专利名称：一种真菌胞外多糖复合物的制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从天然冬虫夏草中分离的真菌—中国弯颈霉(Tolypocladium sinense)胞外多糖复合物的制备方法及其药物用途，特别是将其制成治疗肿瘤等疾病的药物或保健食品，属于生物制药技术领域。
背景技术：
冬虫夏草(简称虫草)是我国特有的名贵中药，是一种传统的滋补良药。它是虫草真菌寄生在鳞翅目昆虫幼虫上的结合体。天然虫草通常生长在青海，西藏和四川的高山之上，非常稀少，其资源已濒于匮乏，所以价格也十分昂贵。研究已证实昆虫只是为真菌提供了生长所需要的营养，因而采用人工培养的虫草真菌来替代天然虫草已成趋势。近来已有报道，人工培养的虫草菌在抗氧化以及其它生物活性方面能发挥与天然虫草相同的功效，目前已有数种其它的人工培养虫草菌开发成产品。然而，这些培养物在被应用时多数只是将培养所获得的菌丝体全部成分同时服用。而虫草菌含有各种不同药用价值的天然成分，其功效并不相同，同时入药，效果不明显，药效慢。
中国弯颈霉是从天然虫草中分离出的真菌之一。有关该真菌的研究和应用，国外尚未有报道，国内有少数有关该菌株的报道主要集中在该菌培养条件的探讨、化学成分的初步分析以及代谢成分环孢菌素的研究等。至于该真菌多糖组分的研究和开发利用，尤其是它分泌至菌体外的胞外多糖的提取以及生物活性的研究尚未见报道。
发明内容
由于目前肿瘤的治疗多数还是采用化学药物治疗，而这些化疗药物在抑制肿瘤生长的同时也会杀伤正常细胞，从而导致机体免疫力下降。中草药等天然物质其毒副作用小，不仅可作治疗和预防之用，而且同时还可以调节机体的免疫功能，从多方面抑制肿瘤的生长，这是大多数化疗药物所无法比拟的。为此，本发明提供一种由中国弯颈霉培养液中分离得到的多糖复合物及其制备方法，以及在抗肿瘤和免疫调节方面的应用。该多糖复合物具有抑制肿瘤生长和转移，提高免疫功能等作用，其疗效稳定，安全可靠。
本发明的技术方案是1.以含蛋白胨，酵母粉，葡萄糖，KH2PO4和MgSO4的液体培养基发酵培养中国弯颈霉真菌，于摇床25～28℃，180r/min培养3天。
2.将发酵培养的虫草及其培养液过滤，收集发酵液并浓缩至小体积，然后加入乙醇沉淀，离心收集沉淀，采用Sevag法去蛋白，冷冻干燥即得胞外多糖复合物。用紫外光谱(UV)和红外光谱(IR)进行检测。
3.采用H22小鼠肝癌模型以及B16小鼠黑色素瘤转移模型测定胞外多糖复合物对肿瘤生长和转移的作用，同时测定其对荷瘤鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力、脾淋巴细胞增殖能力和NK细胞活性等免疫指标的影响。采用免疫组化方法测定该多糖复合物对肿瘤相关基因bcl-2表达的影响。该多糖可显著抑制肿瘤的生长和转移，降低肿瘤相关基因在肺和肝脏中的表达水平，提高腹腔巨噬细胞的吞噬能力，提高淋巴细胞的增殖能力以及脾脏NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。
本发明所述中国弯颈霉胞外多糖复合物对肿瘤的生长和转移具有显著的抑制作用，同时可提高机体的细胞免疫水平，增强机体抵抗肿瘤生长的能力，可用于制备预防和治疗肿瘤生长和转移以及减低肿瘤相关基因表达的药物或保健食品，用于制备因肿瘤等疾病引起的免疫低下患者的免疫调节药物或保健食品，其价格低廉、易于生产、疗效稳定、安全可靠。
四
图1，胞外多糖复合物紫外扫描图，该多糖在190～400nm的紫外吸收光谱显示在260nm和280nm处几乎未见核酸和蛋白质的紫外吸收峰，说明核酸和蛋白质在其中的含量很低。
图2，胞外多糖复合物红外光谱图，在3600～3200cm-1、3000～2800cm-1、1400～1000cm-1处有多糖特征性的吸收峰存在。
图3，Bcl-2在C57BL/6小鼠肺和肝脏中的表达。bcl-2在正常小鼠的肺和肝脏中没有表达(细胞质中未见棕色颗粒)，为阴性(A，F)；在肿瘤未治疗组小鼠的肺和肝脏以及低剂量组的肺中有非常强的阳性表达(B，G，C)；在低剂量组的肝脏和中剂量组肺中为弱阳性表达(H，D)；在中剂量组的肝脏和高剂量组的肺和肝脏中几乎未见表达(I，E，J)。
五具体实施例方式
实施例11.虫草菌的培养虫草真菌液体培养基1升中含蛋白胨5g，酵母粉10g，葡萄糖40g，KH2PO41g，MgSO40.5g，调pH7.0。
种子液培养100ml三角瓶装25ml虫草真菌液体培养基，每瓶接种一小块已活化的PDA平板菌丝块，于摇床25～28℃，180r/min培养3天。
发酵培养100ml三角瓶装25ml虫草真菌液体培养基，每瓶接种1ml种子液，于摇床25～28℃，180r/min培养3天。
2.胞外多糖的提取和检测以过滤法收集发酵液，并以3∶1浓缩至小体积，然后将浓缩液3000r/min离心10min，去沉淀，取上清液加入3倍体积95％的乙醇过夜，再以3000r/min，离心10min收集沉淀，自然干燥，采用Sevag法去蛋白，冷冻干燥即得胞外多糖复合物，得率为0.619g/L。其中多糖含量为65～80％；蛋白质含量为6～9％。该多糖在190～400nm的紫外吸收光谱显示在260nm和280nm处几乎未见核酸和蛋白质的紫外吸收峰(见附图1)，说明核酸和蛋白质在其中的含量很低。从红外光谱可以看出，在3600～3200cm-1、3000～2800cm-1、1400～1000cm-1处有多糖特征性的吸收峰存在(见附图2)，说明该物质确实是多糖成分。
3.动物实验小鼠肝癌(H22)模型30只ICR小鼠，雌雄各半，体重26±2g，随机分成5组。每只小鼠右腋下皮下接种0.2ml浓度为1.0×107个/ml的H22肿瘤细胞，按三个不同剂量腹部皮下连续给药7天，设正常对照组和肿瘤未治疗组。于第8天剥离皮下肿瘤并称重，采用中性红吞噬实验测定各组小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，用MTT法测定脾脏淋巴细胞的增殖能力和NK细胞的杀伤活性。
各剂量组对小鼠肿瘤生长的作用结果见表1。与肿瘤未治疗组相比，三个剂量的多糖复合物对皮下肿瘤的生长都有显著的抑制作用。
表1 胞外多糖复合物对小鼠皮下生长的肿瘤重量的影响(x±s)组别 剂量(mg/kg) 肿瘤重量 抑瘤率(100％)正常对照组 ---- ---- ----肿瘤未治疗组0 0.755±0.062 ----低剂量组15 0.306±0.081**59.5中剂量组30 0.304±0.082**59.7高剂量组60 0.373±0.095*50.6*p＜0.05，**p＜0.01，与肿瘤未治疗组相比较。
胞外多糖复合物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响见表2。三个剂量组与正常对照组和肿瘤未治疗组相比较，巨噬细胞的吞噬能力都有非常显著的提高。表2胞外多糖复合物对H22荷瘤鼠巨噬细胞吞噬中性红能力的影响(x±s)组别剂量(mg/kg) 吞噬中性红能力(OD540nm)正常对照组 0 0.845±0.029肿瘤未治疗组0 0.876±0.037低剂量组151.161±0.037###***中剂量组301.202±0.030###***高剂量组601.209±0.040###***###p＜0.001，与正常对照组相比较；***p＜0.001与肿瘤未治疗组相比较胞外多糖复合物各剂量组对脾脏淋巴细胞的增殖能力和NK细胞的杀伤活性的影响见表3。与正常对照相比，肿瘤未治疗组淋巴细胞增殖能力有显著降低；低剂量组虽然比肿瘤组有所提高，但比正常对照还是有显著降低；而中、高剂量组与正常对照相比没有显著差异，说明低剂量胞外多糖只能部分抵消因肿瘤而引起的淋巴细胞增殖能力的降低，中、高剂量组则能使其恢复至正常小鼠的水平。至于NK细胞对肿瘤细胞杀伤活性，三个剂量组的平均值都高于肿瘤未治疗组，中剂量组有显著性提高。
表3 胞外多糖复合物对小鼠淋巴细胞增殖能力和NK杀伤活性的影响(x±s)组别剂量(mg/kg)脾淋巴细胞 NK杀伤活性(％)增殖能力(OD570nm)正常对照组 0 0.655±0.04061.82±2.13肿瘤未治疗组0 0.508±0.020###61.61±2.75低剂量组15 0.608±0.034#***62.91±2.03中剂量组30 0.644±0.039***69.40±4.65##**高剂量组60 0.659±0.034***66.99±8.77#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001，与正常对照相比较；**p＜0.01，***p＜0.001，与肿瘤未治疗组相比较实施例21.同实施例1。
2.同实施例1。
3.动物实验小鼠黑色素瘤(B16)转移模型30只C57BL/6小鼠，20±2g，随机分成5组，每组6只，雌雄各半。于尾静脉接种B16肿瘤细胞，1.5×105/只。从接种当天起腹部皮下给药，同时设正常对照组和肿瘤不治疗组。三个剂量分别30，60，120mg/Kg，每两天一次，第28天全部处死小鼠，检测黑色素瘤在肺和肝脏中的转移程度，用中性红试验测定腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力、MTT法测脾淋巴细胞的增殖能力。用免疫组化方法测定肿瘤相关基因bcl-2在肺和肝脏内的表达水平。
胞外多糖复合物对B16在肺和肝脏中转移的影响见表4。与肿瘤未治疗组相比，多糖复合物可显著减低肿瘤在肺和肝脏的转移。
本多糖复合物还可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的功能(表5)并促进脾脏淋巴细胞的增殖(表6)。
表4 胞外多糖复合物对B16肺转移的影响(x±s)组别剂量转移灶数目 转移抑制率(％)(mg/kg)肺肝 肺 肝正常对照组 0 ---- -------- ----肿瘤未治疗组0 6.8±2.6 2.8±0.6---- ----低剂量组301.8±0.4 0.3±0.3**73.4 85.7中剂量组600.8±0.3*0***87.8 100高剂量组120 0.2±0.2*0***97.6 100*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与肿瘤未治疗组相比较表5 胞外多糖复合物对B16荷瘤鼠巨噬细胞吞噬能力的影响(x±s)组别剂量(mg/kg)吞噬中性红能力(OD540nm)正常对照组 0 0.7852±0.0708肿瘤未治疗组0 0.7555±0.0689低剂量组15 0.7990±0.0611中剂量组30 0.8350±0.0471**高剂量组60 0.9253±0.0601###***###p＜0.001，与正常对照组相比较；**p＜0.01，***p＜0.001与肿瘤未治疗组相比较表6 胞外多糖复合物对B16荷瘤鼠淋巴细胞增殖的影响(x±s)组别 剂量(mg/kg) 脾淋巴细胞增殖能力(OD570nm)正常对照组 0 0.562±0.035肿瘤未治疗组 0 0.558±0.029低剂量组 15 0.557±0.038中剂量组 30 0.611±0.033#*高剂量组 60 0.647±0.026###***#p＜0.05，###p＜0.001，与正常对照组比较；*p＜0.05，***p＜0.001与肿瘤未治疗组比较胞外多糖复合物还显著抑制bcl-2在肺和肝脏中的表达水平(见附图3)。bcl-2在正常小鼠的肺和肝脏中没有表达(细胞质中未见棕色颗粒)，为阴性(A，F)；在肿瘤未治疗组小鼠的肺和肝脏以及低剂量组的肺中有非常强的阳性表达(B，G，C)；在低剂量组的肝脏和中剂量组肺中为弱阳性表达(H，D)；在中剂量组的肝脏和高剂量组的肺和肝脏中几乎未见表达(I，E，J)。表明本发明的多糖复合物有明显的抗肿瘤作用。
权利要求
1.一种真菌胞外多糖复合物，其特征在于其中多糖含量为65～80％，蛋白质含量为6～9％，紫外扫描显示在260nm和280nm处未见明显的核酸和蛋白质的吸收峰，红外光谱显示，在3600～3200cm-1、3000～2800cm-1、1400～1000cm-1处有多糖特征性的吸收峰，在1650cm-1、1400cm-1、1240cm-1、880cm-1附近也有吸收峰。
2.制备权利要求1所述真菌胞外多糖复合物的菌种，其特征在于菌种发酵的液体培养基成分为1升培养基中含蛋白胨5g，酵母粉10g，葡萄糖40g，KH2PO41g，MgSO40.5g，pH7.0。
3.根据权利要求2所述产生胞外多糖复合物的菌种，其特征在于培养条件为25～28℃，180r/min震荡培养3天。
4.根据权利要求1所述真菌胞外多糖复合物的制备方法，其特征在于以过滤法收集发酵液，并以3∶1浓缩至小体积，离心去沉淀，取上清液加入3倍体积95％的乙醇过夜，离心收集沉淀，自然干燥，采用Sevag法去蛋白，冷冻干燥即得胞外多糖复合物。
5.根据权利要求1所述真菌胞外多糖复合物在制备预防和治疗肿瘤生长和转移以及减低肿瘤相关基因表达的药物或保健食品中的应用。
6.根据权利要求1所述真菌胞外多糖复合物在制备用于因肿瘤等疾病引起的免疫低下患者的免疫调节药物或保健食品中的应用。
全文摘要
本发明属于生物制药技术领域。从一种虫草真菌—中国弯颈霉的培养液中提取胞外多糖复合物，该多糖复合物含糖量为65～80％，含蛋白质6～9％，具有显著的抑制肿瘤生长和转移的功效，同时可提高机体免疫功能，可用于制备抗肿瘤药物和保健食品，其价格低廉、易于生产、疗效稳定、安全可靠。
文档编号A61P37/04GK1594587SQ20041004116
公开日2005年3月16日 申请日期2004年7月5日 优先权日2004年7月5日
发明者张伟云, 杨金宇, 陈佳萍, 施佩花 申请人:南京大学