新的o－超家族芋螺毒素肽，其编码多核苷酸及用途的制作方法

专利名称：新的o－超家族芋螺毒素肽，其编码多核苷酸及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的O-超家族芋螺毒素肽、其编码多核苷酸及用途，属于生物技术领域。
背景技术：
芋螺毒素(Conotoxin，CTX)是由生活在热带海洋中的肉食性软体动物芋螺(Conus)分泌出来的，用于麻醉猎物的小肽类毒素。它们是由6-41个氨基酸残基组成的，富含半胱氨酸(Cys)的动物神经肽毒素。其毒性极大，可引起动物出现惊厥、颤抖、甚至麻痹死亡。芋螺毒素的化学结构新颖，生物活性强，作用靶位的选择性高。既可直接用作天然药物，又可作为药物设计的先导化合物。鉴于其分子小、结构稳定、对受体作用范围大、特异性强、可化学合成；又是基因表达的产物，还可在体外重组表达获得较大量毒素。每种芋螺毒液中有约50-200种不同的芋螺毒素(Conotoxin，CTX)，且不同芋螺种类的毒素肽互不相同，不同的芋螺毒素在生物体内的作用靶位完全不同，至少有几万种芋螺毒肽具有调节各种离子通道的特殊功能，从而组成了一系列的神经药物源。食虫芋螺毒素对多种蠕虫有致死作用，可开发为多肽杀虫剂，或转化植物培育抗虫作物新品种。因此，芋螺毒素已跃居动物神经毒素研究的首位，成为药理学和神经科学的有力工具和新药开发的新来源，引起了全世界科学家们的广泛重视。我国芋螺资源丰富，是我国海南特有的药用海洋生物，绝大多数芋螺种类的毒素研究尚未开展，我国更应加紧开展具有自主知识产权的芋螺毒素基因资源的研究开发工作，对海洋制药工业具有特别重要的意义。本发明内容正是适应当前海洋药物芋螺毒素研究的发展趋势和需要而取得的，具有广阔的应用前景。
根据芋螺毒素作用于生物体内的不同靶位可分为3类(1)作用于电压门控离子通道的CTX，电压门控离子通道又称电压敏感性通道，常以通透离子(如Na+，K+，Ca2+等)命名。(2)作用于配体门控离子通道的CTX，包括烟碱受体、5HT3受体、NMDA受体。配体门控通道又称化学门控通道或递质依赖性通道，后者按相应的受体命名。(3)作用于其他受体的CTX，CTX除了作用于离子通道以外，还有以G-蛋白为靶标的，如芋螺加压素和芋螺惰性素，以及2种磷脂(conodipineM和PLA2)，它们基本上不含有二硫键。按其作用的受体靶可将芋螺毒素分为α、ω、μ、δ等多种亚型。根据芋螺毒素基因及其前体蛋白信号肽的保守性，可将芋螺毒素分为A、O、T、M、P、I等多个超家族。每个超家族根据受体靶类型，又可分为α、αA、κA(A-超家族)，ω、δ、κ、μO(O-超家族)，μ、ψ、KM(M-超家族)等家族(亚型)(见表1，引自J.Michael McIntosh，et al.CONUS PEPTIDES TARGETED TOSPECIFIC NICOTINIC ACETYLCHOLINE RECEPTOR SUBTYPES.AnnualReview of Biochemistry.1999，(68)59-88.)与受体有关的过程是生命调节过程中的重要环节，受体蛋白的研究鉴定，与具有特异作用和高亲和性结合能力的毒素密切相关。芋螺毒素通过与神经和肌肉细胞膜多种受体(钠通道、钙通道和乙酰胆碱受体等)特异性结合，影响与受体有关的一系列细胞调节过程，使受体研究从推测分析水平进入阐明分子机理水平，成为神经科学研究鉴定受体及其调控细胞活动分子机理的重要工具，并在顽痛、癫痫症、心脏血管疾病、精神病、运动失调、痉挛、癌症、艾滋病、神经保护、中风等疑难杂症的治疗中显示出诱人的应用前景。多种芋螺毒素已进入临床试验(见表2，引自LAURA NELSON.Venomous snailsOne slip，andyou′re dead....Nature，2004，429798-799).
表1 芋螺毒素超家族

表2 处于不同临床试验阶段的芋螺毒素

O-超家族芋螺毒素(半胱氨酸模式C-C-CC-C-C)主要作用于电压门控离子通道(又称电压敏感性通道)，包括Ca2+离子通道、Na+离子通道和K+离子通道等。
Ca2+通道为所有兴奋性细胞膜的必要成分之一，分为L，T，N，P和Q类型，其中N类型的Ca2+通道只存在于神经元组织(如脊椎动物的中枢神经系统以及外周神经系统)，它主要抑制神经递质尤其是去甲肾上腺素从交感神经上释放时Ca2+的进入。作用于Ca2+通道的CTX只有ω-CTX。ω-CTX G VI A从地纹芋螺中提取的，含有27个氨基酸、3个二硫键，属于O超家族。它是选择性抑制N类型Ca2+通道的毒素。MVIIA是从幻芋螺中提取的ω-CTX，也是首次进入临床试验的神经Ca2+通道拮抗剂.ω-芋螺毒素MVIIA，用于癌症、爱滋病晚期的顽痛治疗，成本比鸦片类止痛剂大大降低，它比常用麻醉药强万倍以上，是珍贵的海洋药物.ω-芋螺毒由于能特异作用于多种类型的钙离子通道，并具有严格的生物活性特异性而受到神经生物学家和药理学家的重视，成为研究鉴定钙离子通道的有效工具药，同时在特异诊断试剂和新药研制开发方面也具有潜在的应用前景。以Na+离子通道为靶标的有μ-CTX、μO-CTX和δ-CTX。其中μ-CTX的半胱氨酸模式与μO-CTX和δ-CTX的不同，前者属于M超家族，后两者属于O超家族。以K+离子通道为靶标的有κA-CTX和κ-CTX。κ-CTX属于O超家族。Na+和K+通道是研究神经信号的重要途径，与之相结合的芋螺毒素在神经科学研究和新药开发领域的应用潜力巨大。
虽然已有多个O超家族的芋螺毒素肽被发现，但进行深入研究的不多。绝大多数海南产的芋螺毒素急待研究与开发。本发明针对的正是现有技术中的这一需求，对我国乃至世界海洋制药将具有重要的意义。

发明内容
本发明基于的是从我国海南产的大理石芋螺(Conus marmoreusLinnaeus)、幻芋螺(Conus magus Linnaeus)、信号芋螺(Conuslittertus Linnaeus)、勇士芋螺(Conus miles Linnaeus)、独特芋螺(Conus caracteristicus Fischer)、帝王芋螺(Conus ImperialisLinnaeus)、织锦芋螺(Conus textile Linnaeus)、桶形芋螺(Conusbetulinus Linnaeus)、疣蒿芋螺(Conus lividus Hwass)等共12个种中分别发现的具有药用功能的O-超家族芋螺毒素肽(O-superfamilyConotoxin，O-CTX)。
因此，本发明在一个方面提供了新的O-超家族芋螺毒素肽(O-CTX)。
本发明在另一方面提供了编码所述肽的多核苷酸。
本发明还提供了含有所述多核苷酸的核酸构建体，含有该核酸构建体的表达载体，以及被所述核酸构建体或表达载体转化了的细胞。
本发明还提供了所述肽的人工合成与重组制备方法。
本发明中发现，所述芋螺毒素肽对蟑螂、棉铃虫、烟青虫、水稻螟虫、甘蔗螟虫、荔枝椿象等害虫有致死作用。因此，本发明的芋螺毒素可作为多肽杀虫剂开发。其基因可用于转化微生物(例如昆虫杆状病毒、大肠杆菌和酵母等)和植物，开发出新型生物农药，培育出抗虫作物新品种。
本发明的芋螺毒素肽可通过结合电压门控离子通道发挥作用，电压门控离子通道又称电压敏感性通道，包括Ca2+离子通道、Na+离子通道、K+离子通道等受体，具有镇痛活性。它们是新药开发的候选药物和先导药物。
因此，本发明还提供了包含本发明所述肽的药物组合物或杀虫剂组合物。
具体实施例方式
在一个实施方案中，本发明提供了O-超家族芋螺毒素肽(O-CTX)，其包含选自下组的氨基酸序列(1)SEQ ID NO1-35中任一所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO36-70中任一所示的氨基酸序列；(3)与上述(1)或(2)所述的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；或(4)因1-5个、优选1-3个、更优选1-2个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而与上述(1)或(2)所述的氨基酸序列有所不同的氨基酸序列。
优选地，所述芋螺毒素肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO1-70至少大约85％相同，更优选至少大约90％相同，尤其优选至少大约95％相同，最优选至少大约97％相同(在本文中称作“同源肽”)。
为了本发明的目的，两个或更多个氨基酸序列之间的相同程度是通过BLAST2.0蛋白质数据库查询程序(Aaltschul等，1997，核酸研究253389-3402)并采用下列参数确定的blastall pblastp-a4-e10-E0-v500-b250-I[查询文档]-d prot_all，其中-p指程序名称，-a指将要用到的服务器数，-e指期望值，-E指延伸缺口的代价，-v指单线描述(one-line description)数，-b指将要显示的比对数，-I指查询文档，-d指用于查询的数据库。
同源多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO1-70任一所示的氨基酸序列不同之处可能在于取代、插入、添加和/或缺失了1或多个、优选1-5个、更优选1-3个、尤其优选1-2个、最优选1个氨基酸残基。优选地，氨基酸改变是性质改变较小的变化，即是不会显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守性氨基酸取代；小片段缺失，通常是1到大约5个、优选1-3个、更优选1个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基端添加的甲硫氨酸残基；有多达大约20-25个残基的小连接肽；或可通过改变净电荷或者其它功能而有助于纯化的小延伸如多聚组氨酸片段、抗原表位或结合区。
保守性取代的例子是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)内进行的取代。通常不会改变特异活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，在《蛋白质》一书，Academic Press，New York中描述过。最常见的替换是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly以及反向进行的替换。
本发明还包括在本发明芋螺毒素肽的N-末端和/或C-末端融合了其它肽/多肽的融合多肽或可裂解的融合多肽。产生融合多肽的技术为本领域内已知，包括连接编码本发明肽的编码序列与编码所述其它肽/多肽的编码序列，使它们在同一读框中，并且融合多肽的表达受控于相同的启动子和终止子。
多核苷酸本发明还涉及含有编码本发明所述肽的核酸序列的分离多核苷酸。在一个优选实施方案中，该多核苷酸包含编码具有SEQ ID NO1-35中任一所示氨基酸序列的多肽的核酸序列。在一个优选实施方案中，该多核苷酸包含SEQ ID NO71-105中任一序列中所包含的成熟肽编码序列。在另一个优选实施方案中，该多核苷酸包含SEQ ID NO71-105中任一所示的核苷酸序列。本发明还包括编码具有SEQ ID NO1-35中任一所示氨基酸序列的多肽的核酸序列，它与SEQ ID NO71-105中任一所示的成熟肽编码序列之间因遗传密码的简并性而有所不同。本发明的核酸序列包括基因组序列，以及相应的cDNA和RNA序列。此处所用术语“核酸序列”应理解为包括合成DNA在内的所有这类变种。
本发明还涉及编码活性芋螺毒素肽、与SEQ ID NO71-105中任一所示的成熟肽编码序列有一定同源性的核酸序列，同源程度至少约为70％、优选约80％、更优选约90％，还要优选的是约95％，最优选的是大约97％同源。就本发明目的而言，两个核酸序列间的同源程度是通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur & Lipman，1983，美国国家科学院学报80726-730)用LASERGENETMMEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)以及相同性表和以下多重对比参数缺口罚分和缺口长度罚分均为10确定的。成对对比参数为Ktuple＝3，缺口罚分＝3，窗口＝20。
合成与本发明所述多肽基本相似的多肽时，可能有必要对编码本发明多肽的核酸序列进行修饰。术语与所述多肽“基本相似”是指非天然形式的多肽。这些多肽可能与从天然来源分离到的多肽在某些加工方式上不同。例如，可能希望用例如定点诱变来合成多肽的变体，这些变体有不同的热稳定性或最适pH等。可以在SEQ ID NO71-105中任一所示的成熟肽编码部分的核酸序列基础上构建出类似序列；并/或通过引入核苷酸取代而构建，所述取代不会使产生的氨基酸序列与原核酸序列编码的多肽不同，但它们符合酶制备所用宿主生物对密码子的使用习惯；或通过引入会产生不同氨基酸序列的核苷酸取代而构建。关于核苷酸取代的综述，参见例如Ford等，1991，蛋白质表达和纯化295-107。
本发明还涉及包含编码活性芋螺毒素肽、与SEQ ID NO71-105中任一所示的成熟肽编码序列或其互补序列可杂交的核酸序列的多核苷酸。关于多核苷酸之间的杂交，在现有技术中有众多的文献可供参考，包括例如Sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，1989。杂交中可以应用各种程度的严谨条件，例如中度、中度-高度，或者高度严谨条件。越严谨的条件，形成双螺旋要求的互补程度越高。可以通过温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间等等控制严谨程度。对于双链DNA基因探针，杂交于低于DNA杂合体熔解温度[melting temperature，Tm])20-25℃下在6X SSPE、5X Denhardt氏溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml变性DNA中进行过夜。清洗通常如下进行于Tm-20℃在0.2X SSPE、0.1％SDS中一次15分钟(中度严谨条件清洗)。
对于寡核苷酸探针，杂交于低于杂合体的熔解温度Tm 10-20℃下在6X SSPE、5X Denha rdt氏溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml变性DNA中进行过夜。清洗通常如下进行于杂交温度在1X SSPE、0.1％SDS中一次15分钟(中度严谨条件清洗)核酸构建体本发明还涉及包含本发明所述核酸序列及与之可操作连接的1或多个调控序列的核酸构建体，所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中进行表达。表达应理解为包括多肽生产中所涉及的任何步骤，包括，但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
“核酸构建体”在文中定义为单链或双链核酸分子，它们分离自天然基因，或者经修饰而含有以非天然方式组合和并列的核酸片段。当核酸构建体包含表达本发明所述编码序列必需的所有调控序列时，术语核酸构建体与表达盒同义。术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
可以以多种方式操作编码本发明所述肽的分离的核酸序列，使其表达所述肽。可能期望或必须在插入载体之前对核酸序列进行加工，这取决于表达载体。应用重组DNA方法修饰核酸序列的技术为本领域所熟知。
本文中术语“控制序列”定义为包括表达本发明肽所必需或有利的所有组分。每个调控序列对于编码多肽的核酸序列可以是天然含有的或外来的。这些调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入特定的限制位点以便将调控序列与编码多肽的核酸序列的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于相对DNA序列之编码序列的适当位置，以使调控序列指导多肽的表达。
调控序列可以是合适的启动子序列，即可被表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，可以得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。
调控序列还可以是合适的转录终止序列，即能被宿主细胞识别从而终止转录的一段序列。终止序列可操作连接在编码多肽的核酸序列的3’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何终止子都可以用于本发明。
调控序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞的翻译十分重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作连接于编码多肽的核酸序列的5’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何前导序列均可用于本发明。
调控序列还可以是信号肽编码区，该区编码一段连在多肽氨基端的氨基酸序列，能引导编码多肽进入细胞分泌途径。核酸序列编码区的5’端可能天然含有翻译读框一致地与分泌多肽的编码区片段自然连接的信号肽编码区。或者，编码区的5’端可含有对编码序列是外来的信号肽编码区。当编码序列在正常情况下不含有信号肽编码区时，可能需要添加外来信号肽编码区。或者，可以用外来的信号肽编码区简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽分泌。但是，任何能引导表达后的多肽进入所用宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可以用于本发明。
调控序列还可以是肽原编码区，该区编码位于多肽氨基末端的一段氨基酸序列。所得多肽被称为酶原或多肽原。多肽原通常没有活性，可以通过催化或自我催化而从多肽原切割肽原而转化为成熟的活性多肽。
在多肽的氨基末端即有信号肽又有肽原区时，肽原区紧邻多肽的氨基末端，而信号肽区则紧邻肽原区的氨基末端。
添加能根据宿主细胞的生长情况来调节多肽表达的调控序列可能也是需要的。调控系统的例子是那些能对化学或物理刺激物(包括在有调控化合物的情况下)作出反应，从而开放或关闭基因表达的系统。调控序列的其他例子是那些能使基因扩增的调控序列。在这些例子中，应将编码多肽的核酸序列与调控序列可操作连接在一起。
表达载体本发明还涉及包含本发明核酸序列、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体。可以将上述各种核酸和调控序列连接在一起来制备重组表达载体，该载体可以包括1或多个方便的限制位点，以便在这些位点插入或取代编码多肽的核酸序列。或者，可以通过将核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入适当表达载体而表达本发明所述核酸序列。制备表达载体时，可使编码序列位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作连接。
重组表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作并表达核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。
载体可以是自主复制型载体(即存在于染色体外的完整结构，可独立于染色体进行复制)，例如质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可包含保证自我复制的任何机制。或者，载体是一个当导入宿主细胞时，将整合到基因组中并与所整合到的染色体一起复制的载体。此外，可应用单个载体或质粒，或总体包含将导入宿主细胞基因组的全部DNA的两个或多个载体或质粒，或转座子。
优选本发明所述载体含有1或多个便于选择转化细胞的选择标记。选择标记是这样一个基因，其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性，或赋予营养缺陷体原养型等。细菌选择标记的例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性标记。
优选本发明所述载体包含能使载体稳定整合到宿主细胞基因组中，或保证载体在细胞中独立于细胞基因组而进行自主复制的元件。
就进行自主复制的情况而言，载体还可以包含复制起点，使载体能在目标宿主细胞中自主地复制。复制起点可以带有使其在宿主细胞中成为温度敏感型的突变(参见例如，fEhrlich，1978，美国国家科学院学报751433)。
可以向宿主细胞插入1个以上拷贝的本发明核酸序列以提高该基因产物的产量。该核酸序列的拷贝数增加可以通过将该序列的至少1个附加拷贝插入宿主细胞基因组中，或者与该核酸序列一起插入一个可扩增的选择标记，通过在有合适选择试剂存在下培养细胞，挑选出含有扩增拷贝的选择性标记基因、从而含有附加拷贝核酸序列的细胞。
用于连接上述各元件来构建本发明所述重组表达载体的操作是本领域技术人员所熟知的(参见例如Sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。
宿主细胞本发明还涉及包含可用来重组生产多肽的本发明所述核酸序列的重组宿主细胞。可将包含本发明之核酸序列的载体导入宿主细胞，从而使该载体以上述染色体整合体或自我复制的染色体外载体形式得以维持。术语“宿主细胞”涵盖任何由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的后代。宿主细胞的选择很大程度上取决于多肽编码基因及其来源。
宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞，例如细菌或酵母细胞。可以通过本领域技术人员熟知的技术将载体导入宿主细胞。
制备方法本发明还涉及重组制备本发明肽的方法，该方法包括(a)在适于产生所述肽的条件下，培养含有核酸构建体的宿主细胞，该核酸构建体包含编码所述肽的核酸序列；和(b)回收该肽。
在本发明所述制备方法中，用本领域已知方法在合适多肽产生的营养培养基中培养细胞。例如，可以在合适的培养基中，在允许多肽表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批加料或固态发酵)来培养细胞。在包含碳和氮源以及无机盐的合适的培养基中，采用本领域已知的步骤进行培养。合适的培养基可由供应商提供或者可以参照公开的组成(例如，美国典型培养物保藏中心的目录中所述)来制备。如果多肽被分泌到培养基中，则可以直接从培养基中回收多肽。如果多肽不分泌，可以从细胞裂解物中回收。
可以用本领域已知方法回收所产生的多肽。例如，可以通过常规操作(包括，但不限于离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀)从培养基中回收多肽。
可以通过各种本领域已知的操作来纯化本发明所述多肽，这些操作包括，但不限于层析(例如，离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、层析聚焦、和大小排阻层析)、电泳(例如，制备性等电点聚焦)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或抽提(参见例如，蛋白质纯化，J.C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。
转基因动物和植物本发明还涉及转化了本发明的核酸序列的动物或植物细胞，优选小麦、玉米、水稻、大豆等植物细胞，赋予被转化宿主新的性状(如抗虫性)。这可以通过本领域技术人员熟知的技术，用此处公开的构建体转化动物或植物细胞而实现。
用于控制害虫的方法和制剂可以通过本领域技术人员知道的多种方法，使用本发明的芋螺毒素肽或多核苷酸来实现控制害虫。这些方法包括例如将重组微生物应用于害虫(或它们的所在地)、和用编码本发明的芋螺毒素肽的基因转化植物。转化可以由本领域技术人员使用常规技术进行。此处公开了用于这些转化的必要物质，或者熟练的技术人员可以通过其它方法容易的获得。
可以将配制的含有芋螺毒素肽、或包含本发明所述多核苷酸的重组微生物的制剂应用于土壤。还可以将配制的产品作为种子覆料或根部处理或作物生长周期晚期的完整植株处理应用。制剂可以包括扩散-增稠佐剂、稳定剂、其它杀虫添加剂、或表面活性剂。液体制剂可以是基于水的或非水的，并以泡沫、凝胶、悬浮液、可乳化浓缩物等等形式使用。成分可以包括流变剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂、或聚合物。
本领域技术人员可以理解，杀虫剂浓度将由于特殊制剂的本性广泛变化，特别是可作为浓缩物或直接使用。杀虫剂将以至少1％(重量计)存在，而且可能是100％(重量计)。干燥制剂通常有大约1-95％(重量计)的杀虫剂，而液体制剂将通常是液相中固体重量大约1-60％。含有细胞的制剂将通常含有大约102-大约104个细胞/mg。这些制剂将以每公顷大约50mg(液体的或干的)-1kg或更多的量使用。通过喷、撒、洒、等等，可以将制剂应用于害虫环境，例如土壤和植物。
药物组合物本发明还涉及含有本发明肽和药学可接受载体和/或赋形剂的药物组合物。所述药物组合物可用于缓解或治疗与缺血性损伤有关的疾病或病症。在一个实施方案中，含有治疗有效量的本发明肽的药物组合物以利于药用的方式配制和给药，并需考虑到个体病人的临床状况、运送位点、给药方法、给药日程安排和医生已知的其它因素。因此用于本文目的的“有效量”由这些方面的考虑决定。
含治疗有效量的本发明多肽的药物组合物可口服、非肠道给药、脑池内给药等。“药学可接受载体”指无毒的固体、半固体或液体填充物、稀释液、胶囊材料或任何类型的配方辅助物。本文所用术语“非肠道的”表示的给药方式包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注。本发明多肽还可通过缓释系统恰当地给药。
还可应用本发明的芋螺毒素肽或基因作为有用的探针，来研究鉴定动物电压门控离子通道(包括Ca2+、Na+和K+离子通道等)受体及其调控细胞活动分子机理的重要工具；作为分子探针来确定离子通道的不同亚型；作为分子模型，设计新药；作为多肽杀虫剂，开发为新型生物农药等。在神经科学受体研究，在顽痛、癫痫症、心脏血管疾病、精神病、运动失调、痉挛、癌症、艾滋病、神经保护、中风等疑难杂症的治疗中有广阔的应用前景下面参考实施例对本发明作进一步说明。给出这些实施例只是为了举例说明，它们不以任何方式限制本发明的范围。
实施例实施例1 O-超家族芋螺毒素基因的克隆1芋螺总RNA的提取以从海南岛、西沙群岛等沿海采集的织锦芋螺(Conus textileLinnaeus)、桶形芋螺(Conus betulinus Linnaeus)、疣蒿芋螺(Conuslividus Hwass)、信号芋螺(Conus littertus Linnaeus)、勇士芋螺(Conus miles Linnaeus)、独特芋螺(Conus caracteristicus Fischer)、菖蒲芋螺(Conus vexillum Gmelin)、大尉芋螺(Conus capitaneusLinnaeus)、大理石芋螺(Conus marmoreus Linnaeus)、幻芋螺(Conusmagus L.)、玉女芋螺(Conus virgo L.)、假玉女芋螺(Conus emaciatusReeve)共12种芋螺活体为材料。用小量柱离心式组织/细胞总RNA抽提试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)，或用Total RNA IsolationSystem试剂盒(Promega)，按操作手册提取总RNA。下面以上海华舜产的RNA抽提试剂盒为例。
先把芋螺毒腺或毒管用液氮冷冻并研成粉末，转入1.5mL离心管中。样品中加500μL TCL液(RNA裂解液，上海华舜)，混匀后12000rpm离心3分钟→转移上清并向上清液中加入250μL 75％的乙醇彻底混匀→移入RNA吸附柱中，10000rpm离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一收集管中→加500μL RP液(去蛋白液)，10000rpm离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一收集管中→加500μL W3液(洗涤液)，10000rpm离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一收集管中→同法用W3液洗两次10000rpm离心1分钟→将吸附柱移入另外一个干净的1.5mL离心管中→在吸附膜中央加入50u l纯水溶解RNA，室温净置1分钟10000rpm离心1分钟→将1.5mL离心管放-70℃保存。
2 cDNA的合成以步骤1提取的总RNA为模板，分别以Oligo(dT)15和3′-RACEAdapter Primer为引物，采用两种方法合成cDNA。分述如下。
方法1、采用ThermoScriptTM RNase H-Transcriptase试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。
反应成分3′-RACE引物(5’GGC CAC GCG TCG ACT AGTAC(T)17-3’)，0.5μg，总RNA 2μg，1mmol.1-1 dNTP混合物，重蒸水，5×cDNA合成缓冲液，0.1mol.1-1 DTT，RNaseOUTTM重组核糖核酸酶抑制剂(RNaseOUTTM Recombinant Ribonuclease Inhibitor)，ThermoScriptTM RT 20U。反应总体积为20μl。反应程序先将总RNA模板在65℃温浴5min，再加入其他成分；反应液于50℃温育60min，85℃温育5min终止反应；反转录产物放-20℃保存。
方法2、采用AMV Transcriptase试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。
反应成分0.5μg Oligo(dT)15，2μg总RNA，反转录缓冲液，1mmol.1-1dNTP，20U重组RNA酶抑制剂核糖核酸酶抑制剂(RecombinantRnasin Ribonuclease Inbibitor)，25U AMV反转录酶，重蒸水。反应总体积为20μl。反应程序先将总RNA在70℃温育10min，再加入其他反应成分；于42℃温育1h，95℃终止反应5min；反转录产物放-20℃保存。
取5μl反转录产物进行1％琼脂糖电泳检测。
3 反转录PCR反应(RT-PCR)和3-RACE扩增以步骤2合成的cDNA为模板，根据O-超家族芋螺毒素信号肽区域保守区和3’非翻译区序列(文献1 Thomas F.Duda Jr，Stephen R.Palumbi.Molecular genetics of ecological diversificationDuplication and rapid evolution of toxin genes of the venomousgastropod Conus.Evolution，1999，96(12)6820-6823.文献2Silvestro G.Conticello，Yoav Gilad et al.Mechanisms forEvolving HypervariabilityThe Case of Conopeptides.MolecularBiology and Evolution.2001，18120-131.)，设计O-超家族CTX引物共8条上游引物、3条下游引物(引物配对见下文表3)和3-RACE接头引物(5’GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC 3’)，分别进行PCR反应。PCR反应总体积为25ul，包括cDNA模板50ng，10×PCR buffer，200uMdNTPs，1umol上游引物与下游引物或3′-RACE接头引物(5’GGC CACGCG TCG ACT AGT AC 3’)，2mM MgCl2，1U Taq酶和去离子水。循环程序94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，50℃(或55℃)退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环后，72℃再延伸2分钟。PCR扩增产物取5ul点样，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
4 PCR产物的克隆与测序回收上述特异PCR产物，与T-easy载体(Promega)连接后转化大肠杆菌XL1菌株(发明人实验室保存)，利用蓝白菌落和氨苄青霉素抗性挑选重组子，抽提纯化重组子质粒用于测序分析。经序列分析比较，获得了本发明所述的35种新型O-超家族芋螺毒素成熟肽(O-CTX，SEQ IDNO1-35)。成熟肽是根据其前肽(SEQ ID NO36-70)及芋螺毒素特点推测而来，前肽是根据前体基因(SEQ ID NO71-105)推测而来。O-CTX编号及其来源芋螺种类等情况列于表3。
35种O-超家族芋螺毒素成熟肽(O-CTX，SEQ ID NO1-35)序列见表4。35种O-CTX前肽(O-CTX，SEQ ID NO36-70)序列见表5。35种O-CTX的编码多核苷酸(DNA)序列(SEQ ID NO71-105)见表6。
表3 O-超家族芋螺毒素肽(SEQ ID NO1-35)、前肽(SEQ ID NO36-70)及其编码多核苷酸(SEQ ID NO71-105)编号和来源


注SEQ ID NO77-86；96-105的下游引物均为3’-RACE adapter(20bp)5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’
表4 O-超家族芋螺毒素肽(O-CTX，SEQ ID NO1-35)的序列

表5 35种O-超家族芋螺毒素前肽序列(SEQ ID NO36-70)


表6 O-CTX编码多核苷酸(DNA)序列(SEQ ID NO71-105)











实施例2 O-超家族芋螺毒素MiEr93M(SEQ ID NO10)、MgJr93M(SEQ ID NO14)和CaFr179M(SEQ ID NO33)的合成根据芋螺毒素肽MiEr93M、MgJr93M和CaFr179M的氨基酸序列，采用Fmoc方法人工合成了这三种多肽。具体方法如下。
采用固相合成法中的Fmoc方法，在ABI Prism 433a多肽合成仪上合成了上述三条芋螺毒素肽。Fmoc氨基酸的侧链保护基为Pmc(Arg)、Trt(Cys)、But(Thr、Ser、Tyr)，OBut(Asp)，Boc(Lys).采用Fmoc HOBT DCC方法，Rink树脂及Fmoc氨基酸，合成步骤参考仪器合成手册进行。为反应完全，在哌啶脱保护及偶合时间上分别适当延长，对难接氨基酸采用双偶合。回收线性肽粗品，用250*4.6mm，Hypersil ODS-2柱纯化，线性肽纯度达70％以上，并通过质谱(MS)鉴定。MiEr93M、MgJr93M和CaFr179M的分子量分别为2732.16，2797.2和3501.0。线性肽冻干后用于氧化折叠。
实施例3 芋螺毒素MiEr93M、MgJr93M和CaFr179M线性肽氧化折叠纯化的还原性线性肽MiEr93M、MgJr93M和CaFr179M在室温下分别氧化折叠24h。氧化折叠缓冲液组成为0.1M醋酸铵(pH 7.8)，20μM充分还原的线性肽，还原型(GSH)和氧化型(GSSG)谷胱苷肽。缓冲液中肽∶GSH∶GSSG的浓度比例为1∶50∶5。氧化反应结束时，用TFA(trifluoroacetic acid)调pH至23以终止氧化反应。用液相层析系统(Bio-Rad)纯化肽。反应混合物载入一制备层析柱(4.6×250mm，Sinochrom ODS-BP)，流速1ml/min，用0.1％TFA洗脱，直到所有的反应液被洗提完全。溶剂A是0.1％TFA的乙腈溶液，溶剂B是0.1％TFA的水溶液。梯度洗脱(10％→100％A，90％→0％B，30分钟)可纯化出95％的氧化折叠后的活性肽。
实施例4 MiEr93M和CaFr179M抗虫活性的测试。
参照Xiu-hong Wang，Ross Smith et al，Structure functionstudies of ω-atracotoxin，a potent antagonist of insectvoltage-gated calcium channels.Eur.J.Biochem.264，488-494(1999)的方法，测试MiEr93M和CaFr179M的抗虫活性.将MiEr93M和CaFr179M分别以不同的浓度注射到蟑螂(Periplaneta americana)、棉铃虫(Heliothis armigera Huber)、烟青虫(Heliothis assultaGuenee)、水稻螟虫(三化螟，Tryporyza incertulas(Walker))、甘蔗螟虫(Chilo infuscatellus Snellen)、荔枝椿象(Tessaratomapapillosa)的幼虫或若虫(体重30 180mg)体内，观察48h内虫体的反应情况。每只昆虫用微量注射器注射5μL到腹部中央，注射前虫体暂时置冰上防止昆虫运动。对照同时注射5μL蒸馏水(ddH2O)或5μL昆虫生理盐水.两种毒素分别用昆虫生理盐水(200mM NaCl，3.1mM KCl，5.4mM CaCl2，5mM MgCl2，2mM NaHCO3，0.1mM NaH2PO4，pH 7.2)配制。毒素浓度为10 103pmol(每克体重)。每组10只昆虫，记录注射后48h内的死亡率。计算害虫半致死剂量LD50。
计算公式为y＝(a-b)LD50/x LD50＝xy/(a-b)y是注射后48h样本群体的死亡百分率，x是中毒剂量(pmol·g-1)，a是最大反应剂量，b是最小反应剂量。LD50是害虫半致死剂量。
结果表明(表7)，MiEr93M和CaFr179M对上述害虫的半致死剂量LD50差异不大，MiEr93M的LD50较CaFr179M的略低。MiEr93M的LD50分别为LD50蟑螂75±6pmol·g-1、LD50棉铃虫81±7pmol·g-1、LD50烟青虫66±5pmol·g-1、LD50水稻螟虫78±7pmol·g-1、LD50甘蔗螟虫68±6pmol·g-1、LD50荔枝椿象63±5pmol·g-1。
CaFr179M的LD50分别为LD50蟑螂103±11pmol·g-1、LD50棉铃虫108±12pmol·g-1、LD50烟青虫86±7pmol·g-1、LD50水稻螟虫94±9pmol·g-1、LD50甘蔗螟虫88±7pmol·g-1、LD50荔枝椿象76±5pmol·g-1。当MiEr93M浓度达到180pmol·g-1时，当CaFr179M浓度达到220pmol·g-1时，所试昆虫死亡率均为100％，而对照组死亡率不到6％，个别对照死亡多因注射操作引起。因此MiEr93M和CaFr179M对所试昆虫均有很强的致死作用，且MiEr93M杀虫力更强。
表7 MiEr93M和CaFr179M对害虫的半致死剂量LD50(pmol·g-1)

实施例5 测试MgJr93M的镇痛活性利用小鼠热板试验测定了来自幻芋螺(C.magus)的SEQ ID NO14MgJr93M肽的镇痛活性.
测试用昆明小鼠体重为(20g±2g)。小鼠采用侧脑室给药，每只注射10μL含不同浓度MgJr93M毒素肽的盐溶液(150mM NaCl)，用热板法测量小鼠脚部受热镇痛后舔后足或抬后足并回头时间为痛阈时间，60s为100％镇痛。注射后观察小鼠的反应。设5个剂量浓度0、5、10、20、30ng/只，每剂量5只小鼠。结果表明(表8)MgJr93M剂量为5ng/只，镇痛活性(热板法)为55±20s，在60s附近，镇痛活性明显；当剂量大于或等于10ng/只时，镇痛活性大于60s，且作用4h以上。因此MgJr93M具有强大的镇痛活性。
表8 O-CTX MgJr93M肽对小鼠的活性

上述实施例只是为了阐明、而不是限制本发明。相关领域的技术人员清楚地知道，可对本文所述的内容作其它适当的修饰和变化，并可在本发明或其任何实施方案的范围内进行这种修饰和变化。这样的修饰和变化都落入本发明的保护范围。
权利要求
1.一种O-超家族芋螺毒素肽，其包含选自下组的氨基酸序列(1)SEQ ID NO1-35中任一所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO36-70中任一所示的氨基酸序列；(3)与上述(1)或(2)中任一所示的氨基酸序列至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、尤其优选至少95％、最优选至少97％相同的氨基酸序列；或(4)因1-5个、优选1-3个、更优选1-2个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而与上述(1)或(2)中任一所示的氨基酸序列有所不同的氨基酸序列。
2.权利要求1的芋螺毒素肽，其具有选自SEQ ID NO1-70中任一所示的氨基酸序列。
3.编码权利要求1或2所述O-超家族芋螺毒素肽的多核苷酸。
4.权利要求3的多核苷酸，其包含选自下组的核苷酸序列(1)编码SEQ ID NO1-70中任一所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(2)EQ ID NO71-105中任一所示的核苷酸序列；(3)SEQ ID NO71-105中任一所示核苷酸序列中的相应成熟肽编码序列；或(4)在严谨条件下可与上述(1)、(2)或(3)所述核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
5.一种核酸构建体，其中包含权利要求3或4所述的多核苷酸，以及与之可操作连接、可指导多肽在适当表达宿主中生产的一个或多个控制序列。
6.一种表达载体，其中包含权利要求5所述的核酸构建体。
7.一种转化的细胞，其中转化了权利要求5的核酸构建体或权利要求6的表达载体。
8.权利要求7的细胞，它是原核细胞例如细菌细胞，或者真核细胞例如酵母细胞，或植物细胞，例如小麦、玉米、水稻、大豆细胞等。
9.一种药物组合物，其中包含药学有效量的权利要求1或2所述芋螺毒素肽以及药学上可接受的载体。
10.一种杀虫剂组合物，其中包含杀虫有效量的权利要求1或2所述芋螺毒素肽以及任选的载体。
11.一种融合蛋白，其中包含权利要求1或2所述的芋螺毒素肽以及与之相融合的其它氨基酸序列。
12.一种杀灭害虫的方法，包括对含有所述害虫的位点使用权利要求10的杀虫剂组合物。
全文摘要
本发明涉及新的O－超家族芋螺毒素肽(O－Conotoxin，O－CTX)，编码所述肽的多核苷酸，含有该多核苷酸的构建体和转化细胞，以及重组生产所述肽的方法。本发明还涉及所述芋螺毒素肽的人工合成和用途。
文档编号A61K38/17GK1796412SQ20041010356
公开日2006年7月5日 申请日期2004年12月30日 优先权日2004年12月30日
发明者罗素兰, 长孙东亭, 张本, 林秋金 申请人:海南大学