伦理和技术顾虑，以及关于移植物免疫排斥的重要问题。最近，科学家已经发现成人神经干细胞的存在，该细胞能在受刺激后分裂和发育成神经元和神经胶质。这一令人兴奋的发现展开了细胞治疗的新的可能性。
2.受损轴突的再生在中枢(CNS)和外周(PNS)神经系统中，神经元与神经胶质密切相关。损伤后，CNS神经胶质大大抑制了再生，同时在PNS中，施万细胞容易再生。将细胞接种于特别设计的“引导通道”，已经发现其促进切断的大鼠脊髓中神经纤维的再生。施万细胞和神经元产生生长因子。通过将这些因子单独或与移植物一起导入损伤部位，已经发现可以刺激额外的脊髓再生。可经遗传工程使施万细胞产生生长因子，这也会改善再生。已经观察到移植后后肢运动功能的一些改善，但是，这些结果对于证明这些方法的临床试验是正确的还不足够可靠。两项新的令人兴奋的研究显示当长神经纤维退出施万细胞桥或生长超出损伤部位后，成嗅神经鞘性胶质(olfactoryensheathing glia)可以“引导(usher)”长神经纤维长入SCI部位以外的存活的脊髓区域。这些有前途的研究使人看到可能在某一天成功实现在SCI，卒中或癫痫后的功能重建的希望。
3.轴突的髓鞘再形成施万细胞是外周神经中形成髓鞘的细胞。通常其中的髓磷脂由少突胶质细胞产生的脑和脊髓中找不到它们。研究者已经发现施万细胞移植入脑可使中枢的轴突髓鞘化。当髓磷脂的丢失是损伤的重要部分时，移植入施万细胞可刺激髓鞘再形成和可能的功能恢复。一项多中心临床试验已经在其它研究中心启动来研究药物(4-AP)，该药物似乎能暂时恢复通过脱髓鞘化的神经纤维的信号传导。
CNS髓磷脂和它在轴突再生中的主要抑制作用再生的一个重要障碍是轴突生长抑制活性，该活性存在于CNS髓磷脂中，也与在CNS中合成髓磷脂的少突胶质细胞的质膜有关。CNS髓磷脂的生长抑制特性已经被许多不同实验室通过多种技术所证实，包括将神经元铺于髓磷脂底物或白质的恒冷箱切片，并观察到轴突与成熟的少突胶质细胞的接触。因此，资料很好地证明在体外成人神经元不能延长神经突使其超出CNS髓磷脂。资料也很好地证明，在体内去除髓磷脂改善了超CNS的自然范围的再生生长的成功。新生大鼠在放射线照射后发生再生，而照射是杀死少突胶质细胞并阻止髓磷脂蛋白质出现的过程。大鼠在该处理并联合皮质脊髓束损伤后，某些皮质脊髓轴突再生较长距离并超出了损伤范围。而且，在脊髓修复的雏鸡模型中，髓鞘形成的出现与切断的轴突再生能力的丧失有关。用抗半乳糖脑苷脂和补充物去除鸡胚脊髓中的髓磷脂延长了轴突再生的允许时期。已知的髓磷脂中的抑制分子包括髓磷脂相关糖蛋白(MAG)，腱生蛋白-R(TN-R)，arretin，和硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)。最近，三个小组报告了在大鼠和人类中鉴定了编码抑制髓磷脂蛋白的基因，Nogo(GrandPre et al，2000；Prinjha et al，2000；Chen et al，2000)。已经发现抗髓磷脂的免疫允许损伤后广泛的轴突再生，这证明克服髓磷脂抑制的巨大潜在价值。这些实验证明在髓磷脂的抑制因子和CNS中轴突再生失败之间有良好相关。
多发性硬化MS是涉及神经功能降低的退化性中枢神经系统疾病，其与神经细胞周围被称作髓磷脂的绝缘性鞘上的疤痕形成有关。
引起MS的原因不清楚。但是，许多研究者认为它可能是自身免疫疾病，可能由病毒感染触发。没有确定性的临床试验用于MS的诊断。然而，MRI(磁共振成像)可以显示脑中髓磷脂受损部位。
在美国MS影响着大约250,000-300,000人。它主要侵犯妇女，白种人，和来自气候温和地区的人们。通常，在年龄20-40的人中诊断MS的发病。
普遍认为，MS损害包含大量前髓鞘形成性少突胶质细胞，意味着●修复的潜力不受这些细胞丢失的限制；●少突胶质细胞和它们周围环境的相互作用可能决定修复过程的结果。
本发明的第一方面发明第一方面的背景在CNS再生的相关方面中Nogo-A已经被广泛研究，并且在损伤后轴突再生的抑制中是一个关键的因子(Woolf，2003)。CNS髓磷脂的生长抑制特性依靠的三个主要分子-Nogo-A，髓磷脂相关糖蛋白(MAG)和少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)似乎结合于轴突表面相同的糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定的Nogo-66受体(NgR)(Woolf，2003)。了解参与抑制神经元再生的分子的相互作用得到了令人兴奋的可能性，即可以控制CNS环境以增强神经元再生。然而，除这些发现以外，也必须确定在CNS中Nogo-A作用的其它范例。例如，在突触处Nogo-A的存在(Wang et al，2002)提示其在调节突触可塑性中可能起作用。
Nogo以三种异构体表达，Nogo-A，B和C，它们都有相同的两个跨膜结构域C-末端和细胞外66个氨基酸的环(Nogo-66)(GrandPre et al，2000；Fournier et al，2001)。Nogo-A有大的细胞质N-末端结构域(Nogo-N)，这在Nogo-B或Nogo-C中没有发现(GrandPre et al，2000；Prinjha et al，2000；Brittiset al，2001)。Nogo-A的Nogo-66和Nogo-N具有独立的抑制活性(Fournier etal，2001；GrandPre et al，2000)。在少突胶质细胞表面的Nogo-66环与Nogo-66受体(NgR)结合，该受体介导轴突生长延迟(Fournier et al，2001)。反之，迄今公认Nogo-N没有受体或相互作用的蛋白。Nogo-A表达在早期胚胎CNS的脑中，但是在早期胚胎的神经元中NgR的表达极少或检测不到(Wang et al，2002)。因此在胚胎阶段Nogo-A可能具有不依赖NgR的功能。在基因敲除小鼠缺失Nogo-A时神经元再生表型不是很清楚，而且Nogo-A在CNS中的确切作用仍需进一步研究(Woolf，2003)。在成人，尽管Nogo-A已经定位在少突胶质细胞而NgR定位在成熟的轴突，但是这两种分子沿着有髓鞘轴突的准确分布类型和相互关系没有详细解释。对神经元和少突胶质细胞接触面的Nogo-A和NgR分布的认识对于了解它们在CNS发育中的作用将是重要的。
建立和维持轴突区域的分子结构对确保神经冲动的快速传导是至关重要的(Pedraza et al，2001)。在髓鞘形成过程中，存在复杂但精确有效的程序确保具体离子通道和其它蛋白质分子沿着轴突在具体节段的聚集(Dupree etal，1999；Rasband et al，2000；2001a)。耶维耶结处富含Na+通道，同时K+通道被排除在此部位以外而占据近结旁区(juxtaparanodal region)。但是，在在髓鞘形成和髓鞘再形成发展的早期阶段，K+通道聚集短暂定位于结区和近结旁区之间的结旁区(Rasband et al，1998；Vabnick et al，1999)。该处神经胶质的细胞质环与轴膜接触。粘附分子，例如F3/接触蛋白(Contactin)，神经束蛋白(neurofascin)155，和Caspr(Paranodin)位于结旁(Einheber et al，1997；Menegoz et al，1997；Tait et al，2000；Kazarinova-Noyes et al，2001)。对髓磷脂相关蛋白和轴突蛋白缺陷的脱髓鞘小鼠突变体的研究显示轴突区域组成成分的聚集和离子通道具体是K+通道的精确定位依赖于轴突和少突神经胶质之间的通讯，所述髓磷脂相关蛋白和轴突蛋白诸如神经酰胺半乳糖基转移酶(CGT)，(Ishibashi et al，2002；Popko B，2000)，F3/接触蛋白(Boyle et al，2001)，或Caspr(Bhat et al，2001)。但是，调节K+通道聚集成紧密区带的分子机制不完全清楚。
接触蛋白相关蛋白(Caspr)是有细胞外结构域的跨膜蛋白，其细胞外结构域含有一系列层粘连蛋白G样结构域和EGF重复(Peles et al，1997)，以及含SH3蛋白和4.1家族蛋白的潜在结合位点的胞质段(Gollan et al，2002)。Caspr作为与GPI-锚定的分子F3/接触蛋白的复合物存在(Peles et al，1997)。在髓鞘形成过程中，Caspr和Na+通道向细胞表面的正确转运需要Caspr与F3/Contactin的相互作用(Faivre-Sarrailh et al，2000；Kazarinova-Noyes et al，2001)。而且这个复合物构成了维持轴突神经胶质部分构造的基本脚手架(Bhat et al，2001；Boyle et al，2001)。尽管神经束蛋白155(NF155)转而与Caspr/F3复合物相互作用(Charles et al，2002)，但是这种相互作用的功能性后果仍不清楚。从Caspr的多结构域结构判断，在髓鞘形成中可能存在与该分子相互作用的其它神经胶质成分。
发明第一方面的概述发明者探索在髓鞘形成期间，Nogo-A是否在轴突神经胶质连接中起作用-具体是，Nogo-A是否参与轴突和少突胶质细胞之间分子相互作用。发明者认为可能发现Nogo-A特异地定位于结旁，在该处它与结旁连接蛋白-Caspr相互作用。发明者也判断Nogo-A和Caspr都与电压门控K+通道Kv1.1有关。而且，在发育中Nogo-A/Kv1.1和Caspr/Kv1.1共同定位的类型是密切相关的。发明者因此认为Nogo-A和Caspr的相互作用在调节髓鞘形成早期K+通道沿着轴突的定位中起作用。
具体地，发明者所完成的工作表明少突胶质细胞Nogo-A聚集在特定的轴突神经胶质连接处，在该处它经细胞外Nogo-66环直接与轴突Caspr相互作用，并间接与K+通道蛋白相互作用。这是迄今首次描述的不依赖NgR的Nogo-66相互作用，而且对Nogo-A在轴突神经胶质连接构造的形成和维持中的作用具有重大意义。
因此，最为概括地，本发明提供测定Nogo-A和Caspr相互作用并在髓鞘形成中起作用所需的物质和方法。这具有重要意义，具体是在脊髓损伤领域或导致髓鞘损害的其它疾病中。
本发明提供联合适当载体的组合物其包括Nogo和Caspr，或其模拟物，或能够促进Nogo和Caspr相互作用的物质。
优选地组合物包括Nogo和Caspr的复合物，或该复合物的模拟物。
所述组合物中存在的Nogo分子优选是Nogo-A或其一部分或结构域。优选地，包括在所有三类已知的Nogo异构体(A，B和C)中都发现的Nogo-66。它可进一步包括这些异构体的其它结构域；或者可能在缺乏Nogo蛋白其它部分的情况下存在Nogo-66结构域。
所述组合物的Caspr分子优选是Caspr1或其一部分或结构域。
能够促进Nogo和Caspr相互作用的物质可以是任何分子类型，包括但不局限于蛋白质，肽，或小分子。
一般地，能够促进这种相互作用的物质会结合于Nogo和/或Caspr。例如，它可与这两种蛋白结合，例如在Nogo和Caspr的接触面处。或者它可以仅结合于Nogo和Caspr中的一个，可能稳定复合物中该蛋白的构象并因此促进结合和/或抑制该复合物的解离。
作为例子，能够促进Nogo和Caspr相互作用的物质可以是抗体，例如能够结合于Nogo和Caspr两者的抗体，如双特异抗体。
所述组合物可以是药用组合物，其中载体将是可药用的类型。优选地药用组合物被制成用于体内注射的剂型，更优选地是用于直接向CNS中注射。具体地，提供包含Nogo和Caspr的药用组合物。
发明进一步提供上面描述的用于医学治疗方法中的组合物，并具体用于CNS损伤或疾病的治疗，所述CNS损伤或疾病例如脊髓损伤(SCI)，多发性硬化(MS)，癫痫或卒中。
发明进一步提供Nogo在制备用于治疗CNS损伤或疾病的药物中的应用，其中所述药物是与Caspr或其模拟物联用给药。
同样地，发明提供Caspr在制备用于治疗CNS损伤或疾病的药物中的应用，其中所述药物与Nogo或其模拟物联用给药。
因此药物可以既包括Nogo又包括Caspr或其模拟物(即它可以是如上描述的药用组合物)。从而发明提供生产药用组合物的方法，其包括将Nogo和Caspr或它们模拟物与可药用的载体混合。或者可以将两种成分分别给药。
也提供的是如本文所述能够促进Nogo和Caspr相互作用的物质在制备用于治疗CNS损伤或疾病的药物中的应用。
发明也提供刺激神经元具体是神经元轴突的髓鞘形成的方法，包括将神经元或少突胶质细胞与上面描述的组合物接触。这可以在体内进行，例如如本说明书别处描述的治疗方法，或在体外进行。
也提供的是治疗患有中枢神经系统疾病或损伤的患者的方法，包括给予患者一种或多种含有上面描述的Nogo和Caspr的药用组合物。具体地，提供治疗患有CNS疾病或损伤例如SCI，MS，癫痫或卒中患者的方法，包括给予患者含有Nogo-A和Caspr的复合物。
认为所描述的所有治疗方法具体适合于脊髓损伤(SCI)，多发性硬化(MS)，癫痫或卒中的治疗。
发明进一步提供筛选能够调节(优选促进)Nogo和Caspr相互作用的物质方法，该方法包括将Nogo和Caspr与候选物质接触，并测定Nogo和Caspr之间的相互作用。
方法可以进一步包括在缺乏该候选物质但其它方面类似的条件下将Nogo和Caspr接触，并测定Nogo和Caspr之间的相互作用。
优选地方法包括将Nogo和Caspr复合物与候选物质接触；优选在与候选物质接触之前形成复合物。
可以以任何合适的方式实施该方法。技术人员会熟知许多合适的实验方式，并能很好设计出合适的方案。
Nogo和/或Caspr可以存在于细胞内或表面。表达该蛋白质的基因可以是所讨论的细胞内源产生的，或者它可以是存在于导入细胞的载体。蛋白质优选表达在细胞表面。
此外或可选地，Nogo和/或Caspr可以被固定在固体支持物上。Nogo和/或Caspr可以包括如下面详细描述的可检测的标志。
本发明进一步提供生产药用制剂的方法，包括通过这里描述的筛选方法鉴定能调节Nogo和Caspr相互作用的物质以后，进一步将该物质与可药用的载体配制在一起的步骤。方法可以包括在配制前优化该鉴定出的物质以便体内给药的另一步骤。
细胞术语少突胶质细胞用在这里指能够在中枢神经系统(CNS)中神经元轴突周围产生(lay down)髓鞘的少突神经胶质细胞。
蛋白质序列使用的术语“Nogo”包括Nogo蛋白的所有异构体，包括Nogo-A，B和C，以及它们的一部分和分离的结构域，包括Nogo-66结构域，以及与下面给出的序列有80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％以上同源性的突变体和变异体。也包括其它哺乳动物种属的直向同源蛋白。优选地Nogo蛋白具有结合Caspr蛋白具体是Caspr1的能力。Nogo-A是具体优选的。
使用的术语“Caspr”包括Caspr蛋白的所有异构体，包括Caspr-1，2，3和4。Caspr-1是具体优选的。该术语也意图包括该Caspr蛋白的分离的结构域，例如细胞外结构域，以及与下面给出的序列有80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％以上同源性的突变体和变异体。也包括其它哺乳动物种属的直向同源蛋白。优选地Caspr蛋白具有结合Nogo蛋白，具体是Nogo-A的能力。它也可以具有结合至少一个电压门控钾通道亚基，具体是Kv1.1和/或Kv1.2的能力。
Nogo和Caspr蛋白的氨基酸序列连同它们的GeneBank登录号列于下面；Nogo-Agi9408096(CAB99248)1 medldqsplv sssdspprpq pafkyqfvre pedeeeeeee eeedededle elevlerkpa61 aglsaapvpt apaagaplmd fgndfvppap rgplpaappv aperqpswdp spvsstvpap121 splsaaavsp sklpeddepp arppppppas vspqaepvwt ppapapaapp stpaapkrrg181 ssgsvdetlf alpaasepvi rssaenmdlk eqpgntisag qedfpsvlle taaslpslsp
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1381 srseNogo-66从Nogo-A的823至888氨基酸延伸出并具有下列序列Nogo-66RIYKGVIQ AIQKSDEGHP FRAYLESEVA ISEELVQKYS NSALGHVNCT IKELRRLFLV DLVDSLK实验方法如上面所描述，技术人员熟知许多实验程序其可能适合判断Nogo和Caspr之间相互作用，并鉴定调节优选是促进该相互作用的物质。
例如，在体外研究两种蛋白质之间相互作用可以通过将一种蛋白质用可检测的标记物标记，并将其与固定在固体支持物上的另一种接触来实施。尤其对petidvl物质，合适的可检测的标记物包括35S-蛋氨酸，其可以掺入重组生产的肽或多肽中。或者在固体支持物上形成的复合物的检测可以通过标记抗体进行，其中该抗体是抗未被固定在该固体支持物上的蛋白的表位的抗体。如果得不到合适的抗体，可以将重组生产的肽或多肽表达成含有可得的适宜抗体的表位的融合蛋白。
可以使用抗结合于固相支持物上蛋白的抗体将蛋白固定在固相支持物上，或用其它已知的技术。优选的体外相互作用可利用包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白。它可被固定在谷胱甘肽琼脂糖珠上。在上面描述类型的体外测定程序中，可测定受试化合物影响与固定化GST-融合多肽结合的标记化肽或多肽的量的能力。这可以通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将谷胱甘肽琼脂糖珠进行分级来测定。或者，可以将珠子洗涤以去除未结合蛋白质，并通过例如用合适的液闪计数仪计数存在的标记物的量测定结合的蛋白质的量。
按照本发明的测定也可以是基于细胞形式，其中两种蛋白中至少一种由合适的细胞表达，优选表达在细胞表面。测定可以利用细胞系，诸如酵母菌株或哺乳动物细胞系，其中相关的多肽或肽是从导入到细胞的一个或多个载体表达的。
可以对用所描述方法鉴定的Nogo-Caspr相互作用的调节物进一步修饰，以增加它们对体内给药的适宜性。
制剂可以将发明的组合物制备成药用制剂，其包含至少一种如上面所定义的活性成分，以及一种或多种对本领域技术人员熟知的其它可药用的成分，其包括但不局限于可药用的载体，佐剂，赋形剂，缓冲液，防腐剂和稳定剂。制剂可以进一步包括其它活性物质。
因此，本发明进一步提供制备如前所定义的药用组合物的方法，该方法包括将至少一种这里描述的活性物质与一种或多种本领域的技术人员熟知的可药用的成分，如载体、佐剂、赋形剂等混合。
这里使用的术语“可药用的”适合于化合物，成分、原料、组分、剂量形式等等，其是，在合理地医学评价范围内，适合于与所讨论的受试者(例如人类)的组织接触而无过分的毒性，刺激性，过敏反应，或其它问题或并发症，相当的合理的效应/风险比率。在与其它制剂成分相容的意义上来讲，每种载体、佐剂、赋形剂等必须也是“可接受的”。
适合的载体、佐剂、赋形剂等可以在标准的制药课本中找到，例如Remington’s的制药科学，第20版，2000，Lippincott，Williams & Wilkins出版(Remington’s Pharmaceutical Sciences，20th Edition，2000，pub.Lippincott，Williams & Wilkins)；和制药赋形剂手册，第2版，1994(Handbook ofPharmaceutical Excipients，2nd edition，1994.)制剂可以是适合注射的剂型，例如水性的，等张的，无热源的，无菌溶液的形式，其中活性化合物是溶解的。这种液体可以额外含有其它可药用的成分，例如抗氧化剂，缓冲液，防腐剂，稳定剂，抑菌剂，悬浮剂，增稠剂，和使制剂与血液或脑脊液等张的溶质。在这种制剂中使用的合适的等张载体的例子包括氯化钠注射液，林格氏(Ringer′s)溶液或乳酸盐林格氏注射液。通常地，液体中活性成分的浓度从大约1ng/ml到大约10μg/ml，例如从大约10ng/ml到大约1μg/ml。制剂可以被放在单剂量或多剂量密封的容器中，例安瓿和小瓶，并可以以冷冻干燥(冻干的)情况贮存，其只需在临用前加入无菌液体载体，例如注射用水。临时的注射溶液和悬液可以从无菌粉末，颗粒和片剂制备。
给药发明的组合物的给药一般可通过注射，优选直接注射入CNS。可以直接注射到损伤部位。或者，可以注射入脑脊液，通常是接近疾病或损失部位。
序列同一性与参考序列的氨基酸序列同源百分比(％)定义为候选序列中与参考序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，所述定义是在对所述序列进行比对并引入缺口以(如果有必要)以实现最大百分比序列同一性、而不考虑任何保守取代作为部分序列同一性之后。可以用WU-BLAST-2来确定％同一性值(Altschul et al.，Methods in Enzymology，266460-480(1996))。WU-BLAST-2使用数种搜索参数，其中多数设定为缺省值。可调节的参数用下列值设定重叠跨度(overlap span)＝1，重叠分数(overlap fraction)＝0.125，字符(word)阈值(T)＝11。％氨基酸序列同一性值如下确定通过如WU-BLAST-2确定匹配的相同残基数目，除以参照序列残基总数(由WU-BLAST-2引入参照序列的缺口以最大化被忽略的比对得分)，乘以100。
除了计数BLOSUM62矩阵中得分为阳性值的残基，氨基酸相似百分比(％)按与同一性相同方式的定义。因此，也计数不相同但是具有相似特性(例如是保守取代反应的结果)的残基。
以相似的方式，与参考核酸序列的核酸序列同一性百分比(％)定义为候选序列中与参考核酸序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。这里使用的同源值可以如下产生WU-BLAST-2的BLASTN模块设为缺省值，重叠跨度和重叠分数分别设为1和0.125。
受试者将要接受发明的组合物和/或治疗的受试者可以是哺乳动物，优选实验动物例如啮齿动物(例如家兔，大鼠或小鼠)，狗，猫，猴或猿，或家畜例如母牛，马，绵羊，猪或山羊。较优选地，所述受试者是人。
一般地，受试者患有疾病或外伤例如头外伤引起的CNS损伤。但是较优选地，所述损伤在脊髓，例如SCI。在实验动物，所述损伤可以是实验性的。CNS损伤也可以源自疾病，例如卒中，癫痫或神经变性疾病，学习记忆相关的疾病和/或痴呆例如阿尔茨默氏病(Alzheime’s disease)或帕金森氏病(Parkinson’s disease)。
通常考虑将本发明的治疗与其它治疗例如外科和/或康复联用。
模拟物对体内药用而言非肽“小分子”经常是比肽或多肽更为优选。相应地，可以设计Caspr和/或Nogo的模拟物，具体是用于药用。通常本发明的Nogo模拟物能结合于Caspr分子以模拟Nogo结合于该分子的效应。同样地，Caspr模拟物能结合于Nogo分子以模拟Caspr结合于该分子的效应。
已知的药物活性化合物的模拟物的设计是基于“前导(lead)”化合物的已知药物开发方法。这对于活性化合物的合成较困难或昂贵或不适合具体的给药方法时是理想的，例如肽为不适合口服组合物的活性剂时，这是由于所述肽倾向于较快地由蛋白酶在消化道内代谢。模拟物设计，合成，以及检测通常用于避免随机筛选大量具有靶性质的分子。
有数个步骤通常用于由具有给定靶性质的化合物设计模拟物。首先，确定对于确定靶性质而言关键和/或重要的所述化合物的具体部分。对于肽，这可通过系统性改变肽中的氨基酸进行，例如通过依次取代每个残基。肽的丙氨酸扫描通常用于定义所述肽基序。构成化合物的活性区的这些部分或残基已知为“药效基团”。
一旦药效基团被发现，可根据其物理性质，例如立体化学，键合，大小和/或电荷，利用各种来源的数据，例如分光镜技术，X-射线衍射数据和NMR来模拟药效基团的结构。计算机分析，类似性作图(模拟药效基团的电荷和/或体积，而不是原子间的键合)以及其它技术可用于该模拟方法。
该方法的变体中，配体的三维结构以及其结合配偶体被模拟。这具体可用于配体和/或结合配偶体在结合时改变构型，允许在模拟物设计的模拟中考虑到这一点。
随后选择模板分子，其上移植了模拟药效基团的化学基团。所述模板分子和移植到其上的化学基团可方便地选择，使得所述模拟物易于合成，很可能是可药用的，并且不在体内降解，同时保持前导化合物的生物活性。可选，当模拟物是以肽为基础时，可通过使所述肽发生环化获得进一步的稳定性，增加其刚性。通过这种方法发现的模拟物可随后被筛选以发现它们是否具有靶性质，或它们显示所述性质的程度。可实施进一步的优化或修饰以实现一或多种终模拟物用于体内或临床检验。
在这种情况下，可以使用肽图谱研究(peptide mapping study)以鉴定与另一种蛋白相互作用所需要的一种蛋白的最小部分。这种肽可然后被用作前导化合物用于如上所述的模拟物。
抗体因为抗体可被以多种方式修饰，所以术语“抗体”应当被理解为包括具有所需特异性的结合结构域的任何特异结合的物质。因此，此术语包含抗体片段，衍生物，抗体的功能等价物和同源物，包括含有免疫球蛋白结合结构域的任何多肽，而无论其是天然还是合成的。因此也包括包含免疫球蛋白结合结构域或等价物的嵌合体分子，所述结构域或其等价物融合于另一种多肽。在EP-A-0120694和EP-A-0125023中描述了嵌合体抗体的克隆和表达。
已知完整抗体的片段可以完成结合抗原的功能。结合片段的例子是(i)由VL，VH，CL和CH1结构域组成的Fab段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd段；(iii)单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv段；(iv)由VH结构域组成的dAb段(Ward，E.S.et al.，Nature 341，544-546(1989))；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab’)2片段，包括两个连在一起的Fab段的双价片段(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域由肽接头连接，肽接头允许两个结构域联合以形成抗原结合位点(Bird et al，Science，242，423-426，1988；Huston et al，PNAS USA，85，5879-5883，1988)；(viii)双特异的单链Fv二聚体(PCT/USS92/09965)和(ix)“diabodies”，用基因融合构建的多价或多特异的片段(WO94/13804；P.Holliger et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448，1993)。
Diabodies是多肽的多聚体，每个多肽包括含有免疫球蛋白轻链结合区的第一个结构域，和含有免疫球蛋白重链结合区的第二个结构域，两个结构域是相连的(例如通过肽接头)但是不能彼此联合形成抗原结合位点抗原结合位点的形成通过将多聚体中一个多肽的第一个结构域与多聚体中另一个多肽的第二个结构域联合所形成(WO94/13804)。
当使用双特异抗体时，它们可以是传统的双特异抗体，其可以多种方式生产(Holliger，P.and Winter G Current Opinion Biotechnol.4，446-449(1993))，例如通过化学方法制备或从杂交的杂交瘤制备，或者双特异抗体可以是上面提到的任何双特异抗体片段。优选使用ScFv二聚体或diabodies而不是完整抗体。仅使用可变区可将Diabodies和ScFv构建成没有Fc区，可能降低抗独特型反应的效应。双特异抗体的其它形式包括Traunecker等在Embo Journal，10，3655-3659，(1991)中描述的单链“Janusins”。
可能希望将非人类(例如鼠类)抗体“人源化”以提供具有非人类抗体的抗原结合特性的抗体，而最小化了抗体的免疫原性，例如当将它们用于人类治疗时。因此，人源化的抗体包括从人类免疫球蛋白(受体抗体)来源的框架区，其中从一个或多个互补性决定区(CDR)来源的残基被非人类种属(供体抗体)例如小鼠，大鼠或兔抗体的CDR的残基取代，其中非人种属CDR具有所需特性，例如特异性，亲和性或载量(capacity)。人类抗体的某些框架残基也可被相应的非人类残基取代，或被既不存在于供体也不存在于受体抗体的残基取代。进行这些修饰以进一步改进并最优化抗体的特性。
现在将以举例方式并参考


本发明第一方面的具体实施方案。进一步的实施方案对本领域的技术人员是明显的。所有本文提及的资料在此引入以作参考。
涉及本发明第一方面的附图简述图1.在CNS中位于结旁段的神经胶质来源的Nogo-A簇(cluster)。
A.对成年大鼠脑干切片进行Nogo-A(绿色；a，c，d，f，g，和i)以及Kyl.1K+通道α亚基(红色；b，c，h，和i)或PAN Na+通道(红色；e和f)的双免疫标记。对于阴性对照，在对成年脑干切片染色前将Nogo-A抗血清(1∶200)与抗原预混合(j)。对于本研究使用的两种Nogo-A抗体，一种在发明者的实验室制备(a-f)，另一种在Dr.Stritmatter的实验室制备(g-i)。c，f和i分别是图a-b，d-e和g-h的合并图像。
B.Nogo-A在大鼠脊髓结旁段的超微结构定位。(a)对有髓鞘的轴突的横断切片的免疫金标记显示，在髓鞘内侧和外侧发现金颗粒。(b和c)在神经胶质环和密集的(compact)髓磷脂中发现Nogo-A的免疫金颗粒。(d和e)在结旁段的纵向切片上，Nogo-A的免疫金颗粒位于轴突胶质连接中神经胶质环的尖端并且在d中某些所述颗粒位于轴突中。d和e中框起来的区域的高倍放大图像如d’和e’所示。ax轴突；OL少突胶质细胞。金颗粒如箭头所示。标尺对于图Aa-i为5μm，对Aj为10μm，Ba，d和e为200nm，Bb，c，d’和e’为100nm。
图2.Nogo-A在EAE大鼠和CGT-/-小鼠的CNS有髓鞘轴突中的表达和定位A和B.对EAE大鼠脊髓切片进行Nogo-A(绿色，A)，Caspr(绿色，B)和Kv1.1(红色，A和B)双重免疫染色。星号标记Nogo-A阳性的细胞体，箭头显示不间断的结旁段Nogo-A标记。C.在正常和EAE大鼠脊髓切片的数个显微视野中计数Nogo-A和Caspr簇的数目。数值表示为来自至少3个独立实验的均数±SEM。与正常大鼠相比，Nogo-A在EAE中的聚集明显减少。双星号(**)表示p＜0.01的显著性水平。D.Western印迹结果显示Nogo-A在EAE动物脊髓中明显下调，但是Caspr的表达仅受轻度影响。单星号表示p＜0.05的显著性水平。E，F，G和H.对野生型和CGT-/-小鼠脊髓切片进行Nogo-A(绿色)和PAN Na+通道的双标记。在野生型(P16)，Nogo-A聚集在结旁段而Na+通道聚集郎维耶结(E)。在CGT-/-小鼠(P16)，Nogo-A在结旁段分离而PAN Na+通道簇几乎检测不到(F)。在CGT-/-小鼠(P21；H)Nogo-A标记似乎松散地围绕在轴突周围，但是在野生型小鼠(P21；G)结旁段区域中明显簇集。标尺对A-B为10μm，对E-H为5μm。I和J.对P16CGT-/-小鼠脊髓节旁段的纵切面的Nogo-A免疫金标记证明，金颗粒在异常反向的环中是可见的。插图I’和J’分别是I和J中框起来的区域的高倍放大图像。箭头指示金颗粒。星形表示反转的结旁环。ax轴突。OL少突胶质细胞。标尺对I和J为200nm，对I’和J’为50nm。
图3.在体外Caspr与Nogo-A结合。
A.NgR沿着有髓鞘的轴突广泛分布。(a)使用抗NgR和γ-微管蛋白抗体对成年大鼠CNS各个区域的组织裂解物进行Western印迹。(b)使用抗NgR和γ-微管蛋白抗体对生后1-30天(P1-P30)大鼠脑干进行Western印迹。对成年大鼠的海马(c-e)和脑干(f-h)切片进行NgR(绿色，c和f)，MAP2(红色，d)和Kv1.1(红色，g)复染。e和h分别代表c，d和f，g的合并图像。c至h的标尺为10μm。
B.Nogo-A与Caspr/F3结合。(a)将成年小鼠脑膜级分的去垢剂(detergent)裂解物用Caspr，Nogo-A，和NB3抗体以及非免疫性IgG进行免疫沉淀。使用抗Caspr，Nogo-A，F3，和NB3抗体，对免疫沉淀物和脑的去垢剂提取物(脑)连同蛋白-A珠(珠)进行Western印迹。(b)将Nogo-A/Caspr/F3-，Nogo-A/F3-和Nogo-A-转染的CHO细胞的膜级分用抗Caspr和Nogo-A以及非免疫性IgG进行免疫沉淀。使用抗Nogo-A，Caspr和F3的抗体对免疫沉淀物和脑的提取物(脑)进行Western印迹分析。(c)将P15大鼠大脑皮质膜级分的去垢剂裂解物加载到线性蔗糖梯度上。收集12个梯度级分，进行SDS-PAGE并用Western印迹分析Nogo-A，Caspr和F3的分布。级分1是从梯度顶部回收的密度最低的级分。标记为“总量”的最后条带表示加载到蔗糖梯度上以前匀浆物中的水平。
图4.Caspr表达细胞粘附于Nogo-66。
A-L.将Caspr/F3-(A，E和I)，F3-(B，F和J)，和模拟(C，G和K)，以及PI-PLC处理的Caspr/F3-(D，H和L)CHO细胞铺于分别用Nogo-66肽，重组的GST-Nogo-66蛋白，和GST包被的底物上。标尺8μm。M-N.粘附于各种底物的细胞的定量。Caspr/F3-CHO细胞(存在或缺乏PI-PLC处理)，而不是F3-或野生型CHO细胞，结合于Nogo-66肽和GST-Nogo-66。柱代表从至少3个独立实验得到的粘附性细胞数(表示为均数±SEM)(M)。O.在PI-PLC处理后粘附测定结束时，收集Caspr/F3-CHO和F3-CHO细胞及它们的培养上清，并对总蛋白标准化后进行Western印迹分析以检测F3/接触蛋白。1，小鼠脑；2，F3-CHO细胞裂解物；3，PI-PLC处理后Caspr/F3-CHO细胞裂解物；4，PI-PLC处理后Caspr/F3-CHO细胞培养基。星号(*)表示p＜0.05的显著水平。用更高浓度(0.02，0.04和0.06U/ml)PI-PLC处理后，Caspr/F3-CHO细胞以相同效率粘附于Nogo-66和GST-Nogo-66(N)。
图5.Nogo-A/Caspr复合物与K+通道相互作用。
A.(a)P7小鼠脑膜提取物与抗Caspr，Nogo-A，Kv1.1，Kv1.2及NB3的抗体以及非免疫性IgG进行免疫沉淀。对显示的免疫沉淀物和脑提取物(脑)用抗Kv1.1，Kv1.2，Nogo-A和Caspr抗体进行Western印迹分析。(b)成年小鼠脑提取物的GST拖曳(pull-down)实验使用重组的GST-Nogo-66，GST-Nogo-N和GST进行。显示的免疫沉淀物和脑提取物(脑)在SDS-PAGE分离后用Caspr和Kv1.1抗体进行检查。
B.(a)在SDS-PAGE分离后使用Caspr抗体对CHO，F3-CHO，Caspr/F3CHO细胞的膜级分和脑提取物进行免疫印迹。(b)用Kv1.1表达构建体RBG4/Kv1.1瞬时转染后，将CHO，F3-CHO，Caspr/F3CHO细胞的膜提取物分别与GST-Nogo-66或GST保温。将洗脱的蛋白用SDS-PAGE分离并用Caspr和Kv1.1抗体进行检查。IP免疫沉淀反应；WBWestern印迹。
图6.生后不同天数的大鼠的脑干中Nogo-A，Caspr和Kv1.1的免疫组织化学标记。
对P5至成年大鼠的脑干切片进行Caspr(绿色)和Kv1.1(红色)双标记。标尺5μm。B.对P1至P30大鼠进行Nogo-A(绿色)和Kv1.1(红色)双标记。标尺(o中)5μm。C.(a)从显微图像测量Nogo-A，Kv1.1免疫染色的长度和它们的重叠(μm，均数±SEM)。(b)计数结旁段Nogo-A/Kv1.1或Caspr/Kv1.1簇重叠的数目。
图7.Nogo-A，Caspr和Kv1.1在EAE大鼠和Shiverer小鼠中的分布。
A和B.在EAE(A)和对照大鼠(B)的脑干切片中对Caspr(绿色)和Kv1.1(红色)进行免疫荧光双标记。插图代表Ky1.1标记的放大图像。标尺对A-B为10μm，A-B插图为5μm。C-G在野生型(C)和Shiverer(D-G)小鼠的脊髓切片中对Nogo-A(绿色)和Kv1.1(红色)的双标记。F是D和E的合并图像。C，F和G中箭头显示Nogo-A阳性细胞体。标尺10μm。H和I.在野生型(H)和Shiverer(I)小鼠的脑干切片中对Caspr(绿色)和Kv1.1(红色)的免疫荧光重染。标尺10μm。J.分别从显微图像测量EAE与对照大鼠以及Shiverer(Shi)与野生型(WT)小鼠中成对的Kv1.1染色之间的距离(μm，均数±SEM)。与对照相比，EAE大鼠或Shiverer小鼠中的值分别明显降低(星号**表示p＜0.01的显著性水平)。
图8.在结旁段Nogo-A和Caspr之间的相互作用可能在髓鞘形成过程中起作用。
除了NF155，发明者的发现表明结旁段Nogo-A是神经元表达的Caspr的一种神经胶质配体。结旁段Nogo-A与轴突的Caspr反式相互作用(trans-interact)，并可能在髓鞘形成早期阶段的K+通道定位中起作用(来自P5)。在成年轴突胶质连接稳固建立，K+通道被从结旁段排除而该保持着Nogo-A/Caspr相互作用，但是，这种分离的详细机制仍需探讨。N郎维耶结，PN结旁段，JPN近结旁区。
发明第一方面的详述结果Nogo-A定位在有髓鞘轴突的结旁段检查Nogo-A沿成年大鼠脑干白质束的分布。在纵向切片上，用两种不同的Nogo-A抗体观察到相似的Nogo-A定位类型一种抗体是发明者的实验室制备的(图1A，a-f；Liu et al，2002)，另一种是Stephen Stritmatter博士(耶鲁大学)惠赠(图1A，g-i；Wang et al，2002)。象用与Kv1.1(红色；图1A，a-c，g-i)或Na+通道(红色；图1A，d-f)免疫荧光双标记所证实的，Nogo-A的免疫反应(绿色)特异地局限在沿着有髓鞘轴突的结旁段(图1A)。当将Nogo-A抗血清(1∶200)与摩尔数过量100倍的抗原预混合后，检测不到Nogo-A在轴突区域的特异标记(图1A j)。Nogo-A染色(绿色)在结区Na+通道标记(红色)的侧方，并且是在近结旁区Kv1.1标记(红色)的侧方，因此反映出它的结旁段定位。在其它富含神经纤维的CNS部位例如胼胝体和脊髓作了类似观察(未显示)。在所检查的切片中，也在神经元和少突胶质细胞上检测到Nogo-A(未显示)，与其它已发表的研究一致(Huber et al，2002；Wang et al，2002；Liu et al，2002)。这些观察表明Nogo-A可能在结旁段富集并且是结旁段蛋白复合物的一个成分。
用免疫-电子显微镜(IEM)进一步研究Nogo-A的特异性结旁段定位。与以前的观察一致(Huber et al，2002)，Nogo-A免疫反应在髓鞘环的内侧和外侧较高(图1Ba)，在大鼠脊髓致密髓磷脂中低(图1Bb)。值得注意地，在纵向切片中，Nogo-A免疫反应在膨大的末梢神经胶质环(图1Bb和c)中以及结旁段的环和轴膜之间的轴突胶质连接处(图1Bd和e)较高，并且仅偶尔在结旁段轴突中存在(图1Bd)。这些观察表明Nogo-A是CNS结旁段的成分。
Nogo-A是主要源于少突神经胶质的结旁段成分Nogo-A主要在少突胶质细胞胞体和成年CNS的白质中表达(Huber etal.，2002)。为研究结旁段Nogo-A的细胞起源特征，我们检查了两种动物模型中的Nogo-A分布实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)，一种涉及进行性CNS脱髓鞘的疾病(Swanborg 2001)，和CGT-/-小鼠，已知其表现为存在反向的侧环但是缺乏横向带，并且K+通道沿轴突定位异常(Dupree et al，1999)。在成年EAE大鼠脱髓鞘的顶峰时，制备它们的脊髓纵向切片用于Nogo-A或Caspr，，和Kv1.1的免疫荧光复染。与来自对照动物的那些相比，EAE大鼠切片中Nogo-A阳性结旁段聚集体的密度明显降低(大约90％)(图2A和C)。仅残留很少的Nogo-A阳性结旁段簇的灶(箭头；图2A)，并保留了少突胶质细胞免疫反应(星形；图2A)。与结旁段染色消失相关，Nogo-A的表达在EAE大鼠脊髓中下调(图2D)。但是，在脊髓中Caspr的表达受此疾病的影响较轻。(图2B-D)。
在P16野生型小鼠，Nogo-A(绿色)在结旁段聚集的Na+通道(红色)旁簇集(图2E)。然而，在P16CGT-/-小鼠，沿轴突几乎检测不到Nogo-A(绿色)和Na+通道(红色)的簇集(图2F)。联用另一个轴突标志即200kDa的神经丝和Nogo-A抗体在P21野生型和CGT-/-小鼠脊髓切片上进行免疫荧光分析。在CGT-/-小鼠沿着神经丝标记的轴突检测到Nogo-A的松散的螺旋样标记(图2H)。这种相当紊乱的标记类型明显不同于在野生型动物上Nogo-A标记的紧凑簇集类型(图2E和G)，显示在突变体中神经胶质Nogo-A沿轴突的聚集被严重破坏。IEM观察显示Nogo-A免疫反应性明显存在于这些突变小鼠的结旁段的反向侧环中(图2I和J)。已知在EAE大鼠中广泛的脱髓鞘和少突胶质细胞损伤以及CGT-/-小鼠中异常的结和结旁段结构，在结旁段失去Nogo-A聚集表明结旁段Nogo-A主要和OL相关。
NgR沿有髓鞘的轴突均一分布发明者接下来研究Nogo-66受体(NgR)的表达和分布，以查明是否它在有髓鞘的轴突上也表现为结构域特异的聚集类型。用NgR抗体的免疫印迹分析证明在成年脑干，海马，和大脑皮质NgR的表达高，而在脊髓表达低(图3Aa)。早在生后1天可以检测到NgR，它的表达水平一直维持到生后14天，随后表现为从3周龄逐渐降低(图3Ab)。为确认使用的NgR抗体可以标记神经元的NgR，发明者将大鼠海马区染色并显示NgR与神经元特异的微管相关蛋白2(MAP2)共存于细胞体和突起中(图3A，c-e)。由于两种抗体都是兔多克隆起源，所以NgR和Nogo-A的双标记是困难的。发明者改为进行NgR和Kv1.1的双标记。在脑干纵向切片上，与聚集的K+通道标记相反，NgR沿轴突均一分布(图3A，f-h)。在P1，P5，P14和P30龄组观察到相似的NgR标记(未显示)。NgR定位类型与结旁段聚集的Nogo-A完全不同的观察结果提示，在这些特异性轴突-胶质结构域，Nogo-A与轴突受体相互作用而不是NgR的可能性。
Nogo-A与结旁段Caspr/F3复合物相互作用已知Nogo-A的结旁段定位，发明者研究是否结旁段轴突成分，例如Caspr，F3和NB3(一种F3相关分子)(Lee et al，2000)是Nogo-A的结合配体。将Nogo-A，Caspr，F3和NB3从成年大鼠脑膜提取物中免疫沉淀。对在SDS-PAGE上分离的免疫沉淀物的Western印迹分析显示，Nogo-A，Caspr和F3，而不是NB3存在于Nogo-A抗体或Caspr抗体所沉淀的免疫复合物中(图3Ba)。在Nogo-A表达构建体瞬时转染的Caspr/F3-，F3-，和野生型CHO细胞上也进行了免疫沉淀(IP)研究。用表达Caspr/F3的细胞进行转染，因为转染的Caspr在细胞表面正确表达是需要F3的(Faivre-Sarrailh et al，2000)。Western印迹证实在Caspr/F3-，而不是F3-和野生型CHO细胞中，Nogo-A和Caspr确实相关(图3Bb)。这些观察表明Nogo-A特异地与Caspr而不是F3相互作用。
大多数Nogo-A和Caspr/F3复合物不是共存在脂筏(lipid raft)上在神经元，转染的CHO细胞和OL中F3和Caspr与脂筏有关(Buttiglioneet al，1998；Krmer et al，1999；Faivre-Sarrailh et al，2000)。为研究在发育中Nogo-A和Caspr/F3与显微结构域的关系，将大鼠大脑皮质裂解并按照已建立的步骤(Krmer et al，1999)在蔗糖密度梯度上分级分离。已知的筏相关蛋白F3大部分在级分5中检测到，并且确实在此级分中发现裂解物中所有的Caspr，表明两种分子位于神经元筏中。另一方面，尽管少量存在于级分5-7中，发现大多数Nogo-A在富含细胞骨架相关蛋白的级分8-12中(图3Bc)。用P15和成年的大脑皮质裂解物也得到了相似的结果(未显示)。这些观察结果证实在体内大多数Nogo-A不存在于神经元筏中，并为结旁段的Nogo-A源于少突神经胶质膜的观点提供间接支持。
Nogo-A经由细胞外Nogo-66环以反式方式直接与Caspr相互作用Nogo-A的细胞外结构域包括在其两个跨膜结构域之间的66个氨基酸的环，称作Nogo-66结构域(Fournier et al，2001)。在Nogo-A和Caspr间的任何反式相互作用会涉及Nogo-66结构域。发明者接下来用细胞粘附测定研究是否Nogo-A和Caspr直接以不依赖于F3的反式方式相结合。将不同的CHO细胞系(表达Caspr或其它)铺在分别用Nogo-66肽或含有Nogo-66的重组的GST融合蛋白(GST-Nogo-66)或Nogo-A的细胞质N-末端结构域(GST-Nogo-N)以及GST包被的底物上。只有表达Caspr/F3-，而既不是表达F3-也不是野生型CHO细胞容易粘附于Nogo-66肽(图4A-C)或GST-Nogo-66(图4E-G)。这些细胞类型都不与GST(图4I-K)或GST-Nogo-N(未显示)很好地粘附。粘附细胞的定量显示Caspr/F3-CHO细胞结合于Nogo-66和GST-Nogo-66的数目均大大高于其它实验组(图4M)。
为研究是否Nogo-66只与Caspr或者细胞表面Caspr/F3复合物产生的结合口袋(binding pocket)相互作用，发明者用磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C(PI-PLC)去除GPI连接的F3。在PI-PLC处理后，Caspr/F3-CHO细胞仍旧既粘附于Nogo-66也粘附于GST-Nogo-66，但不粘附于GST包被的底物(图4D，H，L和M)。为确认PI-PLC处理后F3被完全从细胞表面去除，使用浓度渐增(0.02，0.04和0.06单位/ml)的PI-PLC。在所有三个不同浓度的PI-PLC条件下，细胞结合不变(图4N)。与以前的工作(Faivre-Sarrailh et al，2000)一致，用F3抗体的Western印迹(图4O)和免疫染色(未显示)证明在PI-PLC处理后大量的F3真正地被从Caspr/F3-CHO细胞去除。PI-PLC对细胞粘附于Nogo-66底物的这种效应的缺失表明F3不直接参与Nogo-66和Caspr间的相互作用。
Nogo-A/Caspr复合物与K+通道相互作用在髓鞘形成过程中，K+通道从近结旁区的正确隔离需要完整的结旁段轴突胶质连接(Vabnick and Shrager，1998)。在髓鞘形成和髓鞘再形成过程中，这种结构由轴突分子诸如Caspr和F3，以及由神经胶质特异的分子形成并维持(Girault and Peles，2002)。发明者假设Nogo-A和Caspr的相互作用形成轴突-神经胶质信号连接，其能影响髓鞘形成早期在近结旁区K+通道的最终定位。进行免疫沉淀测定以研究在CNS中是否K+通道能与Nogo-A/Caspr复合物物理性相互作用。从P7和成年(未显示)小鼠脑提取物，Nogo-A和Caspr两种抗体与Kv1.1和Kv1.2相互沉淀，而不与Kv2.1(未显示)沉淀，而NB3抗体和非免疫IgG不发生沉淀(图5Aa)。Kv2.1一般发现于神经细胞胞体和近侧突起中，轴突中没有(Trimmer et al，1991)。在用成年小鼠脑的膜提取物的GST拖曳测定(pull-down assay)中，Caspr和Kv1.1都可以被GST-Nogo-66所拖曳，但是不能被GST-Nogo-N或GST自身所拖曳(图5Ab)。这些结果支持Nogo-66是Caspr的反式相互作用配体而且K+通道可能与该复合物相互作用的观点。
Nogo-66经由Caspr间接地与K+通道相互作用发明者接下来研究是否Nogo-66可以直接与K+通道相互作用。用Kv1.1cDNA瞬时转染Caspr/F3-，F3-和野生型CHO细胞，并分别用GST和GST-Nogo-66融合蛋白对膜提取物进行GST拖曳测定。野生型和表达F3的CHO细胞不表达Caspr(图5Ba)。Western印迹分析显示，对于表达Caspr/F3而不是表达F3和野生型CHO细胞，Kv1.1和Caspr都只能被GST-Nogo-66，而不能被GST所沉淀(图5Bb)。这些结果证明至少在体外Nogo-66可以通过Caspr间接与K+通道相互作用。
Nogo-A和Caspr与沿有髓鞘轴突的Kv1.1共享相似的空间和时间关系考虑到上面确定的结旁段Nogo-A/Caspr和Kv1.1可能的相互作用，发明者研究了在发育中Nogo-A/Caspr和Kv1.1沿有髓鞘轴突分布之间的关系。在生后不同天数对大鼠脑干切片进行Caspr和Kv1.1以及Nogo-A和Kv1.1免疫荧光双标记。从大约P5开始Caspr和Kv1.1标记的集合均变得明显(图6Aa)。从P5-P14(图6A，a-c)，Caspr染色在结旁段与Kv1.1的染色重叠，表明两种分子在该重要的髓鞘形成早期的共同定位。在P30(图6Ad)，Kv1.1标记变得在近结旁区更清楚，在结旁段和近结旁区的边缘仅有极少重叠条带。在成年(图6Ae)，Caspr和Kv1.1沿有髓鞘轴突分离成不同的显微区域。在P1时Nogo-A和Kv1.1的免疫荧光双标记(图6B，a-c)显示Nogo-A沿神经纤维被广泛标记。在P5(图6B，d-f)，Nogo-A染色的成簇和聚集变得更明显。但是，染色类型仍不具有明确的区域或边缘。结间隙明显并且也看到半结(hemi-node)。从P7(图6B，g-i)，Nogo-A分布明显向结旁段簇集。从P5-P14(图6B，j-1)，在结旁段和近结旁区Nogo-A和Kv1.1免疫染色的聚集之间的重叠程度不断变化。在P30(图6B，m-o)，Kv1.1聚集仅定位于近结旁区之外，类似于成年动物的状况。
通过在捕获的图像(图6Ca)上测定Nogo-A和Kv1.1标记区域的长度定量Nogo-A/Kv1.1和Caspr/Kv1.1的共同定位。Nogo-A标记区域的平均长度在P5大约是9μm，在P7是5μm，这从P14到成年短至大约2μm，表明Nogo-A在髓鞘形成的早期阶段进一步聚集成更窄的区带。Kv1.1标记区域的平均长度不显示这种随时间的明显改变在P5为6um到成年为8μm。值得注意的是Nogo-A和Kv1.1标记间重叠长度的变化从P5的4μm，P14的2μm和P30的1μm降低到成年的几乎为0μm。这种变化证明在紧密的髓磷脂完全定位之前，在结旁段Nogo-A和Ky1.1有短暂的共同定位。也比较了Nogo-A/Kv1.1和Caspr/Kv1.1共同定位的程度(图6Cb)。从P5-P14，在每个视野中＞60％的结旁段是Nogo-A/Kv1.1和Caspr/Kv1.1双标记的。在成年，Nogo-A和Caspr与Kv1.1分开并观察到完全的分离。已知K+通道结合于Nogo-A/Caspr复合物，这些观察结果意味着Nogo-A/Caspr复合物可以短暂地与K+通道相互作用，并且如果如此可以协同调节在髓鞘形成早期Kv1.1的结旁段定位。
在脱髓鞘动物模型中Nogo-A和K+通道Shiverer是低髓鞘化型(hypomyelinating)突变体小鼠，其缺乏髓磷脂基本蛋白(MBP)，有正常少突神经胶质包鞘的轴突，但是表现异常的轴突胶质连接和沿轴突K+通道的不正常定位(Rasband and Trimmer，2001a)。为研究神经胶质相关分子在调节有髓鞘轴突上K+通道定位中的作用，检测Nogo-A，Caspr和Kv1.1在EAE大鼠和shiverer小鼠中的分布。免疫荧光复染证明与正常大鼠脑干(图7B)相比，在EAE大鼠的结旁区仍可检测到紊乱的Caspr(绿色)和Kv1.1(红色)标记(图7A)。与正常小鼠脊髓切片中结旁段Nogo-A(绿色)和近结旁区Kv1.1(红色)的定位(图7C)相反，Nogo-A染色沿轴弥散并且在shiverer小鼠的结旁区几乎检测不到它的聚集(图7D-G)。然而在OL中Nogo-A的免疫反应仍完整而清楚(箭头；图7C，F和G)。与以前的观察结果(Poliak et al，2001)一致，紊乱的Caspr和Kv1.1标记共同定位在shiverer小鼠的结旁段(图7I)，而不在正常小鼠(图7H)。对成对Kv1.1免疫染色间的距离的定量分析证明在EAE和shiverer小鼠与正常动物相比，所述对间的距离明显降低(p＜0.01；图7J)。这些观察表明，在表现结旁段连接缺陷的EAE大鼠和shiverer小鼠两种病理条件下，K+通道的确再定位于结旁段。同时，Nogo-A在结旁段的聚集明显减少。因此，除了轴突分子，某些参与轴突胶质连接形成的神经胶质来源的分子对正常成年动物K+通道在近结旁区正确定位也可能是必不可少的。此时，对发明者而言，这些变化的分子结构基础是未知的，但是很可能涉及K+通道和Nogo-A/Caspr复合物的相互作用。
涉及发明第一方面的讨论Nogo-A，而不是Nogo-66受体，是结旁段的标志已经有描述Nogo-A在少突神经胶质和CNS髓磷脂中的定位(Huber etal，2002；Liu et al，2002；Wang et al，2002)。明确地，Nogo-A定位在少突胶质细胞胞体和突起中以及髓鞘的最内环和外环(Huber et al，2002)。在小脑发育中，Nogo-A mRNA和蛋白出现的时间段与形成髓鞘框架的时间平行，刚好发生在髓磷脂基本蛋白表达前的时期。这些观察表明Nogo-A在髓鞘形成中起作用。
更多的证据表明少突轴突-胶质通信在调节胶质细胞分化(Barres et al，1999；Marcus et al，2000)和离子通道在神经突上聚集(Dupree et al，1999；Ishibashi et al，2002)中的重要性。发明者已经研究是否Nogo-A定位在具体位点参与这种细胞间信号传递并且已经显示Nogo-A主要定位在沿轴突的Na+通道和K+通道之间的间隙，在成年CNS中它的免疫反应清楚地位于神经胶质环与轴突膜表面接触的部位。这表明Nogo-A是结旁段成分，通过观察数种病理动物模型进一步确认了这点。与Nogo-A下调相一致，它在EAE动物结旁段的聚集明显减少。在CGT-/-小鼠中Nogo-A免疫反应存在于反向的结旁段环，但是，在CGT-/-和shiverer小鼠的结旁段也几乎检测不到聚集的Nogo-A。总之，这些观察支持Nogo-A是结旁段神经胶质成分的观点(图8)。
结旁段Nogo-A的染色类型和少突神经胶质起源提出了关于它是否与轴突表面成分相互作用的问题。迄今为止，仅知道Nogo-A的高亲和性神经元受体是Nogo-66受体(NgR)。以前的工作显示NgR在神经元和沿有髓鞘轴突上的表达主要发现于成年动物，并且在髓鞘形成期间它的表达是极低的(Fouruier et al，2001；Hunt et al，2002；Wang et al，2002)。发明者的结果与这些发现一致，因为他们显示从发育的早期阶段到成年，在脑干中NgR位于神经元胞体并且沿有髓鞘的轴突均一分布。在结旁段明显的Nogo-A聚集，而NgR分布类型仍是沿轴突弥散分布是令人感兴趣的。由于Nogo-A的聚集与髓鞘形成的发育时期相符，因此结旁段的Nogo-A可能因此参与该过程，并可能与除NgR以外的其它分子相互作用，起到与抑制轴突芽生不同的功能。
结旁段的Nogo-A是Caspr的神经胶质配体在结旁段，GPI-锚定的轴突F3/Contactin以与膜蛋白Caspr的复合物的形式存在。Caspr/F3复合物与神经胶质源的分子NF155以反式相互作用，并且是结旁段轴突胶质分子连接的实例(Girault and Peles，2002)。发明者已经显示Nogo-A具体与Caspr/F3复合物，而不是另一种结旁段分子NB3相关，在CO-IP测定中，暗示在体内Nogo-A与该复合物相互作用。大多数CNS Nogo-A不与神经元脂筏中复合物共同定位的观察结果意味着，这种相互作用可能以反式方式发生，OL膜的Nogo-A与轴突膜的Caspr/F3相互作用。尽管仍存在可能性即轴突Nogo-A是Caspr/F3复合物的顺式结合配体，并且依赖髓鞘形成来聚集，但是这似乎不可能因为结旁段Nogo-A主要由CNS中的OL表达(Huber et al，2002Liu et al，2002；Wang et al，2002)。为支持此观点，发明者进一步证明表达Caspr/F3的CHO细胞既结合于Nogo-66肽包被的底物也结合于GST-Nogo-66包被的底物，该处结合必须以反式方式进行。这种结合甚至发生在经PI-PLC处理从细胞中去除F3之后，进一步说明Nogo-A与Caspr直接作用(图8)。
在调节Kv1.1定位中Nogo-A可能与Caspr互补有证据强烈显示K+通道在近结旁区聚集是受形成髓鞘的OL影响(Vabnick and Shrager，1998)。Shaker-型K+通道是由Kv1.1，Kv1.2和Kvβ2亚基构成的多蛋白复合物(Rasband and Trimmer，2001b)。在CNS的有髓鞘轴突上，K+通道标记在出生后的发育进程中变得更加明显，起初定位在近结旁区，也定位在有Caspr免疫反应的结旁段区域(Rasband et al，1999)。在以后的出生后发育阶段，K+通道被排除在结旁段之外，并且在近结旁区消失。发明者已经显示，Nogo-A经Caspr间接与Kv1.1联系。但是，Nogo-A和Kv1.1，以及Caspr和Kv1.1分布类型中的发育性变化是相似的，这提示有Kv1.1和Nogo-A/Caspr复合物之间相互作用发生，至少在髓鞘形成的早期阶段当Nogo-A/Caspr和Kv1.1在结旁段共同定位时暂时发生过。Nogo-A可能因此对Caspr在组织成熟的轴突结构域中起到补充性或调节性作用，并且因此对K+通道在近结旁区的协同定位有帮助(图8)。
可能使用OL特异的启动子的Nogo-A(或Nogo-A/Caspr)条件下转基因或敲除的动物的体内研究，可以帮助进一步揭示Nogo-A在髓鞘形成中的作用。根据发明者的定量分析，成对的K+通道聚集之间的间隔距离明显减小。与正常有髓鞘的轴突相比，这与Nogo-A在EAE大鼠和Shiverer的脱髓鞘轴突中的聚集明显减少是同时发生的。这些观察结果意味着在病理情况下K+通道与Caspr再次共同定位，研究在髓鞘再形成过程中是否也发生这种短暂的相互作用可能是有趣的。
也表明有理由进一步研究的一点是Nogo-A，Caspr，和K+通道之间相互作用的结构和功能性质。应当指出Caspr家族成员的定位在有髓鞘的轴突上中划出清楚的区域界限。与Caspr有45％同一性的Caspr2定位在成年有髓鞘轴突的近结旁区。它通过其C-末端与K+通道间接联系，其C-末端含有公知的PDZ结合位点(Poliak et al，1999)，此特征是最近描述的哺乳动物Caspr家族的两个其它成员Caspr3和Caspr4所共有的(Spiegel et al，2002)。与该家族其它成员相比，从长度来说Caspr的C-末端是相当独特，发明者制备的抗体不可能与Caspr的其它同种型交叉反应。Caspr的C-末端不具有公知的PDZ结合基序，但是与Caspr2共享区带4.1结合结构域(Scherer andArroyo，2002)。判断是否由Caspr的该结构域介导其与Kv1.1和Kv1.2相互作用是感兴趣的。
在CNS中Nogo-A的相互作用仅知道除了NgR外Nogo-A相互作用的配偶体是Nogo相互作用线粒体蛋白(NIMP)(Hu et al，2002)，α-微管蛋白，和MBP(Taketomi et al，2002)。所有这些相互作用可能有Nogo-A细胞内结构域的参与，没有Nogo-66细胞外环参与，后者是最可能作为细胞间信号配体发挥功能的Nogo-A结构域。发明者的结果显示少突胶质细胞表面Nogo-66环直接与轴突表面Caspr结合，因此意味着Nogo-A在轴突胶质连接中具有以前没想到的功能。这种相互作用不包括NgR。实际上，不清楚在正常生理状态下，是否需要任何成年少突神经胶质的Nogo-A和轴突NgR之间持久而重现的相互作用。发明者们相信Nogo-A/Caspr相互作用可能在髓鞘形成过程中或形成后，以某种方式成型化并维持轴突胶质连接的结构(图8)。更详细地，这种相互作用可能具有组织其它分子在特定连接区域定位的作用。
简言之，发明者显示少突胶质细胞Nogo-A簇集在具体的轴突胶质连接处，在该处它经其细胞外的Nogo-66环与轴突Caspr直接相互作用，并与K+通道间接作用。这表示迄今为止首次不依赖NgR的Nogo-66作用，并且对于Nogo-A在轴突胶质连接结构的形成和维持中的作用具有重要意义。
发明第一方面涉及的物质和方法抗体抗Nogo-A的多克隆抗体以前有所描述(Liu et al，2002)。发明者的实验中使用两种抗NgR的多克隆抗体。一种是用与人NgR的277-430氨基酸的谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白在家兔体内激发产生的，另一种是由Dr.Stephen Strittmatter惠赠(Yale University School of Medicine，New Haven；Wang et al，2002)。抗F3和NB3的抗体以前有描述(Ang et al，2001)。
为制备抗Caspr的多克隆抗体，从人脑cDNA中扩增编码人Caspr(Einheber et al，1997)胞内区(amino acids 1308-1377)的230bp片段，扩增使用分别添加了BamH1和EcoR1位点的引物5’-AGTCGGATCCACAAAATC ATCGA/CTAT/CA/CAGGG-3’(正向)和5’-ACTCGAATTCAGACCTGGACT CCTCCTCCAA/GGATCTGG-3’(反向)。将扩增的片段用BamH1和EcoR1消化并亚克隆到pGEX-3C的框内，最终构建体的序列用DNA测序来证实。将质粒转化大肠杆菌BL21，使用谷胱甘肽-琼脂糖珠从细菌裂解物中回收预期大小的Caspr-GST融合蛋白。用还原的谷胱甘肽将Caspr-GST从珠上洗脱，冻干浓缩，并用以免疫家兔。通过免疫印迹和免疫沉淀实验确认从家兔获得的免疫血清识别雏鸡和小鼠Caspr的能力。
抗Kv1.1α-亚基(K20/78)和抗Na+通道(K58/35)的小鼠单克隆抗体分别购自Upstate Biotechnology和Sigma。抗Kv1.1，Kv1.2和Kv2.1的多克隆抗体购自Chemicon。抗MAP2的单克隆抗体购自Sigma。Cy2-偶联的山羊抗兔和Cy2-偶联的山羊抗小鼠二抗购自Amersham Pharmacia Biotech，ABC试剂盒购自Vector Laboratories。
EAE模型按照以前的报道(Ahn et al，2001)建立大鼠的实验性自身免疫脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis)(EAE)模型。简言之，按照0.5ml/只大鼠在Lewis大鼠(2月龄，雌性)的两侧后足垫中注射加了完全弗氏佐剂(CFA，含有1mg/ml结核杆菌；sigma)(1∶1)的新鲜大鼠脊髓匀浆(SCH)。密切观察动物EAE相关症状以判断疾病进展。在注射后13天(dpi)～14dpi，将在EAE顶峰阶段的动物处死作进一步实验。
免疫组织化学和免疫电子显微镜术对生后不同年龄(P1，P5，P7，P14，P30，P60和成年)的Wistar大鼠，CGT-/-(P16P21；Coetzee et al，1996)和Shiverer(成年，Jackson Laboratories)小鼠用4％多聚甲醛进行灌注。取出脊髓和脑干，在4％多聚甲醛中后固定2小时，随后在15％和30％蔗糖中依次保温。将恒冷箱切片(10μm)、用抗Nogo-A(1∶200)或Caspr(1∶200)多克隆抗体以及抗Kv1.1α-亚基(1∶200)或Na+通道(1∶100)单克隆抗体分别双标记，或者用抗NgR单克隆抗体与抗MAP2(1∶100)或Kv1.1α-亚基的单克隆抗体双标记。免疫染色用Carl ZeissLSM5共聚焦显微镜观察并拍照。测定出生后不同天数时Nogo-A和Kv1.1免疫标记的长度和它们的重叠。计数生后不同天数时在结旁段Nogo-A和Kv1.1或Caspr/Kv1.1的共同定位。在正常的和EAE大鼠，野生型和Shiverer小鼠的脑干切片中，测量成对的Kv1.1免疫标记之间的距离并计数Nogo-A簇。数值表示为均数±SEM。使用配对T检验进行统计学分析。
对于电子显微镜，按照以前公开的方法(Huber et al，2002)从成年Wistar大鼠和CGT-/-(P16)制备标本。将在镍网上的90nm厚的超薄切片用1％BSA，0.1％Tween20，1％正常山羊血清和0.025％NaN3，在0.1M磷酸钠缓冲液(pH8.3)中、于室温封闭40分钟，然后分别用在相同缓冲液中的Nogo-A多克隆抗体4℃保温过夜。用上述缓冲液洗涤后，将该网与偶联了10nm金(1∶20，Aurion)的山羊抗兔IgG一同保温1小时，并用2.5％戊二醛水溶液固定15分钟。用醋酸双氧铀和柠檬酸铅复染后，将该网置于Philips 208电子显微镜下观察。
Western印迹和免疫共沉淀实验收集成年的，出生后1天(P1)至30天(P30)Wistar大鼠CNS的各个部位(全脑，脑干，海马，大脑皮质和脊髓)，EAE和对照大鼠的脊髓，并用含有1％Triton X-100和蛋白酶抑制剂混合物的磷酸盐缓冲液提取。将裂解物在SDS-PAGE凝胶上电泳并在硝酸纤维素膜(Hybond C-extra，Amersham)上印迹。将相同的印迹用抗Nogo-A，Caspr，Nogo-66受体(NgR)和γ-微管蛋白(为了上样标准化)检测，并用Pierce化学发光检测试剂显影。
对免疫共沉淀(IP)实验，按照以前描述的(Lei et al，2002)制备脑膜提取物。简言之，将脑组织置于添加了1％蛋白酶抑制剂混合物(Amersham)的冰冷的匀浆缓冲液(320mM蔗糖，10mM Tris-HCl pH7.4，1mM NaHCO3pH7.4，1mM MgCl2)中匀浆，然后于5,000g离心15分钟。收集上清并于4℃，60,000g(Beckman ultracentrifuge)离心60分钟。然后将沉淀溶解于裂解液(10mM Tris-HCl pH9，150mM NaCl，0.5％Triton X-100，1％去氧胆酸钠(sodium deoxycholate)(DOC)，0.5％SDS，2mM EDTA，和1％蛋白酶抑制剂混合物)中用于后面的实验。将分别用非免疫IgG，Caspr，Nogo-A和NB3抗体免疫沉淀的蛋白用Laemmli样品缓冲液从珠上洗脱，在8％SDS-PAGE凝胶上分离，转移至硝酸纤维素膜并检测Caspr，Nogo-A，Kv1.1，Kv1.2，F3或NB3之前。在另一个实验中，将在哺乳动物表达载体pCIneo(Promega)上的Nogo-A表达构建体瞬时转染表达Caspr/F3的CHO(Faivre-Sarraih et al，2000)，表达F3的CHO(Gennarini et al，1991)或野生型CHO细胞进行免疫共沉淀研究。
细胞粘附实验和PI-PLC处理Nogo-66肽(KLSDVLDDVLFLRRLEKITCNVHGLASNSYKQVLEESIAVESELYARFPHGEDSKQIAQIVGKYIR)购自Loke Diagnostics ApS(丹麦)。为得到Nogo-66-GST和Nogo-N-末端-GST(Nogo-N-GST)的重组蛋白，从人脑cDNA克隆HK07722(Nogo-A)中扩增Nogo-66和Nogo-N-末端的编码序列，所使用的引物如下对于Nogo-66-GST5’-CTGAATTCTTAGGATATACAAGGGTGT-3’(正向)5’-GCTAAGCTTTCACTTCAGAGAATCAACTA-3’(反向)对于Nogo-N-GST5’-AGGAATTCTAGATGAGACCCTTTTTGC-3’(正向)5’-CCCAAGCTTTCAATTAAAACTGTCTTTTGCTTT-3’(反向)。
将PCR产物用EcoRI和HindIII消化并连接到EcoRI/Hind III-消化的pGEX-KG上(Guan and Dixon，1991)。然后，将这些重组质粒转化到大肠杆菌(E.coli)Top 10细胞中。从细菌裂解物中回收GST融合蛋白，并用谷胱甘肽-琼脂糖珠纯化。按照以前描述的方法(Xiao et al，1996)进行细胞粘附实验。将蛋白斑点(1.5μl的5μM GST， Nogo-66-GST或100μM Nogo-66)点于硝酸纤维素包被的Petri皿(Becton Dickinson)表面并在湿润的空气中于37℃保温2小时。然后将平皿用含2％热灭活的无脂肪酸的BSA(Sigma)保温过夜以封闭残留的非特异蛋白结合位点。然后将模拟(mock)-转染的CHO，F3转染的或Caspr/F3共转染的CHO细胞以2.5×105细胞/ml的密度接种在2ml化学限制性培养基中，并在湿润空气中于37℃保温。12小时后，用含2.5％戊二醛的PBS灌注来固定所述细胞。对粘附于各种斑点的细胞进行拍照并计数。所有实验至少进行三次。统计学分析使用Student-t检验完成。显著性水平选择为p＜0.05。
如所示，将转染了Caspr/F3的CHO细胞用PI-PLC(0.02，0.04 or 0.06U/ml)(Sigma)处理，保温2小时然后按照上述的同样步骤接种在平皿上。如上述将PI-PLC处理的细胞进行Western印迹分析和免疫组织化学。
GST拖曳实验将与珠结合的GST，GST-Nogo-66和GST-Nogo-N(20μg)分别与0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4)中均为1.5ml的下列物质混合并于4℃保温过夜成年脑的膜提取物，或野生型、F3表达型和Caspr/F3表达型CHO细胞的膜提取物CHO细胞，所述细胞由Kv1.1瞬时转染(Trimmer博士惠赠，Nakahira Ket al，1996)。将结合的蛋白用2×Laemmli样品缓冲液洗脱，经SDS-PAGE分离并用Caspr和Kv1.1抗体检测。
脂筏分析基本上按照Krmer et al，1999描述的方法完成大鼠大脑皮质(15天和成年)的去垢剂提取物的制备。简言之，将切下的大鼠大脑皮质(总湿重2g)在含有2％Triton-X100，2mM过钒酸盐，蛋白酶抑制剂片(Roche)的12.5mlTBS(pH 7.4)中匀浆，并于4℃搅拌30分钟。通过在TBS中加入等体积的80％蔗糖将去垢剂提取物的蔗糖含量调节至40％，并放入SW28转头的超速离心管中。将在TBS中的从5％至30％线性梯度蔗糖施加于裂解物样品。将所述梯度于25,000转/分离心18小时。自上至下按每2ml一份收集。每份中的蛋白由SDS-PAGE然后由Western印迹分析。去垢剂不溶解的漂浮物质大多数回收在级分5中。
发明的第二方面发明第二方面的背景髓鞘形成是一个复杂的多步骤过程，其中潜在的分子机制还远没有完全弄清楚。但是，认为在结旁段轴突与可成髓磷脂(competent)细胞的相互作用对髓磷脂螺旋缠绕轴突节段而形成的隔离起重要作用。这种轴突-胶质接触类似于无脊椎动物的有隔膜连接(septate junction)，并被认为作为轴突和髓磷脂环之间的锚点，起到进入轴突周围空间的部分扩散障碍物(partialdiffusion barrier)的作用，并通过阻止膜成分的侧向扩散将轴突分隔成多个区域(Rosenbluth，1995)。近几年，已经发现位于结旁段区域的具体分子。
F3/Contactin是神经细胞粘附分子免疫球蛋白超家族中的糖基-磷脂酰肌醇(GPI)连接的分子(Gennarini et al，1989；Faivre-Sarrailh et al，2000)。该分子由一串模块化(modular)免疫球蛋白结构域和III型纤连蛋白重复构成。发明者以前证明(Xiao et al，1998，在此引入以作参考)F3是特异性定位于郎维耶结(Wintergerst et al，1993)的神经胶质起源分子-细胞外基质糖蛋白腱生蛋白-R的神经元受体。与F3的相互作用中，腱生蛋白-R上的结合位点位于EGF(表皮生长因子)样重复(Xiao et al，1996，1997，在此引入以作参考)。腱生蛋白-R是钠通道亚基的功能调节物。F3以反式方式与RPTPζ/β(受体蛋白酪氨酸磷酸化酶)作用促进神经突生长(Sakurai et al，1997)，并以顺式方式与RPTPα作用(Zeng et al，1999)以便向髓鞘形成相关的Fyn激酶(Umemori et al，1994)转导细胞外信号。此外，在结旁段F3与Caspr/Paranodin共同定位并以顺式方式发生相互，而作用F3与神经胶质神经束蛋白155共同定位并以反式方式发生相互作用(Girault and Peles，2002)，其中对髓鞘形成而言结旁段是轴突胶质联系的重要部位。无F3小鼠表现部分破坏的结旁段结构并在P18时死亡(Berglund et al，1999)，表明F3可能对发育是至关重要的。
已知也作为paranodin的F3相关蛋白(Caspr)，是结旁段的另外一种轴突成分(Einheber et al，1997；Menegoz et al，1997)。Rios等(2000)进一步显示在髓鞘形成过程中，F3和Caspr在结旁段共同定位并以顺式方式作用。尽管在染色也扩展到视神经中的结区，但在成年坐骨神经和视神经中F3染色位于结旁段。
NB3是与F3同一亚家族的神经细胞粘附分子(Lee et al，2000)。在大脑，NB-3mRNA分析显示在胚胎发生过程中低水平表达而在出生后突然增加，在出生后第7天达到最高水平，这与髓鞘形成时间框(time frame)相对应。随后，所述水平降至高峰的五分之一并保持至成年。
脊椎动物中枢神经系统(CNS)中的髓鞘形成对于快速的冲动传导是必不可少的。在CNS中，少突胶质细胞(OL)分化由神经元来源的信号介导(Barres and Raff，1999)。轴突胶质相互作用(axoglialinteraction)Jagged1/Notch1，促进少突胶质细胞前体细胞(OPC)迁移并抑制OPC分化(Wang et al，1998)。Notch/Jagged1信号通路在促进神经胶质发生上起到重要作用，例如在胎儿前脑中的放射状神经胶质细胞，背根神经节中的施万细胞，和视网膜中的Muller神经胶质细胞(Furukawa et al，2000；Hojoet al，2000；Gaiano et al，2000；Morrison et al，2000；Wakamatsu et al，2000；Tanigaki et al，2001)。OPC中Notch1的条件性消除导致出现异位早熟OL并随后凋亡(Genoud et al，2002)，在多发性硬化中，有效的髓鞘再形成缺失部分由于星形胶质细胞表达的Jagged1对OPC Notch受体的活化(John et al，2002)，意味着当Notch1缺乏或由Jagged1的活化不充分时，OPC分化可变为紊乱的。因此，除了抑制Jagged1/Notch1信号通路外，经Notch1的其它通路，可能指导性地介导OPC分化成OL。然而，对于控制OPC向OL分化时机和随后OL成熟的分子机制的了解仍很少。考虑到在少突胶质细胞成熟前Jagged1被明显下调，可以想像可能其它分子与继续在髓鞘形成中起作用的Notch相互作用。聚集在轴突的分离节段的分子是潜在的Notch1配体。
Notch1是I型跨膜蛋白，其经由侧方抑制(lateral inhibition)介导细胞命运选择。它的核心信号机制包括受调节的膜内蛋白质水解(RegulatedIntramemebrane Proteolysis)(RIP)(Ebinu and Yankner，2002)。一旦与经典的配体，Delta，Serrate/Jagged和Lag-2(统称DSL)结合，Notch经历两次蛋白水解，释放其细胞内结构域(NICD)。NICD转移至细胞核并与RBP-J转录因子作用以活化例如Hes基因(Martinez Arias et al，2002)。此外，已经鉴定Deltex1(DTX1)是Notch信号通路的细胞质下游元件。DTX同源物共享三个相同的结构域，即，N-端区，富含脯氨酸基序和RING-H2指(finger)基序(Kishi et al，2001)。具体是，N-端区与NICD相互作用。经由DTX1的Notch信号抑制调节OL分化的JNK信号，并与Wingless信号协同作用(Brennan and Gardner，2002；Martinez Arias et al，2002)。尽管数项研究显示活化Notch/DTX1信号的细胞外配体存在，但是还没有鉴定出推定的配体。
已经发现Notch调节神经胶质分化(Wang et al，1998；Gaiano et al，2000；Morrison et al，2000)。对发明者重要的是，与腱生蛋白-R一样，Notch细胞外部分含有多个EGF-样重复，其为潜在的配体-受体相互作用的位点，(Rebay et al，1991)。因此对发明者来说可以想像神经胶质来源的Notch可能是轴突F3和NB3的结合配偶体。在大鼠视神经，Wang等(1998)证明Jagged1在视网膜神经节细胞轴突上的表达。Jagged1向少突胶质细胞前体传递信号以抑制其分化。感兴趣的是Jagged1的表达类型，其随与髓鞘形成相平行的时间进程而进行性下调(Dugas et al，2001)。这得出结论是Jagged1向少突胶质细胞传递信号，因此作为部分时间机制来调节少突胶质细胞分化以及由此调节髓鞘形成。但是髓鞘的分节段性质如何保持？阻止形成髓鞘的少突胶质细胞包鞘化公知的郎维耶结的终止信号是什么？发明者假设这种轴突终止信号理论上应该存在于结的每一侧，即在结旁段。如下面详述的，发明者已确实证明F3能够作为少突胶质细胞突起的终止信号起作用并且NB-3可能参与触发少突胶质细胞分化。
发明第二方面概述本发明者第一次显示F3和NB-3都是少突神经胶质Notch受体的生理性配体-确认经由Deltex1的信号通路的存在以协调髓鞘形成中事件。
因此，发明者鉴定了新的结旁段分子-NB-3，并显示终止信号位于结旁段，其涉及F3/NB-3向少突神经胶质表面的Notch发出信号。在OLN-93细胞和F3转染的CHO细胞共培养系统中，少突神经胶质细胞突起终止并在F3转染的细胞体上展开而绕过对照CHO细胞。细胞粘附，免疫共沉淀和GST拖曳实验确认F3/NB-3和Notch结合成复合物。MAG上调出现在OLN-93细胞和F3转染的CHO细胞共培养时，也出现在OLN-93细胞和原代少突胶质细胞接触F3和NB-3蛋白质底物时。这些结果描述了F3/NB-3和Notch之间新的、功能重要的信号相互作用，其中Notch参与髓鞘形成的调节。本发明者在细胞粘附实验和生物化学实验中也显示F3能结合于Notch1和Notch2。而且相互作用诱导少突胶质细胞系OLN-93的放射性形态变化，OLN-93发展出包鞘化特征并明显地上调髓磷脂相关蛋白，例如MAG(髓磷脂相关糖蛋白)，CNPase(2′，3′-环核苷3′-磷酸二酯酶)，和PLP。这些结果表明F3是Notch受体的生理配体，并且该信号在少突胶质细胞成熟中起重要作用。
这个判断显示F3和NB-3与Notch的相互作用在少突胶质细胞成熟中起重要作用。
发明者进一步确定，F3诱导Notch在S3位点的膜内裂解，并且F3/Notch诱导MAG上调是不依赖于HES1的并与Deltex 1(DTX1)有关。DTX1是已知的Notch信号通路的细胞质下游元件。以前已经显示Notch信号经由DTX1来抑制JNK信号，其为调节少突胶质细胞分化的通路。但是，以前的研究没有鉴定出激活Notch/DTX1信号的细胞外配体。
本文中，发明者报道NB-3是发育性(developmentally)簇集在CNS结旁段的神经元起源细胞的识别分子，并鉴定NB-3是Notch1的功能配体。NB-3/Notch信号通路经Deltex1促进OPC分化和OL成熟。而且，Jagged1局限于近结旁区和结间区。因此从Jagged1/Notch1向NB-3/Notch1的空间信号转换机制可能沿轴突存在，其可协调少突神经胶质成熟。
在脊椎动物CNS中神经元和神经胶质在临时分离但重叠的时相中出现。从共同的祖细胞首先产生神经元，随后是星形细胞和然后少突胶质细胞(OL)(Sauvageot and Stile，2002)。更多证据显示轴突起源的信号是调节OL成熟以及髓磷脂形成的时间和空间上所需的(Barres and Raff，1999；Hu et al，2003)。然而，关于神经元分子如何参与从神经干细胞(NSC)产生OL的了解很少。发明者关于如何有利地指导胚胎神经干细胞向OL分化的研究显示神经元细胞识别分子NB-3，结合于Notch1并触发干细胞中Notch1细胞内结构域的核转移。这种NB-3/Notch1相互作用促进从胚胎神经干细胞的少突胶质细胞产生，并可被显性阴性Notch1以及Deltex1缺失突变体所阻断，其中Deltex1缺少环-H2基序。但是，单独组成型活性Notch1不能促进OL产生，表明NB-3诱导的NICD在此过程是需要的。综合起来，这里的观察证明经Deltex1的NB-3/Notch1信号通路指导少突胶质细胞产生。
因此本发明提供刺激少突胶质细胞或其前体的分化的方法，其包括将该少突胶质细胞或其前体与F3，NB-3，或其中一种的模拟物接触。
本发明进一步提供刺激神经元，具体是神经元轴突髓鞘形成的方法，包括将少突胶质细胞、其前体、或神经元与F3，NB-3，或其中一种的模拟物接触。
在上述的任一种方法中，少突胶质细胞，前体，或神经元优选与F3和NB-3，或其模拟物接触。F3和NB-3可以以复合物的形式存在。
在该少突胶质细胞或前体中，髓磷脂蛋白例如MAG的表达对接触步骤的反应一般是上调。
不希望受任何特殊理论约束，认为MAG上调是通过F3，NB-3或其模拟物与少突胶质细胞或其前体表面的Notch具体是Notch1或2结合来诱导的。认为这种结合诱导经Deltex-1的Notch信号传递。
少突胶质细胞前体可能是少突神经胶质前体细胞(OPC)或神经干细胞(NSC)。OPC一般在其表面展示Cnpase，Gal C和MAG；NSC有Nestin标志。描述OPC和NSC的有Wang et al，1998(Notch receptor activation inhibitsoligodendrocyte diffrentiation.Neuron 21，63-75)；Mortison S.J.，2001(Neuronal potential and lineage determination by neural stem cells.Curr.Opin.Cell Biol.13，666-672)；Sauvageot，C.M.and Stiles，C.D.，2002(Molecularmechanism controlling cortical gliogenesis.Curr.Opin.Neurobiol.12，244-249)；Xiao et al，2003(F3/Contactin is a notch ligand.Cell，Vol 115，163-175).
该方法可以在体外或离体进行。该方法具体适合于产生可能用于治疗目的的分化的少突胶质细胞。因此，该接触步骤后，可以将OPC或NSC导入或植入有中枢神经系统疾病或损伤的受试者体内；例如，以神经元脱髓鞘为特征的任何疾病，例如多发性硬化(MS)，癫痫，卒中和脊髓损伤(SCI)。导入或植入后，这些经处理的细胞可能继续分化，并使脱髓鞘神经元发生髓鞘形成。
从将经处理后的少突胶质细胞前体细胞所给药的受试者获得所述少突胶质细胞前体细胞是所需的。
发明进一步提供组合物，其包括F3和NB-3或其模拟物，以及载体。所述组合物可包含F3和NB-3的复合物，或其模拟物。
在某些实施方案中，组合物是药用组合物，并因此包括可药用的载体。优选药用组合物作成体内注射的制剂，更优选用于向CNS中直接注射。
也提供的是上面描述的组合物，其用于医学治疗方法中。具体提供所述组合物用于CNS损伤或疾病的治疗。它们可被用于治疗以神经元脱髓鞘为特征的任何疾病，例如SCI，MS，癫痫或卒中。
也提供的是F3和/或NB-3在用于治疗CNS损伤或疾病的药物制备中的应用。可以将它们单独或分别制剂。不过分别制剂的NB-3和F3可以一起给药。
因此也提供F3在制备用于治疗CNS损伤或疾病的药物中的应用，其中药物与NB-3或其模拟物联用给药。
同样地，也提供NB-3在制备用于治疗CNS损伤或疾病的药物中的应用，其中药物与F3或其模拟物联用给药。
发明进一步提供刺激神经元，具体是神经元轴突髓鞘形成的方法，包括将神经元或少突胶质细胞与本文描述的组合物接触。
发明进一步提供治疗患有中枢神经系统疾病或损伤的受试者的方法，包括向受试者给药本文描述的药用组合物。
从前述已经清楚，受试者一般患有以脱髓鞘为特征的疾病，例如SCI，MS，癫痫或卒中。
发明进一步提供筛选能调节(优选促进)Notch与F3和/或NB-3相互作用物质的方法，该方法包括将F3和/或NB-3，Notch与候选物质接触，并测定Notch和F3和/或NB-3的相互作用。
该方法可以进一步包括在在缺乏候选物质而其它条件类似的情况下将Notch与F3和/或NB-3接触，并测定Notch与F3和/或NB-3的相互作用。
优选地，方法包括将Notch与F3和/或NB-3间的复合物与候选物质接触。优选地该复合物在与候选物质接触前形成。
方法可以通过任何合适的方式进行。技术人员会很清楚许多合适的实验方案，并能设计更多例子。
NB-3，F3和Notch的任何一个或全部可以存在于细胞中或表面。表达该蛋白质的基因可以是所讨论的细胞内源产生的，或者它可以是存在于导入细胞的载体。蛋白质优选表达在细胞表面。
此外或二者择一地，NB-3，F3和Notch的任何一个或全部可以被固定在固体支持物。一者或两者可以包括如下面详细描述的可检测的标志。
在详细的实施方案中，Notch存在于细胞表面，并且所述方法包括测定Notch信号，具体是经由Deltex1。如果所讨论的细胞是少突胶质细胞或其前体，该方法可以包括MAG表达上调的测定。
发明进一步提供生产药用制剂的方法，包括通过这里描述的筛选方法鉴定能调节Notch和F3和/或NB-3相互作用的物质后，进一步使该物质与可药用的载体形成制剂的步骤。该方法可以包括在制剂前优化该鉴定出的物质用于体内给药的另一步骤。
在具体的实施方案中，本发明首次提供用于增强个体中髓鞘形成的方法，包括向该患者给予Notch受体活化剂，该活化剂包括F3，NB-3，或其模拟物。
优选将方法用于SCI，MS，癫痫或卒中的治疗。
发明也提供包括Notch受体活化剂的药用组合物，该活化剂包括F3，NB-3，或其模拟物。
也提供筛选能调节配体与Notch受体的相互作用的物质的方法，所述配体是F3，NB-3或其模拟物，该方法包括将物质与配体和受体接触；测定配体和受体相互作用，比较其与同样条件但缺少该物质时受体和配体的相互作用。
该方法可以进一步包括生成含有该物质的药用组合物。
细胞术语少突胶质细胞用在这里指能够在中枢神经系统(CNS)中神经元轴突周围产生髓鞘的少突神经胶质细胞。
术语少突胶质细胞前体细胞用来指，在给予适当刺激例如F3和NB-3的条件下，能分化成少突胶质细胞的细胞。该细胞包括少突神经胶质前体细胞(OPC)和神经干细胞(NSC)。
蛋白质序列术语“Notch”用来包括Notch蛋白的所有同种型，包括Notch1，2和3，以及它们的一部分和分离的结构域，例如细胞外结构域，以及与下面给出的序列有80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％以上同一性的突变体和变异体。优选地蛋白是Notch1和2。也包括其它哺乳动物种属的直向同源蛋白。优选地Notch蛋白具有结合NB-3和/或F3蛋白的能力。它也可以具有经Deltex1信号传递诱导少突胶质细胞或其前体中MAG蛋白表达上调的能力。
术语“F3”用来包括F3蛋白的同种型，该蛋白的分离的结构域，以及与下面给出的序列有80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％以上同一性的突变体和变异体。也包括其它哺乳动物种属的直向同源蛋白。优选地F3蛋白具有结合Notch蛋白，具体是Notch1和2的细胞外结构域的能力。
术语“NB-3”用来包括NB-3蛋白的同种型，和该蛋白的分离的结构域，以及与下面给出的序列有80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％以上同一性的突变体和变异体。也包括其它哺乳动物种属的直向同源蛋白。优选地NB-3蛋白具有结合Notch蛋白，具体是Notch1和2的细胞外结构域的能力。
Notch，F3和NB-3蛋白的氨基酸序列连同它们的GeneBank登录号列于下面；F3/接触蛋白gi414791(CAA79696)1mkmwllvshl viisittcla eftwyrrygh gvseedkgfg pifeeqpint iypeeslegk61 vslncraras pfpvykwrmn ngdvdltsdr ysmvggnlvi nnpdkqkdag iyyclasnny121 gmvrsteatl sfgyldpfpp eerpevrvke gkgmvllcdp pyhfpddlsy rwllnefpvf181 itmdkrrfvs qtngnlyian veasdkgnys cfvsspsitk svfskfipli piperttkpy241 padivvqfkd vyalmgqnvt lecfalgnpv pdirwrkvle pmpstaeist sgavlkifni301 qledegiyec eaenirgkdk hqariyvqaf pewvehindt evdigsdlyw pcvatgkpip361 tirwlkngya yhkgelrlyd vtfenagmyq ciaentygai yanaelkila laptfemnpm421 kkkilaakgg rviieckpka apkpkfswsk gtewlvnssr iliwedgsle innitrndgg481 iytcfaennr gkanstgtlv itdptriila pinaditvge natmqcaasf dpaldltfvw541 sfngyvidfn kenihyqrnf mldsngelli rnaqlkhagr ytctaqtivd nssasadlvv601 rgppgppggl riediratsv altwsrgsdn hspiskytiq tktilsddwk daktdppiie661 gnmeaaravd lipwmeyefr vvatntlgrg epsipsnrik tdgaapnvap sdvgggggrn721 reltitwapl sreyhygnnf gyivafkpfd geewkkvtvt npdtgryvhk detmspstaf
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例如，在体外研究两种蛋白质之间相互作用可以通过将一或多种蛋白质用可检测的标记物标记，并将其与固定在固体支持物上的另一种接触来进行。尤其对petidyl物质，合适的可检测的标记物包括35S-蛋氨酸，其可以掺入重组生产的肽或多肽中。或者在固体支持物上形成的复合物的检测可以通过标记抗体进行，其中该抗体是抗未被固定在该固体支持物上的蛋白的表位的抗体。如果得不到合适的抗体，可以将重组生产的肽或多肽表达成含有可得的适宜抗体的表位的融合蛋白。
可以使用抗结合于固相支持物上蛋白的抗体将蛋白固定在固相支持物上，或用其它已知的技术。优选的体外相互作用可利用包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白。它可被固定在谷胱甘肽琼脂糖珠上。在上面描述类型的体外测定程序中，可测定受试化合物影响与固定化GST-融合多肽结合的标记化肽或多肽的量的能力。这可以通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将谷胱甘肽琼脂糖珠进行分级来测定。或者，可以将珠子洗涤以去除未结合蛋白质，并通过例如用合适的液闪计数仪计数存在的标记物的量测定结合的蛋白质的量。
按照本发明的测定也可以是基于细胞形式，其中两种蛋白中至少一种由合适的细胞表达，优选表达在细胞表面。测定可以利用细胞系，诸如酵母菌株或哺乳动物细胞系，其中相关的多肽或肽是从导入到细胞的一个或多个载体表达的。
可以对用所描述方法鉴定的Notch与NB-3和/或F3的相互作用的调节物进一步修饰，以增加它们对体内给药的适宜性。
制剂可以将发明的组合物制备成药用制剂，其包含至少一种如上面所定义的活性成分，以及一种或多种对本领域技术人员熟知的其它可药用的成分，其包括但不局限于可药用的载体，佐剂，赋形剂，缓冲液，防腐剂和稳定剂。制剂可以进一步包括其它活性物质。
因此，本发明进一步提供制备如前所定义的药用组合物的方法，该方法包括将至少一种这里描述的活性物质与一种或多种本领域的技术人员熟知的可药用的成分，如载体、佐剂、赋形剂等混合。
这里使用的术语“可药用的”适合于化合物，成分、原料、组分、剂量形式等等，其是，在合理地医学评价范围内，适合于与所讨论的受试者(例如人类)的组织接触而无过分的毒性，刺激性，过敏反应，或其它问题或并发症，相当的合理的效应/风险比率。在与其它制剂成分相容的意义上来讲，每种载体、佐剂、赋形剂等必须也是“可接受的”。
适合的载体、佐剂、赋形剂等可以在标准的制药课本中找到，例如Remington’s的制药科学，第20版，2000，Lippincott，Williams & Wilkins出版(Remington’s Pharmaceutical Sciences，20th Edition，2000，pub.Lippincott，Williams & Wilkins)；和制药赋形剂手册，第2版，1994(Handbook ofPharmaceutical Excipients，2nd edition，1994.)制剂可以是适合注射的剂型，例如水性的，等张的，无热源的，无菌溶液的形式，其中活性化合物是溶解的。这种液体可以额外含有其它可药用的成分，例如抗氧化剂，缓冲液，防腐剂，稳定剂，抑菌剂，悬浮剂，增稠剂，和使制剂与血液或脑脊液等张的溶质。在这种制剂中使用的合适的等张载体的例子包括氯化钠注射液，林格氏(Ringer′s)溶液或乳酸盐林格氏注射液。通常地，液体中活性成分的浓度从大约1ng/ml到大约10μg/ml，例如从大约10ng/ml到大约1μg/ml。制剂可以被放在单剂量或多剂量密封的容器中，例安瓿和小瓶，并可以以冷冻干燥(冻干的)情况贮存，其只需在临用前加入无菌液体载体，例如注射用水。临时的注射溶液和悬液可以从无菌粉末，颗粒和片剂制备。
给药发明的组合物的给药一般可通过注射，优选直接注射入CNS。可以直接注射到损伤部位。或者，可以注射入脑脊液，通常是接近损伤或疾病的部位。
序列同一性与参考序列的氨基酸序列同源百分比(％)定义为候选序列中与参考序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，所述定义是在对所述序列进行比对并引入缺口以(如果有必要)以实现最大百分比序列同一性、而不考虑任何保守取代作为部分序列同一性之后。可以用WU-BLAST-2来确定％同一性值(Altschul et al.，Methods in Enzymology，266460-480(1996))。WU-BLAST-2使用数种搜索参数，其中多数设定为缺省值。可调节的参数用下列值设定重叠跨度(overlap span)＝1，重叠分数(overlap fraction)＝0.125，字符(word)阈值(T)＝11。％氨基酸序列同一性值如下确定通过如WU-BLAST-2确定匹配的相同残基数目，除以参照序列残基总数(由WU-BLAST-2引入参照序列的缺口以最大化被忽略的比对得分)，乘以100。
除了计数BLOSUM62矩阵中得分为阳性值的残基，氨基酸相似百分比(％)按与同一性相同方式的定义。因此，也计数不相同但是具有相似特性(例如是保守取代反应的结果)的残基。
以相似的方式，与参考核酸序列的核酸序列同一性百分比(％)定义为候选序列中与参考核酸序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。这里使用的同源值可以如下产生WU-BLAST-2的BLASTN模块设为缺省值，重叠跨度和重叠分数分别设为1和0.125。
受试者将要接受发明的组合物和/或治疗的受试者可以是哺乳动物，优选实验动物例如啮齿动物(例如家兔，大鼠或小鼠)，狗，猫，猴或猿，或家畜例如母牛，马，绵羊，猪或山羊。较优选地，所述受试者是人。
一般地，受试者患有CNS损伤，所述CNS损伤通常由以不恰当的髓鞘形成为特征。所述疾病包括MS。在实验动物，所述损伤可以是实验性的。CNS损伤也可以源自生理性损伤，例如脊髓损伤(SCI)，其它疾病或病症，例如卒中，癫痫或神经变性疾病，学习记忆相关的疾病和/或痴呆例如阿尔茨默氏病(Alzheime’s disease)或帕金森氏病(Parkinson’s disease)。
通常考虑将本发明的治疗与其它治疗例如外科和/或康复联用。
模拟物对体内药用而言非肽“小分子”经常是比肽或多肽更为优选。相应地，可以设计F3和/或NB-3以及其复合物的模拟物，具体是用于药用。通常F3和/或NB-3的模拟物能结合于Notch分子，优选Notch1或2的细胞外结构域，以模拟与相同的分子结合的一或多种蛋白的效应。
已知的药物活性化合物的模拟物的设计是基于“前导(lead)”化合物的已知药物开发方法。这对于活性化合物的合成较困难或昂贵或不适合具体的给药方法时是理想的，例如肽为不适合口服组合物的活性剂时，这是由于所述肽倾向于较快地由蛋白酶在消化道内代谢。模拟物设计，合成，以及检测通常用于避免随机筛选大量具有靶性质的分子。
有数个步骤通常用于由具有给定靶性质的化合物设计模拟物。首先，确定对于确定靶性质而言关键和/或重要的所述化合物的具体部分。对于肽，这可通过系统性改变肽中的氨基酸进行，例如通过依次取代每个残基。肽的丙氨酸扫描通常用于定义所述肽基序。构成化合物的活性区的这些部分或残基已知为“药效基团”。
一旦药效基团被发现，可根据其物理性质，例如立体化学，键合，大小和/或电荷，利用各种来源的数据，例如分光镜技术，X-射线衍射数据和NMR来模拟药效基团的结构。计算机分析，类似性作图(模拟药效基团的电荷和/或体积，而不是原子间的键合)以及其它技术可用于该模拟方法。
该方法的变体中，配体的三维结构以及其结合配偶体被模拟。这具体可用于配体和/或结合配偶体在结合时改变构型，允许在模拟物设计的模拟中考虑到这一点。
随后选择模板分子，其上移植了模拟药效基团的化学基团。所述模板分子和移植到其上的化学基团可方便地选择，使得所述模拟物易于合成，很可能是可药用的，并且不在体内降解，同时保持前导化合物的生物活性。可选，当模拟物是以肽为基础时，可通过使所述肽发生环化获得进一步的稳定性，增加其刚性。通过这种方法发现的模拟物可随后被筛选以发现它们是否具有靶性质，或它们显示所述性质的程度。可实施进一步的优化或修饰以实现一或多种终模拟物用于体内或临床检验。
在这种情况下，可以使用肽图谱研究(peptide mapping study)以鉴定与Notch相互作用所需要的F3或NB-3的最小部分。这种肽可然后被用作前导化合物用于如上所述的模拟物。
抗体因为抗体可被以多种方式修饰，所以术语“抗体”应当被理解为包括具有所需特异性的结合结构域的任何特异结合的物质。因此，此术语包含抗体片段，衍生物，抗体的功能等价物和同源物，包括含有免疫球蛋白结合结构域的任何多肽，而无论其是天然还是合成的。因此也包括包含免疫球蛋白结合结构域或等价物的嵌合体分子，所述结构域或其等价物融合于另一种多肽。在EP-A-0120694和EP-A-0125023中描述了嵌合体抗体的克隆和表达。
已知完整抗体的片段可以完成结合抗原的功能。结合片段的例子是(i)由VL，VH，CL和CH1结构域组成的Fab段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd段；(iii)单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv段；(iv)由VH结构域组成的dAb段(Ward，E.S.et al.，Nature 341，544-546(1989))；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab’)2片段，包括两个连在一起的Fab段的双价片段(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域由肽接头连接，肽接头允许两个结构域联合以形成抗原结合位点(Bird et al，Science，242，423-426，1988；Huston et al，PNAS USA，85，5879-5883，1988)；(viii)双特异的单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)“diabodies”，用基因融合构建的多价或多特异的片段(WO94/13804；P.Holliger et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448，1993)。
Diabodies是多肽的多聚体，每个多肽包括含有免疫球蛋白轻链结合区的第一个结构域，和含有免疫球蛋白重链结合区的第二个结构域，两个结构域是相连的(例如通过肽接头)但是不能彼此联合形成抗原结合位点抗原结合位点的形成通过将多聚体中一个多肽的第一个结构域与多聚体中另一个多肽的第二个结构域联合所形成(WO94/13804)。
当使用双特异抗体时，它们可以是传统的双特异抗体，其可以多种方式生产(Holliger，P.and Winter G Current Opinion Biotechnol.4，446-449(1993))，例如通过化学方法制备或从杂交的杂交瘤制备，或者双特异抗体可以是上面提到的任何双特异抗体片段。优选使用ScFv二聚体或diabodies而不是完整抗体。仅使用可变区可将Diabodies和ScFv构建成没有Fc区，可能降低抗独特型反应的效应。双特异抗体的其它形式包括Traunecker等在Embo Journal，10，3655-3659，(1991)中描述的单链“Janusins”。
可能希望将非人类(例如鼠类)抗体“人源化”以提供具有非人类抗体的抗原结合特性的抗体，而最小化了抗体的免疫原性，例如当将它们用于人类治疗时。因此，人源化的抗体包括从人类免疫球蛋白(受体抗体)来源的框架区，其中从一个或多个互补性决定区(CDR)来源的残基被非人类种属(供体抗体)例如小鼠，大鼠或兔抗体的CDR的残基取代，其中非人种属CDR具有所需特性，例如特异性，亲和性或载量(capacity)。人类抗体的某些框架残基也可被相应的非人类残基取代，或被既不存在于供体也不存在于受体抗体的残基取代。进行这些修饰以进一步改进并最优化抗体的特性。
现在将以举例方式并参考

本发明第二方面的各个方面以及具体实施方案。其它方面以及实施方案对本领域的技术人员是明显的。所有本文提及的资料在此引入以作参考。
涉及本发明第二方面的附图简述图1.测定经过或未经过抗体封闭处理的OLN-93细胞或小鼠Notch1转染的Hela细胞与施加在硝酸纤维素上的蛋白斑点的粘附，所述蛋白斑点例如F3-Fc(a，k-1，和q)，CHL1-Fc(a)和NB-3-His(b，e-j，m-p，和r)。柱(a-b和q-r)代表从至少三个独立实验得到的粘附细胞数量(均数±SD)。标记*的柱与对照相比有显著性差异(P＜0.05)。
OLN-93细胞在包被了F3-Fc和NB-3-His底物上的粘附。
a.抗体阻断对于OLN-93细胞对F3-Fc底物的粘附的影响。F3仅有F3蛋白底物(作为对照)；CHL1只有CHL1蛋白底物；抗F3或抗NB-3分别添加了这两种抗体，以在接种OLN-93细胞前封闭F3-Fc包被的底物；抗-Notch1，抗-Notch2或血清在接种于F3-Fc包被的底物之前，用这两种特异性封闭抗体或预免疫的血清分别预处理OLN-93细胞。
b.抗体封闭对于OLN-93细胞对NB-3底物的粘附的影响。NB-3仅有NB-3-His蛋白底物(作为对照)；抗NB-3或抗F-3分别添加了这两种抗体，以在接种OLN-93细胞前封闭NB-3-His包被的底物；抗-Notch1，抗-Notch2或血清在接种到NB-3-His包被的底物上之前，用这两种特异性封闭抗体或预免疫的血清分别预处理OLN-93细胞。
c-d用抗Notch 1抗体(c)和抗Notch2抗体(d)染色的OLN-93细胞的免疫荧光显微照片。两种情况下细胞表面染色都存在。
e-jOLN-93细胞与包被的NB-3-His底物接触的明场显微照片，其条件分别为培养0.5小时(e)，存在抗Notch1(f)，NB-3(g)，Notch2(g)，F3(i)和预免疫血清(j)的封闭抗体的条件下培养0.5小时。(j)中的标尺对于(c-j)为8μm。
转染有小鼠Notch1的Hela细胞在经包被的F3-Fc和NB-3-His底物上的粘附。
k-p下列情况的明场显微照片模拟-转染的Hela细胞(k)和小鼠Notch1转染的Hela细胞(1-p)与F3-Fc(k-1)或NB-3-His(m-p)接触，以及存在抗NB-3封闭抗体(n)，抗Notch1封闭抗体(o)和预免疫血清(p)的所述接触。(p)中的标尺对于(k-p)为8μm。
q.抗体封闭小鼠Notch1转染的Hela细胞与F3-Fc底物相互作用的影响。F3仅有F3-Fc包被的底物；抗F3添加了这些抗体，以在接种小鼠Notch1转染的Hela细胞前封闭F3-Fc包被的底物；抗-Notch1或血清在接种于F3-Fc包被的底物之前，用这些特异性封闭抗体或预免疫血清分别预处理用小鼠Notch1转染的Hela细胞；Hela细胞将模拟-转染的Hela细胞铺于F3-Fc包被的底物(作为对照)。
r.抗体封闭对于小鼠Notch1转染的Hela细胞与NB-3-His底物的相互作用的影响。NB-3仅有NB-3-His包被的底物；抗NB-3添加了这些抗体，以在接种小鼠Notch1转染的Hela细胞前封闭NB-3-His包被的底物；抗-Notch1或血清在铺于NB-3-His包被的底物之前，用这些特异性封闭抗体或预免疫血清分别预处理用小鼠Notch1转染的Hela细胞；Hela细胞将模拟-转染的Hela细胞铺于NB-3-His包被的底物(作为对照)。
图2.Notch和F3/NB-3相互作用的生物化学和细胞学分析。
a-dF3和NB-3与Notch1和Notch2的交互关联。使用四种抗体，珠和非免疫IgG(作为对照)，对大鼠脑的裂解物进行免疫共沉淀分析。在每种情况下，标记与抗体相对应的条带(抗N1抗Notch1抗体，抗N2抗Notch2抗体)。Western印迹使用抗F3(a)，NB-3(b)，Notch1(c)和Notch2(d)的抗体检测。
eNotch1分子的示意图，显示对每个亚克隆的片段的命名。
f-g显示四个片段的考马斯亮兰染色(f)和免疫印迹分析(g)。抗Notch1的抗体特异识别N1.3和N1.4。
h-i用拖曳实验对Notch1片段和F3/NB-3间的相互作用的分析。将大鼠脑裂解物与结合于琼脂糖4B珠上的GST或GST融合蛋白(N1.1，N1.2，N1.3，N1.4)一同保温。将结合的蛋白用SDS样品缓冲液洗脱，并用抗F3或NB-3的抗体通过SDS-PAGE和Western印迹分析。
j-1F3转染的CHO细胞(j)，NB-3转染的CHO细胞(k)和模拟-转染的CHO细胞(1)对四种不同Notch1片段和GST的粘附。将蛋白片段N1.1，N1.2，N1.3和N1.4，连同作为对照的GST包被在petri平皿表面，并将F3转染的CHO细胞(i)，NB-3转染的CHO细胞(k)和模拟-转染的CHO细胞(1)铺于化学限定的培养基并在所述培养基中维持2h。柱代表从至少三个独立实验得到的粘附细胞数量(均数±SD)。标记*的柱是与对照(GST)相比有显著性差异(P＜0.05)。
图3.对F3转染的CHO细胞和OLN-93细胞共培养中MAG和PLP表达的Western印迹分析。
a大鼠脑匀浆物(脑)和细胞共培养提取物中MAG的免疫印迹分析。b细胞共培养提取物中PLP的免疫印迹分析。OLN只有OLN-93细胞培养；F3/OLNOLN-93细胞和F3转染的CHO细胞的共培养；CHO/OLNOLN-93细胞和模拟-转染的CHO细胞的共培养；TAG/OLNOLN-93细胞和TAG-1转染的CHO细胞的共培养；TAX/OLNOLN-93细胞和TAX转染的CHO细胞的共培养。
图4.Jagged1和NB-3的免疫荧光定位。
a-c在P2，几乎检测不到任何NB-3染色。Jagged1染色以与轴突定位一致的线性条纹存在。a-c中的标尺对于a-i为20μm。
d-f在P5，可以观察到NB-3在结旁段局部簇集。很明显，在Jagged1和NB-3免疫荧光之间有清楚的界限，在放大的图j-o中最清楚。J-l中的标尺对于j-o为2μm。
g-i在P14，除了轴突密度增加和因而导致的结旁段的数目增加以外，NB-3和Jagged1的分布与P5的类型相比没有变化。
图5.中枢神经系统中结旁段分子组成的示意图。
在此区域，多个少突神经胶质的细胞质环(这里图片仅显示成一个环)与轴膜密切接触。目前的研究已经揭示除了轴突F3/Contactin和Caspr及神经胶质神经束蛋白155(NF-155)外，轴突胶质连接的其它成员包括轴突NB-3和神经胶质Notch。已经证明在F3/NB-3和Notch间存在功能性的信号相互作用。(N郎维耶结，PN结旁段，JPN近结旁区)。
表1将原代大鼠少突胶质细胞分别铺于包被F3-Fc，NB-3-His或BSA(对照)的底物。培养2h后，提取总RNA并进行MAG和PLP的mRNA表达水平的实时RT-PCR分析。用比较性Ct方法得到相对表达水平。(Ct循环阈值)。
图6.Notch和F3是结合配偶体。
(A)细胞粘附实验。将OLN细胞用α-Notch1(a)或α-Notch2(b)标记。(b).将OLN细胞铺于有F3(c，e-i)或CHL1(d)斑点的平皿上。细胞未经处理或接种前用下列物质预处理α-Notch1(e)或α-Notch2(f)，预免疫血清(血清)(g)，或用抗原耗竭的α-Notch1(D-α-Notch1)(h)或α-Notch2(D-α-Notch2)(i)。斑点线描绘出蛋白Fc点的边界。粘附性细胞用考马斯亮兰染色显示。J粘附于F3底物的OLN细胞的定量和抗体封闭效应。#与CHL1相比p＜0.05，*与预免疫的血清相比p＜0.05。(i)中的标尺对于a，b为20μm，对于c-I为120μm。
(B)细胞排斥(repulsion)实验。将mN1转染的Hela细胞(a)或模拟-转染的Hela细胞(b)铺于F3包被的平皿上。粘附性细胞用考马斯亮兰染色。c粘附于F3的Hela细胞的定量和抗体封闭效应。在某些实验中，将mN1-转染的hela细胞用α-F3或α-Notch1，或预免疫血清预处理。#与模拟-转染的Hela细胞相比p＜0.05，*与预免疫的血清相比p＜0.05。(b)中的标尺对于a，b为15μm。柱形图(Aj，Bc)代表粘附性细胞数(均数±SD)。
图7.Notch和F3结合成蛋白复合物。
(A)F3与Notch1或Notch2免疫共沉淀。a用α-Notch1，α-Notch2，非免疫IgG或未标记的珠从大鼠脑裂解物中制备免疫沉淀物，并用α-F3检测。b交互实验使用α-F3俘获蛋白复合物，随后与α-Notch1，α-Notch2进行免疫印迹以检测结合配偶体。
(B)Notch1细胞外结构域的亚克隆。aNotch1和其亚克隆的片段示意图。b，c分别为四个片段的考马斯亮兰染色和α-Notch1免疫印迹。
(c)F3结合于Notch1的具体结构域。a将GST-Notch1细胞外片段(N1.1，N1.2，N1.3和N1.4)或单独GST用于大鼠脑裂解物的GST拖曳实验。检测沉淀物和大鼠脑裂解物的F3(右侧条带)。b粘附于用四种GST融合蛋白片段或单独的GST包被的平皿上的模拟-和F3转染的CHO细胞的定量。柱代表粘附的细胞数(均数±SD)。*与GST相比，p＜0.05。
(D)脂筏分析。F3主要位于第五级分中而Notch1在级分9-12中富集。用Caspr作为标记脂筏级分的阳性对照。H总匀浆物。
图8.NICD转移。
(A)F3诱导的NICD核转移。将由mNotch1-myc转染的OLN细胞用11.2nM F3(a)，Jagged1(b)，BSA(c)处理或与α-Notch1 EGF(11-12)预保温(d)，用F3处理，然后用α-NICD染色。e用更高浓度的F3和Jagged1处理后有NICD核染色的细胞定量。数据为均数±SEM。f将OLN细胞与Jagged1-，F3-或模拟-转染的CHO细胞一同培养，其裂解物用α-Notch1，α-Notch2和α-微管蛋白免疫探针检测。
(B)用γ-分泌酶在S3位点进行F3诱导的RIP。将OLN细胞用200μMγ-分泌酶抑制剂预处理，用F3(a)或Jagged1(b)刺激，并用NICD染色。在用F3(c，d)或Jagged1(e，f)预处理后，对myc-标记的V1744K或V1744L突变体转染的OLN细胞进行c-myc的免疫标记。g来自表达myc-标记的野生型Notch1或V1744K和V1744L突变体的OLN细胞的α-c-myc免疫沉淀物用NICD(其既识别Notch1300kDa的全长也识别其120kDa的细胞内部分)或α-V1744(其只识别在S3位点断裂后的NICD)进行免疫印迹。(Bf)中的标尺对于Aa-d，Ba-f为15μm。
(C)Notch1和Notch2的上调。在F3处理的和BSA处理的mNotch1-myc转染的OLN细胞中定量总(细胞质加上细胞核)NICD染色强度(a)。使单独培养的OLN细胞或与F3-，模拟-，TAG-1-，或TAX-转染的CHO细胞一起培养的OLN细胞裂解，并用α-Notch1，α-Notch2和α-Notch3检测(b)。c用11.2nM F3，Jagged1或PBS处理的OLN细胞中Notch mRNA水平的实时PCR实验。Notch mRNA水平用β-肌动蛋白标准化。柱为均数±SEM。*与PBS对比，p＜0.05。
图9.一旦与F3转染的CHO细胞接触，OLN细胞突起停止并且其形态改变。
OLN细胞的细胞突起(a和b中的箭头)伸向F3转染的CHO细胞体，并且一旦与它们接触则停止并形成包裹细胞体的扁平的细胞质片。这种现象如星号(*)所示。aOLN和F3-转染的CHO细胞都用PKH26红色荧光染料预染色。b与(a)相应的明场显微照片。c，f，iOLN细胞用PKH26红色荧光染料预染色。d，g，j对OLN细胞和F3-转染的CHO细胞都进行c-myc染色(绿色)。e，h，k分别是(c，d)，(f，g)，(i，j)的合并图像。1-q在对照系统中，OLN细胞的细胞突起(箭头)延伸超出经转染的CHO细胞体。(l，m)，(n，o)和(p，q)OLN细胞与模拟-(l，m)，TAX-(n，o)和TAG-1-(p，q)转染的CHO细胞的共培养的相应PKH26红色荧光和明场显微照片。r在所述共培养物中，延伸超出经转染的CHO细胞体的OLN细胞突起的定量。数据为均数±SD。*与对照相比，p＜0.01。(q)中的标尺对于(a，b，l-q)为25μm，对于(c-k)为15μm。
图10.MAG由F3/Notch相互作用上调。
(A)MAG被F3上调。CHO细胞和转染的衍生物不表达Notch，Delta，Jagged1和Jagged2的常规配体(a)。大鼠脑，单独OLN，和所述共培养的细胞的裂解物用α-MAG(上面插图)或α-γ-微管蛋白(下面插图)检测(b)。(c)实时PCR检测到，相对于BSA处理，在原代OL中MAG mRNA被F3显著升高。
使用对比Ct值的方法将原始数据相对于GAPDH标准化。
(B)F3，而不是Jagged1可上调MAG。将MNotch1-myc转染的OLN细胞用11.2nM F3-Fc(a，d)或Jagged1(b，c，e，f)处理，并用α-MAG(a，b)或α-CNPase(d，e)标记。(b，e)中的箭头显示细胞体，其可在明场照片中(c，f)看得更清楚。g用F3，Jagged1，BSA处理或用α-Notch1 EGF(11-12)预处理然后用F3处理的细胞中MAG和CNPase染色的荧光强度。数据为均数±SEM。h用F3，Jagged1或BSA处理的细胞占据的表面积的定量。与BSA相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
(C)MAG上调依赖于F3/Notch相互作用。
a-j用下列物质转染的OLN细胞Notch ICD-缺失的突变体，dn-N1(a)，dn-N2(b)；LacZ(c)；S3切割突变体，V1744K(d)和V1744L(e)；Notch ECD-缺失的突变体，caN1(f，g)和caN2(h，i)，用11.2nM F3处理(a-e)或不用其处理(f-i)，并且双标记MAG(红色)和V5(a-c，f，h)(绿色)或c-myc(d，e)(绿色)。f，h中转染的细胞可分别通过在明场照片g，i中的箭头所示看得更清楚。j用所示的各种构建体转染后用不同蛋白处理的细胞中MAG荧光强度。数据为均数±SEM。ECD细胞外结构域；TM跨膜结构域；ICD细胞内结构域。在V1744K和V1744L构建体中的S3位点突变用跨膜区中的三角形显示。*与F3-处理的OLN细胞相比p＜0.01。(Ci)中的标尺对于(Ba-f)为20μm；对于(Ca-i)为40μm。
图11.MAG表达不依赖于Hes1，依赖于DTX1。
(A)MAG上调不依赖Hes1表达。(a)将OLN细胞用所示的配体或化合物处理。在所示的时间，用实时PCR定量Hes1转录物并相对于起始时间点的所述量进行标准化。(b，d，e)不处理OLN细胞或用Hes1有义(Hes1-S)或反义(Hes1-AS)寡核苷酸预处理所述细胞，然后用11.2nM F3处理。用α-Hes1(上面插图)或α-核基质蛋白(N-matrix)(下面插图)检测细胞裂解物(b)或对细胞的MAG进行标记(d，e)。而且，将对单独的转染了pGVB/Hes1报道物的OLN细胞或连同表达caN1，RBP-J，或myc-标记的dn-RBP-J的构建体进行萤光素酶测定(c)。数据为均数±SD。f转染了dn-RBP-J-myc的OLN细胞用11.2nM F3处理并对MAG(红色)和c-myc(绿色)进行复染。g经过上述各种处理的OLN细胞中的MAG染色强度。数据为均数±SEM。与单独用F3处理的细胞相比，*p＜0.01。
(B)MAG上调有DTX1参与。a用于萤光素酶报道物测定和免疫染色研究中的DTX1构建体。N末端N末端结构域；Pro富含脯氨酸基序；环指环-H2指基序。用pGVB/Hes1报道基因单独或和所述表达构建体一起转染OLN细胞。b这些细胞中萤光素酶报道物活性。数据为均数±SD。将DTX1(c-e)-，DTX1-D1-HA(f-h)-，或DTX1-D2-Flag(i-k)-转染的OLN细胞用11.2nM F3处理，并对MAG(红色)和相关的标记(绿色)进行双标记。1用所述构建体转染后经不同蛋白处理的OLN细胞中的MAG荧光强度。数据为均数±SEM。*与用F3处理的OLN细胞相比，p＜0.01。(Bk)中标尺对于Ac-f，Bc-k为30μm。
图12.经DTX1的F3/Notch信号传递促进OPC分化。
将纯化的Ng2+/CNPase-OPC(a)用BSA(b)，F3(c)或Jagged1(d)处理2天，对Ng2(红色)和CNPase(绿色)进行双标记并计数(k)。将OPC也用标记的dn-N1(e，h)和DTX1-D2(f，i)转染，随后用F3处理或用caN1转染而不进行处理(g，j)。复染细胞的适合标记(绿色)和CNPase(红色；e-g)或Ng2(红色；h-j)，并计数(k)。(j)中的标尺对于(a，e-插图)为25μm，对于(b-j)为100μm。
图13.发育中独特的配体依赖性Notch信号通路的模型举例。
在细胞表面对侧，F3与Notch受体相互作用以刺激Notch/RBP-J信号通路在向胞质释放NICD之前或之后募集DTX1。NICD/RBP-J/DTX1复合物在转入核内前可能经历特殊的但未经确认的修饰，在核内它激活靶基因例如MAG。此信号可能利于OL在P6后成熟，此时降低的Jagged1表达利于F3/Notch信号的启动。相反，P6之前，Jagged1/Notch信号活化靶基因例如Hes1的NICD/RBP-J-依赖的转录并主要抑制OPC分化。ECM细胞外基质；C细胞质；N核；NICDJag1，NICDF3分别为Jagged1和F3活化时的NICD释放；E胚胎；P6，P15分别为出生后6天和15天；A成年；OPC少突胶质细胞前体细胞；O少突胶质细胞；右下草示形成髓鞘的少突胶质细胞将轴突包入鞘中。
图14.NB-3是结旁段神经元分子。
A.NB-3由神经元表达。对E17大鼠的经纯化的神经元，OL和星形胶质细胞的NB-3和相应细胞表面标志进行复染NF200(a)，Gal-C(b)和GFAP(c)。(c)中标尺对于(a-c)为30μm。
(d)E17表达NB-3。对所示年龄的大鼠的脑干匀浆并进行NB-3，F3，MAG的免疫印迹。
(B)NB-3位于结旁段。对90天龄大鼠脑干切片进行NB-3和Caspr(a-c)或NB-3和钠通道(d-f)的双标记。(f)中标尺对于(a-f)为15μm。
(C)脂筏实验。NB-3在级分5中富集，F3和Caspr在同一级分中富集。H总匀浆物。
图15.NB-3是Notch1的功能配体。
(A)NB-3结合于Notch1。(a)NB-3与Notch1免疫共沉淀。用αα-Notch1和α-NB-3从大鼠脑裂解物获得的免疫沉淀物分别用α-NB-3或α-Notch1检测。(b)细胞粘附实验。将OLN细胞铺于NB-3底物并与该底物粘附。粘附被α-Notch1或α-NB-3特异地阻断。#与CHL1对比，p＜0.05；*与预免疫血清对比p＜0.05。(c)NB-3结合于Notch1的特定区域。将Notch1 GST融合蛋白或单独的GST用于自大鼠脑裂解物的GST拖曳实验。检测沉淀物和脑裂解物的NB-3。(d)定量与四种Notch1 GST融合蛋白片段粘附的NB-3-和模拟-转染的CHO细胞。*与GST对比p＜0.05。柱状图(b，d)代表粘附细胞的数量(均数±SD)。
(B)OLN细胞中NB-3/Notch相互作用诱导NICD核转移。对用NB-3(a)，Jagged1(b)和BSA(c)处理的mNotch1-myc转染的OLN细胞中的NICD进行免疫染色。在NB-3刺激前用EGF抗体(d)或γ-分泌素酶抑制剂处理一些细胞。转染了V1744K-myc(f，h)或V1744L-myc(g，i)的OLN细胞也用NB-3(f，g)或Jagged1(h，i)处理，并用c-myc抗体免疫染色以定位NICD。(a)中标尺对于(a-i)为20μm。(j)在NB-3或Jagged1处理后，用α-NICD(上面插图)或α-V1744(下面插图)对mNotch1-myc，V1744K-myc或V1744L-myc转染的OLN细胞的α-c-myc沉淀物进行免疫印迹。
(C)Hes1和Hes5不被NB-3活化。裂解利用NB-3处理所示不同时间的OLN细胞，并提取mRNA进行实时PCR(a)。数据相对于起始点的mRNA水平标准化。其它细胞用PBS，BSA，L1，NB-3处理48小时并用实时PCR分析(b)。(c)将OLN细胞用Hes1或Hes5或萤光素酶报道物单独转染，随后用NB-3或caN1构建体处理。转染24小时后，对细胞进行萤光素酶测定。数据为均数±SD。
图16.NB-3/Notch相互作用经DTX1上调MAG。
(A)在OLN-93细胞和NB-3-转染的CHO细胞共培养中MAG上调(a)。N-基质核基质蛋白。CHO/OLN，NB3/OLN分别是OLN-93细胞与模拟-或NB-3-转染的CHO细胞的共培养。(b)实时PCR监测发现，NB-3刺激后原代OL中MAG mRNA增加大约24倍。用GAPDH作为内对照。将OLN细胞用NB-3(c)，Jagged1(d，e)和BSA(未显示)处理并对MAG进行免疫染色。计算MAG的荧光强度(f)。数据为均数±SEM。
(B)NB-3诱导的MAG上调与DTX1有关。将OLN细胞用下列物质转染并用NB-3处理dn-N1-V5(a)，V1744K-myc(b)，V1744L-myc(c)，caN1(d，e)，dn-RBP-J-myc(h)，DTX1-myc(i)，DTX1-D1-HA(j)，和DTX1-D2-Flag(k)。然后将细胞进行MAG和相应标记的免疫染色。计算转染的和未转染的细胞中MAG的荧光强度(1)。数据为均数±SD。(f)DTX1和它的两个缺失突变体的结构示意图。数字1，2，3分别对应于N-末端，富脯氨酸区和环-H2指基序。(g)Hes1萤光素酶报道物测定来确认所示构建体的有效性。数据为均数±SD。(k)中的标尺对于(Ac-e，Ba-k)为30μm。
图17.NB-3发育性结旁段簇集促进经Notch1/DTX1信号通路的OPC分化。
(A)在发育中NB-3和Jagged1的分布完全不同。对P2(a)，P5(b，c)大鼠的脑干进行Jagged1(绿色)和NB-3(红色)双染。(c)中的标尺对于(a，b)为30μm，对于(c)为5μm。
(B)NB-3/Notch经由DTX1加速OPC分化。将P7大鼠视神经(a)中纯化出的Ng2+OPC用BSA(b)，NB-3(c)或Jagged1(d)处理2天并对Ng2(红色)和CNPase(绿色)双标记。其它细胞用dn-N1(e)，DTX1-D1(f)转染，随后用NB-3或caN1(g)单独刺激。然后对细胞进行标记(绿色)和CNPase(红色)免疫染色。计算CNPase+细胞百分比(h)。数据为均数±SEM。(g)中标尺对于(a-g)为40μm。
图18.NSC对所示年龄的大鼠脑干进行NB-3和Notch1表达模式的Western印迹。
图19.NSCNB-3是Notch1的功能配体。
(A)NSC表达Notch1。用前体标志物nestin(a)和Notch1(b)对NSC进行复染。(c)是合并的图片。(c)中的标尺对于(a-c)为60μm。
(B)NB-3结合于Notch1。将P0大鼠脑标本用偶联了NB-3-Fc融合蛋白，α-Notch1或α-NB-3的蛋白A珠沉淀，并将沉淀物如所述进行印迹(a)。在缺乏(b)或存在阻断性抗体的条件下，将N1-转染的Hela细胞(N1)接种于包被的NB-3底物α-NB-3(c)，α-Notch1(d)或一或多种相预免疫血清(e)。计数粘附性细胞(f)。数据为均数±SD。*与模拟-转染的Hela细胞相比，p＜0.05；#与预免疫血清相比p＜0.05。
(C)NB-3诱导NICD核转移。将NSC分别用NB-3(12.5nM)(a)，Jagged1(50nM)(b)或BSA(c)处理24小时，然后固定并三染nestin(绿色)，NICD(红色)和Hoechst 33258(蓝色)以定位NICD。(c)中标尺对于(a-c)为20μm。
(D)NB-3不活化Hes1。将NSC用Hes1萤光素酶报道物构建体转染，随后用NB-3或Jagged1处理或用caN1共转染。转染24小时后，将细胞裂解并进行萤光素酶测定(a)。其它NSC用pE7萤光素酶报道物连同所示构建体一起转染，经或不经NB-3处理，进行萤光素酶测定(b)。数据为均数±SD。
图20.NSCNB-3促进OL生长。
将NSC传代至添加了NB-3(a，d)，BSA(b，e)或Jagged1(c，f)的有丝分裂原去除(mitogen-withdrawn)培养基中。7DIV分化后，对细胞三染CNPase(a-c，红色)或β-微管蛋白(d-f，红色)，GFAP(a-f，绿色)和Hoechst 33258(a-f，蓝色)。其它NSC分别用标志物抗体免疫标记，并进行流式细胞术。计数每类细胞的百分比OL，神经元和星形胶质细胞(g)。数据为均数±SEM。(f)中标尺对于(a-f)为40μm。
图21.经由DTX1的NB-3/Notch信号通路指导少突胶质细胞形成。
将NSC用dn-N1(a，b)，DTX1-D2(d，e)转染，随后用NB-3或caN1处理(f，g)，并复染合适的标记以及CNPase(a，d，f)或GFAP(b，e，g)。(c)DTX1和DTX1-D2构建体的示意结构。这里使用的构建体的有效性用Hes1萤光素酶报道物测定确认(h)。计数CNPase或GFAP阳性的经转染细胞百分比(i)。数据为均数±SD。(g)中标尺对于(a，b，d-g)为20μm。
图22.公知的模型。
细胞外NB-3/Notch相互作用从膜NICD释放，其募集DTX1并向细胞核中转移，在细胞核中复合物直接或间接介导CNPase表达，因此促进少突胶质细胞形成。NSC神经干细胞；OOL；M膜；N细胞核；CNPCNPase。
本发明第二方面详述结果Notch是F3和NB-3的少突神经胶质表面受体发明打算鉴定F3和NB-3的神经胶质上的受体。两种分子都具有由免疫球蛋白和III型纤连蛋白重复构成的基本结构。以前的工作研究在各种体外模型上F3/tenascin-R(TN-R)相互作用的影响(Xiao et al，1996，1997，and1998在此将其全部引入以作参考)。与本研究有关，发明者证实TN-R的表皮生长因子样重复构成神经元受体F3的结合位点。Notch的细胞外结构域主要由表皮生长因子样重复构成，因此它作为F3和NB-3的候选神经胶质受体似乎是合理的。除了这种结构因素，Notch在成熟少突胶质细胞上的时间和空间定位又与轴突接触，这证明它作为结旁段F3和NB-3的受体的适合性。由于实验使用少突胶质细胞系OLN-93，通过免疫细胞化学确认这些细胞的确在表面既表达Notch1又表达Notch2(图1c-d)。
发明者首次进行了底物粘附实验以判断是否F3和NB-3可能是Notch的结合配偶体。为进行该实验，在存在或缺乏F3，NB-3和Notch的各自封闭抗体时，将OLN-93细胞培养在F3和NB-3蛋白底物上。结果显示OLN-93细胞容易与F3粘附，并且粘附作用可以被抗F3底物以及Notch1和Notch2的抗体封闭(图1a-j)。当加入NB-3的抗体时，细胞与F3底物的粘附也减弱。OLN-93细胞也与NB-3粘附，并且与抗NB-3，Notch1和Notch2的抗体保温降低细胞粘附。此外，当将OLN-93细胞铺在NB-3上时，它们快速出现明显的形态变化。它们变大并转变成卵圆形至圆形的扁平细胞，其最醒目的特征是膨胀的细胞质薄片(图1c-j)。形态上的这种改变也发生在OLN-93细胞铺于F3底物上时，只不过在较长时间后发生(未显示)。作为对照，发明者用牛血清白蛋白和CHL1(Holm et al，1996)，CHL1是免疫球蛋白超家族的另一个神经细胞粘附分子，但不是促进OLN-93细胞粘附的底物。这显示F3/NB-3信号可能构成触发少突胶质细胞分化的机制。
F3/NB-3和Notch间相互作用的额外证据用同样的实验系统和封闭抗体提供，但是使用小鼠Notch1转染的Hela细胞而不是OLN-93细胞(图1k-r)。在这种情况下，发明者有趣地发现Notch1转染的Hela细胞被F3-Fc排斥，并且当加入抗F3和Notch1的抗体时，这种排斥影响被逆转。对于NB-3-His，有Notch1转染的Hela细胞粘附，其在加入NB-3和Notch1的抗体时被抑制。这些细胞的研究强烈提示Notch是F3和NB-3的受体。
F3和NB-3结合于Notch的不同位点为进一步分析F3和Notch之间以及NB-3和Notch之间的联系的存在，发明者进行了几个生物化学和分子实验(图2)。将大鼠脑膜制备物溶解于2％Triton X-100，并与Notch1和Notch2抗体免疫沉淀。用抗F3和抗NB-3抗体的Western印迹分析显示抗Notch1和2的抗体沉淀物既含有F3也含有NB-3(图2a-b)。用非免疫IgG的对照免疫沉淀物对于F3和NB-3都为阴性。在反向免疫共沉淀实验中，使用抗F3和抗NB-3抗体免疫沉淀相似的脑制备物，并用Notch1和Notch2的抗体检测印迹(图2c-d)。这些免疫共沉淀结果提供证据，即F3/Notch和NB-3/Notch相互作用可能是脑内蛋白复合物形成的基础。
为允许发明者进一步研究这种相互作用的特征，将Notch1的细胞外结构域任意分成4个等大小的重叠的1.5kb片段(图2e)，并将其每一个亚克隆到pGEX-KG(Guan and Dixon，1991)框架中进行GST融合蛋白生成。通过诱导使转化的大肠杆菌表达四种蛋白片段。按照从N末端到C末端方向，发明者为四个Notch1蛋白的GST融合蛋白片段命名为N1.1，N1.2，N1.3和N1.4。显示四个片段的考马斯亮兰染色和免疫印迹(图2f-g)。Notch1的抗体特异识别N1.3和N1.4(Fig.2g)。考虑到发明者发现OLN93细胞与F3和NB-3的粘附被同一Notch1抗体封闭，F3和NB-3可能至少有一个共同结合位点在或者N1.3或者N1.4。
然后发明者进行了GST拖曳实验以提供Notch与F3和NB-3两者间存在联系的进一步生物化学证据。将四种Notch1 GST融合蛋白用于结合大鼠脑裂解物中F3和NB-3。用Western印迹分析，他们发现F3与两个片段N1.1和N1.3有关(图2h)，而NB-3只与N1.3有关(图2i)。这些结果适合于提炼发明者早期的数据即F3和NB-3是Notch的结合配偶体，并且它们具有在N1.3上的共同结合位点。
作为这种生物化学相互作用的更多证据，发明者使用四个Notch1蛋白片段来进行细胞粘附实验，其中将F3转染的CHO细胞和NB-3转染的CHO细胞分别铺在每个单独片段上。结果支持GST拖曳实验的发现，即F3转染的细胞主要结合于N1.1和N1.3(图2j)，而NB-3转染的细胞主要结合于N1.3(图2k)。综合起来，这些结果提供了支持Notch作为F3和NB-3受体的观点的生物化学证据。
Notch和F3/NB-3相互作用上调MAG的表达上面的结果证实了发明者的假设，即结旁段F3和NB-3与少突胶质细胞Notch之间发生相互作用，理由是发明者提供了它们物理联系的证据，也提供了它们各自的轴突(F3，NB-3)和神经胶质(Notch1在少突胶质细胞的表面表达)的定位。接下来，发明者探索了这个信号活动与髓鞘形成如何相关。当形成髓鞘的少突胶质细胞与轴突接触并将轴突包裹在多层螺旋鞘中时，理论上髓磷脂鞘的蛋白成分因此过程进展而上调。因此使用共培养的OLN-93细胞和F3-或NB-3-转染的CHO细胞，发明者研究这些F3/NB-3-Notch相互作用的细胞模型中髓磷脂特异蛋白的表达。用单纯OLN-93培养物和OLN-93细胞与模拟(mock)-，TAG-或TAX-转染细胞的共培养物作为对照。将这些细胞培养物匀浆以制备膜提取物，并用免疫印迹分析以确定CNS中髓鞘成分MAG(髓磷脂相关糖蛋白)和PLP(蛋白脂质蛋白)的水平。发现当将OLN-93细胞与F3转染的CHO细胞或与NB-3转染的CHO细胞(未显示)共培养时，MAG出现特异性的上调(图3)。但是，PLP的水平在所研究的所有培养系统中是相同的。这表明在髓鞘形成中F3/Notch或NB-3/Notch相互作用是活跃的。为提供进一步证据以支持这一发现，发明者继续分析当用原代少突胶质细胞代替OLN-93细胞系时，是否髓磷脂特异的蛋白发生类似改变。因此，制备大鼠(出生后1天或2天)少突胶质细胞的原代培养物，并将其铺于F3-Fc和NB-3-His融合蛋白底物上。用BSA(牛血清白蛋白)作为对照底物。此外，这种直接的细胞-蛋白接触力争模拟轴突配体和神经胶质间的接触。细胞铺在蛋白上2h后，从这些相互作用系统中的每一个分离总RNA，并进行实时RT-PCR实验以测定MAG和PLP的mRNA表达水平。注意到在原代少突胶质细胞被铺到F3和NB-3的两个系统中，MAG的表达水平比用BSA作为底物的对照系统高大约8倍(表1)。但是与对照相比，PLP的信使水平未发现升高。这些发现与Western印迹的结果一致，并且进一步证实存在F3/Notch和NB-3/Notch信号作用导致的髓磷脂特异基因上调。
NB-3和Jagged1位于不同的轴突区域已经说明了Jagged1如何通过Notch影响少突胶质细胞分化(Wang et al，1998)。当少突胶质细胞的细胞突起在结旁段遇到F3和NB-3时，另一种指令会传递给形成髓鞘的细胞，仍然通过同一受体-Notch。已经确定F3和NB-3限制在结旁段区域，很明显如果Jagged1限制在靠近结旁段的轴突节段，即结间部，那么在轴突被包入髓鞘过程中起作用的信号转换机制可能存在。因此发明者用免疫荧光分析大鼠脑干矢状面冰冻切片上NB-3和Jagged1的分布(图4)。分析3个独立的年龄组-出生后2，5和14天，因此允许研究动物成熟的NB-3分布的轴突类型。在P2发明者未观察到任何NB-3染色(图4a-c)，而在P5(图4d-f)，可以在结旁段看到聚集的NB-3。从这项结果，发明者推断NB-3可能开始在轴突表面广泛分布，然后在发育中转位到结旁段形成明显的聚集。重要地，Jagged1免疫反应局限在结间区，并且与结旁段分离(图4f)。这些发现提示当沿着轴突从结间向邻近的结旁段迁移时，在形成髓鞘的少突胶质细胞上Notch受体可能把轴突结合配偶体从Jagged1转换成F3/NB-3，因此随后暴露于不同的信号。
Notch是F3的少突胶质细胞表面结合配偶体。
轴突的F3聚集在结旁段，一个F3与形成髓鞘的神经胶质相互作用的潜在位点(Girault and Peles，2002)。Notch是似乎合理的结合配偶体，因为它细胞外部分有许多EGF样重复(Martinez Arias et al，2002)，并且在成熟的OL上丰富表达(Lardelli et al，1994；Wang et al，1998)。为研究这种潜在的相互作用，使用OL细胞系OLN-93(OLN)。OLN细胞源于大鼠脑神经胶质培养物中自发转化的细胞并且类似于成熟的OL(Richter-Landsberg and Heinrich，1996)。OLN细胞不再表达祖细胞表面标志A2B5，只有不成熟OL特征的髓磷脂基础蛋白(MBP)(～14kDa)的一种异构体是阳性。免疫细胞化学确认OLN细胞在表面表达Notch1和Notch2(图6Aa，b)。
为研究是否F3结合于Notch，如所描述进行细胞粘附实验(Xiao et al，1996)。在缺乏或存在封闭抗体情况下将OLN细胞铺在F3-Fc(F3)底物上。OLN细胞容易粘附于F3(图6Ac)，但是不粘附另一种神经细胞粘附分子CHL1-Fc(CHL1)(Holm et al，1996)(图6Ad)。与F3(图6Aj)，Notch1或Notch2抗体(图6Ae，f，j)预保温可以封闭粘附，但是用预免疫的血清或Notch1或Notch2抗原删除的抗体不能封闭粘附(图6Ag，h，i)。小鼠Notch1(mN1)转染的Hela细胞(Logeat et al，1998)也被用于细胞排斥实验，其是研究配体受体相互关系的另一种方法(图6B)。与模拟-转染的Hela细胞(图6Bb)相比，mN1转染的Hela细胞从F3上排斥(图6Ba)。将细胞用F3或Notch抗体预处理排斥被逆转，而预免疫血清预处理则不能逆转(图6Bc)。这些研究显示Notch1与F3相互作用。
F3结合于Notch1的特异位点为确认F3/Notch相互作用，将大鼠脑膜标本与Notch1或Notch2抗体免疫沉淀。用F3抗体的沉淀物免疫印迹显示它们含有F3(图7Aa)。在反向实验中，将F3抗体-沉淀物用Notch1或Notch2抗体检测(图7Ab)。这些结果提示Notch和F3可以形成复合物。
为鉴定Notch1上F3结合的特异位点，将小鼠Notch1细胞外结构域分成4个等大小的片段，命名为N1.1，N1.2，N1.3和N1.4(图7Ba)，并将它们以重组GST融合蛋白生成(图7Bb，c)。前述的细胞学研究中使用的Notch1抗体识别N1.3和N1.4，不识别N1.1或N1.2。用大鼠脑裂解物的GST拖曳实验发现F3与N1.1和N1.3相关(图7Ca)。为确认这点，将F3转染的CHO细胞(Gennarini et al，1991)接种在包被了四种GST融合蛋白的培养皿上。细胞主要结合于N1.1和N1.3。模拟-转染的CHO细胞不结合(图7Cb)。
F3和Notch1不共定位在脂筏上F3是定位在OL的脂筏上的表面分子(Krmer et al，1999)。为确定是否F3/Notch相互作用可能以顺式方式发生在这些微小区域，将它们从P15大鼠大脑皮质分离。如所报道(Faivre-Sarrailh et al，2000)，F3和Caspr都在蔗糖密度梯度的级分5中检测到(图7D)。Notch1仅发现于富含细胞骨架相关蛋白的级分9-12(图7D)。用成年大鼠大脑皮质获得相同结果(未显示)。因此，F3和Notch1不可能在脂筏中横向形成复合物。综合起来，这些观察表明F3是Notch的反向结合配偶体。
Notch与F3相互作用后NICD向核内转移Notch激活的立即后果是释放并向核转运NICD(Schroeter et al，1998)。为判断是否F3作为功能配体起作用来启动这些事件，用myc-标记的全长小鼠Notch1(mNotch1-myc)转染OLN细胞。将细胞用不同的蛋白处理并以NICD抗体免疫标记NICD(Logeat et al，1998)。在F3处理的细胞上主要在核中观察到集中的NICD染色(图8Aa)，与Jagged1诱导的NICD转移(图8Ab)相似。BSA不能触发这一过程(图8Ac)。与Notch1EGF重复11-12的抗体(EGF 11-12抗体，其与Notch2交叉反应，未显示)预保温取消了F3诱导的NICD转移(图8Ad)。抑制Notch1膜插入的化合物Brefeldin A和monensin(未显示)(Schroeter et al，1998)也能封闭NICD转移。用增加浓度的F3或Jagged1处理细胞导致NICD核聚集的相似增强，表明转移以依赖F3或Jagged1浓度的方式发生(图8Ae)。与F3-或Jagged1-转染的CHO细胞共培养的OLN细胞，而不是与模拟-转染的CHO细胞共培养的OLN细胞，也导致Notch2细胞内结构域(ICD)的产生(图8Af)。Notch2 ICD抗体不与Notch1 ICD交叉反应(未显示)。这些结果证明象Jagged1一样，F3能够激活Notch1和Notch2，导致随后NICD的核转移。
F3诱导Notch在S3位点的膜内断裂作为激活的先决条件，被早老素(presenilin)依赖的γ-分泌酶作用，Notch在S3位点(V1744)发生RIP(Schroeter et al，1998；Huppert et al，2000)。为阐明F3诱导的断裂的性质，将mNotch1-myc转染的OLN细胞与γ-分泌酶抑制剂预保温，然后用F3或Jagged1处理。在两种情况下，没有观察到核中NICD染色(图8Ba，b)。而且，将两种S3断裂突变体V1744K-myc和V1744L-myc，其表现出减弱的蛋白水解和活性的相应降低(Schroeter et al.，1998)，转染OLN细胞，然后将细胞用F3或Jagged1处理。细胞表现出c-myc免疫染色主要在细胞质和细胞表面，而不在细胞核(图8Bc-f)。在免疫沉淀实验中，从F3或Jagged1-处理的V1744K-myc和V1744L-myc转染的OLN细胞的c-myc抗体-沉淀物只能被也识别全长Notch1(300kDa)的NICD抗体标记(图8Bg，上面插图)，表明这些突变的Notch1分子仍是完整的。只有F3-或Jagged1-处理的mNotch1-myc转染的OLN细胞的沉淀物在用V1744抗体检测时出现反应条带，该抗体只识别从S3释放的NICD(120kDa)(图8Bg，下面插图)。综合起来，这些观察表明F3诱导Notch1在S3位点的RIP。
F3/Notch相互作用上调Notch1和Notch2表达F3而不是BSA诱导核中NICD增加2倍(图8Ca)，而在细胞质中的NICD没有明显变化，表明F3上调Notch表达。为研究这点，将OLN细胞与模拟-，F3-，TAG-1-或TAX-转染的CHO细胞培养。TAG-1和TAX是F3亚家族的成员(Tsiotra et al，1993)。当OLN细胞与F3转染的CHO细胞培养时，Notch1和Notch2，而不是Notch3表达增加(图8Cb)。实时PCR确认可溶性F3增加了Notch1和Notch2，而不是Notch3的转录(图8Cc)，而Jagged1只上调Notch1，不上调Notch2。因此，F3/Notch相互作用可能提供反馈环以特异上调Notch1和Notch2。
少突神经胶质的突起一旦接触F3则改变其形态为模拟髓鞘形成过程中轴突胶质接触的情况，研究OLN在接触细胞表面表达的F3时OLN突起的形态。由于OLN细胞比原代OL伸出更长的突起，所以它们更适合观察在接触中发生的细微的形态变化。F3转染的CHO细胞模拟结旁段轴突成分。用模拟-，TAG-1-，和TAX-转染的CHO细胞作为对照。明显地，在接触F3-转染的CHO细胞时大多数OLN突起停止并扁平以形成细胞质薄层铺在CHO细胞表面，就像试图包裹细胞一样(图9a-k)。但是在模拟-(Fig.9l，m)，TAG-1-(Fig.9n，o)，和TAX-转染(Fig.9p，q)的CHO细胞上未观察到此现象。到达F3转染的CHO细胞时大约80％伸出的突起停止，而对于其他CHO细胞比例仅有20％(图9r)。这些结果表明当遇到F3时诱导形态改变的信号被提供给少突神经胶质突起。
F3，而不是Jagged1上调MAG为探讨上面描述的形态改变与F3/Notch信号如何联系，研究在上述共培养中髓磷脂相关糖蛋白(MAG)的表达。母系和转染的CHO细胞不表达Delta，Jagged1和Jagged2(图10Aa)。将共培养细胞的膜提取物进行MAG的免疫印迹。在OLN细胞中MAG的组成型水平很低，检测不到。但是，当将OLN细胞与F3转染的CHO细胞培养时，MAG被上调(图10Ab)。F3转染的CHO细胞不表达MAG(未显示)。另一方面，实时PCR中，与接种在BSA上细胞相比，铺在F3底物上的纯化的原代OL显示出MAG转录提高大约16倍(图10Ac)。OLN细胞表现相似的MAG上调效果(未显示)。
在免疫染色实验中，将mNotch1-myc转染的OLN细胞用MAG和一种OL特异抗原2′，3′-环核苷3′-磷酸二酯酶(CNPase)进行免疫标记。与用Jagged1(图10Bb，c，e，f)或BSA(未显示)处理相比，用可溶性F3处理导致MAG染色明显增强(图10Ba)，和增强的CNPase染色(图10Bd)。MAG和CNPase荧光强度的定量显示F3-比Jagged1-或BSA-处理的细胞增加MAG约300％和CNPase约40％(图10Bg)。用Notch1 EGF 11-12抗体预处理的细胞封闭了F3诱导的MAG和CNPase增加(图10Bg)，表明此过程需要Notch。此外，F3诱导细胞变扁平和形成薄片样结构(图10Ba)。被细胞覆盖的底面积的定量显示F3处理的细胞比Jagged1或BSA处理的细胞的增加2倍(图10Bh)。这些发现确认F3诱导MAG上调。
F3/Notch相互作用上调MAG为更好理解NICD在此过程中作用，将OLN细胞瞬时转染V5-标记的显性负性突变的Notch1(dn-N1)或Notch2(dn-N2)(Small et al，2001)，其缺少细胞内区但能结合细胞外配体。然后将细胞用F3处理并用V5和MAG抗体双染。显著地，dn-N1-V5-(图10Ca)和dn-N2-V5-(图10Cb)阳性细胞缺少MAG标记。pcDNA4/V5/LacZ (LacZ)用作载体对照(图10Cc)。而且，用两种S3突变体，myc-标记的V1744K(图10Cd)和V1744L(图10Ce)转染的OLN细胞用F3处理，并双染c-myc和MAG。在任一种情况下，F3不能在c-myc-阳性细胞中上调MAG。MAG荧光强度的定量确认Notch1或Notch2功能障碍，换言之，NICD的缺失取消了F3诱导的MAG上调(图10Cj)，表明NICD对MAG表达是需要的。
通过向OLN细胞导入V5-标记的组成型活性的Notch1(caN1)(图10Cf，g)和Notch2(caN2)(图10Ch，i)，其缺乏细胞外结构域，有配体不依赖的活性(Small et al，2001)，进一步研究了F3在这个过程中的诱导作用。即，即使缺乏F3刺激，也产生NICD并向核转移。在OLN细胞，荧光素酶报道基因测定中caN1(图10Ac)和caN2(未显示)导致Hes1的反向激活。转染后，将细胞进行V5和MAG的双染色。免疫标记显示V5阳性细胞被MAG弱染色(图10Cj)。考虑到Jagged1也诱导NICD释放，但不增加MAG表达，这些结果证明MAG上调需要F3诱导的NICD。
F3/Notch诱导的MAG上调不依赖Hes1Notch信号的突出特点是以振荡方式激活Hes基因(Hirata et al，2002)。因此研究OLN细胞中Hes1 mRNA的表达。在实时PCR，用2mM EDTA(Rand et al，2000)非生理性处理细胞触发在第一个2h内Hes1 mRNA急剧增加和3h回到基础水平(图11Aa)，反映出内源的Hes1表达的精确的内在调节(Dale et al，2003)。然而，F3，Jagged1或BSA处理在处理后短时间(最初3小时)或长时间(12和24小时)没有明显改变内源Hes1转录的基础振荡水平(图11Aa)。
为研究是否F3诱导的MAG上调与Hes1蛋白的组成型水平有关，使用Hes1反义寡核苷酸(Kabos et al，2002)封闭OLN细胞中基础的Hes1蛋白表达(图11Ab)。MAG上调不受这种处理或对照正义寡核苷酸的影响(图11Ad，e，g)。
RBP-J是Notch调节的转录因子其能激活Hes基因(Martinez Arias et al，2002)。将OLN细胞用显性负性突变RBP-J-myc(dn-RBP-J-myc)转染，该突变是218的赖氨酸突变为组氨酸，其丧失结合于Hes1启动子区的有效的高亲和性(Kato et al，1997)。Hes1荧光素酶报道基因测定显示突变阻止Hes1被caN1激活(图11Ac)。转染后，将细胞用F3处理并进行c-myc和MAG双标记。C-myc阳性细胞表现出与相邻未转染细胞相同水平的MAG(图11Af，g)。这些结果显示由F3/Notch信号触发的MAG上调不依赖于内源的Hes1表达。
F3/Notch诱导MAG上调有DTX1参与更多证据显示DTX1是Notch信号通路的另一个下游元件(MartinezArias et al，2002)。既然F3诱导的MAG上调与Hes1表达无关，研究此过程中DTX1的作用，研究使用myc-标记的野生型DTX1(Yamamoto et al，2001)和所描述的它的两个删除突变体(图11Ba)，即含有氨基酸1-411的HA-标记的DTX1突变体(DTX1-D1)(Yamamoto et al，2001)和含有氨基酸1-242的Flag-标记的DTX1突变体(DTX1-D2)(Izon et al，2002)。两种突变体缺少H2指环模序，其利于DTX1功能的基本步骤-DTX1低聚(Matsuno et al，2002)。如以前所观察的(Yamamoto et al，2001)，Hesl荧光素酶报道基因测定显示过量表达DTX1抑制Hes1被caN1反式激活(图11Bb)。另一方面，DTX1-D1和DTX1-D2都能恢复Hes1对caN1的应答(图11Bb)。转染后，用F3处理OLN细胞并进行MAG和相应标记的双标记。DTX1的过量表达对F3诱导的MAG上调没有影响(图11Bc-e，l)。有趣地，在HA-阳性或Flag-阳性细胞中MAG上调被取消(图11Bf-1)。这些观察强烈表明F3/Notch诱导MAG上调有DTX1参与。
F3/Notch信号通路经DTX1促进OPC向OL分化Jagged1/Notch信号通路抑制OPC向OL分化(Wang et al.，1998)。为探讨是否F3/Notch信号经DTX1指导OPC分化，将祖细胞标志Ng2(Dawson etal.，2000)阳性的纯化的OPC(图12a)用F3或Jagged1处理2天，然后进行Ng2和OL特异的CNPase双染(图12b-d)。F3处理后，70％以上的OPC分化成CNPase+的OL，相对比用BSA刺激的有～50％，而Jagged1处理导致几乎所有OPC仍保持未分化(图12k)。F3刺激的细胞(图12c)比BSA处理的细胞(图12b)更明显被分为两部分并倾向形成网状结构。Notch和DTX1联系的检测通过用dn-N1-V5(图12e，h)和DTX1-D2-Flag(图12f，i)分别转染OPC，随后用F3处理2天。其他OPC用caN1-V5转染并留有未处理的(图12g，j)。显著地，标记和CNPase(图12e-g)或Ng2(图12h-j)的免疫标记显示，尽管存在F3，大多数dn-N1(～75％)或DTX1-D2(～67％)转染的OPC仍旧保持Ng2+(图12k)。具体地，～40％dn-N1-转染的细胞是CNPase+，但与周围未转染的细胞相比，这些细胞较少被分成两部分(图12e，插图)，意味着相对不成熟阶段。然而，CNPase+DTX-D2-转染的细胞几乎检测不到。与以前的报道(Wang et al.，1998)一致，caN1-转染的细胞仍是Ng2+，并几乎没有变成CNPase+OL(图12k)，意味着F3诱导的NICD对加速OPC分化是特别需要的。这些结果证实F3/Notch信号经DTX1促进OPC发育。
NB-3定位在结旁段发明者的中心目的是描述在结旁段轴突配体和神经胶质受体间相互作用的特征，其作为终止信号阻止少突胶质细胞的细胞突起延伸以避免碰及注定成为郎飞结的轴突结构域。第一步是证明轴突配体的特性。在潜在的候选者中，在结旁段有与Caspr形成复合物存在的F3(Rios et al，2000)。以前的结果(Kazarinova-Noyes et al，2001)一致，显示大鼠视神经纤维，用Caspr双标记显示在结旁段和结区存在F3。
最近，NB-3，一种GPI联结的细胞粘附分子，已经被鉴定为F3/Contactin家族的一个成员(Lee et al，2000)。为判断表达NB-3细胞类型，将来自E17大鼠大脑的纯化的原代神经元，OL和星形胶质细胞分别培养，并进行NB-3和特异性标志的双染，特异性标志是对于神经元用神经纤维丝200(NF200)(图14Aa)，对于OL用半乳糖脑苷脂(Gal-C)(图14Ab)，及对于星形胶质细胞用胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein(GFAP))(图14Ac)。结果证实只有神经元表达NB-3。接下来通过Western印迹研究大鼠脑干发育中NB-3的表达。与F3对比，NB-3的表达从E17开始，在P0至P21之间达到平台期，此后下降(图14Ad)，其与以MAG表达增加为标志的OL发育的时间范围相平行。这些观察显示NB-3是源于神经元的分子。这些结果表明NB-3/Notch信号可能在OL发育的多个阶段起一定作用。然而，NB-3的准确定位和生理作用还不完全清楚。
F3/contactin和TAG-1，F3/contactin家族的两个成员，明确定位在结区，结旁段和近结旁区(Girault and Peles，2002)。具体地，结旁段在郎飞结的侧面并形成轴突胶质连接的粘附位点，其中轴突胶质连接对启动髓鞘形成和髓磷脂环的稳定是至关重要的(Girault and Peles，2002)。为研究NB-3在轴突胶质相互作用中的作用，分析NB-3沿有髓鞘轴突的分布。使用不与F3交叉反应(未显示)的NB-3单克隆抗体，和抗Caspr或钠通道的多克隆抗体，在成年大鼠脑干矢状面冰冻切片上进行免疫荧光双染色。注意到NB-3与Caspr精确重叠(图14Ba-c)并且在结区钠通道的侧面(图14Bd-f)。为确认这种空间特征，研究P15和成年(未显示)大鼠大脑皮质脂筏中NB-3的分布。F3和Caspr共定位在脂筏上。与以前的发现(Faivre-Sarrailh et al，2000)一致，这两种结旁段分子共存在于蔗糖密度梯度的级分5中。有趣地，NB-3也主要存在于此级分中(图14c)。综合起来，这些结果表明NB-3作为结旁段成分可能在有髓鞘的轴突上与F3/Caspr复合物共定位。
NB-3是Notch1的功能配体考虑到在OL成熟中NB-3的表达特点和特殊的定位，发明者对发现NB-3是否能与源自OL的Notch1相互作用感兴趣。免疫沉淀实验显示，成年大鼠脑膜提取物的NB-3抗体沉淀物中检测到Notch1细胞外结构域(～190kDa)，而Notch1抗体沉淀物含有NB-3(图15Aa)，意味着NB-3/Notch复合物的存在。OLN-93(OLN)细胞，一个类似成熟OL的永久细胞系(Richter-Landsberg and Heinrich，1996)被用于细胞粘附实验。免疫细胞化学显示OLN细胞在表面表达Notch1(未显示)。细胞粘附于包被的NB-3底物，而不是另一种神经细胞粘附分子CHL1(Holm et al，1996)。与NB-3或Notch1抗体预保温封闭了粘附，与F3抗体或预免疫血清预保温不能封闭(图15Ab)。用Notch1转染的Hela细胞获得同样结果(未显示)。为绘出Notch1上的结合位点，将小鼠Notch1细胞外结构域的四个亚克隆的连续的等大小部分，标记为N1.1，N1.2，N1.3和N1.4，用于大鼠脑裂解物的GST拖曳实验。免疫印迹显示NB-3只与含有EGF重复22-34的区域N1.3相关(图15Ac)。这种特性的确认通过观察铺在单独的重组片段上的NB-3转染的CHO细胞主要结合于N1.3(图15Ad)，而模拟-转染的CHO细胞则不结合。综合起来，这些结果支持NB-3是Notch1配体的概念。
NB-3/Notch相互作用诱导OLN细胞中NICD核转移一旦结合于配体，Notch的核心信号机制包括在S3位点的调节性膜内蛋白水解(RIP)，其释放NICD入核(Schroeter et al，1998)。为探讨NB-3是否是Notch1的功能配体，将用myc-标记的全长小鼠Notch1(mNotch1-myc)转染的OLN细胞用NB-3(图15Ba)，Jagged1(图15Bb)或BSA(图15Bc)处理，并用NICD抗体免疫染色(Logeat et al，1998)。NB-3和Jagged1两者而不是BSA诱导NICD向核内浓集。靶向Notch1上EGF样重复的Notch1 EGF抗体阻止NB-3诱导的NICD核聚集(图15Bd)。为研究NB-3诱导的NICD释放的特性，将OLN细胞在暴露于NB-3(图15Be)或Jagged1(未显示)之前与γ-分泌酶预保温。在两者情况下，核NICD聚集被取消，意味着NB-3诱导的NICD释放有γ-分泌酶参与。而且，用取消S3断裂(Schroeter et al，1998)的两种S3突变体myc-标记的V1744K和V1744L转染的OLN细胞成功地阻止NB-3-(图15Bf，g)以及Jagged1-(图15Bh，i)诱导的NICD核转移。在Western印迹中(图15Bj)，来自或者NB-3或者Jagged1-处理的V1744K-myc或V1744L-myc-转染的OLN细胞的c-myc抗体沉淀物只被NICD抗体印迹，其也识别完整的Notch1(～250kDa)(上面插图)，不被V1744抗体印迹，其仅识别从S3位点释放的NICD。相对照，用NB-3或Jagged1处理后，mNotch-myc转染的OLN细胞产生被V1744抗体印迹的NICD(～120kDa)(下面插图)。综合起来，这些结果证明NB-3诱导γ-分泌酶依赖的S3位点的Notch1 RIP。
Hes1和Hes5不被NB-3激活在核中NICD与转录因子相互作用，例如RBP-J和/或Deltex1(DTX1)，因此激活靶基因，例如HES genes基因(Martinez Arias et al，2002)。因此研究OLN细胞中在Notch1被NB-3激活和内源的Hes1 mRNA水平之间的相互关系。实时PCR显示与BSA对比，NB-3诱导导致相似的Hes1 mRNA水平和振荡的表达类型(Ref)(图15Ca)。各种处理48小时后，包括另一种细胞粘附分子L1在内，Hes1 mRNA仍旧保持在基础水平(图15Cb)。为进一步弄清是否NB-3激活Hes1，使用Hes荧光素酶报道基因测定(图15Cc)。Hes1和Hes5都不能被NB-3处理激活，而组成型活性的Notch1(caN1)(Smallet al，2001)激活两种荧光素酶报道基因，意味着NB-3不激活Hes1和Hes5。
NB-3/Notch相互作用经DTX1上调MAG进一步研究髓鞘形成中NB-3/Notch1信号的影响。将共培养的OLN细胞与NB-3-或模拟-转染的CHO细胞的膜提取物进行MAG的免疫印迹，其中MAG是OL成熟的标志。只有与NB-3-转染的CHO细胞培养的OLN细胞上调MAG(图16Aa)。实时PCR显示源自P5-P7大鼠大脑皮质的原代OL中，NB-3增加MAG转录大约24倍(图16Ab)。免疫染色显示对NB-3应答，mNotch1-myc转染的OLN细胞产生比Jagged1(图16Ad-f)或BSA(图16Af)强2.5倍的MAG染色(图16Ac，f)。将细胞用Notch1 EGF抗体预处理阻止MAG上调(图16Af)。为研究NB-3/Notch1在MAG上调中的作用，将OLN细胞用缺少细胞内部分但仍能结合细胞外配体的显性负性突变的Notch1(dn-N1)(Small et al，2001)转染。用NB-3处理后，在转染的细胞中未观察到MAG上调(图16Ba，绿色)。而且，V1744K或V1744L-转染的OLN细胞(绿色)也取消了MAG升高(图16Bb，c)。因为在转染的细胞中caN1单独不能增加MAG表达(图16Bd，e绿色)，所以这些观察意味着NB-3产生的NICD对MAG上调是必需的。
NB-3诱导的MAG上调有DTX1参与为鉴定参与此过程的转录因子，将OLN细胞用显性负性突变的RBP-J(dn-RBP-J)(Kato et al，1997)转染，其缺失有效结合DNA的高亲和性(图16Bh)，或用DTX1(Yamamoto et al，2001)(图16Bi)或缺少DTX1低聚所需H2指环模序的两种DTX1删除突变体DTX1-D1(Yamamoto et al，2001)和DTX1-D2(Izon et al，2002)。Hesl荧光素酶报道基因测定确认OLN细胞中这些构建体的有效性，因为dn-RBP-J抑制Hesl被caN1反式激活，并且DTX1竞争性结合于caN1也影响此过程，其被DTX1-D1和DTX1-D2所恢复(图16Bg)。NB-3处理后，将细胞进行MAG免疫染色并计算荧光强度(图16B1)。发现在OLN细胞中(绿色)dn-RBP-J(图16Bh)引起的Hesl基础表达消减不影响NB-3诱导的MAG上调。相似地，DTX1转染的细胞(图16Bi，绿色)对NB-3刺激应答。然而，由DTX1-D1和DTX1-D2引起的内源DTX1功能障碍(图16Bj，k绿色)取消此现象，意味着DTX1参与NB-3介导的MAG表达。因此NB-3可能激活Notch1受体并释放NICD，其在髓鞘形成中补充DTX1。
NB-3在结旁段发育性地聚集通过Notch/DTX1信号通路促进OPC分化因为NB-3从E17开始表达，所以设想两对相互作用Jagged1/Notch1和NB-3/Notch1可能在早期发育阶段沿轴突共存在。为探讨是否NB-3和Jagged1逐步式协同调节髓鞘形成，首先研究这两种分子在发育中沿轴突的空间关系。将P2，P5和P14(未显示)的大鼠脑干切片进行Jagged1(绿色)and NB-3(红色)的双标记。在P2，Jagged1均匀地沿轴突分布并且几乎检测不到聚集的NB-3(图17Aa)，这与以前观察的在此时期Jagged1/Notch1信号可能控制促进年轻的OL环沿轴突迁移一致(Wang et al，1998)。在P5，NB-3聚集在结旁段(图17Ab，c)而Jagged1占据近结旁区和结间，与结旁段NB-3分离(图17A)。已知在P6后Jagged1表达降低(Wang et al，1998)，所以发明者的观察表明在这两对相互作用之间的平衡可能在OL成熟的晚期被破坏，换言之，NB-3/Notch1相互作用主要诱导CNS结旁段OL的成熟。为证明此观点，将来自P7Wistar大鼠视神经的纯化的OPC(图17Ba)用BSA，NB-3或Jagged1处理2天，然后进行祖细胞标志Ng2(红色)和年轻OL标志的CNPase(绿色)的免疫染色(图17Bb-d)。统计学计算显示，与BSA(～50％)或Jagged1(～0％)处理相比，NB-3促进OPC分化成CNPase阳性OL细胞(～75％)(图17Bh)。为进一步确认Notch1和DTX1参与NB-3促进OPC分化，将OPC用dn-N1(图17Be)或DTX1-D1(图17Bf)转染，并同时用NB-3处理。对标记(绿色)和CNPase(红色)的双标记显示导入任一种构建体都明显封闭NB-3促进OPC分化成OL(图17Bh)。与以前的研究(Wang et al，1998)一致，caN1-转染的OPC保持未分化(图17Bg，h)。
NB-3/Notch信号通过Deltex1指导胚胎神经干细胞分化成少突胶质细胞为探讨是否NB-3/Notch1相互作用也参与从神经干细胞(NSC)的少突神经胶质生成，研究NB-3和Notch1的发育表达类型。大鼠脑标本的Western印迹显示NB-3和Notch1都在胚胎17天(E17)表达，并且出生后急剧升高在生后0天(P0)和21天(P21)达到最高水平，其对应于从NSC的少突神经胶质生成的时间范围(图18)。
NSCNB-3是Notch1的功能配体接下来用免疫荧光研究NSC上Notch1的表达。本研究中使用的NSC是从胚胎14天的BALB/c小鼠胚胎纹状体分离的(Arsenijevic et al，2001)。这些细胞表达祖细胞标志中间体丝蛋白nestin(图19Aa)和Notch1(图19Ab，c)。为确认以前观察到的NB-3/Notch相互作用，将偶联到蛋白A珠上的NB-3-Fc融合蛋白用来沉淀NSC膜提取物中NB-3的结合配偶体。沉淀物与Notch1抗体印迹阳性(图19Ba)。进而，将P0大鼠脑膜提取物用NB-3抗体免疫沉淀，并用Notch1抗体印迹，反过来也是这样(图19Ba)。Western印迹显示NB-3和Notch1免疫共沉淀。此外，通过将小鼠Notch1-(N1)和模拟转染的Hela细胞铺在NB-3底物包被的蛋白上进行细胞粘附实验。N1转染的Hela细胞粘附于NB-3(图19Bb)，而模拟-转染的Hela细胞不结合(图19Bf)。细胞与NB-3或Notch1抗体预保温阻止粘附(图19Bc，d)，但与预免疫血清预保温不能阻止(图19Be)。这些研究确认NB-3是Notch的结合配偶体。
NSCNB-3诱导NICD核转移但不激活Hes1通过配体结合的Notch激活以NICD核转移为特征(Schroeter et al，1998)。发明者研究NSC中是否发生NICD核转移以应答NB-3刺激。上面已经观察到OLN细胞中NB-3诱导γ-分泌酶依赖的NICD核转移。与该研究一致，叠加的三染显示NB-3处理nestin(绿色)阳性NSC导致NICD聚集(红色)在Hoechst 33258染色(蓝色)显示的核内(图19Ca)，其与Jagged1刺激相似(图19Cb)。但是，BSA不能触发这一过程(图19Cc)，表明NB-3特异地与Notch1相互作用来实现典型的NICD核转移。经典Notch信号通路的另一个突出特征是核NICD反式激活靶基因，例如Hes基因(MartinezArias et al，2002)。因此利用Hesl荧光素酶报道基因测定来研究是否NB-3产生的NICD可以激活Hes1。结果显示NB-3不能上调Hes1，而如所预测Jagged1或组成型活性的Notch1(caN1)(Small et al，2001)激活Hes1(图19Da)。由于越来越多的证据显示Deltex1(DTX1)是另一个Notch下游元件(Yamamoto et al，2001)，所以在pE7荧光素酶报道基因测定中研究NB-3对DTX1介导的Mash1转录活性的影响(图19Db)。与以前的报道一致(Yamamoto et al，2001)，DTX1抑制pE7报道基因的Mash1反式激活。但是，NB-3处理部分地模拟这种抑制，其被一种DTX1删除突变体Flagged-标记的DTX1-D2(Izon et al，2002)所消除，该突变体缺少结构域3，其是功能性DTX1同源二聚体形成所需的H2指环模序(Matsuno et al，2002)(图21c)。这些结果表明NB-3产生的NICD可能介导与DTX1相关的转录事件。
NSCNB-3促进OL产生考虑到NB-3和Notch1的表达都与OL发育的时间范围平行，发明者研究是否NB-3/Notch相互作用参与来自NSC的少突神经胶质发生。为进行这项研究，允许NSC在缺乏促有丝分裂剂并存在血清和NB-3(图20a，d)，BSA(图20b，e)，或Jagged1(图20c，f)时分化7天。将用Hoechst 33258鉴定的细胞(图20a-f，蓝色)进行下列的免疫染色OL标志CNPase(图20a-c，红色)；神经元标志β-微管蛋白(tubulin)(图20d-f，红色)，和星形胶质细胞标志GFAP(图20a-f，绿色)。结果显示与BSA和Jagged1不同，NB-3促进OL产生。另一方面，与BSA对比，NB-3对神经元发生影响很小，而有报道Jagged1抑制该过程(Morrison et al，2000)。流式细胞术确认了这些观察结果，因为与BSA处理对比，NB-3诱导产生的OL增加2倍，而Jagged1抑制OL发育(图20g)。
NSCNB-3/Notch信号通路通过DTX1指导少突神经胶质发生为确定Notch1参与此过程，将NSC用V5-标记的显性负性突变的Notch1(dn-N1)转染(Small et al，2001)。dn-N1缺少细胞内结构域但仍能结合于细胞外配体。Hes1荧光素酶报道基因测定显示dn-N1没有对Jagged1处理应答以激活Hes1(图21h)。然后撤去促有丝分裂剂并向培养基中加入NB-3。对V5和CNPase或GFAP的双标记显示dn-N1导致的Notch1功能障碍取消了NB-3促进的少突神经胶质发生，而利于星形神经胶质形成(图21a，b，i)。为进一步研究是否DTX1参与NB-3诱导的OL形成，将NSC用Flag-标记的DTX2-D2转染(图21c)。Hes1荧光素酶报道基因测定确认DTX1抑制Hes1被caN1激活，而DTX2-D2恢复了caN1引起的Hes1升高(图21h)。在存在NB-3的分化后，将NSC进行Flag和CNPase或GFAP免疫染色。结果显示DTX1-D2转染的细胞在NB-3刺激后没有分化成OL而是直接向星形胶质细胞分化(图21d，e，i)。并且与以前的研究(Tanigakiet al，2001)一致，向NSC中导入caN1导致星形胶质细胞发生而抑制OL产生(图21f，g，i)。这些观察表明NB-3通过Notch/DTX1信号通路促进少突神经胶质发生(图22)。
涉及发明第二方面的讨论应用分子，细胞，和形态学方法，发明者鉴定了在结旁段Notch和F3/NB-3之间的功能性分子相互作用，其中结旁段是髓鞘形成中轴突胶质信号的重要部位。一种新的轴突粘附分子-NB-3，定位在结旁段。在轴突包入髓鞘过程中这种相互作用可能调节形成髓鞘的少突胶质细胞分化，并起到防止公认的郎飞结包有髓磷脂的作用。除了确定的Notch/Jagged1信号通路，发明者提供了在髓鞘形成过程前后新的Notch配体-F3和NB-3的证据，表明通过Jagged1和F3/NB-3的信号可能以协同方式有利于髓鞘形成。
数据表明粘附分子F3为Notch的新功能配体。F3/Notch相互作用诱导NICD产生和核转移，并提高Notch1和Notch2的表达。这促进OPC分化和上调OLN细胞和原代OL中MAG，因此揭示F3在OL成熟中潜在的调节作用。所以，通过Jagged1的配体特异的Notch信号作为抑制因子，而F3作为正性指导者可能以共同作用的方式调节髓鞘形成(图13)。
数据也表明NB-3为Notch的另一个新功能配体。细胞外的NB-3/Notch相互作用从膜上释放NICD，其募集DTX1并向核转移，在核内复合物介导直接的或间接的CNPase表达，因此促进少突神经胶质发生(图22)。
Notch是F3/NB-3的少突胶质细胞表面受体直观地，如果髓鞘形成被适当协调，那么轴突和少突胶质细胞都必须主动参与并完成双向通讯。形成的观点是活跃的轴突胶质信号通道位于结旁段，该处充满细胞质的神经胶质环螺旋形并凹进相邻的轴突膜。尽管对结旁段轴突和胶质的分子成员已有描述，它们在调节髓鞘形成中的功能相互作用仍不清楚。为了支持神经胶质Notch可能作为轴突F3和NB-3受体的观点，发明者通过免疫共沉淀实验和GST拖曳实验显示了这些分子的物理相互作用。而且，鉴定了Notch1细胞外结构域中F3作用的两个区域(N1.1和N1.3)，其中一个(N1.3)与涉及NB-3结合的区域共享或重合。
Notch是F3/NB-3的功能受体本研究假设存在分子终止信号以阻止成熟的形成髓鞘的少突胶质细胞侵犯并在公认的郎飞结处形成髓鞘。发明者有从OLN-93细胞发出的少突胶质细胞突起在F3转染的CHO细胞表面停止并展开的直接证据。这一信号的分子基础是F3和Notch之间相互作用的。为支持此观点，用OLN-93和培养在F3底物上的Notch1转染的Hela细胞进行粘附实验，证明细胞相互作用被假设的配体-受体对的特异抗体所破坏。连同以前的形态学数据，确定结旁段F3的存在，并且发明者的数据揭示少突胶质细胞Notch受体的表面表达，发明者认为F3信号相互作用的确在结旁段存在，并起到防止少突神经胶质突起进一步延伸的作用。这种有趣的结果在推断调节有髓鞘的结间侧向限制机制中是独一无二的。用与F3相似的方式，发明者也提供了NB-3是Notch1配体的证据。将表达Notch1的Hela细胞铺在F3或NB-3上导致不同相互作用结果；粘附于NB-3底物，但被F3底物排斥。这可能由于来自双位点F3-Notch相互作用(导致细胞排斥)和单位点NB-3-Notch相互作用(介导粘附)的信号起源不同。将OLN-93细胞铺在NB-3上产生快速的分化和形态改变最终导致细胞体扁平薄片样外观，可能代表分化步骤，其出现在髓鞘形成的多阶段中当少突胶质细胞准备将接触的轴突包入鞘中时。但是，F3/Notch和NB-3/Notch相互作用隐含的共同主题是两者都与髓鞘形成有关联，正如两者都在蛋白和mRNA水平上调MAG所证实。
对神经胶质来源的Notch的不同配体信号以协调髓鞘形成髓鞘形成的复杂特性需要轴突胶质相互作用的协调动态连续，其可能受反式相互作用成分的时间和空间分布所调节。一种这类调节的相互作用涉及大鼠视神经中轴突Jagged1和少突胶质细胞源Notch1的相互作用(Wanget al，1998)。Notch受体被Jagged1激活抑制少突胶质细胞分化并促进其细胞突起沿轴突迁移。在视神经模型中，Jagged1下调与髓鞘形成的时间过程平行。与髓鞘形成只开始于靶神经分布之后的发现(Schwab and Schnell，1989)相符合，进一步研究显示Jagged1下调只发生在轴突到达它们的靶之后(Dugas et al，2001)。因此减弱保持少突胶质细胞于未成熟状态的Jagged1/Notch信号，并且渐进地发生少突胶质细胞向成熟的产生髓磷脂细胞分化。然后，这个重要信号可能允许少突胶质细胞突起沿轴突接触并延伸。发明者的结果支持Notch受体可能转换其他配体的想法，例如在结旁段聚集的F3/NB-3作为正性信号，触发髓鞘包裹过程的出现。这种配体转换机制可能也是从分化的少突胶质细胞被轴突抑制信号抑制到随后成熟为髓鞘形成细胞的相变基础。
髓鞘形成的空间调节可能通过沿轴突的分子的聚集完成。钠通道的聚集已经有描述(Salzer，1997)。在成熟的神经，Caspr分子逐渐地向结区聚集以形成紧密条带，在结区的每侧形成“Caspr螺旋”(Pedraza et al，2001)。
少突胶质细胞本身通过指导分子定位在促进结旁段形成中似乎是重要的。在MBP-TK中FIAU诱导的少突胶质细胞脱离导致Caspr的错误定位(Mathis et al，2001)。值得注意的是，在MBP-TK脑中少数形成髓鞘的少突胶质细胞与Caspr在临近MBP阳性区域的局部聚集有关。在jimpy小鼠，发生少突胶质细胞的自发性退化和Caspr的错误定位(Mathis et al，2001)。发明者以前的工作也已显示，在髓鞘再形成的外周神经中，起初沿脱髓鞘的神经纤维广泛分布的F3如何在再形成髓鞘的施万细胞影响下在结旁段聚集。具体地，在施万细胞延伸的边缘观察到F3聚集(Kazarinova-Noyes et al，2001)。这里提供的结果表明NB-3也经历相似的聚集过程，因为在沿P2轴突几乎检测不到，但在P5和P14时形成明显的相应于结旁段染色的一对条带(图4)。该结果也支持少突胶质细胞可能是轴突分子例如Caspr，F3，和NB-3聚集所需要的观点。
少突胶质细胞依赖的聚集可能不仅导致轴突蛋白再分布到一定区域，而且导致“剂量影响”，因为曾经稀疏分布的分子变成在高密度条带中聚集在一起。只有浓集的轴突配体可能有效地向神经胶质受体传递信号以达到“终止”效应，这解释了为什么终止信号不是在轴突分子均匀分布的轴突胶质接触起始阶段被过早激活。以此方式，聚集可能促进轴突cues的转换，例如Notch受体从结间的Jagged1向结旁段F3和NB-3的转换。在cues的这种转换代表轴突被包入髓鞘过程中的基本的调节机制。本质上，虽然过于简单，但可以将形成髓鞘的少突胶质细胞比作在其侧面末端有开凿机的机器，它的马达发动机发动(Jagged1/Notch抑制信号下调触发少突胶质细胞分化)，随着它的前进堆起越来越高的泥土(结区和结旁段分子的聚集)，然后通过内在反馈机制制动停止(聚集的“高剂量”F3信号传递给少突神经胶质Notch)。
许多研究致力于可能在髓鞘形成过程中起一份作用的信号机制，例如神经束蛋白(神经束蛋白)(Martin-Collinson et al，1998)和N-钙粘蛋白(cadherin)(Schnadelbach et al，2001)的作用。发明者赞成Pedraza et al(2001)提出的观点，即在作为双向信号转导通道的结旁段，轴突胶质连接的膜蛋白可能作为选择性分子筛和扩散屏障，其目的是有利于轴突结构域结构的组织。并列的轴膜和神经胶质膜环的膜蛋白通过粘附分子相互作用以形成机动的分子筛构造体，和沿轴膜表面的“运行”的屏障，推着钠通道并将它们集中在结区，并允许钾通道穿过以到达近结旁区。联结于轴膜和神经胶质分子的细胞质结构域的细胞内蛋白也可能以明显方式有利于这种屏障/筛选作用。考虑到F3和NB-3都是轴突表面GPI联结分子，研究它们与跨膜蛋白的顺式相互作用和相关的细胞内信号转导通路的性质会是有趣的。与F3有关的Caspr，通过细胞内片段与蛋白4.1家族成员相互作用(Baumgartner et al，1996；Ward et al，1998)。这把Caspr连接于血影蛋白(spectrin)和轴突细胞骨架(Hoover and Bryant，2000)。CGT缺陷小鼠上存在含有聚集的钠通道但异常分布的F3，Caspr和钾通道的完整郎飞结，这证实可能存在其他重要信号机制的事实(Coetzee et al，1996；Bosio et al，1998)。由于该酶(UDP-半乳糖-神经酰胺-半乳糖基转移酶)是半乳糖脂合成所需要的，因此脂类分子可能也是髓鞘形成的重要调节物。
明确轴突胶质连接构型和成分的进一步工作无疑有助于建立认识，基于此认识希望出现有意义的策略以促进损伤的CNS的髓鞘再形成。
本研究也揭示Notch信号的新方面-F3和NB-3作为信号配体的存在。这些神经细胞粘附分子相对广泛地分布在神经系统中，并可能调节Notch介导的过程。目前，主要研究Notch受体与DSL(Delta，Serrate，Lag-2)配体，CSL(CBF1，Suppresssor ofhairless，Lag-1)共转录因子和基因靶物的关系，其被分类在基本的螺旋-环-螺旋转录调节物的HES(Hai(Hairy/Enhancer of Split)家族。Notch受体一般在发育中细胞命运选择中起重要作用(Artavanis-Tsakanos et al，1999；Baker，2000；Mumm and Kopan，2000)。除了发育中的神经元发生，Notch也参与神经胶质发生(Morrison et al，2000)，并与T淋巴细胞发育(Robey et al，1996)，血液恶性疾病(Ellisen et al，1991)和家族性卒中综合症(Joutel et al，1997)有关。Notch也是进行调节膜内蛋白水解的少数蛋白中独特的一个(Weinmaster，2000)。细胞粘附分子对这些过程的调节因此成为另一个研究方向。
Notch是F3的少突神经胶质表面受体轴突胶质连接处的粘附接触部分由F3-Caspr-神经束蛋白155异源三聚体提供(Girault and Peles，2002)，但是这个复合物的确切作用还需进一步研究。这里发明者说明了F3和Notch之间新的配体-受体相互作用。细胞粘附/排斥实验和生物化学方法证明Notch和F3是结合配偶体。进而鉴定了Notch上供F3结合的两个细胞外位点，即，N1.1和N1.3。前者含有参与DSL结合的EGF重复11-12(Rebay et al，1991)。F3也表达在OL上(Koch et al，1997)并向神经胶质细胞内Fyn转导信号，然后Fyn与Tau蛋白相互作用以介导髓鞘形成(Klein et al，2002)。由于可溶性F3足以触发F3/Notch信号并且脂筏实验证明Notch1不存在于富含F3的级分中，所以F3可能不是与Notch1以顺式进行相互作用。考虑到Notch和F3共定位在脑的各种区域中(Lardelli et al，1994；Revest et al，1999)，特别是在轴突胶质连接处，所以结果提示F3作为Notch反式作用的配体的作用。
F3/Notch信号诱导NICD的蛋白水解性释放并上调Notch同源物RIP，从非核前体例如Notch和APP产生核信号蛋白，是信号转导的新范例，其潜在地向细胞信号指令系统加入了无法预知的多样性(Ebinu andYankner，2002)。发明者显示在OLN细胞中，F3与DSL结合时触发Notch膜内S3位点蛋白水解和产生的NICD的核转移。Notch1 EGF(EGF 11-12)抗体，或布雷菲德菌素(brefeldin)A和莫能菌素(monensin)封闭此过程的能力表明细胞外F3/Notch相互作用对膜内断裂产生NICD和NICD的转运是必需的。因此，这是RIP的另一个例子。此外，F3/Notch信号通路可能激活反馈环其特异地增加Notch1和Notch2(不是Notch3)表达或保护Notch1和Notch2不被快速降解。任一种方式，可能补充细胞表面消耗的受体并因此维持信号连续。
通过DTX1的F3/Notch信号的可能模型考虑到F3和Jagged1在Notch1上共享同一个结合结构域，所以在髓鞘形成之前发生的Jagged1下调可能起到允许改变Notch与F3相互作用的作用。在OLN细胞，Jagged1和F3都触发γ-分泌酶介导的和S3指导的NICD释放和随后NICD的核转移。此外，caN1反式激活Hesl，其可被dn-RBP-J-myc或DTX1的共表达而封闭。因此推测F3诱导的Notch细胞内信号与RBP-J有关。但是，只有F3诱导的NICD增加MAG表达，Jagged1诱导的NICD或caN1和caN2则不能，表明这个过程可能需要特异的细胞外配体-受体相互作用。而且，利用或者dn-RBP-J-myc或者Hes1反义寡核苷酸实验显示内源性Hes1表达的封闭不参与F3/Notch诱导的MAG上调。另一方面，DTX1的两个截断的突变体，其缺乏形成功能性同源二聚体DTX1所必需的H2环指模序(Matsuno et al，2002)，既封闭F3促进OPC分化也封闭MAG上调。因此提出配体转换可能改变了Notch细胞内信号效应物(图13)。结合不同的配体可能诱导不同Notch构象的形成。这种构象变化可能由于Jagged1和F3识别不同的Notch区域引起，虽然两者有重叠。在断裂前或之后，不同构象的Notch受体可能与不同的细胞质因子例如DTX1相互作用。随后形成的NICD到达核，然后进一步发挥潜在相互作用并决定其转录靶物。研究这个假说并鉴定F3/Notch信号需要的DTX1相关的共转录因子是非常有意义的。
经由DTX1的F3/Notch信号在OL成熟中的潜在作用
Jagged1/Notch信号利于维持OPC在未分化阶段(Wang et al，1998)。在多发性硬化(MS)中有效地髓鞘再形成失败部分归因于星形胶质细胞表达的Jagged1激活的OPC Notch(John et al，2002)。但是，Jagged1表达从P6左右明显降低(Wang et al，1998)，与髓鞘形成开始和轴突F3在结旁段聚集的时间点(Kazarinova-Noyes et al，2001)一致，其中结旁段是在新形成的OL表面与Notch受体相互作用的理想位置。在OPC中Notch1被选择性删除(Genoudet al，2002)的突变的动物，特征是异常不成熟的OL，大多数发生凋亡，表明在缺乏Notch受体的情况下自主分化可能被破坏，并且可能需要除Jagged1/Notch外的其他调节信号级联，以确保OL的正确分化和存活。这里观察到F3促进OPC分化，其可被显性负性突变的Notch和DTX1删除突变所封闭，并且从OLN细胞伸出的少突神经胶质突起在F3转染的CHO细胞表面停止并展开，其是与上调髓磷脂特异蛋白例如MAG和CNPase有关的过程。一旦Notch与或者固定化的或者可溶性F3相互作用时，成熟OL的特异型标记MAG在蛋白和mRNA水平都明显上调。MAG上调可以被Notch1，Notch2的显性负性突变构建体或DTX1的删除突变所封闭。这些观察结果显示OL成熟有通过DTX1的F3/Notch信号参与(图13)。
概括地，研究揭示Notch信号通路的新方面。一旦被F3激活，Notch信号通过DTX1上调某些髓磷脂相关蛋白继续参与OL成熟，而不是仅仅发挥抑制OPC分化成OL功能。因此，这一发现可能证实是促进退化疾病如MS中髓鞘再形成的有效的分子手段，其通过创造Notch主要与内源或外源F3的相互作用以启动F3/Notch/DTX1信号通路的环境。
NB-3是结旁段结构的新组分在神经系统发育中有髓鞘的轴突的构建是良好编排的现象，然而此过程的分子细节还不清楚。除了髓磷脂鞘的节段特征，发生轴突分子的再分布以在成熟的神经纤维上产生不同的轴突结构域。各种轴突结构域的分子构造已经被广泛综述(Morell and Quarles，1999；Arroyo et al，2000；Peles andSalzer，2000；Denisenko-Nehrbass et al，2002)。结旁段的组成包括与neurexin超家族分子有关的轴突F3，Caspr，和少突神经胶质神经束蛋白-155(NF-155)(Rios et al，2000；Tait et al，2000)。对无F3小鼠的研究突出了F3在外周神经系统(PNS)轴突胶质构造合成中的关键地位。在出生后18天突变小鼠死亡前，出现后肢无力的共济失调表型，其归因于小脑神经元间有缺陷的联系和降低的神经传导速度和兴奋性(Berglund et al，1999；Boyle et al，2001)。神经冲动传导的后一个问题反映出在有髓鞘的外周神经中轴突胶质连接形成出现异常。与F3的结旁段功能相一致，这些异常包括轴突胶质连接破坏和F3的顺式结合配偶体Caspr向轴膜的转运缺陷(Boyle et al，2001)。在F3突变小鼠中仍形成粘附的轴突胶质相互作用的事实表明有其他结旁段分子参与，NB-3就是这样的一个候选者。尽管在PNS中NB-3的分布/定位是未知的，但在CNS中NB-3表达于嗅球，大脑皮质的I，III和V层，梨状皮质(piriform cortex)，前丘脑核，蓝斑(locus coeruleus)，中脑三叉神经核和小脑的浦肯野细胞(Purkinje cell)(Lee et al，2000)。发明者显示从P5至成年，NB-3在结旁段的聚集和与Caspr共定位，的确表明它在PNS中类似定位的可能性。
NB-3在CNS结旁段簇集经由Notch/Deltex1信号通路促进少突胶质细胞前体细胞成熟概括地，上面的研究已经显示源自神经元的分子NB-3是Notch1的功能配体。通过发育性地在CNS结旁段聚集起空间转换信号作用，它通过RIP在S3位点释放NICD并触发Notch/DTX1信号通路，其促进OPC分化和OL成熟以协调髓鞘形成。
NB-3/Notch信号经Deltex1指导胚胎神经干细胞分化成少突胶质细胞多发性硬化(MS)是CNS慢性脱髓鞘疾病。神经干细胞移植是这类疾病的有前途的治疗手段(Pluchino et al，2003)。建立一个可靠的选择性地将适当的供体干细胞预分化成OPC或OL的方法是重要的。在本研究中，已经提供了新信号通路的临床前验证，其允许首次使用一种神经元细胞识别分子NB-3来指导神经干细胞在体外向OPC和/或OL系分化。而且，最近研究表明MS中有效的髓鞘再形成失败部分由于OPC Notch受体被星形胶质细胞表达的Jagged1激活(John et al，2002)。在突变的小鼠中出现异常的不成熟的OL和随后凋亡，其中突变小鼠的OPC中Notch1信号被选择性抑制(Genoud et al，2002)。这些观察表明，除了Jagged1/Notch1相互作用外，可能存在其他轴突源Notch1配体，其通过适当激活Notch1信号通路介导OL分化(Hu et al，2003)。为支持此观点，发明者在NSC中的观察提出NB-3/Notch信号经Deltex1可能调节从NSC向OL分化，并因此代表在脱髓鞘疾病中治疗干预的潜在靶物。
发明第二方面涉及的材料与方法抗体单克隆抗体Notch1 EGF重复11-12(Neomarker)，CNPase，Flag，beta-微管蛋白(tubulin)和MAP2(2a+2b)(Sigma)，c-myc(9E10)和HA(Santa CruzBiotechnology)，核基质蛋白，Gal-C和nestin(Chemicon)，GFAP(DAKO)和V5表位(Invitrogen)；多克隆抗体V1744-断裂的NICD(Cell Signaling)，N2ICD，Jagged1，Jagged2，Delta(Santa Cruz Biotechnology)，γ-微管蛋白(tubulin)(Sigma)，Ng2，钠通道(NaCh)，NF200(Chemicon)，Hes1(Kaneta etal，2000)，NICD(Logeat et al，1998)，Notch1，Notch2，Notch3(Lendah1博士惠赠)和F3(Shimazaki et al，1998)。
通过用人Caspr氨基酸277-430的GST融合蛋白免疫兔获得多克隆Caspr抗体，并且通过用肽N’-CISCGAPDKYESREVST-C’(Eurogentec)免疫兔获得多克隆MAG抗体(7610)。
偶联Cy2，Cy3和FITC的二抗购自Amersham Pharmacia Biotech.Inc.。
用含有编码Ig结构域I-II(氨基酸30-227)的大鼠NB-3cDNA的pET15b载体(Novagen)转化大肠杆菌，抗其表达的重组蛋白生产抗NB-3血清和单克隆抗体。为构建这个表达载体，在PCR反应中使用两个寡核苷酸引物，以从大鼠脑总RNA合成的cDNA文库中扩增编码相应区域的cDNA。两个寡核苷酸引物是5′-TCCGGATCCCATGGAGCCACAGGATGTCATTTT-3′(正向)5′-TCCGGATCCGTCGACTGGCACATATTCCCCCATGA-3′(反向)PCR是在94℃变性3分钟后于94℃30秒，60℃30秒和72℃45秒进行30循环。将扩增的cDNA片段DNA测序后，用BamHI消化并插入BamHI-酶切的pET15b载体中。在用IPTG诱导的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中表达蛋白。将其部分纯化为包涵体，并将其溶解并进行SDS-PAGE，重组蛋白从胶上电泳洗脱。将蛋白用于免疫兔以制备抗血清和免疫BALB/c小鼠以制备单克隆抗体(Harlow，1998)。
细胞共培养将F3转染的CHO细胞(Gennarini et al，1991)，TAX，TAG-1和模拟-转染的CHO细胞(Furley et al，1990；Tsiotra et al，1993)与少突胶质细胞系OLN-93(Richter-Landsberg and Heinrich，1996)以2∶1比例在达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(Dulbecco’s modied Eagle’s medium)(DMEM，Gibco)，10％胎牛血清(Gibco)和青霉素/链霉素(Gibco)中，于37℃，湿润空气中共培养2天。将细胞用PKH26红色荧光细胞接头试剂盒(Sigma)预染。细胞也用c-myc的单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)为一抗并用Cy-2标记的羊抗鼠二抗(Sigma)染色。为判断共培养中停止的突起的数目，来自每个实验从3个盖片中每一个上随机选取3个区域的OLN-93细胞(多于100个细胞)计数。将来自至少3个独立实验的原始数据用方差分析和然后的Newman-Keuls检验进行分析，p＜0.05和p＜0.01分别被认为是显著或非常显著。
将NB-3-或模拟-转染的CHO细胞与OLN以2∶1比例共培养2天。共培养的膜部分按照描述提取(Xiao et al，1996)。
NB-3转染的CHO细胞的转染和特征按照生产商的说明使用lipofectin(GIBCO BRL)将CHO细胞用10μgpcDNA3-NB-3转染。随后用G418(Life Technologies，Inc)药物筛选，将存活的细胞克隆扩增，并用Western印迹和免疫组织化学染色分析表面NB-3表达。
细胞的转染应用Lipofectamine(Invitrogen)将OLN细胞瞬时(V1744K-myc，V1744L-myc，dn-N1-V5，dn-N2-V5，pcDNA4/V5/LacZ(Invitrogen)，dn-RBP-J-myc，DTX1-myc，DTX1-D1-HA，DTX1-D2-Flag，caN1，caN2)或稳定(mNotch1-myc)转染。应用Lipofectamine将CHO细胞用全长Jagged1(Small etal，2001)稳定转染。稳定转染物用400μg/ml G418(Sigma)或250μg/mlZeocin(Invitrogen)筛选，并且用免疫染色和Western印迹鉴定。
免疫细胞化学将细胞培养在13mm盖片上(Nalge Nunc International)。包括γ-分泌素酶抑制剂(Sigma)的各种处理后，将细胞用4％多聚甲醛固定并用1％BSA封闭。然后将细胞用0.2％BSA中的一抗保温1小时，随后是Cy3-标记的或Cy2-标记的二抗(Sigma)。用荧光封片剂(DAKO)封片后，用Leica DM RXA2荧光显微镜观察细胞。用相同光学参数拍照以确保可对比的发光度。取3个独立实验的至少10个不同视野用来计算表现NICD转移或分化的细胞的百分比。用Adobe PhotoshopTM(Jack et al，2001)定量从至少3个独立实验的200个细胞的荧光强度，并用Leica Qfluoro软件测定细胞质面积。原始数据用Student’s t检验分析，p＜0.05和p＜0.01分别被认为有显著或非常显著的差异。
为检测NF200，GFAP和Gal-C的一抗，使用Alexa Fluor 488-偶联的抗小鼠IgG或Alexa Fluor 546-偶联的抗兔IgG(1∶1500；Molecular Probes)。对于转染的NSC，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将细胞首先用质粒caN1，DTX-D2，dnN1转染，并在无生长因子的无血清培养基中用或不用NB-3处理24小时，然后允许细胞在1％胎牛血清培养基中在13mm盖片上分化。
细胞粘附和排斥实验此实验按照以前描述的进行(Xiao et al，1996)。简言之，将35mm组织培养皿(Becton Dickinson)用甲醇溶解的硝酸纤维素(Lagenaur and Lemmon，1987)包被并在无菌通风橱内风干。然后将蛋白(2.5μl的12μM F3-Fc，CHL1-Fc，或不同亚克隆的Notch1细胞外片段)置于这些平皿上并在37℃，湿润空气中保温2小时。随后，将平皿用无钙镁的Hank’s平衡盐溶液(CMF-HBSS)洗涤3次，并用CMF-HBSS中2％热灭活无脂肪酸的BSA封闭过夜(排斥实验跳过此封闭步骤)。然后将平皿再洗涤一次，并将各自细胞，例如OLN-93，小鼠Notch1转染的Hela细胞(Logeat et.al.，1998)，F3-转染的CHO细胞，和NB-3-转染的CHO细胞以1.5×106cells/ml在2ml化学限制性培养基中铺平皿。0.5小时(粘附实验)或12小时(排斥实验)后，将平皿用CMF-HBSS轻轻洗涤3次，并将细胞用CMF-HBSS中的2.5％戊二醛(glutaldehyde)固定。粘附的封闭应用抗F3(Gennarini et al，1991；1∶100)，多克隆抗-Notch1(Mitsiadis et al，1995；1∶200)和抗-Notch2(Mitsiadis et al，1995；1∶200)的抗体进行。将粘附于各种斑点的细胞拍照并计数。结果用Student’s t检验分析，p＜0.05和p＜0.01分别被认为有显著或非常显著的差异。
Western印迹分析收集F3，TAx，TAG-1和模拟-转染的CHO细胞与OLN-93细胞共培养物，在含有蛋白酶抑制剂混合片的PBS中用超声裂解。于4℃，100,000g离心1小时后，将沉淀用2％Triton X-100溶解。随后，细胞的膜部分，大约每种细胞系20μg蛋白，用SDS-PAGE(8％凝胶，Laemmli，1970)和Western印迹(Towbin et al，1979)分析，分析使用下列物质的抗体Notch1，Notch2，Notch3，髓磷脂相关糖蛋白，MAG(Yang et al，1999)和蛋白脂质蛋白(PLP)(Jung et al，1996)。
发育性表达类型的Western印迹分析从Wistar大鼠E17的胚胎或P0至P21新生鼠切下脑干。将标本在9倍体积的还原性样品缓冲液中匀浆，并煮沸5分钟。将每份10μl的匀浆物进行Western印迹。用ECL Western印迹系统(Amersham Biosciences)进行检测。
融合蛋白重组F3-Fc，Jagged1-Fc和CHL1-Fc融合蛋白的生产。将用人IgG Fc取代GPI锚的编码小鼠F3的cDNA重组子插入带有扩增启动序列(APS)的pDx的Hind III-Not I位点(Hemann et al，1994)，并导入Ltk-/-细胞。按照描述纯化Fc融合蛋白(Shimizu et al，1999)。
重组NB-3-His融合蛋白的生产。在HEK293细胞中生产可溶性的NB-3重组蛋白，NB-3-His。将大鼠NB-3cDNA编码GPI锚的信号序列区域用跟有终止密码子的6个His取代。将如此处理的NB-3cDNA插入pREP4的Hind III和BamHI位点之间，将所得的载体转染入HEK293细胞。当表达NB-3-His的细胞达到汇合时，将其在无血清培养基中培养1周。收集培养基，用50mM NaH2PO4，300mM NaCl，pH 8.0浓缩并透析。向透析液中加入Ni-NTA树脂(Qiagen)并保温至少30分钟。应用50mM NaH2PO4，300mMNaCl，250mM咪唑(imidazole)将NB-3重组蛋白从Ni-NTA树脂上洗脱。
Notchl GST融合蛋白的生产。Notch1 GST融合蛋白的生产已有描述(Huet al，2003)。包括小鼠Notch1(mN1)细胞外结构域的不同区域的重组蛋白如下生产。加入Hind III和BspE1位点(下面有下划线的)的引物用来在聚合酶链式反应中扩增mN1 cDNA的区域(Jeffrey Nye博士惠赠)。
N1.1正向5’-GGTGGAATTCTAATGCCACGGCTCCTG-3’反向5’-TTGAAGTTCCTCATCCGTGTTGATTT-3’N1.2正向5’-TGTGGAATTCTATGTGATCTGGGTGCC-3’反向5’-CGTCAAGTTCGTCATCGATGTCACTCT-3’N1.3正向5’-CTTGGAATTCTATGTGCTACCAGCCCC-3’反向5’-TTGAAGCTTGCCATTGATGACTGACT-3’N1.4正向5’-ACTGGAATTCTATGCCATCCCCCCCTT-3’反向5’-AAGGAAGCTTCTGCGAGGGCAGCGGAG-3’
扩增的区域是N1.1(核苷酸79-1557；1478bp片段编码氨基酸27-519；EGF重复1-13)，N1.2(核苷酸1324-2808；1484bp片段编码氨基酸442-936；EGF重复11-24)，N1.3(核苷酸2575-4008；1433bp片段编码氨基酸859-1336；EGF重复22-34)，和N1.4(核苷酸3751-5247；1496bp片段编码氨基酸1251-1749；EGF重复32-36，LNR重复)。用pGEX-KG载体生产重组的GST融合蛋白并按照描述进行纯化(Xiao et al，1996)。
在存在1mM MgCl2情况下进行质粒DNA的PCR。循环为首先5个循环为93℃保持1min，45℃保持30s和72℃保持1min；随后30个循环是93℃保持1min，50℃保持30s和72℃保持1min；末轮延伸用72℃保持5min。将这些扩增片段分别用于构建载体pN1.1，pN1.2，pN1.3，和pN1.4，其通过在它们延长的HindIII和BspEI位点限制性酶切，并连接到相同消化的pGEX-KG载体上。将转化的大肠杆菌JM 109细胞用IPTG诱导，并用谷胱甘肽-琼脂糖珠纯化表达的GST-N1.1，-N1.2，-N1.3，和-N1.4融合蛋白。
重组的NB-3-Fc蛋白的生产。用跟随终止密码子的人IgG Fc取代GPI锚的信号序列。将如此处理的cDNA插入pREP4的Hind III和BamHI位点之间，并转染至293T细胞。用蛋白A-琼脂糖珠(Roche)从条件培养基中纯化NB-3-Fc。
免疫组织化学深麻醉后，将成年Wistar大鼠经心脏用Ringer’s盐水灌流，随后用0.1M磷酸盐缓冲液(PB；pH 7.4)中的4％多聚甲醛灌流。收获脑干部分并在转移入含有15％蔗糖的0.1M PB中过夜之前进行后固定2小时。将组织在O.C.T.化合物(Tissue-Tek)中冷冻，并将矢状面冰冻切片(10μm)收集在明胶包被的玻片上。对于免疫染色，将切片在37℃干燥30分钟，然后浸于冷丙酮(-20℃)中15分钟以增强通透性。用0.1M PB中的10％山羊血清溶液于室温30分钟封闭非特异结合位点。在包括加抗体的每步中间，用含有0.3％TritonX-100的0.1M PBS洗涤制备物3次，每次5分钟。所有抗体用0.1M PB稀释。将切片双标记。一般将组织切片首先用多克隆一抗保温过夜，随后是山羊抗兔二抗。然后将切片暴露于单克隆一抗并用抗小鼠二抗标记。为检测，使用盖片并在Zeiss激光共聚焦显微镜上观察切片。
免疫共沉淀和GST拖曳实验按照描述(Xiao et al，1996)制备大鼠脑膜标本并用抗体偶联的蛋白A琼脂糖珠(Roche)或结合GST-N1.1，N1.2，N1.3或N1.4的谷胱甘肽-琼脂糖珠(Sigma)于4℃保温过夜。用SDS-PAGE样品缓冲液将俘获的蛋白从珠上洗脱，进行Western印迹并用ECL试剂(Amersham)检测。
按照描述(Xiao et al，1996)制备NSC和大鼠脑膜部分，并用NB-3-Fc和抗体偶联的蛋白A琼脂糖珠于4℃保温过夜。用SDS-PAGE样品缓冲液将俘获的蛋白从珠上洗脱，进行Western印迹并用ECL试剂检测。
Caspr的免疫沉淀。按照描述(Zeng et al，1999)制备的小鸡或小鼠脑裂解物(800μg)，与兔预免疫血清(PI)或抗Caspr血清和随后用蛋白A+G-Sepharose(Sigma)保温。将免疫沉淀物经SDS-PAGE洗涤，分离并用抗Caspr血清检测。对于免疫印迹，预免疫的和免疫的血清以1∶1000稀释度应用。
免疫共沉淀。按照以前的描述(Isom et al，1995)制备脑膜。将膜溶解于2％Triton X-100，并将可溶性部分与Notch抗体(抗-Notch1和抗-Notch2)4℃保温过夜。然后加入蛋白A Sepharose珠(1∶1悬液50μl)继续在4℃保温2小时或过夜。将珠用含有0.1％Triton X-100和蛋白酶抑制剂的50mM Tris HCL，pH 7.5洗涤。用SDS-PAGE样品缓冲液将免疫沉淀的蛋白从珠上洗脱，并在7.5％聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶上分离。将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，并用抗F3和NB-3的抗体检测。免疫反应条带的化学发光检测用ECL试剂完成。交互实验用抗-Notch1和抗-Notch2抗体检测用抗F3和抗NB-3获得的免疫沉淀物。
GST拖曳实验。按照生产商的说明将纯化的GST融合蛋白(mNotch 1.1，1.2，1.3和1.4)偶联于Sepharose 4B珠(Amersham Pharmacia Biotech Inc)。收获新鲜的成年大鼠大脑半球并溶解于2％Triton X-100。将匀浆物于13,000g离心60分钟。然后将澄清的裂解物与结合于珠上的GST融合蛋白室温保温45分钟。将珠用裂解缓冲液洗涤3次，并用SDS-PAGE凝胶样品缓冲液将蛋白洗脱，并在7.5％SDS-PAGE上分离，将蛋白转移到硝酸纤维素上，并用抗F3和NB-3的抗体通过Western印迹分析。
原代OL和OPC的培养发明者使用了一种神经胶质细胞分离技术，其中按照以前描述(Colelloand Sato-Bigbee，1998)用Percoll梯度离心分离少突胶质细胞。简言之，铺细胞前1小时，将培养皿(Falcon)用多聚左旋赖氨酸包被。断头处死出生后1-2天的大鼠，并将其大脑半球快速取出。用显微解剖镊小心撕去脑膜和血管。将半球转移至平皿中冰上预冷的HEPES/HBSS中，并用解剖刀片细细切碎。将组织转移到50ml圆锥形管中，并于200g离心5分钟，之后弃上清，并在再次离心前将细胞沉淀重悬于10μg/ml DNAase I的HEPES/HBSS中。迫使组织通过70μm尼龙网的Falcon细胞过滤器而制备单细胞悬液，应用于Percoll梯度，离心后回收含有少突胶质细胞的级分。将细胞悬液用HEPES/HBSS稀释，并通过不同的粘附分离少突胶质细胞。将用此方式获得的少突胶质细胞重悬于化学限制性DMEM/F12培养基中。
原代神经元，OL，和星形胶质细胞的培养。按照描述(Itoh，2002)分离并培养Wistar大鼠E17的神经元，OL和星形胶质细胞。P5-7Wistar大鼠小脑的OL通过Percoll梯度离心获得(Colello and Sato-Bigbee，1998)，并从P5-7Wistar大鼠视神经纯化OPC(Bogler，1997)。
NSC的培养。从14天龄BALB/c小鼠胚胎(IFFA Credo，L’Arbresle，France)分离小鼠纹状体神经干细胞，并用含有N2添加物和EGF(20ng/ml)(Invitogen)的DMEM/F12培养(Arsenijevic et al，2001)。为诱导分化，将脑半球机械分离成单细胞，并在无生长因子的培养基中用NB-3或Jagged1处理24小时，然后向培养基中加入1％胎牛血清。
实时RT-PCR分析用与前述细胞粘附实验相似的方式将原代少突胶质细胞铺于F3-Fc，NB-3-His和BSA的蛋白斑点上。培养2小时后，按照生产商的说明使用QIAGEN RNAeasy试剂盒提取总RNA。用TaqMan RT试剂盒(AppliedBiosystems)将总RNA(0.5μg)逆转录。为测量mRNA的表达水平，我们用TaqMan系统在ABI PRISM 7700序列检测系统上进行实时定量PCR。所有引物和探针用Primer Express软件(ABI)设计。引物和探针序列如下。
髓磷脂相关糖蛋白(MAG)正向引物5’-ATCCTGGCCACGGTCATC-3’反向引物5’-CACACCAGTACTCCCCATCGT-3’Taqman探针5’-CAGCTGGAACTCCCTGCAGTGACG-3’蛋白脂质蛋白(PLP)
正向引物5’-AGGCCAACATCAAGCTCATTCT-3’反向引物5’-CGGGATGTCCTAGCCATTTTC-3’Taqman探针5’-CCAAACAATGACACACCCGCTCCA-3’按照生产商的说明进行每个靶基因和GAPDH RNA的独立扩增。每个转录本的相对表达水平用ABI用户手节描述的使用比较的CT的方法判断。
用QIAGEN Rneasy试剂盒从OL或OLN细胞提取总RNA，并用无Rnase的DNaseI(Invitrogen)处理以除去基因组DNA。用SuperScript第一链合成系统(Invitrogen)(Notch同源物，Hes1)或TaqMan RT Kit(Applied Biosystems)(MAG)使用随机六聚体引物将样品逆转录。用β-肌动蛋白(actin)和GAPDH作为内参照。用SYBR Green PCR Master Mix(Notch同源物，Hes1)或TaqMan系统(MAG)在ABI PRISM 7700序列检测系统上进行实时PCR。用PrimerExpress软件(ABI)设计引物和Taqman探针，并且如果需要可以给出序列。来自至少4个独立实验的原始数据通过使用比较的CT方法(ABI用户手册)用来判定每个转录本的相对表达水平。
脂筏实验此实验按照描述(Krmer et al，1999)的进行。
Hes1荧光素酶报道基因测定将12孔平皿中的OLN细胞(1.5×105/孔)用于Hes1荧光素酶报道基因测定。将细胞用Lipofectamine和Lipofectamine Plus试剂(Invitrogen)瞬时转染。每孔接受0.2μg pGvB/Hes1 Hes1荧光素酶报道基因质粒连同各种表达质粒(0.1或0.2μg caN1；0.3或0.6μg RBP-J，dn-RBP-J-myc，DTX1，DTX1-D1-HA，DTX1-D2-Flag)。包括作为内对照的β-半乳糖苷酶表达质粒pCMV/β-Gal以监测转染的效率。转染24小时后将细胞裂解并用Steady-Glo Luciferase Assay试剂盒(Promega)测定。来自至少4个独立实验的原始数据用来判定相对的报道基因活性。
按照描述(Hu et al，2003)进行NSC实验。简言之，将24孔平皿中的NSC用所示构建体使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)瞬时转染。共转染表达β-半乳糖苷酶的pCMV/β-Gal以监测转染的效率。转染24小时后用Steady-GloLuciferase Assay Kit(Promega)将细胞进行荧光素酶测定。来自至少4个独立实验的原始数据用来判定相对的报道基因活性。
流式细胞术分析将细胞用胰蛋白酶消化，PBS洗涤并用FACSPerm(Becton Dickinson)处理。将细胞用抗MAP2(2a+2b)抗体，GFAP，CNPase和FITC-偶联的抗小鼠IgG1和抗兔IgG，然后用安装有CELLQuest软件版本(Becton Dickinson)的流式细胞仪(FACScalibur，Becton Dickinson)分析。
发明第一方面的参考文献Ahn，M.，D.S.Min，J.Kang，K.Jung，and T.Shin.2001.Increased expression of phospholipaseD1 in the spinal cords of rats with experimental autoimmune encephalomyelitis.Neurosci.Lett.31695-98.
Ang，B.T.，M.Karsak，S.Lee，Y.Takeda，U.Lendahl，G.Rougon，A.Israel，M.Schachner，K.Watanabe，and Z.C.Xiao.2001.Notch is a receptor for F3/contactin and NB-3a paranodal axon-glialsignaling mechanism during myelination.Soc.Neurosci.Abst.900.5Barres，B.A.，and M.C.Raff.1999.Axonal control of oligodendrocyte development.J. CellBiol.1471123-1128.
Bhat，M.A.，J.C.Rios，Y.Lu，G.P.Garcia-Fresco，W.Ching，M.St Martin，J.Li，S.Einheber，M.Chesler，J.Rosenbluth，J.L.Salzer，and H.J.Bellen.2001.Axon-glia interactions and the domainorganization ofmyelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin.Neuron.30369-383.
Boyle，M.E.，E.O.Berglund，K.K.Murai，L. Weber，E.Peles，and B.Ranscht.2001.Contactinorchestrates assembly of the septate-like junctions at the paranode in myelinated peripheral nerve.Neuron.30385-97.
Brittis，P.A.，and J.G.Flanagan.2001.Nogo domains and a Nogo receptorimplication foraxon regeneration.Neuron.3011-14.
Buttiglione，M，J.M.Revest，O.Pavlou，D.Karagogeos，A.Furley，G.Rougon，and C.Faivre-Sarrailh.1998.A functional interaction between the neuronal adhesion molecules TAG-1andF3 modulates neurite outgrowth and fasciculation of cerebellar granule cells.J Neurosci.186853-6870.
Charles，P.，S.Tait，C.Faivre-Sarrailh，G.Barbin，F.Gunn-Moore，N.Denisenko-Nehrbass，A.M.Guennoc，J.A.Girault，P.J.Brophy，and C.Lubetzki.2002.Neurofascin is a glial receptor for theparanodin/Caspr-contactin axonal complex at the axoglial junction.Curr.Biol.12217-220.
Chen，M.S.，A.B.Huber，M.E.van der Haar，M.Frank，L.Schnell，A.A.Spillmann，F.Christ，and M.E.Schwab.2000.Nogo-A is a myelin-associated neurite outgrowth inhibitor and an antigen formonoclonal antibody IN-1.Nature.403434-439.
Coetzee，T.，Fujita，N.，Dupree，J.，Shi，R.，Blight，A.，Suzuki，K.，Suzuki，K.，Popko，B.1996.Myelination in the absence of galactocerebroside and sulfatidenormal structure with abnormalfunction and regional instability.Cell.86(2)209-219.
Dawson，M.R.，Levine，J.M.，and Reynolds，R.2000.NG2-expressing cells in the centralnervous systemare they oligodendroglial progenitors？J.Neurosci.Res.61，471-479.
Dupree，J.L.，J.A.Girault，and B.Popko.1999.Axo-glial interactions regulate the localizationofaxonal paranodal proteins.J.Cell Biol.1 471145-1152.
Einheber，S.，G.Zanazzi，W.Ching，S.Scherer，T.A.Milner，E.Peles，and J.L.Salzer.1997.The axonal membrane protein Caspr，a homologue of neurexin IV，is a component of the septate-likeparanodal junctions that assemble during myelination.J.Cell Biol.1391495-1506.
Faivre-Sarrailh，C.，F.Gauthier，N.Denisenko-Nehrbass，A.Le Bivic，G.Rougon，and J A.Girault.2000.The glycosylphosphatidyl inositol-anchored adhesion molecule F3/contactin is requiredfor surface transport of paranodin/contactin-associated protein(caspr).J. Cell Biol.149491-502.
Fournier，A.E.，T.GrandPre，and S.M.Strittmatter.2001.Identification of a receptor mediatingNogo-66 inhibition of axonal regeneration.Nature.409341-346.
Gennarini，G.，P.Durbec，A.Boned，G.Rougon，and C.Goridis.1991.Transfected F3/F11neuronal cell surface protein mediates intercellular adhesion and promotes neurite outgrowth.Neuron.6595-606.
Girault，J.A.，and Peles，E.2002.Development of nodes of Ranvier.Curr Opin Neurobiol.12(5)476-485.
Gollan，L.，H.Sabanay，S.Poliak，E.O.Berglund，B.Ranscht，and E.Peles.2002.Retention of acell adhesion complex at the paranodal junction requires the cytoplasmic region of Caspr.J.Cell Bio.1571247-1256GrandPre，T.，F.Nakamura，T.Vartanian，and S.M.Strittmatter.2000.Identification of theNogo inhibitor of axon regeneration as a reticulon protein.Nature.403439-444.
Guan，K.L.，and J.E.Dixon.1991.Eukaryotic proteins expressed in Escheridhia colianimproved thrombin cleavage and purification procedure of fusion proteius with glutathioneS-transferase.Anal.Biochem.192262-267.
Hu，W.H.，O.N.Hausmann，M.S.Yan，W.M.Walters，P.K.Wong，and J.R.Bethea.2002.Identification and characterization of a novel Nogo-interacting mitochondrial protein(NIMP).J.Neurochem.8136-45.
Huber，A.B.，O.Weinmann，C.Brosamle，T.Oertle，and M.E.Schwab.2002.Pattern of NogomRNA and protein expression in the developing and adult rat and after CNS lesions..J.Neurosci.223553-3567.
Hunt，D.，M.Mason，G.Campbell，R.Coffin，and P.Anderson.2002.Nogo receptor mRNAexpression in intact and regenerating CNS neurons.Mol.Cell.Neurosci.20537.
Ishibashi，T.，J.L.Dupree，K.Ikenaka，Y.Hirahara，K.Honke，E.Peles，B.Popko，K.Suzuki，H.Nishino，and H.Baba.2002.A myelin galactolipid，sulfatide，is essential for maintenance of ionchannels on myelinated axon but not essential for initial cluster formation.J. Neurosci.226507-6514.
Kazarinova-Noyes，K.，J.D.Malhotra，D.P.McEwen，L.N.Mattei，E.O.Berglund，B.Ranscht，S.R.Levinson，M.Schachner，P.Shrager，L.L.Isom，and Z.C.Xiao.2001.Contactin associates withNa+ channels and increases their functional expression.J.Neurosci.217517-7525.
Krmer，E.M.，C.Klein，T.Koch，M.Boytinck，and J.Trotter.1999.Compartmentation of Fynkinase with glycosylphosphatidylinositol-anchored molecules in oligodendrocytes facilitates kinaseactivation during myelination.J.Biol.Chem.27429042-29049.
Lee，S.，Y.Takeda，H.Kawano，H.Hosoya，M.Nomoto，D.Fujimoto，N.Takahashi，and K.Watanabe.2000.Expression and regulation of a gene encoding neural recognition molecule NB-3 ofthe contactin/F3 subgroup in mouse brain.Gerie.245253-66.
Lei，G.，Xue，S.，Chéry，N.，Liu，Q.，Xu，J.，Kwan，C.L.，Fu，Y.P.，Lu，Y.M.，Liu，M.，Harder，K.W.，Yu，X.M.2002.Gain control of N-methyl-D-aspartate receptor activity by receptor-like protein tyrosinephosphatase α.EMBO J.21(12)2977-2989.
Liu，H.，C.E.Ng，and B.L.Tang.2002.Nogo-A expression in mouse central nervous systemneurons.Neurosci.Lett.328257-260.
Marcus，J.，J.L.Dupree，and B.Popko.2000.Effects of galactolipid elimination onoligodendrocyte development and myelination.Glia.30319-328.
Menegoz，M.，P.Gaspar，M.Le Bert，T.Galvez，F.Burgaya，C.Palfrey，P.Ezan，F.Arnos，andJ.A.Girault.1997.Paranodin，a glycoprotein of neuronal paranodal membranes.Neuron.19319-331.
Nakahira，K.，Shi，G.，Rhodes，K.J.，Trimmer，J.S.1996.Selective interaction of voltage-gated K+channel β-subunits with α-subunits.J.Bio.Chem.271(12)7084-7089.
Pedraza，L.，J.K.Huang，and D.R.Colman.2001.Organizing principles of the axoglialapparatus.Neuron.30335-344.
Peles，E.，K.Joho，G.D.Plowman，and J.Schlessinger.1997.Close similarity betweenDrosophila neurexin IV and mammalian Caspr protein suggests a conserved mechanism for cellularinteractions.Cell.88745-746.
Poliak，S.，L.Gollan，R.Martinez，A.Custer，S.Einheber，J.L.Salzer，J.S.Trimmer，P.Shrager，and E.Peles.1999.Caspr2，a new member of the neurexin superfamily，is localized at thejuxtaparanodes of myelinated axons and associates with K+channels.Neuron.241037-47.
Poliak，S.，Gollan，L.，Salomon，D.，Berglund，E.O.，Ohara，R.，Ranscht，B.，Peles，E.2001.Localization of Caspr2 in myelinated nerves depends on axon-glia interactions and the generation ofbarriers along the axon.J.Neurosci.21(19)7568-7575.
Popko B.2000.Myelin galactolipidsmediators of axon-glial interactions？Glia.29149-153.
Prinjha，R.，S.E.Moore，M.Vinson，S.Blake，R.Morrow，G.Christie，D.Michalovich，D.L.Simmons，and F.S.Walsh.2000.Inhibitor of neurite outgrowth in humans.Nature.403383-384.
Rasband，M.N.，and P.Shrager.2000.Ion channel sequestration in central nervous systemaxons.J.Physio.52563-73.
Rasband，M.N.，and J.S.Trimmer.2001a.Developmental clustering of ion channels at and nearthe Node of Ranvier.Dev.Biol.2365-16.
Rasband，M.N.，and J.S.Trimmer.2001b.Subunit composition and novel localization of K+channels in spinal cord.J. Comp.Neurol.429166-176.
Rasband，M.N.，J.S.Trimmer，E.Peles，S.R.Levinson，and P.Shrager.1999.K+channeldistribution and clustering in developing and hypomyelinated axons of the optic nerve.J.Neurocytol.28319-331.
Rasband，M.N.，J.S.Trimmer，T.L.Schwarz，S.R.Levinson，M.H.Ellisman，M.Schachner，and P.Shrager.1998.Potassium channel distribution，clustering，and function in remyelinating rataxons.J. Neurosci.1836-47.
Scherer，S.S.，and E.J.Arroyo.2002.Recent progress on the molecular organization ofmyelinated axons.J.Peripher.Nerv.Syst.71-12.
Spiegel，I.，D.Salomon，B.Erne，N.Schaeren-Wiemers，and E.Peles.2002.Caspr3 and caspr4，two novel members of the caspr family are expressed in the nervous system and interact with PDZdomains.Mol.Cell Neurosci.20283-297.
Swanborg，R.H.2001.Experimental autoimmune encephalomyelitis in the ratlessons in T-cellimmunology and autoreactivity.Immunol Rev.184129-135.
Taketomi，M.，N.Kinoshita，K.Kimura，M.Kitada，T.Noda，H.Asou，T.Nakamura，and C.Ide.2002.Nogo-A expression in mature oligodendrocytes of rat spinal cord in association with specificmolecules.Neurosci.Lett.33237.
Tait，S.，F.Gunn-Moore，J.M.Collinson，J.Huang，C.Lubetzki，L.Pedraza，D.L.Sherman，D.R.Colman，and P.J.Brophy.2000.An oligodendrocyte cell adhesion molecule at the site of assemblyofthe paranodal axo-glial junction.J. Cell Biol.150657-666.
Trimmer，J.S.1991 Immunological identification and characterization of a delayed rectifier K+channel polypeptide in rat brain.Proc Natl Acad Sci U S A.88(23)10764-10768.
Vabnick，I.，and Shrager，P.1998.Ion channel redistribution and function during development ofthe myelinated axon.J Neurobiol.37(1)80-96.
Vabnick，I.，J.S.Trimmer，T.L. Schwarz，S.R.Levinson，D.Risal，and P.Shrager.1999.Dynamic potassium channel distributions during axonal development prevent aberrant firing patterns.J.Neurosci.19747-758.
Wang，X.，S.J.Chun，H.Treloar，T.Vartanian，C.A.Greer，and S.M.Strittmatter.2002.Localization of Nogo-A and Nogo-66receptor proteins at sites of axon-myelin and synaptic contact.J.Neurosci.225505-5515.
Woolf，C.J.2003.No Nogonow where to go？Neuron.38(2)153-156Xiao，Z.C.，J.Taylor，D.Montag，G.Rougon，and M.Schachner.1996.Distinct effects oftenascin-R domains in neuronal cell functions and identification ofthe domain interacting with theneuronal recognition molecule F3/F11.Eur.J.Neurosci.8766-782.
发明第二方面的参考文献Arsenijevic，Y.，Weiss，S.，Schneider，B.&Aebischer，P.2001.J.Neurosci.21，7194-7202.
Artavanis-Tsakonas，S.，Rand，M.D.and Lake，R.J.1999.Notch signallingcell fate controland signal integration in deve lopment.Science 284，770-776.
Arroyo，E.J.and Scherer，S.S.2000.On the molecular architecture of myelinated fibres.Histochem.Cell Biol.113，1-18.
Baker，N.E.2000.Notch signalling in the nervous system.Pieces still missing from the puzzle.BioEssays 22，264-273.
Barres，B.A.&Raff，M.C.1999.Axonal control of oligodendrocyte development.J.Cell Biol.147，1123-1128Baumgartner，S.，Littleton，J.T.，Broadie，K.，Bhat，M.A.，Harbecke，R.，Lengyel，J.A.，Chiquet-Ehrismann，R.，Prokop，A.and Bellen，H.J.1996.A drosophila neurexin is required forseptate junction and blood-nerve barrier formation and function.Cell 87，1059-1068.
Berglund，E.O.，Murai，K.K.，Fredette，B.，Serkekova，G.，Marturano，B.，Weber，L.，Mugnaini，E.and Ranscht，B.1999 Ataxia and abnormal cerebellar microorganization in mice with ablatedcontactin gene expression.Neuron 24，739-750.
Bogler，O.1997.Isolation and purification of primary oligodendrocyte precursors.In CurrentProtoco ls in Neuroscience.3.4.1-3.4.9(John Wiley & Sons，Inc).
Bosio，A.，Bussow，H.，Adam，J.and Stoffel，W.1998.Galactosphingolipids and axonal-glialinteraction in myelin ofthe central nervous system.Cell Tissue Res.292，199-210.
Boyle，M.E.T.，Berglund，E.O.，Murai，K.K.，Weber，L.，Peles，E.and Ranscht，B.2001.Contactin orchestrates assembly of the septate-like junctions at the paranode in myelinated peripheralnerve.Neuron 30，385-387.
Brennan，K.，and Gardner，P.2002.Notching up another pathway.Bioessays 24，405-410.
Coetzee，T.，Fujita，N.，Dupree，J.，Shi，R.，Blight，A.，Suzuki，K.and Popko，B.1996.Myelination in the absence of galactocerebroside and sulfatidenormal structure with abnormalfunction and regional iustability.Cell 86，209-219.
Colello，R.J.and Sato-Bigbee，C.1998.Purifcation of oligodendrocytes and their progenitorsusing immunomagnetic separation and percoll gradient centrifugation.InCurrent Protocols inNeuroscience(Crawley，J.N.et.al.eds.).John Wiley and Sons，Inc.，pp.3.12.7-3.12.10.
Dale，J.K.，and Maroto，M.2003.A HES1-based oscillator in cultured cells and its potentialimplicatious for the segmentation clock.Bioessays 25，200-203.
Dawson，M.R.，Levine，J.M.，and Reynolds，R.2000.NG2-expressing cells in the centralnervous systemare they oligodendroglial progenitors？J.Neurosci.Res.61，471-479Denisenko-Nehrbass，N.，Faivre-Sarrailh，C.，Goutebroze，L.and Girault，J.-A.2002.Amolecular view on paranodal junctions of myelinated fibres.J.Physiology(Paris)96，99-103.
Dugas，J.C.，Milligan，B.D.and Barres，B.A.2001.Ouset of myelination is triggered by targetinnervation.Soc.Neurosci.Abst.900.4.
Ebiuu，J.O.，and Yankner，B.A.2002.A RIP tide in neuronal signal transduction.Neuron 34，499-502.
Einheber，S.，Zanazzi，G.，Ching，W.，Scherer，S.，Milner，T.A.，Peles，E.and Salzer，J.L.1997.The axonal membrane protein Caspr，a homologue of neurexin IV，is a component of the septate-likeparanodal junctions that assemble during myelination.J.Cell Biol.139，1495-1506.
Ellisen，L.W.，Bird，J.，West，D.C.，Soreng，A.L.，Reynolds，T.C.，Smith，S.D.and Sklar，J.1991.TAN-1，the human homolog of the drosophila Notch gene，is broken by chromosomaltranslocations in T lymphoblastic neoplasms.Cell 66，649-661.
Faivre-Sarrailh，C.，Gauthier，F.，Denisenko-Nehrbass，N.，Le Bivic，A.，Rougon，G.and Girault，J.A.2000.The glycosylphosphatidyl inositol-anchored adhesion molecule F3/contactin is required forsurface transport of paranodin/contactin-associated protein(caspr).J.Cell Biol.149，491-502.
Furley，A.J.，Morton，S.B.，Manalo，D.，Karagogeos，D.，Dodd，J.and Jessell，T.M.1990.Theaxonal glycoprotein TAG-1 is an immunoglobulin superfamily member with neuriteoutgrowth-promoting activity.Cell 61，157-170.
Furukawa，T.，Mukherjee，S.，Bao，Z.Z.，Morrow，E.M.，and Cepko，C.L.2000.rax，HES1，andNotchl promote the formation of Muller glia by postnatal retinal progenitor cells.Neuron 26，383-394.
Gaiano，N.，Nye，J.S.and Fischell，G.2000.Radial glial identitiy is promoted by Notch1signalling in the murine forebrain.Neuron 26，395-404.
Gennarini，G.，Cibelli，G.，Rougon，G.，Mattei，M.G.and Gorodis，C.1989.The mouse neuronalcell surface protein F3a phosphatidyl-inositol anchored member of the immunoglobulin superfamilyrelated to chicken contactin.J.Cell Biol.109，775-788.
Gennarini，G.，Durbec，P.，Boned，A.，Rougon，G.and Goridis，C.1991.Transfected F3/F11neuronal cell surface protein mediates intercellular adhesion and promotes neurite outgrowth.Neuron 6，595-606.
Genoud，S.，Lappe-Siefke，C.，Goebbels，S.，Radtke，F.，Aguet，M.，Scherer，S.S.，Suter，U.，Nave，K.A.，and Mantei，N.2002.Notch l control of of ogodendrocyte differentiation in the spinal cord.J.Cell Biol.158，709-18.
Girault，J.A.，and Peles，E.2002.Development of nodes of Ranvier.Curr.Opin.Neurobiol.12，476-485.
Guan，K.L.and Dixon，J.E.1991.Eukaryotic proteins expressed in Escherichia colianimproved thrombin cleavage and purification procedure of fusion proteins withglutathione-S-transferase.Anal.Biochem.192，262-267.
Harlow，Ed.，David，L. 1998.Immunizations.In Antibodies A Laboratory Manual.53-244(ColdSpring Harbor Laboratory).
Hemann，C.，Gartner，E.，Weidle，U.H.and Grummt，F.1994.High-copy expression vectorbased on amplification-promoting sequences.DNA Cell Biol.13，437-445.
Hirata，H.，Yoshiura，S.，Ohtsuka，T.，Bessho，Y.，Harada，T.，Yoshikawa，K.，and Kageyama，R.2002.Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop.Science298，840-843.
Hojo，M.，Ohtsuka，T.，Hashimoto，N.，Gradwohl，G.，Guillemot，F.，and Kageyama，R.2000.Glial cell fate specification modulated by the hHLH gene HES5 in mouse retina.Development 127，2515-2522.
Holm，J.，Hillenbrand，R.，Steuber，V.，Bartsch，U.，Moos，M.，Lubbert，H.，Montag，D.and，Schachher，M.1996.Structural features of a close homologue of L1(CHL 1)in the mousea newmember of the L1 family of neural recognition molecules.Eur.J.Neurosci.8，1613-29.
Hoover，K.B.and Bryant，P.J.2000.The genetics of the protein 4.1 familyorganizers of themembrane and cytoskeleton.Curr.Opin.Cell Biol.12，229-234.
Hu，Q.D.，Ang，B.T.，Karsak，M.，Hu，W.P.，Cui，X.Y.，Duka，T.，Takeda，Y.，Chia，W.，Natesan，S.，Ng，Y.K.，Ling，E.A.，Maciag，T.，Small，D.，Trifonova，R.，Kopan，R.，Okano，H.，Nakafuku，M.，Chiba，S.，Hirai，H.，Aster，J.C.，Schachner，M.，Pallen，C.J.，Watanabe，K.，and Xiao，Z.C.2003.F3/Contactin acts as a functional ligand for Notch during oligodendrocyte differentiation.Cell(inpress).
Huppert，S.S.，Le，A.，Schroeter，E.H.，Mumm，J.S.，Saxena，M.T.，Milner，L.A.，and Kopan，R.2000.Embryonic lethality in mice homozygous for a processing-deficient allele of Notch1.Nature 405，966-970.
Isom，L.L.，Ragsdale，D.S.，De Jongh，K.S.，Westenbroek，R.E.，Reber，B.F.，Scheuer，T.andCatterall，W.A.1995.Structure and function of the beta 2 subunit of brain sodium channels，atransmembrane glycoprotein with a CAM motif.Cell 83，433-442.
Itoh，K.2002.Culture of oligodendrocyte precursor cells(NG2+/O1-)and oligodendrocytes(NG2-/O1+)from embryonic rat cerebrum.Brain Res.Brain Res.Protoc.10，23-30.
Izon，D.J.，Aster，J.C.，He，Y.，Weng，A.，Karnell，F.G.，Patriub，V.，Xu，L.，Bakkour，S.，Rodriguez，C.，Allman，D.，and Pear，W.S.2002.Deltexl redirects lymphoid progenitors to the B celllineage by antagonizing Notch1.Immunity 16，231-243.
Jack，C.，Berezovska，O.，Wolfe，M.S.，and Hyman，B.T.2001.Effect of PS1 deficiency and anAPP gamma-secretase inhibitor on Notch1 signaling in primary mammalian neurons.Brain Res.Mol.Brain.Res.87，166-174.
John，G.R.，Shankar，S.L.，Shafit-Zagardo，B.，Massimi，A.，Lee，S.C.，Raine，C.S.，and Brosnan，C.F.2002.Multiple sclerosisRe-expression of a developmental pathway that restricts oligodendrocytematuration.Nat.Med.8，1115-1121.
Joutel，A.，Vahedi，K.，Corpechot，C.，Troesch，A.，Chabriat，H.，Vayssiere，C.，Cruaud，C.，Maciazek，J.，Weissenbach，J.，Bousser，M.G.，Bach，J.F.and Tournier-Lasserve，E.1997 Strongclustering and stereotyped nature of Notch3 mutations in CADASIL patients.Lancet 350，1511-1515.
Jung，M.，Sommer，I.，Schachner，M.and Nave，K.A.1996.Monoclonal antibody O10 defines aconformationally sensitive cell-surface epitope of proteolipid protein(PLP)evidence that PLPmisfolding underlies dysmyelination in mutant mice.J.Neurosci.16，7920-7929.
Kabos，P.，Kabosova，A.，and Neuman，T.2002.Blocking HES1 expression initiates GABAergicdifferentiation and induces the expression of p21(CIP1/WAF1)in human neural stem cells.J.Biol.Chem.277，8763-8766.
Kaneta，M.，Osawa，M.，Sudo，K.，Nakauchi，H.，Farr，A.G.，and Takahama，Y.2000.A role forpref-1 and HES-1in thymocyte development.J.Immunol.164，256-264.
Kato，H.，Tanigachi，Y.，Kurooka，H.，Minoguchi，S.，Sakai，T.，Nomura-Okazaki，S.，Tamura，K.，and Honjo，T.1997.Involvement of RBP-J in biological functions of mouse Notch1 and itsderivatives.Development 124，4133-4141.
Kazarinova-Noyes，K.，Malhotra，J.D.，McEwen，D.P.，Mattei，L.N.，Berglund，E.O.，Ranscht，B.，Levinson，S.R.，Schachner，M.，Shrager，P.，Isom，L.L.，and Xiao，Z.C.2001.Contactin associates withNa+ channels and increase their functional expression.J.Neurosci.21，7517-7525.
Kishi，N.，Tang，Z.，Maeda，Y.，Hirai，A.，Mo，R.，Ito，M.，Suzuki，S.，Nakao，K.，Kinoshita，T.，Kadesch，T.，Hui，C.，Artavanis-Tsakonas，S.，Okano，H.，and Matsuno，K.2001.Murine homologs ofdeltex define a novel gene family involved in vertebrate Notch signaling and neurogenesis.Int.J.Dev.Neurosci.19，21-35.
Klein，C.，Kramer，E.M.，Cardine，A.M.，Schraven，B.，Brandt，R.，and Trotter，J.2002.Processoutgrowth of oligodendrocytes is promoted by interaction of fyn kinase with the cytoskeletal proteintau.J.Neurosci.22，698-707.
Koch，T.，Brugger，T.，Bach，A.，Gennarini，G.and Trotter，J.1997.Expression of theimmunoglobulin superfamily cell adhesion molecule F3 by oligodendrocyte-lineage cells.Glia 19，199-212.
Kramer，E.M.，Klein，C.，Koch，T.，Boytinck，M.，and Trotter，J.1999.Compartmentation of Fynkinase with glycosylphosphatidylinositol-anchored molecules in oligodendrocytes facilitates kinaseactivation during myelination.J Biol Chem.274，29042-29049.
Laemmli，U.K.1970.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head ofbacteriophage T4.Nature 277，680-685.
Lagenaur，C.and Lemmon，V.1987.An L1-like molecule，the 8D9 antigen，is a potent substratefor neurite extension.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7753-7757.
Lardelli，M.，Dahlstrand，J.，and Lendahl，U.1994.The novel Notch homologue mouse Notch3lacks specific epidermal growth factor-repeats and is expressed in proliferating neuroepithelium.Mech.Dev.46，123-136.
Lee，S.，Takeda，Y.，Kawano，H.，Hosoya，H.，Nomoto，M.，Fujimoto，D.，Takahashi，N.andWatanabe，K.2000.Expression and regulation of a gene encoding neural recognition molecule NB-3ofthe contactin/F3 subgroup in mouse brain.Gene 245，253-266.
Logeat，F.，Bessia，C.，Brou，C.，LeBail，O.，Jarriault，S.，Seidah，N.G.and Israel，A.1998.TheNotch1 receptor is cleaved constitutively by a furin-like convertase.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，8108-8112.
Martin-Collinson，J.，Marshall，D.，Stewart Gillespie，C.and Brophy，P.J.1998.Transientexpression of neurofascin by oligodendrocytes at the onset of myelinogenesisImplications formechanisms of axon-glial interaction.Glia 23，11-23.
Martinez Arias，A.，Zecchini，V.，and Brennan，K.2002.CSL-independent Notch signalingacheckpoint in cell fate decisions during development？Curr.Opin.Genet.Dev.12，524-533.
Mathis，C.，Denisenko-Nehrbass，N.，Girault，J.A.and Borrelli，E.2001.Essential role ofoligodendrocytes in the formation and maintenance of central nervous system nodal regions.Development.128，4881-90.
Matsuno，K.，Ito，M.，Hori，K.，Miyashita，F.，Suzuki，S.，Kishi，N.，Artavanis-Tsakonas，S.，Okano，H.2002.Involvement of a proline-rich motif and RING-H2 finger of Deltex in the regulation ofNotch signaling.Development 129，1049-1059.
Menegoz，M.，Gaspar，P.，Le Bert，M.，Galvez，T.，Burgaya，F.，Palfrey，C.，Ezan，P.，Amos，F.and Girault，J.A.1997.Paranodin，a glycoprotein of neuronal paranodal membranes.Neuron 19，319-331.
Mitsiadis，T.A.，Lardelli，M.，Lendahl，U.and Thesleff，I.1995.Expression of Notch 1，2 and 3 isregulated by epithelial-mesenchymal interactions and retinoic acid in the developing mouse tooth andassociated with determination of ameloblast cell fate.J.Cell Biol.130，407-18.
Morell，P.and Quarles，R.H.1999.Myelin formation，structure and biochemistry.InBasicNeurochemistry-molecular，cellular and biochemical aspects，6thedition(Siegel，G.J.et.al.eds.).Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，pp.69-93.
Morrison，S.J.，Perez，S.E.，Qiao，Z.，Verdi，J.M.，Hicks，C.，Weinmaster，G.and Anderson，D.J.2000.Transient Notch activation initiates an irreversible switch from neurogenesis to gliogenesis byneural crest stem cells.Cell 101，499-510.
Mumm.J.S.and Kopan，R.2000.Notch signallingFrom the outside in.Dev.Biol.228，151-165.
Pedraza，L.，Huang，J.K.and Colman，D.R.(2001)Organizing principles of the axoglialapparatus.Neuron 30，335-344.
Peles，E.and Sal zer，J.2000.Molecular domains of myelinated axons.Curr.Opinion Cell Biol.10，558-565.
Pluchino，S.et al.2003.Nature 422，688-694.
Rand，M.D.，Grimm，L.M.，Artavanis-Tsakonas，S.，Patriub，V.，Blacklow，S.C.，Sklar，J.，andAster，J.C.2000.Calcium depletion dissociates and activates heterodimeric Notch receptors.Mol.Cell.Biol.2O，1825-1835.
Rebay，R.J.，Fleming，R.G.，Fehon，R.G.，Cherbas，L.，Cherbas，P.and Artavanis-Tsakanos，S.1991.Specific EGF repeats of Notch mediated interactions with SerTateImplications for Notch as amultifunctional receptor.Cell 67，687-699.
Revest，J.M.，Faivre-Sarrailh，C.，Schachner，M.，and Rougon，G.1999.Bidirectional signalingbetween neurons and glial cells via the F3 neuronal adhesion molecule.Adv.Exp.Med.Biol.468，309-318.
Richter-Landsberg，C.and Heinrich，M.1996.OLN-93A new permanent oligodendroglia cellline derived from primary rat brain glial cultures.J.Neurosci.Res.45，161-173.Rios，J.C.，Melendez-Vasquez，C.V.，Einheber，S.，Lustig，M.，Grumet，M.，Hemperly，J.，Peles，E.and Salzer，J.L.2000.Contactin-associated protein(Caspr)and contactin form a complex that istargeted to the paranodal junctions during myelination.J.Neurosci.20，8354-8364.
Robey，E.，Chang，D.，Itano，A.，Cado，D.，Alexander，H.，Lans，D.，Weinmaster，G.and Salmon，P.1996.An activated form of Notch influences the choice between CD4and CD8T cell lineages.Cell87.483-492.
Rosenbluth，J.1995.Glial membranes and axoglial junctions.InNeuroglia(Kettenmann，H.and Ransom，B.R.eds).Oxford University Press，New York.pp 613-633.
Sakurai，T.，Lustig，M.，Nativ，M.，Hemperly，J.J.，Schlessinger，J.，Peles，E.，and Grumet，M.1997.Induction of neurite outgrowth through contactin and Nr-CAM by extracellular regions of glialreceptor tyrosine phosphatase beta.J.Cell Biol.136，907-918.
Salzer，J.L. 1997.Clustering sodium channels at the node of RanvierClose encounters of theaxon-glia kind.Neuron 18，843-846.
Sauvageot，C.M.& Stiles，C.D.2002.Curr.Opin.Neurobiol.12，244-249.Schnaldelbach，O.，Ozen，I.，Blashuk，O.W.，Gour，B.J.，Meyer，R.L.and Fawcett，J.W.2001.N-Cadherin is involved in axon-oligodendrocytecontact and myelination.Mol.Cell.Neurosci.17，1084-1093.
Schroeter，E.H.，Kisslinger，J.A.，and Kopan，R.1998.Notch-1 signalling requiresligand-induced proteolytic release of intracellular domain.Nature 393，382-386.
Schwab，M.E.and Schnell，L.1989.Region-specific appearance of myelin constituents in thedeveloping rat spinal cotd.J.Neurocytol.18，161-169.
Shimazaki，K.，Hosoya，H.，Takeda，Y.，Kobayashi，S.，and Watanabe，K.1998.Age-relateddecline of F3/contactin in rat hippocampus.Neurosci.Lett.245，117-20.
Shimizu，K.，Chiba，S.，Kumano，K.，Hosoya，N.，Takahashi，T.，Kanda，Y.，Hamada，Y.，Yazaki，Y.，and Hirai，H.1999.Mouse jaggedl physically interacts with notch2 and other notch receptors.Assessment by quantitative methods.J.Biol.Chem.274，32961-32969.
Small，D.，Kovalenko，D.，Kacer，D.，Liaw，L.，Landriscina，M.，Di Serio，C.，Prudovsky，I.，andMaciag，T.2001.Soluble Jagged 1 represses the function of its transmembrane form to induce theformation of the Src-dependent chord-like phenotype.J.Biol.Chem.276，32022-32030.
Tait，S.，Gunn-Moore，F.，Collinson，J.M.，Huang，J.，Lubetzki，C.，Pedraza，L.，Sherman，D.L.，Colman，D.R.and Brophy P.J.2000.An oligodendrocyte cell adhesion molecule at the site ofassembly of the paranodal axo-glial junction.J.Cell Biol.150，657-666.
Tanigaki，K.，Nogaki，F.，Takahashi，J.，Tashiro，K.，Kurooka，H.，and Honjo，T.2001.Notch1and Notch3 instructively restrict bFGF-responsive multipotent neural progenitor cells to an astroglialfate.Neuron 29，45-55.
Towbin，H.，Staehelin，T.and Gordon，J.1979.Electrophoretic transfer of proteins frompolyacrylamide gels to nitrocellulose sheetsprocedure and some applications.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76，4350-4354.
Tsiotra，P.C.，Karagogeos，D.，Theodorakis，K.，Michaelidis，T.M.，Modi，W.S.，Furley，A.J.，Jessel，T.M.and Papamatheakis，J.1993.Isolation of the cDNA and chromosomal localization of thegene(TAX1)encoding the human axonal glycoprotein TAG-1.Genomics 18，562-567.
Umemori，H.，Sato，S.，Yagi，T.，Aizawa，S.，and Yamamoto，T.1994.Initial events ofmyelination involve Fyn tyrosine kinase signalling.Nature 367，572-576.
Wakamatsu，Y.，Maynard，T.M.，and Weston，J.A.2000.Fate determination of neural crest cellsby NOTCH-mediated lateral inhibition and asymmetrical cell division during gangliogenesis.Development 127，2811-2821.
Wang，S.，Sdrulla，A.D.，diSibio，G.，Bush，G.，Nofziger，D.，Hicks，C.，Weinmaster，G.andBarres，B.A.1998.Notch receptor activation inhibits oligodendrocyte differentiation.Neuron 21，63-75.
Ward，R.E.，Lamb，R.S.and Fehon，R.G.1998.A conserved functional domain of drosophilacoracle is required for localization at the septate junction and has membrane-organizing activity.J.CellBiol.140，1463-1473.
Weinmaster，G.2000.Notch signal transductiona real rip and more.Curr.
Opin.Gen.Dev.10，363-369.
Wintergerst，E.S.，Fuss，B.and Bartsch，U.1993.Localization of janusin mRNA in the centralnervous system of the developing and adult mouse.Eur.J.Neurosci.5,299-310.
Xiao，Z.C.，Taylor，J.，Montag，D.，Rougon，G.and Schachner，M.1996.Distinct effects oftenascin-R domains in neuronal cell functions and identification of the domain interacting with theneuronal recognition molecule F3/11.Eur.J.Neurosci.8，766-782.
Xiao，Z.C.，Bartsch，U.，Margolis，R.K.，Rougon，G.，Montag，D.，and Schachner M.1997.Isolation of a tenascin-R binding protein from mouse brain membranes.A phosphacan-relatedchondroitin sulfate proteoglycan.J.Biol.Chem.272，32092-32101.
Xiao，Z.C.，Hillenbrand，R.，Schachher，M.，Thermes，S.，Rougon，G.and Gomez，S.1997.Signalling events following the interaction of the neuronal adhesion molecule F3 with the N-terminaldomain of tenascin-R.J.Neurosci.Res.49，698-709.
Xiao，Z.C.，Revest，J.M.，Laeng，P.，Rougon，G.，Schachner，M.and Montag，D.1998.Defasciculation of neurites is mediated by tenascin-R and its neuronal receptor F3/11.J.Neurosci.Res.52，390-404.
Yamamoto，N.，Yamamoto，S.，Inagaki，F.，Kawaichi，M.，Fukamizu，A.，Kishi，N.，Matsuno，K.，Nakamura，K.，Weinmaster，G.，Okano，H.，and Nakafuku，M.2001.Role of Deltex-1 as atranscriptional regulator downstream of the Notch receptor.J.Biol.Chem.276，45031-45040.
Yang，H.，Xiao，Z.C.，Becker，B.，Hillenbrand，R.，Rougon，G.and Schachner，M.1999.Rolefor myelin-associated glycoprotein as a functional tenascin-R receptor.J.Neurosci.Res.55，687-701.
Zeng，L.，D′Alessandri，L.，Kalousek，M.B.，Vaughan，L.and Pallen，C.J.1999.Protein tyrosinephosphatase alpha(PTPα)and contactin form a novel neuronal receptor complex linked to theintracellular tyrosine kinase fyn.J.Cell Biol.147，707-714.
序列表<110>新加坡综合医院有限公司(Singapore General Hospital Pte Ltd)Forrest，Graham RXiao，Zhi-Cheng<120>用于治疗中枢神经系统损伤与疾病的NOGO，CASPR，F3，NB-3<130>GRF6193338<140>PCT/GB 03/05329<141>2003-12-05<150>US 60/431,549<151>2002-12-06<150>US 60/480,138<151>2003-06-20<160>33<170>PatentIn version 3.1
<210>1<211>1192<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Met Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser Pro1 5 10 15Pro Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Arg Glu Pro Glu20 25 30Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp35 40 45Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly Leu Ser50 55 60Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly Ala Pro Leu Met Asp65 70 75 80Phe Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala85 90 95Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Asp Pro Ser Pro100 105 110Val Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Val115 120 125
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<213>人工序列<220>
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<223>引物
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<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(891〉..(891)<223>Xaa是不确定的<400>15Met Pro Pro Leu Leu Ala Pro Leu Leu Cys Leu Ala Leu Leu Pro Ala1 5 10 15Leu Ala Ala Arg Gly Pro Arg Cys Ser Gln Pro Gly Glu Thr Cys Leu20 25 30Asn Gly Gly Lys Cys Glu Ala Ala Asn Gly Thr Glu Ala Cys Val Cys35 40 45Gly Gly Ala Phe Val Gly Pro Arg Cys Gln Asp Pro Asn Pro Cys Leu50 55 60Ser Thr Pro Cys Lys Asn Ala Gly Thr Cys His Val Val Asp Arg Arg65 70 75 80Gly Val Ala Asp Tyr Ala Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe Ser Gly Pro85 90 95Leu Cys Leu Thr Pro Leu Asp Asn Ala Cys Leu Thr Asn Pro Cys Arg100 105 110Asn Gly Gly Thr Cys Asp Leu Leu Thr Leu Thr Glu Tyr Lys Cys Arg115 120 125
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Val Asp Asp Glu Gly Pro Gln Pro Lys Lys Val Lys Ala Glu Asp1760 1765 1770Glu Ala Leu Leu Ser Glu Glu Asp Asp Pro Ile Asp Arg Arg Pro1775 1780 1785Trp Thr Gln Gln His Leu Glu Ala Ala Asp Ile Arg Arg Thr Pro1790 1795 1800Ser Leu Ala Leu Thr Pro Pro Gln Ala Glu Gln Glu Val Asp Val1805 1810 1815Leu Asp Val Asn Val Arg Gly Pro Asp Gly Cys Thr Pro Leu Met1820 1825 1830Leu Ala Ser Leu Arg Gly Gly Ser Ser Asp Leu Ser Asp Glu Asp1835 1840 1845Glu Asp Ala Glu Asp Ser Ser Ala Asn Ile Ile Thr Asp Leu Val1850 1855 1860Tyr Gln Gly Ala Ser Leu Gln Ala Gln Thr Asp Arg Thr Gly Glu1865 1870 1875Met Ala Leu His Leu Ala Ala Arg Tyr Ser Arg Ala Asp Ala Ala1880 1885 1890Lys Arg Leu Leu Asp Ala Gly Ala Asp Ala Asn Ala Gln Asp Asn1895 1900 1905Met Gly Arg Cys Pro Leu His Ala Ala Val Ala Ala Asp Ala Gln1910 1915 1920
Gly Val Phe Gln Ile Leu Ile Arg Asn Arg Val Thr Asp Leu Asp1925 1930 1935Ala Arg Met Asn Asp Gly Thr Thr Pro Leu Ile Leu Ala Ala Arg1940 1945 1950Leu Ala Val Glu Gly Met Val Ala Glu Leu Ile Asn Cys Gln Ala1955 1960 1965Asp Val Asn Ala Val Asp Asp His Gly Lys Ser Ala Leu His Trp1970 1975 1980Ala Ala Ala Val Asn Asn Val Glu Ala Thr Leu Leu Leu Leu Lys1985 1990 1995Asn Gly Ala Asn Arg Asp Met Gln Asp Asn Lys Glu Glu Thr Pro2000 2005 2010Leu Phe Leu Ala Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Glu Ala Ala Lys Ile2015 2020 2025Leu Leu Asp His Phe Ala Asn Arg Asp Ile Thr Asp His Met Asp2030 2035 2040Arg Leu Pro Arg Asp Val Ala Arg Asp Arg Met His His Asp Ile2045 2050 2055Val Arg Leu Leu Asp Glu Tyr Asn Val Thr Pro Ser Pro Pro Gly2060 2065 2070Thr Val Leu Thr Ser Ala Leu Ser Pro Val Ile Cys Gly Pro Asn2075 2080 2085
Arg Ser Phe Leu Ser Leu Lys His Thr Pro Met Gly Lys Lys Ser2090 2095 2100Arg Arg Pro Ser Ala Lys Ser Thr Met Pro Thr Ser Leu Pro Asn2105 2110 2115Leu Ala Lys Glu Ala Lys Asp Ala Lys Gly Ser Arg Arg Lys Lys2120 2125 2130Ser Leu Ser Glu Lys Val Gln Leu Ser Glu Ser Ser Val Thr Leu2135 2140 2145Ser Pro Val Asp Ser Leu Glu Ser Pro His Thr Tyr Val Ser Asp2150 2155 2160Thr Thr Ser Ser Pro Met Ile Thr Ser Pro Gly Ile Leu Gln Ala2165 2170 2175Ser Pro Asn Pro Met Leu Ala Thr Ala Ala Pro Pro Ala Pro Val2180 2185 2190His Ala Gln His Ala Leu Ser Phe Ser Asn Leu His Glu Met Gln2195 2200 2205Pro Leu Ala His Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Ser Val Ser Gln2210 2215 2220Leu Leu Ser His His His Ile Val Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ala2225 2230 2235Gly Ser Leu Ser Arg Leu His Pro Val Pro Val Pro Ala Asp Trp2240 2245 2250
Met Asn Arg Met Glu Val Asn Glu Thr Gln Tyr Asn Glu Met Phe2255 2260 2265Gly Met Val Leu Ala Pro Ala Glu Gly Thr His Pro Gly Ile Ala2270 2275 2280Pro Gln Ser Arg Pro Pro Glu Gly Lys His Ile Thr Thr Pro Arg2285 2290 2295Glu Pro Leu Pro Pro Ile Val Thr Phe Gln Leu Ile Pro Lys Gly2300 2305 2310Ser Ile Ala Gln Pro Ala Gly Ala Pro Gln Pro Gln Ser Thr Cys2315 2320 2325Pro Pro Ala Val Ala Gly Pro Leu Pro Thr Met Tyr Gln Ile Pro2330 2335 2340Glu Met Ala Arg Leu Pro Ser Val Ala Phe Pro Thr Ala Met Met2345 2350 2355Pro Gln Gln Asp Gly Gln Val Ala Gln Thr Ile Leu Pro Ala Tyr2360 2365 2370His Pro Phe Pro Ala Ser Val Gly Lys Tyr Pro Thr Pro Pro Ser2375 2380 2385Gln His Ser Tyr Ala Ser Ser Asn Ala Ala Glu Arg Thr Pro Ser2390 2395 2400His Ser Gly His Leu Gln Gly Glu His Pro Tyr Leu Thr Pro Ser2405 2410 2415
Pro Glu Ser Pro Asp Gln Trp Ser Ser Ser Ser Pro His Ser Ala2420 2425 2430Ser Asp Trp Ser Asp Val Thr Thr Ser Pro Thr Pro Gly Gly Ala2435 2440 2445Gly Gly Gly Gln Arg Gly Pro Gly Thr His Met Ser Glu Pro Pro2450 2455 2460His Asn Asn Met Gln Val Tyr Ala2465 2470<210>17<211>17<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>17Cys Ile Ser Cys Gly Ala Pro Asp Lys Tyr Glu Ser Arg Glu Val Ser1 5 10 15Thr<210>18<211>33<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>18tccggatccc atggagccac aggatgtcat ttt 33<210>19<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>19tccggatccg tcgactggca catattcccc catga 35<210>20<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>20ggtggaattc taatgccacg gctcctg 27<210>21<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>21ttgaagttcc tcatccgtgt tgattt 26<210>22<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>22tgtggaattc tatgtgatct gggtgcc 27<210>23
<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>23cgtcaagttc gtcatcgatg tcactct 27<210>24<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>24cttggaattc tatgtgctac cagcccc 27<210>25<211>26<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>25ttgaagcttg ccattgatga ctgact 26<210>26<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>26actggaattc tatgccatcc ccccctt 27<210>27<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>27aaggaagctt ctgcgagggc agcggag 27
<210>28<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>28atcctggcca cggtcatc18<210>29<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>29cacaccagta ctccccatcg t21<210>30<211>24<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>Taqman探针<400>30cagctggaac tccctgcagt gacg 24<210>31<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>31aggccaacat caagctcatt ct 22<210>32<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>32cgggatgtcc tagccatttt c21
<210>33<211>24<212〉DNA<213>人工序列<220>
<223>Taqman探针<400>33ccaaacaatg acacacccgc tcca 2权利要求
1.一种组合物，其包括Nogo和Caspr，或其模拟物，或能促进Nogo和Caspr之间相互作用的物质，以及载体。
2.按照权利要求1的组合物，其中所述组合物包括Nogo和Caspr的复合物，或该复合物的模拟物。
3.按照权利要求1或权利要求2的组合物，其包括Nogo-66。
4.按照权利要求1至3任一项的组合物，其包括Caspr1。
5.按照权利要求1的组合物，其中能促进Nogo和Caspr之间相互作用的物质是抗体。
6.按照权利要求5的组合物，其中所述抗体既能与Nogo又能与Caspr结合。
7.按照权利要求1至6任一项的组合物，其是药用组合物。
8.按照权利要求7的药用组合物，其被配制成用于体内注射的制剂。
9.按照权利要求8的药用组合物，其被配制成用于直接注射入CNS的制剂。
10.按照权利要求1至9任一项的组合物，其用于医学治疗方法中。
11.按照权利要求1至9任一项的组合物，其用于CNS损伤或疾病的治疗中。
12.按照权利要求1至9任一项的组合物，其用于SCI、MS、癫痫或卒中的治疗。
13.Nogo在制备用于治疗CNS损伤或疾病的药物中的用途，其中所述药物与Caspr或其模拟物联用给药。
14.Caspr在制备用于治疗CNS损伤或疾病的药物中的应用，其中该药物与Nogo或其模拟物一起给药。
15.能促进Nogo与Caspr之间相互作用的物质在制备用于治疗CNS损伤或疾病药物中的应用。
16.刺激神经元轴突髓鞘形成的方法，其包括将神经元或少突胶质细胞与按照权利要求1至9任一项的组合物接触。
17.治疗患有中枢神经系统疾病或损伤的受试者的方法，其包括向该受试者给予按照权利要求7至9任一项的药用组合物。
18.按照权利要求17的方法，其中该受试者患有SCI，MS，癫痫或卒中。
19.筛选能调节Nogo和Caspr之间相互作用的物质的方法，所述方法包括将Nogo，Caspr与候选物质接触，并判断Nogo和Caspr之间的相互作用。
20.按照权利要求19的方法，其进一步包括在缺乏该候选物质但其它条件相似的情况下将Nogo和Caspr接触，并测定Nogo和Caspr之间的相互作用。
21.按照权利要求19或权利要求20的方法，其包括将Nogo和Caspr的复合物与候选物质接触。
22.按照权利要求19至21的任一项的方法，其中Nogo和Caspr之一存在于细胞内或细胞上。
23.按照权利要求22的方法，其中所述Nogo和Caspr之一由导入了该细胞的载体表达。
24.按照权利要求19至23的任一项的方法，其中Nogo和Caspr之一被固定在固体支持物。
25.生产药用制剂的方法，其包括，按照权利要求19至24任一项的方法鉴定能调节Nogo和Caspr之间相互作用的物质后，将所述物质与可药用的载体配制在一起的另一步骤。
26.按照权利要求25的方法，其包括优化所述物质以用于体内给药的另一步骤。
27.刺激少突胶质细胞或其前体分化的方法，其包括将该少突胶质细胞或前体与F3、NB-3、或者F3或NB3之一的模拟物接触。
28.刺激神经元髓鞘形成的方法，其包括将少突胶质细胞，其前体或神经元与F3、NB-3、或者F3或NB3之一的模拟物接触。
29.按照权利要求27或权利要求28的方法，其包括将适宜的少突胶质细胞，其前体或神经元与F3及NB-3，或其模拟物接触。
30.按照权利要求29的方法，其中F3和NB-3作为复合物存在。
31.按照权利要求27至30任一项的方法，其中F3，NB-3或其模拟物结合于少突胶质细胞或其前体表面的Notch。
32.按照权利要求31的方法，其中所述结合诱导Notch信号。
33.按照权利要求32的方法，其中所述结合诱导Notch1或Notch2信号。
34.按照权利要求32或权利要求33的方法，其中所述Notch信号经由Deltex-1。
35.按照权利要求27至34任一项的方法，其中所述前体是少突神经胶质前体细胞(OPC)或神经干细胞(NSC)。
36.按照权利要求35的方法，其中该方法在体外或离体进行。
37.按照权利要求36的方法，其中在该接触步骤后，将所述OPC或NSC导入患有中枢神经系统疾病或损伤的受试者。
38.按照权利要求37的方法，其中所述受试者患有SCI，MS，癫痫或卒中。
39.组合物，其包括F3和NB-3，或其模拟物，以及载体。
40.按照权利要求39的组合物，其包括F3和NB-3的复合物，或其模拟物。
41.按照权利要求39或权利要求40的组合物，其是药用组合物。
42.按照权利要求41的组合物，其被制剂成用于体内注射的制剂。
43.按照权利要求42的组合物，其被制剂成用于直接注射入CNS的制剂。
44.按照权利要求39至43任一项的组合物，其用于医学治疗方法中。
45.按照权利要求39至43任一项的组合物，其用于CNS损伤或疾病的治疗。
46.按照权利要求39至43任一项的组合物，其用于SCI，MS，癫痫或卒中的治疗。
47.F3和/或NB-3在制备用于治疗CNS损伤或疾病的药物中的用途。
48.F3在制备用于治疗CNS损伤或疾病的药物中的用途，其中所述药物与NB-3或其模拟物联用给药。
49.NB-3在制备用于治疗CNS损伤或疾病的药物中的用途，其中所述药物与F3或其模拟物联用给药。
50.刺激神经元轴突的髓鞘形成的方法，其包括将神经元或少突胶质细胞与按照权利要求39至43任一项的组合物接触。
51.治疗患有中枢神经系统疾病或损伤的受试者的方法，其包括向受试者给予按照权利要求41至43任一项的药用组合物。
52.按照权利要求51的方法，其中所述受试者患有SCI，MS，癫痫或卒中。
53.筛选能调节Notch和F3和/或NB-3之间相互作用的物质的方法，所述方法包括将F3和/或NB-3，Notch与候选物质接触，并测定Notch与F3和/或NB-3之间的相互作用。
54.按照权利要求53的方法，进一步包括在缺乏该候选物质但其它条件相似的情况下，将Notch与F3和/或NB-3接触，并测定Notch与F3和/或NB-3之间的相互作用。
55.按照权利要求53或权利要求54的方法，其包括将Nothch与F3和/或NB-3的复合物与候选物质接触。
56.按照权利要求53至55的任一项的方法，其中F3，NB-3或Notch之一存在于细胞内或细胞上。
57.按照权利要求56的方法，其中所述F3，NB-3或Notch之一由被导入该细胞的载体表达。
58.按照权利要求56至57的任一项的方法，其中Notch存在于细胞表面，并且该方法包括测定Notch信号。
59.按照权利要求58的方法，包括测定经由Deltex-1的Notch信号。
60.按照权利要求53至59任一项的方法，其中F3，NB-3或Notch之一被固定在固体支持物。
61.生产药用制剂的方法，其包括，按照权利要求53至59任一项的方法鉴定能调节Notch与F3和/或NB-3之间相互作用的物质后，将该物质与可药用的载体配制在一起的另一步骤。
62.按照权利要求61的方法，其包括优化该物质以用于体内给药的另一步骤。
全文摘要
本申请提供促进CNS神经元轴突的髓鞘形成的物质和方法。它们源于一些发现，第一个是在轴突胶质连接的建立和维持中分子Nogo与Caspr相互作用，其次是分子F3和NB－3能通过与Notch相互作用促进少突胶质细胞的成熟。提供的物质与方法可能用于CNS损伤的治疗，所述CNS损伤具体是脊髓损伤，多发性硬化，癫痫和卒中。
文档编号A61P25/08GK1744911SQ200380109565
公开日2006年3月8日 申请日期2003年12月5日 优先权日2002年12月6日
发明者肖志诚 申请人:新加坡综合医院有限公司