专利名称：一种含有熊果苷的人参、西洋参及其制备方法
背景技术：
人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是五加科(Araliaceae)人参属(Panax)多年生草本植物，具有大补元气，复脉固脱，补脾益气，生精安神之功效。人参自古以来就是名贵药材，现代化学和药理学研究表明，人参具有提高免疫力，抗衰老，抗肿瘤等医疗作用。人参含有皂苷、糖类、蛋白质、多肽、氨基酸、维生素、挥发油、有机酸及酯等多种有机化合物和20多种矿物质等无机化合物成分。历来将人参皂苷列为人参的主要有效成分，已确定结构的已有40余种，但至今无法人工合成。由于人参及其活性成分具有多方面独特的药理作用，不仅临床医学上用于治疗各种疾病，而且在食品、饮料、化妆品等方面的应用也越来越广泛。
西洋参(Panaxquinque folium)原产于美国东部和加拿大，是五加科(Araliacaeae)人参属植物，属名贵药材，具益肺阴、清虚火、生津止渴之功效，用于肺虚久咳、失血、咽干口渴、虚热烦倦等的治疗。西洋参的主要活性成分为人参皂苷类化合物，多具有一定的生物活性，如人参皂苷Re能减少乙酰胆碱引起的豚鼠离体子宫的收缩，对大鼠有减慢心率和双相性血压(先升后降)作用，对猫的行为和脑电图显示中等程度的抑制作用；人参皂苷Rgl除具有与人参皂苷Re相似的生物活性外，尚可增强大鼠骨髓细胞DNA的生物合成，对蛋白质或脂质的生物合成亦有一定的增强作用。
熊果苷(Arbutin)，化学名称为对-羟基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷，是1930年从厚叶岩菜中分离得到的一种天然产物，是一个集“绿色”、“安全”、和“高效”概念于一体的皮肤美白活性物质。它能够迅速渗入肌肤，在不影响皮肤细胞增殖浓度的同时，有效的抑制皮肤中酪氨酸酶的活性，阻断黑色素的形成，通过自身与酶的结合，加速黑色素的分解，从而减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑。同时还有润肤、愈创、杀菌和协同抗炎的作用。天然熊果苷主要来自越橘(Vaccinicum vitisidaca L.)，熊果(Arcostapylos uva-ursi(L.)Spreng)和沙梨树(Pyrus pyrifolia(Brum.f.)Kakai)、腹水草(Veronicastrum.Stenostachyum(Hemsl)等植物，由于含量较低，从植物中提取熊果苷，成本很高，因此目前市场上所用的熊果苷大多是通过有机合成的途径获得，但有机合成又存在路线长、中间体有的不稳定、产物是混合物等问题。
技术问题人参以及熊果苷已经在化妆品中被应用，但是尚没有含有熊果苷的人参，本发明要解决的问题就是通过人参、西洋参处理外源氢醌，获得含有熊果苷的人参、西洋参。
技术方案本发明涉及通过人参、西洋参切片处理外源氢醌而生物合成熊果苷的方法。
本发明涉及含有熊果苷的人参、西洋参。
本发明涉及的生物合成培养基是含有2mmol/L外源氢醌的MS，1/2MS，1/4MS，B5，1/2B5或1/4B5培养基。
本发明涉及的人参、西洋参植物切片处理外源氢醌的方式有静置处理、通气处理或振摇处理盛有植物切片的生物合成培养基，或采用生物合成培养基对植物切片喷雾处理。
本发明涉及的人参、西洋参切片处理外源氢醌的时间为4-48小时。
影响因素的确定1.人参整体对生物合成熊果苷的影响生物合成条件生物合成培养基是含有2mmol/L外源氢醌的MS培养基，转速100r/min，人参整体处理外源氢醌的时间为24小时。
熊果苷的含量分析方法参见《人参毛状根生物合成熊果苷的研究》(中国中药杂志第26卷第12期，2001年12月，819-821)(下同)由表1显示，不同参龄人参整体都具备生物合成熊果苷的能力，但是与人参培养细胞和人参毛状根相比，人参整体具有较厚的皮层，难以大量吸收氢醌，所以其生物合成熊果苷的能力较弱。这显示进一步处理人参，其生物合成熊果苷的能力显著提高。
表1显示对于生物合成熊果苷的能力而言，一年生人参整体明显高于四年生、八年生人参，而四年和八年生人参差别不大。
表1不同参龄的人参对生物合成熊果苷的影响熊果苷含量 氢醌转化率样品 鲜重(g) 干重(g)(％) (％)一年生人参0.6540.1241.7326.750四年生人参5.8321.0450.2912.799八年生人参11.262.0440.3676.073
2.人参切片对生物合成熊果苷的影响生物合成条件生物合成培养基是含有2mmol/L外源氢醌的MS培养基，转速100r/min，人参切片处理外源氢醌的时间为24小时，表2显示不同参龄人参的切片都具备生物合成熊果苷的能力。
比较表2与表1对于生物合成熊果苷的能力而言，切片生物合成熊果苷的能力有显著影响，不同参龄人参的切片都明显强于其整体。
与人参整体相比，对于生物合成熊果苷的能力而言，人参的切片明显趋近于人参培养细胞和人参毛状根。
这是人参切片以后，其与培养基的接触面积显著扩大，更多的氢醌被吸收，氢醌转化率非显而易见的提高。
表2还显示切片部位对人参生物合成熊果苷的能力有显著影响，具体是主根切片的生物合成能力最强，侧根切片次之，须根切片最弱。
表2人参切片对生物合成熊果苷的影响熊果苷含量氢醌转化率参龄 切片部位 鲜重(g)干重(g)(％) (％)主根切片 5.228 1.243 1.211 55.32四年生人参侧根切片 5.095 1.054 1.246 48.27须根切片 0.806 0.154 0.748 4.219主根切片 5.034 0.940 1.426 44.05八年生人参侧根切片 5.053 0.881 1.161 37.60须根切片 0.783 0.136 1.075 5.3953.通气方式对生物合成熊果苷的影响生物合成条件生物合成培养基是含有2mmol/L外源氢醌的MS培养基，人参切片处理外源氢醌的时间为24小时。
表3显示通气方式对生物合成熊果苷有显著的影响。
在不同通气方式下，人参切片都具备生物合成熊果苷的能力，但存在显著差异。在静置状态下，人参切片生物合成熊果苷的能力较弱。在100r/min的振摇状态下，在4L/min的通气振摇状态下，人参切片生物合成熊果苷的能力显著提高。这说明培养基中的溶解氧对人参切片生物合成熊果苷的能力有显著影响。
表3通气方式对生物合成熊果苷的影响熊果苷含量氢醌转化率通气方式 样品鲜重(g)干重(g)(％) (％)主根切片5.228 1.243 1.211 55.32100r/min 侧根切片5.095 1.054 1.246 48.27须根切片0.806 0.154 0.748 4.219四主根切片5.130 1.143 1.066 44.32年通气速度生 侧根切片4.995 1.023 1.046 38.27人4L/min参 须根切片0.796 0.146 0.648 3.219主根切片5.135 1.201 0.797 35.20静置 侧根切片5.039 0.840 1.130 34.92须根切片*5.166 1.161 0.306 13.07主根切片5.034 0.940 1.426 44.05100r/min 侧根切片5.053 0.881 1.161 37.60须根切片0.783 0.136 1.075 5.395八主根切片 5.130 1.143 1.066 44.32年通气速度生4L/min 侧根切片 4.995 1.023 1.046 38.27人参须根切片 0.796 0.146 0.648 3.219主根切片 5.106 1.014 1.286 47.94静置侧根切片 5.122 0.946 0.407 13.99须根切片 0.783 0.136 1.075 5.395
4.含糖量对人参切片生物合成熊果苷的影响生物合成条件生物合成培养基是含有2mmol/L外源氢醌的含糖量不同的MS培养基人参切片处理外源氢醌的时间为24小时。
转速100r/min由表4显示在含糖量不同的MS培养基中，人参切片都具备生物合成熊果苷的能力，但存在显著差异。其中，以含糖量为60g/L的含有2mmol/L外源氢醌的MS培养基，熊果苷生物合成效果最好。
表4 MS的含糖量对人参切片生物合成熊果苷的影响含糖量熊果苷含量(％)氢醌转化率(％)0g/L 1.638 13.1915g/L 2.118 23.6330g/L 3.117 43.1060g/L 4.611 63.06120g/L5.638 83.425.通气条件对人参切片生物合成熊果苷的影响生物合成条件生物合成培养基是含有2mmol/L外源氢醌的MS培养基人参切片处理外源氢醌的时间为24小时。
使用空气增氧泵对培养基通气表5通气条件对熊果苷生物合成的影响通气条件1/min熊果苷含量(％)氢醌转化率(％)01.236 16.6812.279 33.3523.987 59.5535.638 83.1243.390 47.95
由表5显示厚度为0.5cm的500g人参切片，在含有2mmol/L外源氢醌的MS培养基中，在0-51/min的通气条件下，都具备生物合成熊果苷的能力，但存在显著差异。在41/min的通气条件下，其合成熊果苷的能力最强。
6.西洋参切片生物合成熊果苷由表6可见，西洋参具有生物合成熊果苷的能力。
表6西洋参切片的生物合成熊果苷熊果苷含量氢醌转化率转速 样品 鲜重 干重(％) (％)100r/min 主根切片 5.022 1.177 0.970642.00须根切片 0.5275 0.1060 0.51732.013主根切片 5.072 1.192 0.776234.020须根切片 5.060 1.111 0.423817.31注实验方法同人参切片对生物合成熊果苷的影响实施例实施例1人参的预处理从参地挖出的新鲜人参.，先用自来水冲洗掉表面的泥土，再用细毛刷将人参彻底清洗干净，将其分成主根、侧根、须根三个部分，主根和侧根均切成薄片，薄片的厚度为0.5cm。
生物合成培养基是含有2mmol/L外源氢醌的MS培养基。
生物合成方式1将上述薄片放入150ml的三角瓶中，加入50ml生物合成培养基，静置培养24h后收获。
实施例2人参的预处理方法、生物合成培养基同实施例1生物合成方式2将上述薄片放入150ml的三角瓶中，加入50ml生物合成培养基，在转速为100r/min的摇床上，悬浮培养24h后收获。
实施例3人参的预处理方法、生物合成培养基同实施例1生物合成方式3将上述薄片放入150ml的三角瓶中，加入50ml生物合成培养基，以4ml/min通气速度从下部通气，悬浮培养24h后收获。
实施例4人参的预处理方法同实施例1生物合成培养基是含有2mmol/L外源氢醌的MS培养基。
生物合成方式4用棉花垫在内径为3cm，长度为20cm的钢管底部，再采用一层薄片与一层棉花的方式叠放，共叠放10层薄片，叠实，加入100ml生物合成培养基，以4ml/min通气速度从下部通气，静置培养24h后收获。
实施例5人参的预处理方法同实施例1、生物合成培养基同实施例4生物合成方式5采用生物合成方式4，并在钢管顶部减压抽气。
实施例6人参的预处理方法同实施例1、生物合成培养基同实施例4生物合成方式6将上述须根切片放入150ml的三角瓶中，加入50ml生物合成培养基，静置培养24h后收获。
实施例7人参的预处理方法同实施例1、生物合成培养基同实施例4生物合成方式7将上述须根切片放入150ml的三角瓶中，加入50ml生物合成培养基，在转速为100r/min的摇床上，悬浮培养24h后收获。
实施例8人参的预处理方法同实施例1、生物合成培养基同实施例4
生物合成方式8将上述须根切片放入150ml的三角瓶中，加入50ml生物合成培养基，以4ml/min通气速度从下部通气，悬浮培养24h后收获。
实施例9人参的预处理方法同实施例1、生物合成培养基同实施例4生物合成方式9采用生物合成方式8，并在三角瓶顶部减压抽气。
实施例10西洋参的预处理从参地挖出的新鲜西洋参，先用自来水冲洗掉表面的泥土，再用细毛刷将西洋参彻底清洗干净，将其分成主根、侧根、须根三个部分，主根和侧根均切成薄片，薄片的厚度为0.5cm。
采用实施例1-9的方法处理西洋参。
实施例13人参的预处理方法同实施例1、生物合成培养基是含有2mmol/L外源氢醌的1/4MS、1/2MS、1/4B5、1/2B5或B5培养基。
生物合成方式13将上述薄片放入150ml的三角瓶中，加入50ml生物合成培养基，在转速为100r/min的摇床上，悬浮培养4、12、24、36、48h后收获。
实施例14人参的预处理方法同实施例1、生物合成培养基是含有2mmol/L外源氢醌的1/4MS、1/2MS、1/4B5、1/2B5或B5培养基，其中加入表面活性剂型。
生物合成方式14采用实施例13的方法处理人参。
实施例15生物合成熊果苷的薄层鉴别取各种方式下转化后的人参、西洋参，50℃烘干后研成粉末，取0.5g加甲醇20ml超声30min，过滤，滤液水浴蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，作为样品溶液。取该溶液进行硅胶薄层色谱，展开剂为V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)＝7∶3∶0.4，展开后挥干展开剂，碘蒸汽显色。另设未转化的人参作为阴性对照，操作同前；1mg/ml的熊果苷标准品溶液作为阳性对照。
栽培人参生物合成熊果苷的薄层鉴别结果见附图1，由TLC图谱可以看出，无论是新鲜人参的主根切片、侧根切片还是须根，其样品溶液在与熊果苷标准品溶液相对应的位置上均有相同颜色的斑点，而作为阴性对照的未转化人参却没有该斑点，证明栽培人参能生物转化外源化合物。
对于栽培西洋参生物合成熊果苷的结果而言，无论是新鲜人参的主根切片、侧根切片还是须根，其样品溶液在与熊果苷标准品溶液相对应的位置上均有相同颜色的斑点，而作为阴性对照的未转化西洋参却没有该斑点，证明栽培西洋参能生物转化外源化合物。
实施例13人参、西洋参中熊果苷的分离与鉴定1实验材料转化后的人参、西洋参2仪器与试剂RE-52C旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，D101型大孔树脂(天津南开大学树脂厂)，硅胶(青岛海洋化工厂分厂)，硅胶G板(青岛海洋化工厂)，乙醚，甲醇，乙醇，正丁醇，氯仿等均为分析纯3人参中熊果苷的提取分离取生物转化后的人参或西洋参粉末150g，乙醚脱脂2小时，甲醇回流提取6小时，提取液减压蒸干甲醇，残渣加少量水溶解，上D101大孔树脂，以蒸馏水、10％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，合并水、10％乙醇部分，减压浓缩，浓缩液用正丁醇萃取4～5次，合并萃取液，减压浓缩后，加适量硅胶(100～200目)拌样，上硅胶(200～300目)柱，氯仿-甲醇(7∶1)洗脱，洗脱液再上一次硅胶柱，经重结晶，得到转化产物。
实施例14转化产物的结构鉴定白色针晶，mp198～200℃，Molish反应呈阳性，与α-萘酚浓H2SO4反应在溶液界面出现紫色环，与FeCl3试剂呈淡蓝绿色。将结晶溶于无水乙醇中，加碱性KOH出现白色沉淀。以上化学反应提示此化合物为酚苷类。
IR(KBr)Vmaxcm-11212(C-O-C)，1442，1512(苯环)，2895，2910(CH)，3834(-OH)。
MS m/z311[M+K]+，295[M+Na]+。由UV，IR及MS等光谱可知该化合物基本母核为苯环，分子量272。
1H NMR(D2O，300Hz)δ3.21～3.82(6H，m)，4.82(1H，d，J＝7.42Hz，H-1’)，6.91(2H，d，J＝5.91Hz，2.24Hz)，6.94(2H，d，J＝5.87Hz，3.71Hz)。
13C NMR(D2O，300Hz)δ150(C-1)，116(C-2，C-6)，118(C-3，C-5)，151(C-4)，101(C-1′)，73(C-2′)，76(C-3′)，69(C-4′)，75(C-5′)，60(C-6′)。由1H NMR和13C NMR光谱可知该化合物的苯环上存在A2B2系统的四个质子，苯环为对位取代，母核上有1个葡萄糖基取代。
综上分析，此化合物为对-羟基苯-β-葡萄糖苷。
附图1.栽培人参生物合成熊果苷TLC图谱1人参主根切片2人参侧根切片3人参须根4熊果苷标准品5空白对照的人参本发明的优点本发明通过调节通气方式、切片条件和培养基中的含糖量，在人参生物合成熊果苷的调控方面取得了巨大突破，确定了操作可控、简便易行、适合工业化生产的操作模式，具有显著的经济意义。
权利要求
1.一种含有熊果苷的人参或西洋参。
2.根据权利要求1所述的一种含有熊果苷的人参或西洋参的制备方法，其特征在于使用外源氢醌处理人参或西洋参切片。
3.根据权利要求2所述的一种含有熊果苷的人参或西洋参的制备方法，其特征在于人参或西洋参切片接触生物合成培养基，该生物合成培养基是含有2mmol/L外源氢醌的MS，1/2MS，1/4MS，B5，1/2B5或1/4B5培养基。
4.根据权利要求3所述的一种含有熊果苷的人参或西洋参的制备方法，其特征在于生物合成培养基是含有2mmol/L外源氢醌且含糖量为20-120g/L的自来水。
5.根据权利要求2-4中任意一项所述的一种含有熊果苷的人参或西洋参的制备方法，其特征在于外源氢醌的处理时间为4-48小时。
6.根据权利要求5所述的一种含有熊果苷的人参或西洋参的制备方法，其特征在于静置处理。
7.根据权利要求5所述的一种含有熊果苷的人参或西洋参的制备方法，其特征在于通气处理。
8.根据权利要求5所述的一种含有熊果苷的人参或西洋参的制备方法，其特征在于振摇处理。
9.根据权利要求5所述的一种含有熊果苷的人参或西洋参的制备方法，其特征在于喷雾处理。
全文摘要
本发明涉及含有熊果苷的人参、西洋参，以及通过人参、西洋参切片处理外源氢醌而生物合成熊果苷的方法，本发明涉及的生物合成培养基是含有2mmol/L外源氢醌的MS，1/2MS，1/4MS，B
文档编号A61P17/00GK1608693SQ200410088778
公开日2005年4月27日 申请日期2004年11月3日 优先权日2004年11月3日
发明者蔡洁, 刘峻, 赵明强, 栗建明, 娄飞, 周倩耘, 丁家宜 申请人:丁家宜