线虫多肽佐剂的制作方法

专利名称：线虫多肽佐剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于疫苗组合物中的多肽佐剂。
佐剂是一种物质或方法，它可以通过调节免疫细胞的活性来特异地增强对抗原的免疫反应。佐剂的例子包括弗氏佐剂，胞壁酰二肽，脂质体。佐剂也可以是具有激动作用或拮抗作用的由免疫细胞表达的抗体直至受体。佐剂与载体的区别在于载体通常被用来增强对抗原的免疫反应。
载体是一种具有免疫原性的分子，当它与另一个分子相结合时可以增强后者的免疫反应。有一些本身不具有免疫原性的抗原(即在它们直接存在时不具有免疫原性)，但当它们与诸如匙孔血蓝素(keyhole-limpethemocyanin)或破伤风类毒素的外源蛋白分子相连时则可具有产生抗体反应的能力。这些抗原含有B细胞表位而没有T细胞表位。这些轭合物(“载体”蛋白)的蛋白部分提供T细胞表位来刺激辅助性T细胞，从而刺激抗原特异性B细胞分化为浆细胞，并产生针对于该抗原的抗体。为免疫细胞受体的蛋白配基的佐剂可以同时具有佐剂和载体的性质，而后者依赖于可被免疫系统T细胞识别的“外源”多肽序列的组成。本发明中的新型佐剂具有以上所述的两种性质。
多蛋白抗原或多梯状(polyladder)蛋白是由多种寄生性或自由生活的线虫产生的。这些多蛋白通常包括许多直接串联排列的多亚基，这些蛋白通常作为大前体蛋白合成，其可被蛋白酶剪切产生大小间隔约为15KD的、“梯状”的小片段，反应单个功能域的平均分子量(denominatormolecular mass)的增加。每一个这样亚基的最后4个氨基酸都具有一种易被蛋白酶消化的RX(K/R)R(或有时是RXFR)基序。另外，在这些基序上游(基序的N端)的7，8或9残基位置所述基序前面有半胱氨酸残基(McReynolds et al.(1993)Parasitology today 9 403-406)，该残基的作用在于可以使得蛋白酶的剪切位点远离该蛋白质功能域的主体。
某些寄生虫的多蛋白(例如犬恶丝虫的DiAg蛋白)是很强的免疫刺激剂，能够产生抗原非特异性IgE，并通过干扰寄生虫特异IgE的产生，在寄生虫引起的免疫反应规避中起到重要作用。
产生对众多传染性疾病起到预防保护作用的疫苗，是近代医学中最重要的进步之一。许多预防和治疗包括自身免疫性、神经退行性疾病以及癌症的其它种类疾病的疫苗目前尚在研发中。本发明也可以应用于这些其它种类的疾病。在多数情况下，预防传染性疾病的疫苗来自于引起该疾病的介质(病原体)的灭活或减毒形式，为了预防病原体天然形式所引起的感染，可对受体进行该疫苗的注射或其它形式的给药。受体个体可以通过产生体液(抗体)反应，细胞(例如细胞溶解性T细胞，CTL)反应或两者同时反应来实现免疫反应。
对所谓亚单位疫苗(其中的免疫原被定义为传染性介质(agent)或肿瘤抗原的分子片段或亚单位)的开发一直都是众多医学研究关注的焦点。用于亚单位疫苗的开发中的确定候选分子(例如，蛋白或多糖)的需求最初是基于提高安全性的需要，以及在针对细菌性感染的疫苗时，抗菌素耐受问题的增加也是一种原因。然而，与基于整个有机体获得的疫苗相比，亚单位疫苗的免疫原性越低，而为了产生有效的免疫反应(或产生有效的抗肿瘤免疫反应)以保护目标有机体不受感染，亚单位疫苗对“佐剂”的依赖性也越强。
我们描述了一个蛋白家族，它们可以作为免疫佐剂提高针对于多种预防性和治疗型疫苗所产生的免疫反应。佐剂系统在刺激疫苗抗原产生免疫反应方面相当有效。新的佐剂系统尤其适用于亚单位疫苗，但对其他种类的疫苗也同样适用(包括基于整个有机体、核酸等所获得的疫苗)。
已知线虫的多梯状蛋白对诱导IgE反应高度有效(Tomlinson et al.J.Immunol.143 2349-2356(1989)；Paxton et al.Infect Immunol.612827-2833(1993)。然而，一些多梯状蛋白(例如犬恶丝虫的DiAg蛋白)则可以通过产生抗原非特异的IgE来扰乱正常的免疫反应，其不能与DiAg或寄生虫结合(Tezuka，H et al.Infection and Immunity，July 2003，3802-3811)，并通过不相关IgE将寄生虫特异性的IgE排除在外，来干扰激活的肥大细胞和嗜伊红细胞对寄生虫去除。而且，因为IgE抗体常常与危险甚至是致命的过敏反应相关联(例如，如果在个体中含有预先存在的对于所述抗原特异的IgE抗体，该个体与该抗原相遇时就会发生过敏反应)，因此IgE反应一般被认为是疫苗接种的非理想表现(至少是在针对不是寄生虫的介质的疫苗的情况下)。不仅如此，如果将其作为疫苗物质，那么可存在多梯状蛋白增强人个体内正在进行中的致敏原特异性的IgE反应、或干扰对于寄生虫预期的免疫反应的有限危险性。总之，通过多梯状蛋白诱导产生的IgE反应和可以干扰寄生虫去除或加重过敏性疾病的非特异性IgE反应，都是将寄生虫多梯状蛋白作为疫苗组分或是佐剂进行使用时的禁忌症。
令人惊奇的是，我们公开了在没有强烈非特异性IgE反应出现的时候，通过例如多梯状蛋白(或者优选与这些蛋白的单重复单元)的轭合或微粒共制剂的物理性连接是一种可较强地提高针对相联抗原产生免疫反应的方法。我们公开了多梯状蛋白(或者优选多梯状蛋白的个体单一功能域部分)和预期免疫反应所针对的抗原的物理性连接，能够将对于所述多梯状蛋白的潜在危险的非抗原特异性IgE反应转变为有益的佐剂效应，来产生针对所述抗原的预期抗原特异性抗体。我们还公开了所产生的抗原特异性免疫反应(针对多梯状-功能域-连接的疫苗抗原)是如何倾向于IgG的产生(适用于细菌病原体的去除示例)，并倾向于适合去除诸如病毒(和某些寄生虫)的细胞内寄生物的Th1型T细胞反应的产生，而不是倾向于有潜在危险的IgE反应。我们还公开了多梯状蛋白或蛋白功能域是如何被用来产生针对相联疫苗抗原甚至是当该抗原以非微粒形式进行给药时的细胞溶解性T淋巴细胞(CTL)反应的。除此之外，我们还公开了多梯状蛋白功能域(甚至是DiAg多梯状蛋白的功能域)是如何被用来产生针对与其进行物理性连接的抗原(例如寄生虫抗原而并非DiAg和多梯状蛋白)的预期抗原特异性IgE反应。
DiAg及其相关蛋白已被证明在小鼠中能够将免疫系统偏离引起自身免疫I型(胰岛素依赖型)糖尿病的致病性Th1反应，并且提倡治疗性用于Th1为基础的自身免疫疾病的治疗(Imai，S.et al.Biochem.Biophys.Res.Comm.2861051-1058)。因此令人惊奇的是，在本发明的另一方面，我们现已公开了DiAg及其相关蛋白是如何进行过敏性疾病治疗的，它们与涉及过敏性疾病的发病机理中T细胞的作用(Th1)正好完全相反(Th2)。以下对产生DiAg蛋白这种新用途的必需组合物和方法进行了描述。
一方面，本发明提供作为免疫佐剂用途的多肽，所述多肽包括i)由RXK/RR氨基酸残基组成的氨基酸基序，R为精氨酸，X为任一氨基酸残基，及K为赖氨酸；和/或ii)由RXFR氨基酸残基组成的氨基酸基序，其中F为苯丙氨酸，且在所述基序氨基端前约7-9残基位置所述基序前面有半胱氨酸残基，所述多肽能够通过至少一个氨基酸残基的添加、缺失或取代来修饰。
一方面，本发明提供的含有由核酸分子编码的多肽的佐剂，其中有至少一个RX(K/R)R(其中R为精氨酸，X为任一氨基酸，K/R为赖氨酸或精氨酸，R为精氨酸)或RXFR(其中F为苯丙氨酸)氨基酸基序，在此RX(K/R)R或RXFR基序N端前7，8或9残基位置该基序前面有半胱氨酸残基。
优选的所述多肽由线虫的核酸分子编码。
在本发明的另一实施方案中，提供了所述蛋白片段的佐剂，并优选为淋巴细胞结合片段。
在本发明的另一实施方案中，提供了与所述蛋白或与所述蛋白片段、并优选淋巴细胞结合片段具有至少70％同源性的佐剂，。
另一方面，本发明提供含有至少一种多肽的疫苗组合物，其中所述多肽包括i)由氨基酸残基RX(K/R)R组成的氨基酸基序，其中R为精氨酸，X为任一氨基酸，K为赖氨酸；和/或ii)由RXFR氨基酸残基组成的氨基酸基序，其中F为苯丙氨酸，且在所述基序氨基末端前约7-9残基位置所述基序前面有半胱氨酸残基，所述多肽能够通过至少一个氨基酸残基的添加、缺失或取代来修饰，以及至少一种可以引发预期免疫反应的抗原来修饰。
在本发明的优选实施方案中，所述多肽与所述抗原混合。
在本发明的另一优选实施方案中，所述多肽与所述抗原轭合，连接或交联。
在本发明的另一优选实施方案中，该多肽含有犬恶丝虫(Dirofilariaimmitis)蛋白，嗜中性白细胞趋化因子(NCF)，或其淋巴细胞结合片段，或其同源结构，或其同源结构的淋巴细胞结合片段。
在本发明的优选实施方案中，所述多肽包括选自SEQ NO.1；2；3；4；5；6；7；8；9；10；11；12；13；14；15；16；17；18；19中的氨基酸序列，或与所选自的序列具有至少50％同源性、更优选具有70％的同源性、甚至更优选具有90％同源性的多肽。
在本发明的优选实施方案中，所述多肽的长度为至少20个连续的氨基酸，其序列相同于选自SEQ ID No1；2；3；4；5；6；7；8；9；10；11；12；13；14；15；16；17；18或19序列中的至少20个氨基酸部分。
在本发明的优选实施方案中，在本发明的优选实施方案中，所述多肽是这种蛋白的淋巴细胞结合片段。
在本发明的另一实施方案中，所述多肽由包括选自SEQ ID No20；21；22；23；24；25；26；27；28；29；30；31；32；33或34的核酸序列的核酸分子；或由与所述核酸分子杂交的编码具有免疫佐剂活性多肽的核酸分子所编码。
优选的所述核酸序列与所选自的序列具有至少50％的同源性，或更优选与所选自的核酸序列具有至少70％的同源性，或更优选的与所选自的序列具有至少85％的同源性。
在本发明的另一实施方案中，所述多肽由选自SEQ ID No20；21；22；23；24；25；26；27；28；29；30；31；32；33或34中的核酸序列的60个核苷酸部分所编码。
在本发明的另一实施方案中，佐剂蛋白由与线虫梯状蛋白部分同源的蛋白组成，该蛋白部分含有但不包括全部的RX(K/R)R或RXFR序列，并最优选避开该序列中的R，K(有时为F)残基。
在本发明的另一实施方案中，RX(K/R)R蛋白酶剪切基序(序列(1)中下划线部分)发生了突变，或未包括在佐剂蛋白中。
这种突变序列的应用例子是其中的R和K残基被甘氨酸残基“G”所取代的序列。第二个例子是其中R和K残基被丝氨酸残基“S”所取代的序列。第三个例子是其中R和K残基被任意置换的G或S所取代(例如GXGS，SXSG，GXSG等)。
可用的连接序列可能比天然多梯状蛋白中的长(例如至多达30个残基)，最优选5-20个氨基酸残基，且通常缺乏较强的形成二级结构(例如形成螺旋或形成β-折叠)的倾向以及通常缺乏可被胰蛋白酶样酶剪切的残基(原则上是K和R)。
这种形成二级结构倾向的缺乏可用于间隔地连接脯氨酸残基的工程化，该间隔例如每第三个残基或者每第十个残基，更优选每第4个，第5个或第6个残基。可选择地所述脯氨酸可随机的分布于融合蛋白序列的融合区域中，使得5个残基的较小的连接序列含有1个脯氨酸，而15个残基的较大的连接序列中含有3个或4个脯氨酸。
连接序列的目的在于首先将融合蛋白(也就是多梯状蛋白半族和抗原半族)中的两个蛋白部分，以一种对蛋白酶(与天然的多梯状蛋白序列情况不同，其中所述的功能域间边界对蛋白酶是非常稳定的)相对稳定的方式，连接在一起。所述序列的第二个功能是允许蛋白部分在生物合成过程中发生折叠以形成它们功能属性(佐剂性，抗原性/免疫原性)所依赖的天然结构域。当使用的连接多肽采用多种形式时，所述连接中不能含有来源于人自身抗原(或欲免疫动物的自身抗原)的序列是非常重要的。因此，通常应在数据库中筛选假定的连接序列，以确保连接序列与人类蛋白不具有显著的同源性，尤其是已知蛋白，或那些怀疑在自身免疫疾病病原学中起重要作用的诸如谷氨酸脱羧酶、胰岛素、甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶、胰岛细胞自身抗原、壁细胞自身抗原、肾自身抗原、髓鞘基础蛋白、髓鞘相关糖蛋白、髓鞘少突胶质糖蛋白的蛋白。
这项普遍规则的一个例外情况是当这些蛋白以非器官特异性分布于机体，或高丰度表达-例如血液白蛋白和免疫球蛋白的时候。例如，IgG的铰链区因为其并不是蛋白酶特异不稳定的，因此可为所述的融合蛋白提供很好的连接序列。类似地，尽管此序列暴露在外(以IgA的三维结构存在)且易于弯曲，由于仅有少数几种蛋白酶(例如脑膜炎球菌IgA蛋白酶)可以剪切这段序列，所以IgA的铰链区可为所述融合蛋白提供很好的连接序列。由于作为佐剂使用的蛋白开始于一个剪切基序的下游(羧基端)，并中止在下一个基序的上游(氨基端)，所以RX(K/R)R或RXFR基序可不包括在佐剂蛋白中。佐剂蛋白的起点和终点也可以位于蛋白酶基序的内部。
在本发明的一个优选实施方案中，所述多肽可与所述抗原可通过诸如戊二醛或EDC(乙基碳化二亚胺-一种水溶性的碳化二亚胺)的蛋白交联剂或优选通过诸如MBS或文献中以及Pierce Chemical Company ofRockford，Illinois，USA或Molecular Probes Inc.of Eugene，Oregon，USA目录中所述的其他类型的异型双功能试剂进行轭合或交联。
在本发明的另一优选实施方案中，采用本领域中公知的体外DNA重组技术和克隆技术方法，通过将编码抗原和佐剂的核酸进行读码框融合，产生含有所述抗原的融合蛋白形式的所述佐剂。
在本发明的另一优选实施方案中，采用合成的微粒或纳米微粒(例如聚交酯-乙交酯或“PLG”)，脂质体或免疫刺激复合物(ISCOMs)将所述多肽和所述抗原包被起来。
微粒制剂是所期望的，因为它引导抗原至抗原提呈细胞，该细胞偏好针对所述抗原的Th1形式的免疫反应，而且对抗所述多梯状蛋白部分朝向Th2形式的表现和IgE产生的任何倾向。这种制剂形式在针对抗原产生的所期望细胞介导的和IgG抗体反应的刺激是有用的。微粒制剂还能容易地整合用来将免疫反应偏移至Th1方向上的附加材料。这些材料通常包括抗IL10和IL4，诸如IFN-γ的Th1细胞因子和CpG DNA的抗体。
最好的情况是，微粒制剂包含所述的多梯状蛋白部分和抗原，针对该抗原在同一个微粒中形成预期的免疫反应，从而使制剂中的每一个微粒都有效负载地携带两个实体。这种制剂可以保证两种物质被任何给定的单一抗原体呈细胞摄取并最大化对于所述有效负载抗原的微粒制剂的Th1倾向作用，甚至当此抗原和多梯状功能域(以及上一段中描述的任意的Th1倾向性物质)并没有相连时，同时存在于同一微粒中除外。
微粒制剂优选具有显著程度的多梯状蛋白部分和抗原部分的表面暴露(5-10％)。一般情况下，微粒制剂过程中就可默认形成这种暴露程度。如果这样的暴露程度不能实现，上述蛋白部分可以通过共价轭合的形式轭合到所述微粒表面。抗原部分的表面暴露有利于刺激抗原特异性B细胞，并且有助于对于抗原的抗体反应。
通常这些微粒的大小为150纳米最高至10微米直径。更优选它们为200纳米最高至2微米。
在本发明的一个优选实施方案中，所述多肽和抗原共吸收或共沉淀在诸如氢氧化铝凝胶或磷酸钙的铝或钙盐上。
在本发明的另一优选实施方案中，所述多肽由核酸分子编码，该核酸分子是载体的一部分，其中所述多肽的表达由启动子可操纵地控制。
在本发明的另一优选实施方案中，所述抗原由核酸分子编码，该核酸分子是载体的一部分，其中所述抗原的表达由启动子可操纵地控制。
在本发明的一个优选实施方案中，该多肽和抗原由相同的核酸分子编码。优选的所述核酸分子编码所述多肽和所述抗原的阅读框架融合形式。
在本发明的一个优选实施方案中，所述阅读框架融合形式包括编码柔性连接序列(例如编码寡丝氨酸或甘氨酸或一定残基数量的丝氨酸-甘氨酸组合)的连接核酸分子。
优选的所述载体是一种“穿梭载体”，可以在大肠杆菌中进行扩增，并通过适合的诸如CMV或其它真核启动子的启动子在哺乳动物细胞中表达融合蛋白。
根据本发明另一方面，佐剂蛋白功能域(例如来自于犬恶丝虫的NCF)可由几个拷贝(最优选1，2或3拷贝)代表，并作为同一条多肽链的部分与抗原(单一拷贝)形成共线性融合。可选择地，佐剂蛋白功能域以单拷贝存在，与抗原蛋白融合形成寡聚体(例如二聚体，三聚体，四聚体等)。在后者的构建中，一旦抗原蛋白发生寡聚化，佐剂蛋白功能域就成为寡聚结构。最方便的情况是，单拷贝的佐剂蛋白与来自于传染性介质的寡聚蛋白形成读码框融合，针对该介质进行预防疫苗设计，例如流感红细胞凝集素或HIV衣壳糖蛋白gp120。可选择地，单拷贝佐剂蛋白功能域与不发生寡聚化的抗原相融合。在这种情况下，寡聚体形式可以通过与具有天然寡聚化倾向的蛋白部分(例如卷曲化卷曲)结合来产生。适合的寡聚化部分的例子为链球菌中(例如M蛋白)配对的螺旋卷曲化卷曲结构，其可形成二聚体卷曲化卷曲；同样也可以使用三聚体螺旋蛋白部分。其中一个例子是诸如CD23的2型膜蛋白的茎结构。被设计用来研究卷曲化卷曲蛋白的聚合性质的人工卷曲化卷曲多肽也是合适的。最优选的寡聚化程度是三聚体，因为它反应出犬恶丝虫(D.immitis)蛋白的预测天然存在形式。在佐剂功能域以多个拷贝的形式出现的情况下，最优选的实施方案将是犬恶丝虫蛋白的天然重复结构。当结构域作为单一多肽链的部分进行重复时，最优选的是在DNA水平上发掘可替代的密码子的使用，以避免直接的DNA序列重复，该序列在编码DNA扩增过程中会另外产生同源重组的问题和缺失问题。
通过采用交联剂将佐剂和抗原相连以形成轭合物。可选择地轭合物也可以是佐剂和抗原的翻译融合物。
在本发明的另一优选实施方案中，所述组合物包含有载体。
在本发明的另一优选实施方案中，所述组合物包含有第二种佐剂。
在本发明的优选实施方案中，所述抗原是T细胞依赖性抗原。
在本发明的另一优选实施方案中，所述抗原是一种诸如细菌荚膜多糖(例如肺炎链球菌，脑膜炎双球菌，流感嗜血杆菌或B型链球菌)的T细胞非依赖性抗原。
在本发明的优选实施方案中，所述抗原来源于致病性细菌。
所述抗原优选来源于选自以下的细菌种属金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculsis)；B型链球菌(Streptococcus group B)；肺炎链球菌(Streptoccocus pneumoniae)；螺旋杆菌(Helicobacter pylori)；淋病双球菌(Neisseria gonorrhoea)；A型链球菌(Streptococcus group A)；博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)；粗球孢子菌(Coccidiodes immitis)；Histoplasma sapsulatum；B型脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis type B)；弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)；大肠杆菌(Escherichia coli)；流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，沙眼衣原体(Chalmydia trachomatis)，肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)，鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)，土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)，炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)，肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridiumbotulinum)，鼠疫耶氏菌(Yersinia pestis)，Burkholderia mallei或Bpseudomallei。
在本发明的可选择的优选实施方案中，所述抗原来源于病毒性病原体。
所述抗原优选来源于选自以下的病毒性病原体人免疫缺失型病毒(HIV l型与2型)；人T细胞白血病病毒(HTLV 1型与2型)；埃博拉病毒或其他出血热病毒；人乳头状病毒(HPV)；乳多空病毒(papovavirus)；鼻病毒；脊髓灰质炎病毒；疱疹病毒；腺病毒；非洲淋巴瘤病毒(EB病毒)；甲、乙、丙型流感病毒；乙、丙型肝炎病毒；天花病毒；SARS轮状病毒。
在本发明的另一优选实施方案中，所述抗原来源于寄生性病原体。
在本发明的另一优选实施方案中，所述抗原来源于选自以下的寄生性病原体克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)；布氏锥虫(Trypanosoma brucei)；血吸虫属(Schistosoma spp)；疟原虫属(Plasmodium spp)；罗阿丝虫(LoaLoa)；利什曼原虫属(Leishmania spp)；(人)蛔虫(Ascaris lumbricoides)；犬恶丝虫(Dirofilaria immitis)；鼠弓形体(Toxoplasma gondii)。
在本发明的另一优选实施方案中，所述抗原来源于真菌病原体。
在本发明的优选实施方案中，所述抗原来源于念珠菌属的真菌病原体，优选种为白色念珠菌。
在本发明的另一优选实施方案中，所述抗原是肿瘤特异性抗原(例如癌胚抗原，人多形上皮粘蛋白，MUC-1，或诸如胃泌素的涉及激素依赖性癌症的激素或其类似物)。
在本发明的另一优选实施方案中，所述抗原是神经节苷脂抗原。
在本发明的另一优选实施方案中，所述抗原是来源于诸如激素、激素受体、T细胞受体或者精子抗原的人类宿主抗原。
在本发明的另一优选实施方案中，所述抗原是朊病毒蛋白。
在本发明的另一优选实施方案中，所述抗原是淀粉样蛋白或诸如阿耳茨海默氏病淀粉样前体蛋白中的40残基淀粉样多肽片段(Aβ)的淀粉样蛋白片段。
在本发明的另一优选实施方案中，所述抗原是诸如蓖麻毒素的毒素，或毒素或类毒素的片段。
本发明的另一方面提供了编码轭合物的核酸分子，其中所述轭合物包括与线虫来源的梯状蛋白翻译融合的抗原性多肽，在所述梯状蛋白中，在上游7，8或9残基位置RX(K/R)R或RRFR基序前面有半胱氨酸残基。
本发明的另一方面提供通过给予本发明的多梯状蛋白或其部分(例如DiAg)的溶液或微粒(例如脂质体)制剂来治疗过敏性疾病的方法。
这种治疗过敏性疾病方式的优点在于它可以应用于所有或任何一种过敏性疾病，而不需要考虑过敏原，甚至在对过敏原一无所知(例如过敏性哮喘的情况)的情况下依然有效。DiAg及其相关多梯状蛋白，可以被用来产生非同寻常的大量非抗原特异性IgE来竞争肥大细胞和嗜伊红细胞表面的位点(高亲和性IgE受体)，剥夺这些细胞与过敏源特异性IgE的结合，防止它们在与过敏源接触后被激活以及释放出炎症介质。
例如，因为DiAg在人寄生性感染中并不产生DiAg特异性的IgE，所以使用DiAg进行治疗产生过敏反应的危险是最小的。根据本发明的这一方面，可以使用单个多梯状(例如DiAg)功能域。这样的功能域能够以药物可接受的盐赋形剂制成蛋白溶液进行给药，或者在用于哺乳动物表达的质粒或病毒载体中由DNA或RNA编码，或者存在于作为能够在体内表达的质粒构建的疫苗脂质体载体中。
本发明另一方面提供增强针对多价疫苗的免疫反应的方法，尤其是通过载体蛋白-多梯状轭合物或嵌合蛋白与诸如相同载体蛋白与多糖抗原的多种抗原轭合物共形成的多价多糖疫苗。
在这种情况下，这两种载体蛋白通常可以是完全相同的蛋白，或者是相互之间至少具有一个相同的T辅助细胞表位的不同蛋白。其中的一种或两种都可以是合成的多肽。其中的一个例子是多价肺炎球菌(pneumoccal)轭合物疫苗，它含有数个不同的多糖，每个多糖都与突变的白喉(diphtheria)类毒素相轭合。通过向这种多梯状蛋白-白喉类毒素轭合物的混合轭合物中简单添加，针对该轭合物中所有多糖抗原的免疫反应都将被强烈的提升。
本发明的另一方面提供了编码轭合物的核酸分子，其中所述轭合物包括翻译融合到佐剂的抗原性多肽，所述佐剂与选自SEQ 1，SEQ 2，SEQ 3，SEQ 4，SEQ 5，SEQ 6，SEQ 7，SEQ 8，SEQ 9，SEQ 10，SEQ 11，SEQ 12，SEQ 13，SEQ 14，SEQ 15，SEQ 16，SEQ 17，SEQ 18，SEQ 19中的序列有至少50％的同源性，更优选具有70％的同源性，甚至更优选有至少90％的同源性。
本发明的另一方面提供编码轭合物核酸分子，其中所述轭合物包括翻译融合到佐剂的抗原性多肽。所述佐剂是至少有20个连续氨基酸与选自SEQ 1，SEQ 2，SEQ 3，SEQ 4，SEQ 5，SEQ 6，SEQ 7，SEQ 8，SEQ 9，SEQ10，SEQ 11，SEQ 12，SEQ 13，SEQ 14，SEQ 15，SEQ 16，SEQ 17，SEQ 18，SEQ 19中的序列的20个氨基酸部分在序列上完全一致的蛋白。
在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子是表达载体的一部分，其中该所述核酸分子可操纵地连接至启动子上。
在本发明的另一优选实施方案中，所述载体选自质粒；噬菌粒或病毒。
在本发明的另一优选实施方案中，所述基于病毒的载体的是以选自腺病毒；逆转录病毒；腺相关病毒；疱疹病毒；慢病毒和杆状病毒的病毒为基础的。
本发明所用“载体”可以是所期望序列可插入其中的任意一些核酸。载体包括但不限于质粒、噬菌粒和病毒基因组。克隆载体是指可以在宿主细胞中复制，且通常具有一个或多个限制性内切酶识别位点，并在此位点以确定的方式进行该载体剪切，并将期望的DNA序列连接进来，从而在宿主细胞中保留重组载体的复制能力。在质粒的情况下，在宿主通过有丝分裂进行繁殖前，在宿主细菌体内质粒以拷贝数增加的时候，期望序列的复制可以发生很多次或在每个宿主中仅发生一次。在噬菌体的情况下，在裂解期可以主动发生复制，而在溶原期被动发生。
载体可以含有一段或多段筛选标记序列，该序列适合用于含有或不含有该载体转化或转染后的细胞的鉴定。这些标记包括，例如编码增加或降低对抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白的基因，编码可采用本领域中公知(例如β-半乳糖甘酶，荧光素酶)的标准分析检测的其活性酶的基因，以及可视影响转化或转染后在细胞，宿主，集落或噬菌斑(例如诸如绿色荧光蛋白GFP的多种荧光蛋白)表型的基因。优选的载体能够自我复制，也被称为游离型载体。可选择地载体可适合插入到染色体中，称为整合载体。本发明中的载体通常地提供可以介导细胞/组织特异性表达的转录控制序列(启动子序列)。这些启动子序列可以是细胞/组织特异性的，可诱导的或组成型表达的。
启动子是本领域认知的术语，为了清晰地对其进行说明，其包括以下仅由例子提供的特征，并不是任何方式的限制。增强子元件是一段通常存在于基因(增强子也可以存在于基因序列的3’端，甚至位于内含子序列的内部，因此它们是位置独立的)转录起始位点5’端的顺式作用核酸序列。增强子的功能是增加与其相连基因的转录效率。增强子的活化依赖于与增强子元件特异性结合的反式作用转录因子(多肽)。转录因子的结合/活化(详见Eukaryotic Transcription Factors，by David S Latchman，Academic Press Ltd，San Diego)与很多环境相关因素有关，其包括例如而并非为对其进行限制，中间代谢产物、环境效应因子。
启动子元件还包括所谓的TATA框，RNA聚合酶起始选择序列(RIS)和CAAT框序列元件，其功能在于选择一个转录起始位点。这些序列也可以与多肽相结合，该多肽的功能是通过RNA聚合酶来相互地促进转录起始的选择。
适应性还包括自我复制序列，其同时适合所述载体在真核细胞或原核寄主中的维持，因此称为“穿梭载体”。维持自我复制的载体被称为游离型载体。因为这些分子能够连接较大的DNA片段(30-50kb DNA)，所以游离型载体是所需要的。这类游离型载体的如国际公开第WO98/07876号所述。
促进编码基因载体病毒的适应性包括转录终止/多聚腺苷酸序列本表达的基因。其还也包括内部核糖体进入位点(IRES)，其功能是最大化以双顺反子或多顺反子表达盒排列的编码基因载体的表达。
表达控制序列包括所谓的位点控制区域(LCRs)。当在小鼠中进行转基因构建分析时，这些调控元件对于相连基因具有位置独立性和拷贝数依赖性的表达。LCRs包括可将转基因从相邻异染色质沉默效应(Grosveldet al.，Cell(1987)，51975-985.)中隔离开的调节元件。
这些适应性在本领域中是公知的。总体上有相当多的文献是对表达载体构建和重组DNA技术进行描述的。请参阅Sambrook et al(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，Cold Spring Harbour，NY and references therein；Marston，F(1987)DNACloning TechniquesA Practical Approach Vol III IRL Press，Oxford UK；DNA CloningF M Ausubel et al，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994).
本领域中公知载体中的核酸序列被称为CpG基序或者是ISSs(免疫刺激序列)。尽管与这些二核苷酸相邻的序列可以影响诱导的刺激程度，在这些序列最低限度由作为中心的非甲基化CG二核苷酸组成。这些ISSs可以通过toll-样受体(TLR9)来激活抗原体呈细胞(APCs)。考虑到它们可以通过激活APCs来增强免疫反应，接种DNA疫苗的总的目的就应该将这些基序包含载体中。
在本发明的另一优选实施方案中，所述启动子是组织特异性启动子，例如允许采用基于DNA疫苗在肌肉中进行免疫的肌肉特异性启动子。
肌肉特异性启动子在本领域中是公知的。例如，国际公开第WO0009689号公开了一种横纹肌表达基因及其同源启动子，SPEG基因。欧洲专利第1072680号公开了筒箭毒碱启动子的调控序列。美国专利第5795872号公开了采用肌酸激酶启动子在肌肉组织中实现外源蛋白的高效表达。肌肉特异性基因MyoD显示出仅限于成肌细胞中的表达模式。
本发明的另一方面提供了一种包含本发明所述核酸或载体的疫苗。
本发明的另一方面提供了针对某种抗原免疫动物的方法，该方法包括给予足以刺激针对所述抗原的免疫反应的有效剂量的本发明的轭合物。
本发明优选方法中，所述的动物是人类。
在本发明的可选择的优选方法中，所述动物选自小鼠；大鼠；仓鼠；山羊；绵羊；狗或猫。
在本发明的另一优选方法中，所述动物是免疫姑息的，例如Hu-SCID-PBL小鼠，或SCID-hu小鼠，或另外移植了人淋巴细胞或淋巴细胞前体的小鼠或其它动物，从而能够诱导人类抗体或T细胞反应。
免疫缺陷或免疫姑息的哺乳动物在本领域是公知的。例如，在欧洲专利第0322240号和欧洲专利第0438053号中公开了将造血细胞移植到CID或SCID宿主有机体(参见McGuire et al Clinical Immunology andImmunopathology(1975)3555-566.)，其中的每一个在此引用作为参考。国际公开第WO9505736号，其在此引用作为参考，同样教导了SCID有机体的用途药剂其作为人细胞宿主的作用。
在本发明的另一优选方法中，所述的动物是用于人免疫球蛋白或T细胞受体DNA转基因的。
在本发明的另一优选方法中，所述免疫反应是针对所述轭合物的抗体产生。
在本发明的另一优选方法中，所述免疫反应是识别所述轭合物抗原部分的T辅助细胞的产生。
在本发明的另一优选方法中，所述免疫反应是识别所述轭合物抗原部分的溶解性T淋巴细胞的产生。
尽管免疫方法并不限于特定的给药方式上，但优选的给药途径为口服(例如粘膜)，皮内，皮下，鼻内或肌肉。
在本发明从另一方面提供了根据本发明所述方法来获得抗体。
在本发明的优选实施方案中，所述抗体为治疗性抗体。
在本发明的另一优选实施方案中，所述抗体为诊断抗体。优选的所述诊断抗体具有标记或标签。
在本发明的优选实施方案中，所述抗体是单克隆抗体或其结合片段。优选的所述抗体是人源化或嵌合抗体。
通过重组方法制备的嵌合抗体含有的抗体的可变区和人抗体的非可变区或恒定区。
通过重组方法制备的人源抗体组合有抗体互补决定区与人抗体的恒定区(C)和来自可变区(V)的框架结构区域。
嵌合抗体是重组抗体，其中将小鼠或大鼠抗体的全部V-区与人抗体的C-区相结合的。人源化抗体是重组杂交抗体，其将啮齿类抗体V-区的互补决定区和人类抗体V-区的框架结构区融合到一起。人抗体C-区的结构也可以采用。互补决定区(CDRs)包括抗体轻链和重链的N-端功能域，大部分V-区的变化限于其中。这些区域可以在抗体分子表面形成环状结构。这些环状结构为抗原和抗体提供了结合表面。
优选的所述片段是单链抗体可变区(scFV’s)或抗体片段功能域。如果存在产生特异的单克隆抗体的杂交瘤，本领域所述技术人员就可以通过RT-PCR的手段从所述杂交瘤的mRNA中分离出来scFV’s。可选择地可以采用噬菌体显示技术来鉴定表达scFV’s的克隆。功能域抗体是抗体中最小的结合部分(大约13kD)。这种技术的例子如美国专利第6,248,516号、美国专利第6,291,158号、美国专利第6,127,197号和欧洲专利第0368684号所公开，其在此引用作为参考。
在本发明的优选实施方案中，所述片段为Fab片段。
在本发明的另一优选实施方案中，所述抗体选自F(ab’)2、Fab、Fv和Fd片段；CDR3区域；单链可变区片段或功能域区片段。
来源于非人动物的抗体可以激发针对外源抗体的免疫反应，并从循环系统中清除。因为在重组杂交抗体中啮齿类(即外源)抗体数量有所下降，而人抗体区域又不产生免疫反应，对人进行注射时嵌合抗体和人源化抗体具有降低的抗原性。这导致了较弱的免疫反应和对抗体清除作用的降低。当采用治疗性抗体对人类疾病进行治疗时，这是非常令人期待的。人源化抗体的旨在具有更少“外源”抗体区域，并由此具有比嵌合抗体更低的免疫原性。
在本发明的另一优选实施方案中，所述抗体为调理素抗体。
吞噬作用是由巨噬细胞和多形白细胞介导的，并参与微生物、损伤的细胞或死细胞、细胞碎片、不溶微粒和激活凝血因子的吞入和消化。调理素是促进对上述外源体进行吞噬作用的介质。所以，调理素抗体也具有相同的功能。调理素的例子是抗体的Fc部分或补体C3。
本发明的另一方面提供制备产生本发明所述单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法，所述方法包括i)采用本发明所述的轭合物、组合物、核酸或载体对具有免疫活性的哺乳动物进行免疫；ii)将免疫后的免疫活性哺乳动物的白细胞与骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤细胞；iii)针对与本发明所述轭合物抗原的结合活性，筛选步骤(ii)获得的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体；iv)培养所述杂交瘤细胞来增殖和/或分泌所述单克隆抗体；及v)从培养物的上清中回收单克隆抗体。
优选的所述免疫活性的动物是小鼠。可选择地所述免疫活性动物是大鼠。
本发明的另一方面提供了根据本发明所述方法获得的杂交瘤细胞系。
参考以下的材料、方法和序列现仅以实施例的方式对本发明的实施方案进行描述。
材料与方法1.抗原-佐剂轭合物的制备a.重组佐剂蛋白的制备采用多聚酶链式反应(PCR)，利用引物(5_引物，包含NdeI限制性内切酶识别位点5_GCATATGAATGATCATAATTTAGAAAGC-3，3_引物，包含BamHI限制性内切酶识别位点5_-CTAAAGGATCCTATCACCGCTTACGCCGTTCATTCATTG-3)，从犬恶丝虫的cDNA文库对DiAg基因的V1功能域(一个重复单元)进行扩增。用NdeI和BamHI消化扩增的DNA后克隆到pET3a载体上(Stratagene)，在大肠杆菌HMS174(DE3)中进行表达。根据以下所述进行rDiAg的纯化。用30ml 50mM HCl和5mMEDTA在4℃重悬5g细胞团，然后12,000 g离心10min。采用60-80％的饱和硫酸铵对上清液中的重组DiAg进行沉淀后过Superdex 200柱。采用固定化的多粘菌素B移去浓缩rDiAg溶液中大肠杆菌热源污染物。纯化后的佐剂蛋白经过冻干处理后储存于-20℃直至使用。
b.佐剂蛋白与抗原的轭合下面仅对从多种将抗体和多肽偶联的方法选出的一种作为示例进行描述将犬恶丝虫多梯状蛋白V1结构域佐剂(YFQTYLSWLTDAQKDEIKKMKEEGKSKMIQKKIFDYFESLTGDKKKKAAEELQQGCLMALSEIIGNEKMLMLKEIKDSGADPEQIEDMLKLVVDKEKKKRIDEYPPVCRKIYAAMNERRK)以3-30mg/ml的浓度溶解于pH 7.2的0.1M磷酸钠、0.15M NaCl溶液中。向其中加入6mg的硫代-SMCC(Pierce)，将该混合物于室温孵育30min。采用pH 7.2的0.1M磷酸钠，0.15M NaCl作为层析缓冲液，以脱盐柱(Sephadex G-25)或超滤的方法可随即去除过量的交联物。将含有多肽(经OD280测定)的组分合并，并将马来酰亚胺激活的多肽浓缩到大约10mg/ml。
与此同时，抗原例如，纯化的重组HSV糖蛋白D抗原(gD)以1-5mg/ml的浓度溶解或交换于pH 7.2的0.1M磷酸钠、0.15M NaCl溶液中。以为1mg/ml浓度，在每ml gD中加入10-40μl SATA(Pierce)储存液(8mg/ml溶于DMSO或DMF)。室温反应30min。通过透析、凝胶过滤或超滤从未反应的SATA中纯化gD。
位于SATA修饰gD上的乙酰巯基化基团通过以下描述进行脱保护制备pH7.2的含有10mM EDTA的0.1M磷酸钠中的0.5M羟胺溶液。每毫升抗体中加入100μl上述溶液，室温放置2小时。将硫醇化的gD超滤纯化到pH7.2的0.1M磷酸钠、0.1M氯化钠、10mM EDTA溶液，并随即与经马来酰亚胺处理的DiAg以gD∶DiAg的1∶10的摩尔比混合。37C反应持续两小时。采用超滤的方法从未发生反应的DiAg中纯化轭合的gD-DiAg。
2.抗原佐剂融合蛋白的制备采用多聚酶链式反应(PCR)，利用引物(5_引物，包含HindII限制性内切酶识别位点5_GAAGCTTAATGATCATAATTTAGAAAGC-3，3_引物，包含BamHI限制性内切酶识别位点5_-CTAAAGGATCCTATCACCGCTTACGCCGTTCATTCATTG-3)，从犬恶丝虫的cDNA文库扩增犬恶丝虫多梯状蛋白的V1功能域(一个重复单元)。用HindIII和BamHI消化扩增的DNA。
与此同时，从HSV感染的细胞，使用结合附加的核酸的引物和在5’引物具有BamHI识别序列的引物，通过扩增得到gD编码DNA，从而通过BamHI消化并与DiAg的编码片段相连，使编码DiAg和gD的cDNA是相互在共同的读码框中，使得所述DNA连续地转录为可翻译成由DiAg和gD组成的融合蛋白的mRNA。将这两个DNA片段连入哺乳动物表达载体(pcDNA3.1(Invitrogen))，并将该质粒转化感受态大肠杆菌以产生足量的质粒(使用Qiagen柱进行纯化)来对COS-7细胞进行电穿孔转染。3-5天后，采用抗-DiAg亲和柱对转染的COS-7细胞的上清液进行纯化，在经过凝胶过滤的进一步纯化后，融合蛋白就可以用来进行免疫了。
3.编码抗原-佐剂融合蛋白的DNA疫苗的制备含有插入片段并如上所述制备的pcDNA3.1表达载体，可以直接作为DNA疫苗通过肌肉注射来使用。
参考文献Tomlinson et al.J.Immunol.143 2349-2356(1989)；Paxton et al.InfectImmunol.61 2827-2833(1993)
序列表<110>艾助万提斯有限公司<120>多肽佐剂<130>P104039W0<150>0301433.9<151>2003-01-22<160>34<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>447<212>PRT<213>犬恶丝虫(Dirofilaria immitis)<400>1Lys Val Glu Asp Met Leu Lys Leu Val Val Asp Lys Glu Lys Lys Lys15 10 15Arg Ile Asp Glu Tyr Pro Pro Val Cys Arg Lys Asn Phe Asn Pro Gly20 25 30Asn Glu Arg Arg Lys Arg Asn Asp His Asn Leu Glu Ser Tyr Phe Gln35 40 45Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Thr Asp Ala Gln Lys Asp Glu Ile Lys Lys50 55 60Met Lys Glu Glu Gly Lys Ser Lys Met Asp Ile Gln Lys Lys Ile Phe65 70 75 80Asp Tyr Phe Glu Ser Leu Thr Gly Asp Lys Lys Lys Lys Ala Ala Glu85 90 95Glu Leu Gln Gln Gly Cys Leu Met Ala Leu Ser Glu Ile Ile Gly Asn100 105 110
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Lys Arg Met Lys Glu Ser Gly Met Asp Phe Glu Gln Ile Lys Ala Lys85 90 95Val Glu Ser Ile Leu Asp His Val Thr Asp Glu Thr Gln Lys Gln Lys100 105 110Val Gln Glu Tyr Gly Ala Ala Cys Arg Lys Val Tyr Ala Glu Thr Asp115 120 125Ser Arg Gln Lys Arg130<210>14<211>352<212>PRT<213>彭氏(布鲁格)丝虫<400>14Arg Leu Leu Ser Phe Arg His Arg Leu Asp Phe Arg Ser Ser Gln Gly15 10 15Phe Leu Arg Gln Ile Val Gly Asp Glu Lys Met Ala Glu Leu Lys Gln20 25 30Met Lys Glu Ser Gly Leu Gly Gln Glu Glu Leu Arg Ala Lys Val Asp35 40 45Glu Met Leu Glu His Val Thr Asp Glu Ala Lys Lys Gln Lys Ile His50 55 60Glu Tyr Gly Pro Ala Cys Arg Lys Ile Tyr Glu Asp Arg His Lys Arg65 70 75 80Asp Asn His Glu His Ser Leu Asp Asp Tyr Phe Arg Thr His Leu Ser85 90 95Trp Leu Thr Asp Ala Gln Lys Asp Glu Ile Arg Lys Met Lys Glu Glu100 105 110
Gly Lys Gln Lys Met Asp Met Gln Lys Lys Ile Leu Asp Tyr Tyr Glu115 120 125Asn Leu Thr Gly Asp Gly Lys Lys Glu Ala Gly Glu Lys Leu Arg Gly130 135 140Gly Cys Arg Glu Leu Leu Arg Gln Ile Val Gly Asp Glu Lys Met Ala145 150 155 160Glu Leu Lys Gln Met Lys Glu Ser Gly Leu Gly Gln Glu Glu Leu Arg165 170 175Ala Lys Val Asp Glu Met Leu Glu His Val Thr Asp Glu Ala Lys Lys180 185 190Gln Lys Ile His Glu Tyr Gly Pro Ala Cys Arg Lys Ile Tyr Glu Asp195 200 205Arg His Lys Arg Asp Asn His Glu His Ser Leu Asp Asp Tyr Phe Arg210 215 220Thr His Leu Ser Trp Leu Thr Asp Ala Gln Lys Asp Glu Ile Arg Lys225 230 235 240Met Lys Glu Glu Gly Lys Gln Lys Met Asp Met Gln Lys Lys Ile Leu245 250 255Asp Tyr Tyr Glu Asn Leu Thr Gly Asp Gly Lys Lys Glu Ala Gly Glu260 265 270Lys Leu Arg Gly Gly Cys Arg Glu Leu Leu Arg Gln Ile Val Gly Asp275 280 285Glu Lys Met Ala Glu Leu Lys Gln Met Lys Glu Ser Gly Leu Gly Gln290 295 300Glu Glu Leu Arg Ala Lys Val Asp Glu Met Leu Glu His Val Thr Asp305 310 315 320Glu Ala Lys Lys Gln Lys Ile His Glu Tyr Gly Pro Ala Cys Arg Lys325 330 335
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<400>16His Thr Met Glu His Tyr Leu Lys Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Thr Glu15 10 15Glu Gln Lys Glu Lys Leu Lys Glu Met Lys Glu Ala Gly Lys Thr Lys20 25 30Ala Glu Ile Gln His Glu Val Met His Tyr Tyr Asp Gln Leu His Gly35 40 45Glu Glu Lys Gln Gln Ala Thr Glu Lys Leu Lys Val Gly Cys Lys Met50 55 60Leu Leu Lys Gly Ile Ile Gly Glu Glu Lys Val Val Glu Leu Arg Asn65 70 75 80Met Lys Glu Ala Gly Ala Asp Ile Gln Glu Leu Gln Gln Lys Val Glu85 90 95Lys Met Leu Ser Glu Val Thr Asp Glu Lys Gln Lys Glu Lys Val His100 105 110Glu Tyr Gly Pro Ala Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ala Thr Thr Leu Gln115 120 125His His Arg Arg Arg Arg His His Phe Thr Leu Glu Ser Ser Leu Asp130 135 140Thr His Leu Lys Trp Leu Ser Gln Glu Gln Lys Asp Glu Leu Leu Lys145 150 155 160Met Lys Lys Asp Gly Lys Thr Lys Lys Glu Leu Glu Ala Lys Ile Leu165 170 175His Tyr Tyr Asp Glu Leu Glu Gly Asp Ala Lys Lys Glu Ala Thr Glu180 185 190
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Ala Gly Asp Lys Gln Ala Met Tyr Lys Lys Val Met Glu Ile Tyr Asp165 170 175Ser Val Ser Gly Asp Val Lys Glu Lys Ala Thr Val Glu Leu Lys Ala180 185 190Ala Cys Arg His Tyr Val Lys Asp Ser Ile Gly Glu Glu Asn Ala Glu195 200 205Lys Leu Lys Glu Met Lys Glu Ser Gly Ala Thr Pro Glu Ala Ile Ala210 215 220Ala Lys Val Glu Glu Phe Ile Ala Ala Ile Thr Asp Glu Lys Lys Lys225 230 235 240Ala Gln Ala Glu Arg Ala Ala Val Ala Cys Lys Lys Ile Tyr Gly Val245 250 255Ala Arg Arg Leu Lys Arg Glu His His Glu His Asn Leu Glu Glu Ala260 265 270Met Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Leu Asn Asp Glu Gln Lys Glu Glu Val275 280 285Lys Lys Ile Tyr Gly Thr Gly Asp Arg Ile Ala Val Glu Thr Lys Val290 295 300Leu Gln Met Phe Glu Asn Ala Ser Gly Asp Val Lys Glu Lys Ala Ser305 310 315 320Val Gln Leu Arg Ala Ala Cys Lys His Tyr Ile Lys Glu Tyr Ile Gly325 330 335Asp Glu Asn Val Ala Lys Ile Lys Glu Met Lys Asp Ser Gly Ala Ser340 345 350Asn Glu Ala Met Ser Ala Lys Ile Asp Glu Phe Ile Ala Ala Ile Pro355 360 365
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<212>DNA<213>猪蛔虫<400>31atacaatgga acactatctc aaaacctatc tgagctggct gacagaagaa caaaaagaaa 60agctgaaaga aatgaaagag gcaggcaaaa cgaaggcaga gatccaacat gaagtgatgc 120actactacga tcaactgcat ggtgaagaaa aacaacaagc aacagaaaag ctcaaagtgg 180gctgcaaaat gctcctgaaa ggaatcatcg gcgaggaaaa ggtagttgag ctgaggaaca 240tgaaggaagc aggagcagac attcaagaac ttcaacaaaa ggttgagaag atgctttccg 300aggtcacaga cgaaaagcag aaagaaaaag tccacgagta tggacccgca tgcaaaaaga 360tcttcggtgc gacaacactg caacatcatc gacgaaggag gcatcatttc acccttgaaa 420gtagtctaga tacccatctg aaatggctca gtcaggaaca gaaagatgaa ttgttaaaaa 480tgaagaaaga tggaaaaaca aagaaagagc tcgaggcgaa aattcttcat tactatgacg 540aactcgaagg agatgctaaa aaagaggcaa ctgagcattt gaaaggcgga tgcggcgaaa 600ttcttaagca tgttgttggg gaagagaagg cagcagagct gaagaacctc aaagactcgg 660gagcaagcaa agaagaactg aaagccaaag tcgaagaggc gcttcatgca gtgaccgacg 720aggagaagaa gcaatacatt gccgattttg gaccagcatg caagaaaatc tatggtgtac 780atacttcgcg acgaaggagg catcatttca cccttgaaag cagtctagat acccatctga 840aatggctcag tcaggaacag aaagatgaat tgttaaaaat gaagaaagat ggaaaggcaa 900agaaagagct cgaggcgaaa attcttcatt actatgacga actcgaagga gatgctaaaa 960aagaggcaac tgagcatttg aaaggcggat gcgccgaaat tcttaagcat gttgttgggg1020aagagaaggc agcagagttg aagaacctca aagactcggg agcaagcaaa gaagaactca1080aagccaaagt cgaagaggcg cttcatgcag tgaccgacga ggagaagaag caatacattg1140ccgattttgg accagcatgc aagaaaatct atggtgtaca tacttcgcgg cgaaggaggc1200atcatttcac ccttgaaagt agtctagata cccatctgaa atggctcagt caggaacaga1260aagatgaatt gttaaaaatg aagaaagatg gaaagacaaa gaaagatctt caagctaaaa1320ttcttcatta ctatgacgaa ctcgaaggag atgctaaaaa ggaggcaact gagcatttga1380aggacggatg ccgcgaaatt cttaagcacg ttgttgggga agagaaggaa gcagagctga1440
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<400>34cattcacttg aagacgcaat ggggaagtat ttgacgtggt taactgatga ccaaaaggag 60gaggtcaagt cactttacac ggatgaaggc agaggtgccg tgtatgataa aattatggag 120tacttcgatg aggctacagg tgacaggaag gagaaagcag caaaggaatt gaagggcgct 180tgtaagcatt atgtgaaaga cctgattggc gagaaaaatg gtgagatgat caaagagatg 240aaagaaaacg gggcttcaaa tgatgccatc gcaacaaaag tcgaagagct gattgaagca 300atcgcagacg ataagaaaaa ggcgcaggca cttcgagcat ctgcaaactg taggaaaatt 360tatggagtgg ctcgtcgatt cagaagagat caccatgaac acaacttgga agaagccatg 420gagaaatatc tcacctggct gaatgatgac caaaaagagg aggtcaagaa gttgtacggc 480gcaggcgaca aacaagccat gtacaagaag gtgatggaaa tctatgacag tgtttctggt 540gacgtgaaag agaaggccac cgtcgagctg aaggcagcct gcaggcacta tgttaaggac 600tctatcggtg aggagaatgc cgagaagctc aaggagatga aggaaagtgg agctaccccg 660gaagccattg ctgccaaagt tgaggaattc atagctgcca tcaccgatga gaagaagaaa 720gcacaagcag aacgagccgc agtagcgtgt aaaaagatat atggtgtggc ccggcgccta 780aagagggagc atcacgaaca taaccttgag gaagccatgg aaaagtacct cacttggttg 840aatgacgaac aaaaggagga ggtgaagaaa atctatggaa ccggagatcg tatcgcagtc 900gagacgaaag tactgcagat gtttgagaac gcctcaggtg acgtcaagga gaaagcatct 960gtacaactga gagccgcttg caaacactac atcaaagagt acattggaga cgagaacgtg1020gctaaaatca aggagatgaa agacagtgga gcgagcaatg aggcgatgtc tgctaaaatt1080gacgagttca tcgctgccat acctgagaag gagagaaaag agaaagctga acgggtagca1140gcgtcatgca agaaggttta tggggtgaaa agccgaatga gaaggtatcc ggcgcgcagc1200acgcgttcca catagagggt tacaatagac gtgcattgag agcccagcgt catctggctg1260aaaggcgtcg acgaaatgag gctaaggttc atttcttaga tatctgaata atagcatacc1320aatttatgta tctaatgttg atcgtgaatt ttgtaacaga caccctacta ggtcaagatg1380atcttttttc ttaatattgt ccacaataaa tatttgacgg g142权利要求
1.一种作为免疫佐剂的多肽的用途，所述多肽包括i)由RXK/RR氨基酸残基组成的氨基酸基序，其中R为精氨酸，X为任一氨基酸残基，K为赖氨酸；和/或ii)由RXFR氨基酸残基组成的氨基酸基序，其中F为苯丙氨酸，且在所述基序氨基端前约7-9残基位置所述基序前面有半胱氨酸残基，所述多肽通过至少一个氨基酸残基的添加、缺失或取代来修饰。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述多肽由核酸分子编码，其中有至少一个RX(K/R)R(其中R为精氨酸，X为任一氨基酸，K/R为赖氨酸或精氨酸，R为精氨酸)或RXFR(其中F为苯丙氨酸)氨基酸的基序，在此RX(K/R)R或RXFR基序N端前7，8或9残基位置所述基序前面有半胱氨酸残基。
3.如权利要求1或2中所述的用途，其中该多肽由线虫核酸分子所编码。
4.含有至少一种多肽的疫苗组合物，其中所述多肽包括i)由氨基酸残基RX(K/R)R组成的氨基酸基序，其中R为精氨酸，X为任一氨基酸，K为赖氨酸；和/或ii)由RXFR氨基酸残基组成的氨基酸基序，其中F为苯丙氨酸，且在所述基序氨基端前约7-9残基位置所述基序前面有半胱氨酸残基，所述的多肽能够通过至少一个氨基酸残基的添加、缺失或取代来修饰以及通过至少一种引发预期免疫反应的抗原来修饰。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述多肽与所述抗原混合。
6.如权利要求4或5所述的组合物，其中所述多肽与所述抗原轭合，连接或交联。
7.如权利要求4-6中任一权利要求所述组合物，其中所述多肽包括选自SEQ NO.1；2；3；4；5；6；7；8；9；10；11；12；13；14；15；16；17；18；19的氨基酸序列；或与所述SEQ ID序列有至少50％同源性的多肽。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述多肽与所述SEQ ID序列有至少70％的同源性。
9.如权利要求7所述的组合物中，其中所述多肽与所述SEQ ID序列有至少90％的同源性。
10.如权利要求7-9中任一权利要求所述组合物，其中所述多肽的长度为至少20个连续的氨基酸，其序列相同于选自SEQ ID No1；2；3；4；5；6；7；8；9；10；11；12；13；14；15；16；17；18或19序列中的至少20个氨基酸部分。
11.如权利要求所述的组合物，在本发明的优选实施方案中，所述多肽是这种蛋白的淋巴细胞结合片段。
12.如权利要求4-11中任一权利要求所述的组合物，其中所述多肽由包括选自SEQ ID No20；21；22；23；24；25；26；27；28；29；30；31；32；33或34的核酸序列的核酸分子；或由与所述核酸分子杂交的编码具有免疫佐剂活性多肽的核酸分子所编码。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述核酸分子在严谨杂交条件下进行杂交。
14.如权利要求12或13所述的组合物，其中所述多肽由选自SEQ IDNo20；21；22；23；24；25；26；27；28；29；30；31；32；33或34的核酸序列的60个核苷酸部分所编码。
15.如权利要求4-14中任一权利要求所述的组合物，其中将所述多肽与所述抗原轭合，连接或交联。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述多肽作为含有所述抗原的融合蛋白被制备。
17.如权利要求15或16所述的组合物，其中所述多肽和所述抗原被包被在合成的微粒或纳米颗粒、脂质体、或免疫刺激复合物中。
18.如权利要求15-17中任一权利要求所述的组合物，其中所述多肽与所述抗原共吸收或共沉淀在铝上。
19.如权利要求15-17中任一权利要求所述的组合物，其中所述多肽与所述抗原共吸收或共沉淀钙盐上。
20.如权利要求15-19中任一权利要求所述的组合物，其中所述多肽与所述抗原由相同的核酸分子所编码。
21.如权利要求20所述的组合物，其中所述多肽与所述抗原以读码框架融合的形式来连接。
22.如权利要求21所述的组合物，其中读码框架融合的形式包括编码柔性连接序列的连接性核酸分子。
23.如权利要求21或22所述的组合物，其中所述组合物含有至少两个拷贝的所述多肽与单拷贝所述抗原相融合。
24.如权利要求21或22所述的组合物，其中所述组合物中含有多拷贝所述多肽与单拷贝所述抗原相融合。
25.如权利要求21或22所述的组合物，其中该组合物中含有单拷贝所述多肽与至少二拷贝所述抗原相融合。
26.如权利要求21或22所述的组合物，其中所述组合物中含有单拷贝所述多肽与多拷贝所述抗原相融合。
27.如权利要求20-26中任一权利要求所述的组合物，其中所述多肽是恶丝虫属多肽。
28.如权利要求27中所述的组合物，其中所述多肽是犬恶丝虫多肽。
29.如权利要求4-28中任一权利要求所述的组合物，其中所述组合物含有载体。
30.如权利要求4-29中任一权利要求所述的组合物，其中所述组合物中含有第二佐剂。
31.如权利要求4-30中所述的组合物，其中所述抗原是T细胞依赖性抗原。
32.如权利要求31中所述的组合物，其中所述抗原是T细胞非依赖性抗原。
33.如权利要求31或32所述的组合物，其中所述抗原来源于致病性细菌。
34.如权利要求33中所述的组合物，其中所述抗原来源于选自以下的细菌种属金黄色葡萄球菌；表皮葡萄球菌；粪肠球菌；结核分支杆菌；B型链球菌；肺炎链球菌；螺旋杆菌；淋病双球菌；A型链球菌；博氏疏螺旋体；粗球孢子菌；Histoplasma sapsulatum；B型脑膜炎双球菌；弗氏志贺氏菌；大肠杆菌；流感嗜血杆菌；沙眼衣原体，肺炎衣原体，鹦鹉热衣原体，土拉热弗朗西丝菌，炭疽芽孢杆菌。
35.如权利要求31或32所述的组合物，其中所述抗原来源于病毒病原体。
36.如权利要求35中所述的组合物，其中所述抗原来源于选自以下的病毒病原体人免疫缺失型病毒(HIV1型与2型)；人T细胞白血病病毒(HTLV1型与2型)；埃博拉病毒；人乳头状病毒(HPV)；乳多空病毒；鼻病毒；脊髓灰质炎病毒；疱疹病毒；腺病毒；非洲淋巴瘤病毒；甲、乙、丙型流感病毒；乙、丙型肝炎病毒；天花病毒；轮状病毒。
37.如权利要求31或32所述的组合物，其中所述抗原来源于寄生性病原体。
38.如权利要求37中所述的组合物，其中所述抗原来源于选自以下的寄生性病原体克氏锥虫；布氏锥虫；血吸虫属；疟原虫属；罗阿丝虫；利什曼虫属；人蛔虫；犬恶丝虫；鼠弓形体。
39.如权利要求31或32所述的组合物，其中所述抗原来源于真菌病原体。
40.如权利要求39所述的组合物，其中所述抗原来源于念珠菌属的真菌病原体。
41.如权利要求31或32所述的组合物，其中所述抗原是肿瘤特异性抗原。
42.如权利要求31或32所述的组合物，其中所述抗原是涉及激素依赖性癌症的激素。
43.如权利要求31或32所述的组合物，其中所述抗原是人宿主抗原。
44.如权利要求43所述的组合物，其中所述人宿主抗原选自激素，激素受体，T细胞受体或精子抗原。
45.如权利要求31或32所述的组合物，其中所述抗原是朊病毒蛋白。
46.如权利要求45所述的组合物，其中在本发明的优选实施方案中所述抗原是淀粉样蛋白或其片段。
47.如权利要求46所述的组合物，其中所述片段含有DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFADEVGSNKGAIIGLMVGGVVIA氨基酸序列或该氨基酸序列的变体。
48.编码轭合物的核酸分子，其中所述轭合物中含有翻译融合到线虫来源的阶梯蛋白的抗原多肽，在所述阶梯蛋白中，在上游7，8或9残基位置RX(K/R)R或RRFR基序前面有半胱氨酸残基。
49.如权利要求48所述的核酸分子，其中所述核酸分子含有选自SEQ ID No20；21；22；23；24；25；26；27；28；29；30；31；32；33或34中的核酸序列；或含有与所述核酸分子杂交并编码具有免疫佐剂活性多肽的核酸分子。
50.如权利要求48或49所述的核酸分子，其中所述多肽在序列上至少有20个连续的氨基酸序列相同于选自SEQ 1，SEQ 2，SEQ 3，SEQ 4，SEQ 5，SEQ 6，SEQ 7，SEQ 8，SEQ 9，SEQ 10，SEQ 11，SEQ 12，SEQ 13，SEQ 14，SEQ 15，SEQ 16，SEQ 17，SEQ 18，SEQ 19序列中的至少20个氨基酸部分。
51.含有权利要求48-50中任一权利要求所述核酸分子的载体，其中所述核酸分子可操作地相连到控制所述轭合物表达的启动子。
52.如权利要求51所述的载体，其中所述载体选自质粒；噬菌粒或病毒。
53.如权利要求52所述的载体，其中所述病毒以选自腺病毒；反转录病毒；腺相关病毒；疱疹病毒；慢病毒和杆状病毒的病毒为基础。
54.如权利要求51-53中任一权利要求所述的载体，其中所述启动子是组织特异性启动子。
55.含有权利要求48-55中任一权利要求所述核酸或载体的疫苗。
56.对动物进行抗原免疫的方法，其包括给予足以刺激产生针对所述抗原的免疫反应的、有效剂量的权利要求48-55中任一权利要求所述的轭合物。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述动物为人类。
58.如权利要求56所述的方法，其中所述动物选自小鼠；大鼠；仓鼠；山羊；绵羊；狗或猫。
59.通过权利要求56-58中任一权利要求所述的方法获得的抗体。
60.如权利要求59所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体或其结合片段。
61.如权利要求60所述的抗体，其中所述抗体是人源化或嵌合抗体。
62.如权利要求60所述的抗体，其中所述片段选自F(ab’)2，Fab，Fv和Fd片段；CDR3区域；单链可变区片段或功能域区片段。
63.如权利要求59-62中任一权利要求所述的抗体，其中所述抗体是调理素抗体。
64.制备产生本发明所述单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法，其包括以下步骤i)采用本发明所述的轭合物、组合物、核酸或载体对具有免疫活性的哺乳动物进行免疫；ii)将免疫后的免疫活性哺乳动物的白细胞与骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤细胞；iii)针对与本发明所述轭合物抗原的结合活性，筛选步骤(ii)获得的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体；iv)培养所述杂交瘤细胞来增殖和/或分泌所述单克隆抗体；及v)从培养物的上清中回收单克隆抗体。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述免疫活性哺乳动物是啮齿类动物。
66.根据权利要求64或65所述方法获得的杂交瘤细胞系。
全文摘要
本发明涉及基于所谓线虫“多梯状”蛋白的新型免疫佐剂组合物。这些蛋白具有典型的重复亚基，并被蛋白酶剪切的RX(K/R)或RRXFR基序分隔，其中R为精氨酸，X为任意氨基酸，K为赖氨酸，F为苯丙氨酸。在上游7，8或9个残基位置这些基序前面有半胱氨酸残基。通过与疫苗抗原混合或轭合，多梯状蛋白或多梯状蛋白的片段可以被用作免疫佐剂，强烈地增强对所述抗原的免疫反应。轭合可以以在佐剂和抗原之间进行遗传融合的方式进行。抗原可来源于病原体、肿瘤抗原、自身抗原或其它种类的抗原。疫苗可用于预防和治疗。
文档编号A61K39/385GK1741818SQ200480002703
公开日2006年3月1日 申请日期2004年1月21日 优先权日2003年1月22日
发明者安德鲁·希思, 彼得·莱恩 申请人:艾助万提斯有限公司