专利名称：通过施用神经生长因子拮抗剂和nsaid和含有它们的组合物治疗疼痛的方法
技术领域：
本申请涉及通过对患者组合施用神经生长因子拮抗剂和NSAID来预防和治疗疼痛的方法和组合物。
背景技术：
当前推荐包括施用非类固醇抗炎药(NSAID)的一些治疗用于减轻疼痛。已经证明施用NSAID表现出疼痛减轻的特征。然而，已知用NSAIDs治疗具有缺点，包括有害的副作用，如胃肠道刺激和肾和肝毒性。此外，NSAID即使以它们最大的批准治疗剂量也不能足够减轻某些疼痛状态中的疼痛。
神经生长因子(NGF)是首先鉴定的神经营养蛋白，其在外周和中枢神经元的发育和存活中的角色已被充分表征。已经证明NGF是外周交感和胚胎感觉神经元和基底前脑胆碱能神经元发育中关键的生存和维持因子(Smeyne等，Nature 368246-249(1994)；Crowley等，Cell 761001-1011(1994))。NGF上调感觉神经元中神经肽的表达(Lindsay等，Nature 337362-364(1989))并且其活性通过两种不同的膜结合的受体——TrkA酪氨酸激酶受体和p75受体介导，所以受体在结构上与肿瘤坏死因子受体家族的其他成员相关(Chao等，Science 232518-521(1986))。
除了在神经系统中的作用，已日益显示NGF与神经系统外的过程有关。例如，外源施用的NGF已经表现出增强血管通透性(Otten等，Eur.J.Pharmacol.106199-201(1984))，增强T细胞和B细胞免疫应答(Otten等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8610059-10063(1989))，诱导淋巴细胞分化和肥大细胞增殖和导致从肥大细胞释放可溶生物信号(Matsuda等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.856508-6512(1988)；Pearce等，J.Physiol.372379-393(1986)；Bischoff等，Blood 792662-2669(1992)；Horigome等，J.Biol.Chem.26814881-14887(1993))。
NGF是由许多类型的细胞产生，这些细胞包括肥大细胞(Leon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913739-3743(1994))、B淋巴细胞(Torcia等，Cell 85345-356(1996))、角质形成细胞(Di Marco等，J.Biol.Chem.26822838-22846)、平滑肌细胞(Ueyama等，J Hypertens.111061-1065(1993))、成纤维细胞(Lindholm等，Eur.J.Neurosci.2795-801(1990))、支气管上皮细胞(Kassel等，Clin.Exp.Allergy 311432-40(2001))、肾系膜细胞(Steiner等，Am.J.Physiol.261F792-798(1991))及骨骼肌肌管(Schwartz等，J Photochem.Photobiol.B66195-200(2002))。已在神经系统外的多种细胞型上发现了NGF受体。例如，已在人单核细胞、T细胞及B淋巴细胞以及肥大细胞上发现了TrkA。
在人患者以及若干动物模型中观察到NGF水平增加与多种炎性疾病相关。这些疾病包括全身性红斑狼疮(Bracci-Laudiero等，Neuroreport 4563-565(1993))、多发性硬化(Bracci-Laudiero等，Neurosci.Lett.1479-12(1992))、牛皮癣(Raychaudhuri等，Acta Derm.l′enereol.7884-86(1998))、关节炎(Falcim等，Ann.Rheum.Dis.55745-748(1996))、间质性膀胱炎(Okragly等，J.Urology 161438-441(1999))及哮喘(Braun等，Eur.J Immunol.283240-3251(1998))。
同样，外周组织中NGF水平升高与痛觉过敏及炎症相关并在许多关节炎形式中观察到。患类风湿性关节炎患者的滑膜表达高水平的NGF，而报道非炎症患者的滑膜未检测到NGF(Aloe等，Arch.Rheum.35351-355(1992))。在实验诱导的类风湿性关节炎大鼠中观察到相似结果(Aloe等，Clin.Exp.Rheumatol.10203-204(1992))。已报道在转基因关节炎小鼠中伴随肥大细胞数量的增加，NGF水平升高(Aloe等，Int.J TissueReactions-Exp.Clin.Aspects 15139-143(1993))。
有两类用于治疗疼痛的药物，每一类通过不同的机理作用并且具有不同的效果，但都具有缺点。第一类包括非类固醇抗炎药(NSAID)，其用于治疗轻微疼痛，但是其治疗用途受到不利的胃肠道作用的限制，所述胃肠道作用，如长期使用导致胃腐蚀、形成消化性溃疡或者十二指肠炎症，和结肠和肾毒性。第二类包括阿片样物质镇痛剂(如吗啡)，用于治疗中度到严重疼痛，但是它们的治疗用途由于不利的作用而受到限制，所述不利的作用如便秘、恶心和呕吐、呼吸抑制、意识模糊、肾绞痛、对长期使用的耐受和成瘾的危险。
显然需要改进的疼痛治疗，其提供提高的治疗益处(例如减小疼痛的严重性和/或频率)和/或减小许多当前的方案导致的不利的副作用的影响。
将本文引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)完整引入作为参考。
发明概述本发明基于NGF拮抗剂联合NSAID可有效治疗疼痛这一发现。这种治疗导致出人意料地提高疼痛治疗。此外，这种治疗通常允许用更小的NSAID剂量实现相同量的疼痛减轻和/或NSAID疼痛治疗的其他形式的增强。
一方面，本发明的特征是治疗(或者在其他实施方案中预防)疼痛的方法，该方法包括使用一定量的神经生长因子拮抗剂和一定量的NSAID使得它们的联合提供有效的疼痛减轻。NGF拮抗剂和NSAID的相对量和比例可以改变。在一些实施方案中，将施用足够的NGF拮抗剂以便允许减小实现相同程度的疼痛减轻所需的NSAID的通常剂量。在一些实施方案中，将施用足够的NGF拮抗剂以允许将实现相同程度的疼痛减轻所需的NSAID的通常剂量减少至少约5％，至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，或至少约90％，或以上。该减少可以反映在给定施用的所施用量和/或给定时间内的施用量(降低频率)。
另一方面，本发明提供了增强NSAID疼痛治疗的方法，其包括联合施用有效量NSAID与有效量的NGF拮抗剂。如本文所用的联合施用包括同时施用和/或在不同时间施用。联合施用还包括作为共同制剂(即NGF拮抗剂和NSAID存在(组合)于同一的组合物中)施用和/或作为分离的组合物施用。本文所用“联合施用”包括任何情况，其中NSAID和NGF拮抗剂以有效量施用于个体。如本文进一步讨论的，应当理解NGF拮抗剂和NSAID可以以不同的给药频率和/或间隔施用。例如，抗NGF抗体可以每周施用，而NSAID可以更频繁地施用。可以理解NGF拮抗剂和NSAID可以经相同的施用途径或者不同施用途径施用，并且在施用期间可以更换不同的给药方案。可以在疼痛发作前施用。
另一方面，本发明提供了在个体中减小疼痛的发生、减轻疼痛、缓解疼痛和/或延迟疼痛的发生或进展的方法，所述方法包括联合施用有效量的NGF拮抗剂与有效量的NSAID。
本发明的方法适于治疗或防止任何病原学的任何疼痛，其中包括通常使用NSAID治疗的疼痛。在一些实施方案中，疼痛为手术后疼痛。在一些实施方案中，疼痛为与烧伤有关的疼痛。在其他实施方案中，疼痛为类风湿性关节炎相关的疼痛。在其他实施方案中，疼痛为与骨关节炎相关的疼痛。
适宜用于本发明的方法的NGF拮抗剂是可以直接或间接导致NGF生物活性降低的任何试剂。在一些实施方案中，NGF拮抗剂结合(生理性相互作用)NGF(例如抗体)，结合NGF受体(如trkA受体和/或p75)和/或降低(阻碍和/或阻断)下游NGF受体信号转导(例如靶细胞中NGF诱导的激酶信号或者其他下游信号转导的抑制剂)。在其他实施方案中，NGF拮抗剂抑制(降低)NGF合成和/或释放。在其他实施方案中，NGF拮抗剂降低NGF受体TrkA和/或p75的表达或功能。在另一实施方案中，NGF拮抗剂是不为TrkA免疫黏附素(即TrkA免疫黏附素之外)的NGF拮抗剂。在一些实施方案中，NGF拮抗剂选自下面的任何一种或多种抗NGF抗体、针对编码NGF的核酸的反义分子(包括针对编码NGF的核酸的反义分子)、针对NGF受体(如TrkA和/或p75)的反义分子、NGF抑制化合物、NGF结构类似物、结合NGF的TrkA和/或p75受体的显性失活突变体、抗TrkA抗体、抗p75抗体和激酶抑制剂。在一些实施方案中，NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)结合NGF(如hNGF)并且不显著结合相关的神经营养蛋白，如NT-3、NT4/5和/或BDNF。在另一实施方案中，NGF拮抗剂为抗NGF抗体。在其他实施方案中，抗NGF抗体特异结合NGF。在其它实施方案中，抗NGF受体识别人NGF。在其他实施方案中，抗NGF抗体特异结合人NGF。在其他实施方案中，该抗体与选自MAb911、MAb912和MAb938(见Hongo等，Hybridoma 19215-227(2000))的一种或多种抗体结合基本上相同的NGF表位6。在其他实施方案中，抗NGF抗体经人源化(包括人源化Mab 911，如本文描述的抗体E3)。在其他实施方案中，抗NGF抗体为抗体E3(如本文描述)。在其他实施方案中，抗NGF抗体含有抗体E3的一个或多个CDR(E3的1、2、3、4、5个CDR或如在一些实施方案中，为所有6个CDR)。在其他实施方案中，抗NGF抗体为人的。在其他实施方案中，抗NGF抗体含有表1中所示的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO1)和表2中所示的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。在其他实施方案中，抗NGF抗体含有表1中所示的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。在其他实施方案中，抗NGF抗体含有表2中所示的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ IDNO2)。在其他实施方案中，所述抗体含有修饰的恒定区，如免疫惰性的恒定区，如不引发补体介导的裂解，或者不刺激依赖抗体的细胞毒性(ADCC)。在其他实施方案中，如Eur.J.Immunol.(1999)292613-2624；PCT申请No.PCT/GB99/01441和/或UK专利申请No.9809951.8中描述的修饰恒定区。
在一些实施方案中，NGF拮抗剂结合NGF分子。在其他实施方案中，NGF拮抗剂为特异结合NGF的抗体。然而，NGF拮抗剂也可以结合trkA受体。NGF拮抗剂可以是抗人NGF(抗hNGF)单克隆抗体，其能够结合hNGF并有效抑制hNGF与人TrkA(hTrkA)的结合。
抗NGF抗体与NGF(如hNGF)的结合亲和力可以为约0.10nM到约0.80nM，约0.15到约0.75nM和约0.18到约0.72nM。在一个实施方案中，结合亲和力为约2pM到22pM。在一些实施方案中，结合亲和力为约10nM到。在其它实施方案中，结合亲和力为低于约10nM。在其他实施方案中，结合亲和力为约0.1nM或约0.07nM。在其他实施方案中，结合亲和力为低于约0.1nM或者低于约0.07nM。在其他实施方案中，结合亲和力为约100nM、约50nM、约10nM、约500pM、约100pM之一，或者约50pM到约2pM、约5pM、约10pM、约1nM、约15pM、约20pM、约40pM、约50pM之一。在一些实施方案中，结合亲和力为约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM、或约50pM之一，或低于约50pM。在一些实施方案中，结合亲和力为低于约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM、或约50pM之一。在其他实施方案中，结合亲和力为约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM、约40pM、或高于约40pM。如本领域中熟知的，结合亲和力可以表达为KD或者解离常数，增加的结合亲和力相应于降低的KD。抗NGF小鼠单克隆抗体911(Hongo等，Hybridoma 19215-227(2000))与人NGF的结合亲和力为约10nM，人源化抗NGF抗体E3(本文描述)与人NGF的结合亲和力为约0.07nM。
当NGF拮抗剂为抗体时，抗体可以为抗体片段，包括选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、双抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体和单链Fv(scFv)分子的抗体片段。
NSAID可以为非类固醇抗炎化合物。将NSAID通过它们抑制环加氧酶的能力分类。环加氧酶1和环加氧酶2是环加氧酶的两种主要的同种型，多数标准NSAID是两种同种型的混合抑制剂。多数标准NSAID属于下面的5种结构类别之一(1)丙酸衍生物，如布洛芬、萘普生、消痛灵、双氯酚酸钠，和酮基布洛芬；(2)乙酸衍生物，如托美汀和slindac；(3)芬那酸(fenamicaicid)衍生物，如甲芬那酸和甲氯酚那酸；(4)联苯羧酸衍生物，如二氟尼柳和氟苯沙酸；和(5)oxicam，如piroxim，噻氧噻嗪和伊索昔康。
已经描述了选择性抑制环加氧酶2的另一类别的NSAID。Cox-2抑制剂已经在例如美国专利No.5,616,601、5,604,260、5,593,994、5,550,142、5,536,752、5,521,213、5,475,995、5,639,780、5,604,253、5,552,422、5,510,368、5,436,265、5,409,944和5,130,311中有所描述，所有这些文献在此引入为参考。某些代表性COX-2抑制剂包括塞来昔布(SC-58635)、罗非克西、DUP-697、氟舒胺(CGP-28238)、美洛昔康、6-甲氧基-2-萘乙酸(6-MNA)、MK-966、nabumetone(6-MNA的前药)、尼美舒利、NS-398、SC-5766、SC-58215、T-614或者它们的组合。在一些实施方案中，本发明提供了方法，其中阿司匹林和/或acetominophen与NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)联合使用。
NGF拮抗剂和/或NSAID可以通过任何适宜的途径施用于个体。例如，它们可以一起或者分开和/或同时和/或依次地经口、静脉内、舌下、皮下、动脉内、肌内、直肠、脊柱内、胸内、腹膜内、心室内、舌下、透皮或者通过吸入施用。施用可以是全身性的(例如静脉内)或者局部的。
另一方面，本发明的特征是含有神经生长因子拮抗剂和NSAID的组合物。神经生长因子拮抗剂和NSAID可以与一种或多种可药用载体或者赋形剂一起存在，或者它们可以存在于单独的组合物中。在另一方面，本发明提供了NGF拮抗剂和NSAID的增效组合物。
第三方面，本发明的特征是用于本文公开的任一种方法的试剂盒，所述试剂盒含有NGF拮抗剂和NSAID。该试剂盒可含有关于本文公开的任一种方法的说明书。所述说明书可以包括NGF拮抗剂(如抗NGF-抗体)与NSAID联合施用(即同时施用和/或在不同时间施用)。在一些实施方案中，NGF拮抗剂和NSAID包装在一起，但是它们可以在也可以不在同一的容器中。从而，在一些实施方案中，试剂盒含有存在于同一容器中的NGF拮抗剂和NSAID和关于本文公开的任一种方法的说明书。在其他实施方案中，试剂盒含有存在于单独的容器中的NGF拮抗剂和NSAID。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗个体疼痛的方法，其包括对个体施用有效量的抗神经生长因子(NGF)抗体和NSAID。在一些实施方案中，NSAID选自布洛芬、萘普生、消痛灵、双氯酚酸钠、酮基布洛芬、托美汀、slindac、甲芬那酸、甲氯芬那酸、二氟尼柳、氟苯沙酸、piroxim、噻氧噻嗪、伊索昔康、塞来昔布、罗非克西、DUP-697、氟舒胺、美洛昔康、6-甲氧基-2-萘乙酸、MK-966、nabumetone、尼美舒利、NS-398、SC-5766、SC-58215、T-614。在一些实施方案中，NSAID是布洛芬。在一些实施方案中，抗NGF抗体以约10nm或低于约10nm的亲和力结合人NGF。在一些实施方案中，抗NGF抗体为人抗体。在一些实施方案中，抗NGF抗体为人源化抗体。在一些实施方案中，人源化抗体为含有SEQ ID NO1中所示重链可变区和SEQ ID NO2中所示轻链可变区的抗体。在一些实施方案中，疼痛为手术后疼痛。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗疼痛的药物组合物，其含有有效量抗NGF抗体和NSAID和可药用载体。
在一些实施方案中，本发明提供用于治疗疼痛的试剂盒，其含有抗NGF抗体、NSAID、关于联合施用抗NGF抗体与NSAID以治疗疼痛的说明书。
附图简述
图1阐明在用10或30mg/kg S[+]布洛芬联合NGF拮抗剂(抗NGF拮抗剂Mab 911；见Hongo等，Hybridoma 19215-227(2000))治疗的动物中累积疼痛得分减少了。将动物分成两组(对照和抗体治疗的)。在手术前15小时以1mg/kg剂量腹膜内施用NGF拮抗剂(时间＝-15小时)。在时间0如所描述的实施手术。手术后24小时(图中“0”)评估静息疼痛(resting pain)。然后用布洛芬(以300mg/ml于45％β-环糊精液体中)以10mg/kg或者30mg/kg体重治疗所有动物。非抗体治疗的对照动物也用10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg、和300mg/kg布洛芬治疗。布洛芬在颈背皮下递送。布洛芬剂量后1小时，检查静息疼痛。用抗NGF抗体拮抗剂加布洛芬的治疗比仅用布洛芬或者抗NGF抗体拮抗剂治疗在减轻静息疼痛中更有效。
图2是显示用5mg/kg双氯酚酸钠联合NGF拮抗剂(抗NGF抗体Mab 911；见Hongo等，Hybridoma 19215-227(2000))治疗的动物中累积疼痛得分图。将动物分成两组(对照和抗体治疗的)。在手术前15小时以1mg/kg剂量腹膜内施用NGF拮抗剂(时间＝-15小时)。在时间0如所描述的实施手术。手术后24小时(图中“0”)评估静息疼痛。然后用双氯酚酸钠以5mg/kg治疗所有动物。非抗体治疗的对照动物也用5mg/kg治疗。双氯酚酸钠在颈背皮下递送。布洛芬剂量后1小时，检查静息疼痛。
发明详述我们已经发现通过联合施用有效量的NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)和NSAID可以预防或者治疗疼痛。本发明的方法和组合物可用于治疗或者预防疼痛，其中包括通常使用NSAID治疗的任何疼痛。根据本发明，通过联合使用神经生长因子拮抗剂和NSAID，现在可以用更低剂量的NSAID治疗疼痛，从而减小与NSAID治疗有关的副作用的可能性。在一些实施方案中，将施用足够NGF拮抗剂以允许将实现相同程度的疼痛减轻所需的NSAID的通常剂量减小至少约5％，至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约90％，或以上。
如本文所述，联合施用NSAID与NGF拮抗剂还可以加强NSAID对疼痛的治疗。
一方面，本发明提供了治疗或者预防个体(如哺乳动物，包括人和非人类)疼痛的方法，包括联合施用有效量的NGF拮抗剂与有效量的NSAID。另一方面，本发明提供了加强个体中NSAID治疗或者预防疼痛的方法，该方法包括联合施用有效量的NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)与有效量的NSAID。另一方面，本发明提供了预防、减轻疼痛和/或防止疼痛发展或进展的方法。
在一些实施方案中，抗NGF抗体能够结合NGF并有效抑制NGF在体内与其TrkA或者p75受体的结合或者有效抑制NGF活化其TrkA或者p75受体。在一些实施方案中，所述抗体与NGF的结合亲和力为约0.01到约1.00nM，或约0.05nM到约0.25nM。在其他实施方案中，结合亲和力为约0.1nM或约0.07nM。在其他实施方案中，结合亲和力为约1pM、约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM、约50pM、约100pM，或以上。在一个实施方案中，结合亲和力为约2pM到22pM。在一些实施方案中，该抗体与选自MAb911、MAb912和MAb938的一种或多种抗体基本上相同地结合NGF表位6。见Hongo等，Hybridoma 19215-227(2000)。
抗体可以为抗体片段，如选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、双抗体、单链抗体分子和抗体片段形成的多特异性抗体和单链Fv(scFv)分子的一种或多种抗体片段。所述抗体还可以是嵌合的，其可以是人源化或人的。所述抗体还可以是双特异性的。
可用于本发明的代表性NSAIDs包括(但不限于)(1)丙酸衍生物，如布洛芬、萘普生、消痛灵、双氯酚酸钠和酮基布洛芬；(2)乙酸衍生物，如托美汀和slindac；(3)芬那酸衍生物，如甲芬那酸和甲氯酚那酸；(4)联苯羧酸衍生物，如二氟尼柳和氟苯沙酸；和(5)oxicam，如piroxim、噻氧噻嗪和伊索昔康。已经描述了另一类别的NSAID，其选择性抑制环加氧酶2。Cox-2抑制剂已经在例如美国专利No.5,616,601、5,604,260、5,593,994、5,550,142、5,536,752、5,521,213、5,475,995、5,639,780、5,604,253、5,552,422、5,510,368、5,436,265、5,409,944和5,130,311中有所描述，所有这些文献在此引入为参考。某些代表性COX-2抑制剂包括塞来昔布(SC-58635)、罗非克西、DUP-697、氟舒胺(CGP-28238)、美洛昔康、6-甲氧基-2-萘乙酸(6-MNA)、MK-966、nabumetone(6-MNA的前药)、尼美舒利、NS-398、SC-5766，SC-58215、T-614，或者它们的组合。在一些实施方案中，阿司匹林和/或acetominophen与NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)联合使用。
本发明的方法和组合物可用于治疗任何病原学的疼痛，包括急性及慢性疼痛、任何具炎性成分的疼痛，和其中通常使用NSAID治疗的任何疼痛。疼痛的实例包括外科手术后疼痛、手术后疼痛(包括牙痛)、偏头痛、头痛及三叉神经痛及与烧伤、创伤或肾结石相关疼痛、与外伤相关疼痛(包括外伤性颅脑损伤)、神经性疼痛、与肌-骨骼疾病相关的疼痛，这些疾病如类风湿性关节炎、骨关节炎、内脏痛、大肠炎、胰腺炎、胃炎、强直性脊柱炎、血清阴性(非类风湿)关节病、非关节性风湿病及关节周病症，以及与癌症相关的疼痛(包括“突破疼痛(break-through pain)”及与晚期癌症相关的疼痛)、外周神经病及疱疹后神经痛和与镰刀形细胞危象相关的疼痛。具炎性成分的疼痛的实例(除以上描述的一些外)包括风湿性疼痛、与粘膜炎及痛经相关的疼痛。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗或预防手术后疼痛和/或癌症疼痛。在其他实施方案中，疼痛为通常不使用NSAID治疗的疼痛适应症，如神经性疼痛。在其他实施方案中，本文描述的方法和组合物可用于治疗和/或预防与烧伤有关的疼痛。在其他实施方案中，本文描述的方法和组合物可用于治疗和/或预防与类风湿性关节炎有关的疼痛。在其他实施方案中，本文描述的方法和组合物可用于治疗和/或预防与骨关节炎有关的疼痛。
另一方面，本发明提供了用于治疗疼痛的试剂盒，其含有适用于本文描述的任何方法的NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)和NSAID。
一般技术除非另外指出，本发明的实践将使用本领域技术范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学常规技术。此类技术在文献中详细解释，如《Molecular CloningA LaboratoryManual》，第二版，(Sambrook等，1989)Cold Spring Harbor Press；《Oligonucleotide Synthesis》(M.J.Gait编，1984)；《Methods in MolecularBiology》，Humana Press；《Cell BiologyA Laboratory NOtebook》(J.E.Cellis编，1998)Academic Press；《Animal Cell Culture》(R.I.Freshney编，1987)；《Introduction to Cell and Tissue Culture》(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press；《Cell and Tissue CultureLaboratoryProcedures》(A.Doyle，J.B.Griffiths和D.GNewell，编1993-1998)J.Wiley和Sons；《Methods in Enzymology》(Academic Press，Inc.)；《Handbookof Experimental Immunology》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《Current Protocols in Molecular Biology》(E M.Ausubel等，编辑，1987)；《PCRThe Polymerase Chain Reaction》(Mullis等，编辑，1994)；《Current Protocols in Immunology》(J.E.Coligan等，编辑，1991)；《ShortProtocols in Molecular Biology》(Wiley和Sons，1999)；《Immunobiology》(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；《Antibodies》(P.Finch，1997)；《Antibodiesa practical approach》(D.Catty，编辑，IRL Press，1988-1989)；《Monoclonal antibodiesa practical approach》(P.Shepherd和C.Dean，编辑，Oxford University Press，2000)；《Using antibodiesa laboratory manual》(E.Harlow和D.Lane，Cold Spring HarborLaboratory Press，1999)；《The Antibodies》(M.Zanetti和J.D.Capra，编辑，Harwood Academic Publishers，1995)。
定义“抗体”(可以以复数形式互换使用)为能够通过位于免疫球蛋白分子可变区的至少一个抗原识别位点特异结合靶标，如碳水化合物、多核苷酸、脂类、多肽等的免疫球蛋白分子。如本文所用的，该术语不仅仅包含完整多克隆或单克隆抗体，也包含其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(scFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和含有所需特异抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。抗体包括任一类别的抗体，如IgG、IgA或IgM(或其亚类)并且不必为任何特定类别的抗体。取决于免疫球蛋白重链恒定结构域的抗体氨基酸序列，可将免疫球蛋白归入不同类别。免疫球蛋白主要有五类IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且这些中的几种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。相应于不同类型免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ及μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构及三维构型是公知的。
“单克隆抗体”指同质抗体群，其中单克隆抗体包含参与选择性结合抗原的氨基酸(天然存在或非天然存在的)。单克隆抗体高度特异，针对单一抗原位点。术语“单克隆抗体”不仅仅包括完整单克隆抗体及全长单克隆抗体，也包括其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(scFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、和含有所需特异抗原识别位点且能够结合抗原的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰的构型。抗体的来源或抗体制备的方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)不受限制。
“人源化”抗体指具有基本上来源于非人物种的免疫球蛋白抗原结合位点并且基于人免疫球蛋白的结构和/或序列保持该分子的免疫球蛋白结构的分子。抗原结合位点可以含有融合到恒定结构域的完整可变结构域或者仅仅含有嫁接到可变结构域中适宜构架区的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以为野生型或者通过一个或多个氨基酸替换修饰，例如经修饰而更像人免疫球蛋白。人源化抗体的某些形式保留了所有CDR序列(例如含有来自小鼠抗体的所有6个CDR的人源化小鼠抗体)。人源化抗体的其他形式具有相对于原初抗体具有改变的一个或多个CDR(1、2、3、4、5、6个)。在一些情况中，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基或者其他残基被相应的非人残基代替。此外，人源化抗体可以含有在受体抗体或者供体抗体中没有的残基。
如本文所用的，术语“神经生长因子”和“NGF”指保持NGF的至少部分活性的神经生长因子和其变体(包括，例如拼接变体和蛋白质加工变体)。如本文所用的，NGF包括所有哺乳动物物种(包括人、非人灵长类动物、犬、猫、马或牛)的天然序列NGF。
“NGF受体”指NGF结合或活化的多肽。NGF受体包括任何哺乳动物物种(包括但不限于人、犬、猫、马、灵长类动物或牛)的TrkA受体和p75受体。
“NGF拮抗剂”指阻断、抑制或降低(包括显著降低)NGF生物活性的任何分子，NGF生物活性包括由NGF信号介导的下游途径，如受体结合和/或引发对NGF的细胞应答。术语“拮抗剂”不含特异的生物学作用机制，并且认为显然包括和包含与NGF的所有可能的药理学、生理学或生物化学相互作用，其可以是与直接或间接的，或者与NGF、其受体相互作用，或者通过另一机理，该术语还包括可通过多种不同的、化学上相异的组分实现的所述机制的结果。代表性NGF拮抗剂包括(但不限于)抗NGF抗体、针对NGF的反义分子(包括针对编码NGF核酸的反义分子)、NGF抑制化合物、NGF结构类似物、结合NGF的TrkA受体的显性失活突变体、TrkA免疫黏附素、抗TrkA抗体、抗p75抗体、针对TrkA和/或p75受体之一或两者的反义分子(包括针对编码TrkA或p75的核酸分子的反义分子)和激酶抑制剂。对于本发明，应明确理解术语“拮抗剂”包含所有前述定义的术语、标题、功能状态及特征，从而NGF自身、NGF生物活性(包括但不限于它介导疼痛的任何方面的能力)或生物活性的结果在任何有意义程度上被实质性无效、降低或中和。在一些实施方案中，NGF拮抗剂结合(物理上相互作用)NGF(例如抗体)、结合NGF受体(如trkA受体或p75受体)、降低(阻碍和/或阻断)下游NGF受体信号转导和/或抑制(降低)NGF合成、产生和释放。在一些实施方案中，NGF拮抗剂结合(物理上相互作用)NGF(例如抗体)、结合NGF受体(如TrkA受体和/或p75受体)、和/或降低(阻碍和/或阻断)下游NGF受体信号转导。在其他实施方案中，NGF拮抗剂结合NGF并阻止TrkA受体二聚化和/或TrkA自身磷酸化。在其他实施方案中，NGF拮抗剂抑制或降低NGF合成和/或产生(释放)。本文提供各类型NGF拮抗剂的实例。
如本文所用的，“抗NGF抗体”指能够结合NGF并抑制NGF生物活性和/或NGF信号介导的下游途径的抗体。
“TrkA免疫黏附素”指含有TrkA受体的片段(例如TrkA受体的胞外结构域)和免疫球蛋白序列的可溶性嵌合分子，其保持TrkA受体的结合特异性。
NGF的“生物活性”通常指结合NGF受体和/或活化NGF受体信号途径的能力。不加限制，生物活性包括下面的一种或多种结合NGF受体(如p75和/或TrkA)的能力；促进TrkA受体二聚化和/或自身磷酸化的能力；活化NGF受体信号途径的能力；促进细胞分化、增殖、存活、生长和细胞生理学中的其他改变，包括(对于神经元，包括外周和中枢神经元)神经元形态的改变、突触发生、突触功能、神经递质和/或神经肽释放损伤后再生的能力和介导疼痛的能力。
术语“表位”用于指抗原(如蛋白质抗原)上的(单克隆或多克隆)抗体结合位点。
如本文所用的，“治疗”是得到有益或所希望的临床结果的方法。对于本发明，有益或所希望的临床结果包括(但不限于)下面的一种或多种疼痛的任何方面的改善或减轻，包括急性、慢性、炎性、神经性、或手术后疼痛。对于本发明，有益的或所希望的临床结果包括(但不限于)一个或多个以下内容包括降低严重度、减轻一种或多种与疼痛(包括疼痛的任何方面)相关的症状(如缩短疼痛持续时间和/或降低疼痛敏感性或感觉)。
疼痛“降低的发生”指任何降低的严重性(可包括降低对通常用于此状况的其它药物和/或治疗剂的需要和/或量(例如暴露于其它药物和/或治疗剂))、持续时间和/或频率(包括例如在个体中延迟或增加到达疼痛的时间)。如本领域技术人员理解的，不同个体对治疗的反应可发生变化，并且同样，例如“在个体中降低疼痛发生的方法”反映了联合施用本文描述的NGF拮抗剂和本文描述的NSAID，这是基于合理预期该使用可能导致该具体个体中这类的疼痛发生降低。
“缓解”疼痛或疼痛的一种或多种症状表示与不联合施用NGF拮抗剂与NSAID相比，疼痛的一种或多种症状的减轻或改善。“缓解”也包括缩短或降低症状的持续时间。
“减轻”疼痛或疼痛的一种或多种症状表示在用根据本发明的NGF拮抗剂联合NSAID治疗的个体中或个体群中，降低疼痛的一种或多种不希望的临床表现的程度。
如本文所用的，“延迟”疼痛的发展表示推迟、阻碍、减慢、阻止、稳定和/或延迟疼痛的进程。取决于病史和/或所治疗个体，此延迟的时间长度可变化。如对本领域技术人员显而易见的，足够的或显著的延迟可起到包括预防在内的作用，以致个体不发生疼痛。与不用此方法相比，“延迟”症状发展的方法为在给定期限降低症状发展可能性和/或在给定期限降低症状程度的方法。这些比较一般基于用统计学上显著数量受试者的临床研究。
疼痛的“发展”或“进展”指疾病的最初表现和/或随后发展。可以用本领域中熟知的标准临床技术检测和评估疼痛的进展。然而，发展也指检测不到的进展。关于本发明，发展或进展指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。本文所用的疼痛的“发作”或“发生”包括最初的发作和/或复发。
“有效量”为足以引起有利或期望临床结果(包括减轻或降低疼痛感觉)的量。对于本发明，NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)和NSAID的有效量包括足以治疗、减轻、减小任何类型的疼痛(包括急性、慢性、炎性、神经性或者手术后疼痛)的强度或预防疼痛(包括伤害感受和疼痛的感觉)的量。在一些实施方案中，NSAID和NGF拮抗剂的有效量为能够将对外部刺激的敏感性阈值调节到与健康受试者中观察到的水平相当的NGF拮抗剂和NSAID的量。在其他实施方案中，该水平可以不与健康受试者中观察到的相当，但是与未接受联合治疗的相比降低了。NGF拮抗剂的有效量还包括足以加强如本文所述的疼痛的NSAID治疗(治疗效果)或者减小如本文所述的治疗或预防疼痛所需的NSAID剂量的NGF拮抗剂量。如本领域中理解的，NGF拮抗剂联合NSAID的有效量可以根据如疼痛类型(和患者病史以及其他因素，如所用的NGF拮抗剂和/或NSAID的类型(和/或剂量))而变。在本发明上下本文，有效量可以是实现增效所需的NGF拮抗剂和NSAID拮抗剂的量。在本发明上下本文拮抗剂的有效量通常指足以导致NSAID对于疼痛的治疗效果增强(其又可以指减少的剂量和/或观察到某种其他有益效果)和/或导致与仅使用NSAID治疗相比的有益效果的量。NGF拮抗剂的“有效量”还可以导致与仅使用施用NGF拮抗剂或NSAID相比的增效作用。
“个体”为脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括(但不限于)饲养动物、变种动物(sport animal)、宠物、灵长类动物、马、奶牛、狗、猫、小鼠和大鼠。
术语“NSAID”指非类固醇抗炎化合物。通过NSAIDs抑制环加氧酶的能力将它们分类。环加氧酶1和环加氧酶2是环加氧酶的两种主要的同种型，多数标准NSAID是两种同种型的混合抑制剂。多数标准NSAID属于下面的5种结构类别之一(1)丙酸衍生物，如布洛芬、萘普生、消痛灵、双氯酚酸钠，和酮基布洛芬；(2)乙酸衍生物，如托美汀和slindac；(3)芬那酸衍生物，如甲芬那酸和甲氯酚那酸；(4)联苯羧酸衍生物，如二氟尼柳和氟苯沙酸；和(5)oxicam，如piroxim，噻氧噻嗪、和伊索昔康。
已经描述了另一类别的NSAID，其选择性抑制环加氧酶2。Cox-2抑制剂已经在例如美国专利No.5,616,601、5,604,260、5,593,994、5,550,142、5,536,752、5,521,213、5,475,995、5,639,780、5,604,253、5,552,422、5,510,368、5,436,265、5,409,944和5,130,311中有所描述，引用所有这些文献作为参考。某些代表性COX-2抑制剂包括塞来昔布(SC-58635)、DUP-697、氟舒胺(CGP-28238)、美洛昔康、6-甲氧基-2-萘乙酸(6-MNA)、罗非克西、MK-966、nabumetone(6-MNA的前药)、尼美舒利、NS-398、SC-5766、SC-58215、T-614；或者它们的组合。
在一些实施方案中，阿司匹林和/或acetominophen与NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)联合使用。阿司匹林是另一类非类固醇抗炎化合物。
本文所用“联合”施用包括同时施用和/或在不同时间施用。联合施用还包括作为共同制剂施用(即NGF拮抗剂和NSAID存在于同一组合物中)或者作为单独组合物施用。本文所用联合施用包括将NSAID和NGF拮抗剂施用于个体的任何情况，该施用可以同时和/或分开进行。如本文进一步讨论的，可以理解NGF拮抗剂和NSAID可以不同的给药频率或者间隔施用。例如，抗NGF抗体可以每周施用，而NSAID可以更频繁地施用。应当理解可以使用相同或不同的施用途径施用NGF拮抗剂和NSAID。
“手术后疼痛”(可交互称为“切开后”或者“创伤后疼痛”)指是指外伤如个体组织中切口、穿刺、切割、撕破或创伤引起或导致的疼痛(包括无论是侵袭性或非侵袭性的所有外科程序引起的疼痛)。如本文所用的，手术后疼痛不包括无外部身体创伤发生(引起或引发)的疼痛。在一些实施方案中，手术后疼痛为内部或外部(包括外周)疼痛，并且创伤、切口、外伤、撕伤或切割可偶然(如外伤性创伤)或故意(如外科切口)发生。如本文所用的，“疼痛”包括疼痛的伤害感受及感觉，并且疼痛可用疼痛分数及其它本领域公知的方法客观及主观的评估。如本文所用的，手术后疼痛包括异常性疼痛(即对正常非有害刺激反应增强(即有害感受))及痛觉过敏(即对正常有害或不愉快刺激反应增强)，其本质上又可为热或机械(触觉)的。在一些实施方案中，疼痛的特征为热敏感性、机械敏感性和/或静息疼痛。在一些实施方案中，手术后疼痛包含经机械诱导疼痛或静息疼痛。在其它实施方案中，手术后疼痛包含静息疼痛当NSAID治疗的一方面提高(与施用NSAID而不施用NGF拮抗剂相比)时，疼痛的NSAID治疗“加强”了。例如，相对于不存在NGF拮抗剂时NSAID的功效，存在NGF拮抗剂时NSAID治疗疼痛的功效增强了。作为另一个实例，当该使用允许更好地疼痛减轻时(例如，当使用的NASIAD的剂量不能有效治疗或者防止疼痛时)，通过联合使用NGF拮抗剂与NSAID可以“增强”用NSAID对疼痛的治疗或者预防。
本发明方法关于本文所描述的所有方法，对NGF拮抗剂和NSAIDs的参考还包括含有一种或多种这些试剂的组合物。本发明可用于治疗个体的疼痛，所述个体包括所有哺乳动物，包括人和非人类。
一方面，本发明提供了治疗个体疼痛的方法，其包括联合施用有效量的NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)与有效量的NSAID。在一些实施方案中，将施用足够NGF拮抗剂以允许将实现相同程度的疼痛减轻所需的NSAID的通常剂量减少至少约5％，至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，或至少约90％，或90％以上。
另一方面，本发明提供了增强NSAID治疗个体疼痛的方法，其包括联合施用有效量的NGF拮抗剂与有效量的NSAID。
在一些实施方案中，疼痛包括下面的任何一种或多种急性和/或慢性疼痛、任何具炎性成分的疼痛、手术后疼痛(包括牙痛)、偏头痛、头痛及三叉神经痛及与烧伤、创伤或肾结石相关疼痛、与外伤相关疼痛(包括外伤性颅脑损伤)、神经性疼痛、与镰刀形细胞危象有关的疼痛、与痛经或肠功能失调相关的疼痛，和与癌相关的疼痛(包括“突破疼痛”及与晚期癌症相关的疼痛)。在其他实施方案中，疼痛为通常用NSAID(例如布洛芬)治疗的任一疼痛。在其他实施方案中，疼痛为与烧伤相关的疼痛。在其他实施方案中，疼痛为与类风湿性关节炎相关的疼痛。在其他实施方案中，疼痛为与骨关节炎相关的疼痛。
另一方面，本发明提供了预防、减轻和/或防止疼痛发展或进展的方法。从而，在一些实施方案中，在疼痛事件(如手术)之前施用NGF拮抗剂，如抗NGF抗体和/或NSAID。例如，在可能导致或者处于导致疼痛危险的活动(如外部创伤或者手术)之前30分钟、1小时、5小时、15小时、24小时或者甚至更长，如1天、数天、或者甚至1周、2周、3周或者3周以上施用NGF拮抗剂。
用本领域中公知的方法评估疼痛的治疗或预防。可以基于客观测量实施评估，如观察行为，如对刺激的反应、面部表情等。还可以基于主观测量评估，如用多种疼痛尺度描述患者的疼痛。见，例如Katz等，Surg ClinNOrth Am.(1999)79(2)231-52；Caraceni等，J Pain Symptom Manage(2002)23(3)239-55。
本领域已良好建立了类风湿性关节炎疼痛的诊断或评估。可以基于本领域中公知的测量实施评估，如用多种疼痛尺度表征患者的疼痛。见，例如Katz等，Surg Clin NOrth Am.(1999)79(2)231-52；Caraceni等，J PainSymptom Manage(2002)23(3)239-55。也有用于测量疾病状态的常用尺度，如美国大学类风湿病学(ACR)(Felson等，Arthritis and Rheumatism(1993)36(6)729-740)、健康评估问卷(HAQ)(Fries等，(1982)J.Rheumatol.9789-793)、Paulus尺度(Paulus等，Arthritis andRheumatism(1990)33477-484)，和关节炎影响测量尺度(AIMS)(Meenam等，Arthritis and Rheumatology(1982)251048-1053)。
本领域已良好建立骨关节炎的诊断或评估。可以基于本领域中公知的测量实施评估，如使用多种疼痛尺度表征患者的疼痛。见，例如Katz等，Surg Clin NOrth Am.(1999)79(2)231-52；Caraceni等，J Pain SymptomManage(2002)23(3)239-55。例如，可以用WOMAC移动(Ambulation)疼痛尺度(包括，疼痛、僵硬和身体功能)和100mm视觉模拟尺度(VAS)评估疼痛和评价对治疗的反应。
应当理解当NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)和NSAID作为单一或者分开的组合物联合施用时，所给的神经生长因子拮抗剂和NSAID的比例与所希望的效果表现一致。在一些实施方案中，神经生长因子拮抗剂与NSAID的重量比例可以为1∶1。在一些实施方案中，该比例可以介于约0.001比约1到约1000比约1，约0.01比约1到约100比约1，或者约0.1比约1到约10比约1。也设想其他比例。
应当理解用于治疗或者预防疼痛所需的神经生长因子拮抗剂和NSAID的量将不仅随着所选的具体化合物或者组合物而变，还随着施用途径、所治疗的疾病的性质，和患者的年龄和状况而变，并且最终由主治医生决定。
NGF拮抗剂本发明的方法使用NGF拮抗剂，其指阻断、抑制或者减小(包括显著地)NGF生物活性的任何分子，NGF生物活性包括NGF信号转导介导的下游途径，如结合和/或引起对NGF的细胞应答的受体。术语“拮抗剂”不暗含任何生物作用的特定机理，并且认为其显然包括和包含与NGF的所有可能的药理学、生理学和生物化学相互作用和可以通过多种不同的、化学上相异的组合物实现的所述相互作用的结果。代表性NGF拮抗剂包括(但不限于)抗NGF抗体、多肽(包括含有来源于抗NGF抗体的NGF结合结构域的多肽，例如含有足以结合NGF的CDR区域的结合结构域的多肽)、针对NGF的反义分子(包括针对编码NGF的核酸的反义分子)、针对TrkA和/或p75受体的反义分子(包括针对编码trkA或者p75的核酸分子的反义分子)、NGF抑制化合物、NGF结构类似物、结合NGF的TrkA受体的显性失活突变、TrkA免疫黏附素、抗TrkA抗体、抗p75抗体、和激酶抑制剂。对于本发明，应明确理解术语“拮抗剂”包含所有前述定义的术语、标题、功能状态及特征，从而NGF自身、NGF生物活性(包括但不限于它介导疼痛的任何方面的能力)或生物活性的结果在任何有意义程度上被实质性无效、降低或中和。在一些实施方案中，NGF拮抗剂结合(物理上相互作用)NGF(例如抗体)、结合NGF受体(如trkA受体和/或p75受体)和/或降低(阻碍和/或阻断)下游NGF受体信号转导。因此，在一些实施方案中，NGF拮抗剂结合(物理上相互作用)NGF。在其他实施方案中，NGF拮抗剂结合NGF受体(如trkA受体或者p75)。在其他实施方案中，NGF拮抗剂降低(阻碍和/或阻断)下游NGF受体信号转导(例如激酶信号转导的抑制剂)。在其他实施方案中，NGF拮抗剂抑制(降低)NGF合成和/或释放。在另一实施方案中，NGF拮抗剂为TrkA免疫黏附素。在另一实施方案中，NGF拮抗剂不同于抗NGF抗体。在一些实施方案中，NGF拮抗剂结合NGF(如hNGF)并且不显著结合相关神经营养蛋白，如NT-3、NT4/5和/或BDNF。在一些实施方案中，NGF拮抗剂结合人NGF，并且不显著结合来自另一脊椎动物物种(在一些实施方案中为哺乳动物)的NGF。在一些实施方案中，NGF拮抗剂结合人NGF以及一种或多种来自其它脊椎动物物种(在一些实施方案中为哺乳动物)的NGF。在一些实施方案中，NGF拮抗剂结合NGF以及至少一种其他神经营养蛋白。在一些实施方案中，NGF拮抗剂结合哺乳动物物种(如马或狗)的NGF，但是不显著结合来自另一哺乳动物物种的NGF。
抗NGF抗体在本发明的一些实施方案中，NGF拮抗剂含有抗NGF抗体。抗NGF抗体应该显示出任何一种或多种下面的特征(a)结合NGF并抑制NGF生物活性和/或NGF信号功能介导的下游途径；(b)治疗或者预防疼痛的任何方面，尤其联合NSAID治疗或者防止疼痛的任何方面；(c)阻断或者减弱NGF受体活化(包括trkA受体二聚化和/或自身磷酸化)；(d)增强NGF的清除；(e)增强NSAID对疼痛的治疗。
抗NGF抗体是本领域中公知的，见，例如PCT公布号W002096458、WO01/78698、WO01/64247、美国专利No.5,844,092、5,877,016和6,153,189；Hongo等，Hybridoma，19215-227(2000)；Cell.Molec.Biol.13559-568(1993)；GenBank登录号U39608、U39609、L17078或L17077。
在一些实施方案中，抗NGF抗体特异结合NGF。在其他实施方案中，抗NGF抗体经人源化(如本文描述的抗体E3)。在其他实施方案中，抗NGF抗体为抗体E3(如本文描述)。在其他实施方案中，抗NGF抗体含有抗体E3的一个或多个CDR(如1、2、3、4、5个CDR，或者在一些实施方案中，含有E3的所有6个CDR)。在其他实施方案中，抗体为人抗体。在其他实施方案中，抗NGF抗体含有表1中所示的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO1)和表2中所示的轻链可变区的氨基酸序列(SEQID NO2)。在其他实施方案中，抗NGF抗体含有表1中所示的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。在其他实施方案中，抗NGF抗体含有表2中所示的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。在其他实施方案中，所述抗体含有修饰恒定区，如免疫惰性，即不引发补体介导的裂解或者不刺激依赖抗体的细胞介导毒性(ADCC)的恒定区。在其他实施方案中，如Eur.J.Immunol.(1999)292613-2624、PCT申请No.PCT/GB99/01441和/或UK专利申请No.9809951.8中描述的修饰恒定区。在其他实施方案中，抗NGF抗体为U.S.Ser.No.10/745,775中描述的任何抗体。
在一些实施方案中，抗NGF抗体为称作抗体“E3”的人源化小鼠抗NGF单克隆抗体，其含有包含A330P331到S330S331突变的人重链IgG2a恒定区(氨基酸编号参考野生型IgG2a序列，见Eur.J.Immunol.(1999)292613-2624)、人轻链κ恒定区和表1和表2中所示的重链和轻链可变区。
表1重链可变区QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVS(SEQ ID NO1)表2轻链可变区DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRT(SE Q ID NO2)下面的编码E3重链或者E3轻链可变区的多核苷酸于2003年1月8日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
载体Eb.911.3E是编码表2中所示的轻链可变区的多核苷酸；载体Eb.pur.911.3E是编码表2中所示轻链可变区的多核苷酸，载体Db.911.3E是编码表1中所示重链可变区的多核苷酸。这些多核苷酸也编码恒定结构域。
至少有两种确定CDR的技术(1)基于种间序列变异性的方法(即Kabat等《Sequences of proteins of Immunological Interest)》(第5版，1991，National Institutes of Health，Bethesda MD))和(2)基于抗原-抗体复合体的晶体学研究的方法(Chothia等(1989)Nature 342877；Al-lazikani等(1997)J.Molec.Bioi.273927-948))。如本文所用，CDR可以指通过任一方法或者两种方法组合定义的CDR。
在另一实施方案中，抗NGF抗体含有抗体E3的一个或多个CDR(如1、2、3、4、5个CDR，或者在一些实施方案中，含有E3的所有6个CDR)。CDR区的确定是本领域技术范围内的。CDR可以是Kabat、Chothia，或者Kabat和Chothia的组合。
用于本发明的抗体可以包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)、嵌合抗体、双特异性抗体、异缀合抗体、单链(scFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、和含有所需特异抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体，和共价修饰的抗体。抗体可以是鼠、大鼠、人的或者任何其他来源(包括嵌合或人源化抗体)。对于本发明，抗体以抑制NGF和/或NGF信号转导功能介导的下游途径的方式与NGF反应。在一个实施方案中，抗体为识别人NGF上一个或多个表位的人抗体。在另一实施方案中，抗体为识别人NGF上一个或多个表位的小鼠或者大鼠抗体。在另一实施方案中，抗体识别选自灵长类、啮齿类、犬、猫、马和牛的NGF上的一个或多个表位。在另一实施方案中，所述抗体含有经修饰的恒定区，如免疫惰性，即不引发补体介导的裂解或者不刺激依赖抗体的细胞毒性(ADCC)的恒定区。可以用美国专利No.5,500,362中公开的方法评估ADCC活性。在其他实施方案中，如Eur.J.Immunol.(1999)292613-2624；PCT申请No.PCT/GB99/01441；和/或UK专利申请No.9809951.8中描述的修饰恒定区。
抗NGF抗体与NGF(如hNGF)的结合亲和力可以为约0.01到约1Nm、约0.05到约0.25nM、约0.10到约0.80nM、约0.15到约0.75nM、约0.18到约0.72nM。在一些实施方案中，结合亲和力为约1pM、约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM、约40pM或高于约40pM。在一个实施方案中，结合亲和力为约2pM到约22pM。在其他实施方案中，结合亲和力为低于约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM或约50pM或约10pM。在一些实施方案中，结合亲和力为约10nM。在其他实施方案中，结合亲和力为低于约10nM。在其他实施方案中，结合亲和力约0.1nM或者约0.07nM。在其他实施方案中，结合亲和力为低于约0.1nM或者低于约0.07nM。在其他实施方案中，结合亲和力为约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM、或约50pM之一到约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM、或约40pM之一。在一些实施方案中，结合亲和力为约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM、或约50pM之一，或低于约50pM。在其他实施方案中，结合亲和力为约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM、约40pM之一、或高于约40pM。
测定抗体对NGF的结合亲和力的一种方法是测量该抗体的单功能Fab片段的亲和力。为了得到单功能Fab片段，可以用木瓜蛋白酶切割或者重组表达抗体(例如IgG)。通过表面等离振子共振(BIAcore3000TM表面等离振子共振(SPR)系统BIAcore，INC，Piscaway NJ)，可以确定抗体的抗NGF Fab片段的亲和力。根据供应商的说明可以用N-乙基-N’-(3-甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化CM5芯片。可以将人NGF稀释到10mM乙酸钠(pH4.0)中并以0.005mg/mL的浓度注射到活化的芯片。在各个芯片通道之间使用不同的流动时间，可以实现两种抗原密度范围用于详细动力学研究的100-200反应单位(RU)，用于筛选测定法的500-600RU。可以用乙醇胺封闭芯片。再生研究已经表明Pierce洗脱缓冲液(产品号21004，Pierce Biotechnology，Rockford IL)和4M NaCl(2∶1)的混合物能有效除去结合的Fab而在200次注射中保持芯片上hNGF的活性。HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES，pH7.4，0.15 NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20)用作BIAcore测定法的运行缓冲液。以100μL/分钟注射1分钟纯化的Fab样品的连续稀释液(1.0-10x估计的KD)并允许长达2小时的解离时间。通过ELISA和/或SDS-PAGE电泳，使用已知浓度(如通过氨基酸分析确定)的Fab作为标准测定Fab蛋白质的浓度。通过使用BIAevaluation程序将数据拟合1∶1朗缪尔(Langmuir)结合模型(Karlsson，R.Roos，H.Fagerstam，L.Petersson，B.(1994).Methods Enzyology 699-110)同时得到动力学结合速率(Kon)和解离速率(koff)。可以以Koff/kon计算平衡解离常数(KD)值。该方案适用于确定抗体对任何物种的NGF的结合亲和力，所述NGF包括人NGF、另一种脊椎动物(在一些实施方案中为哺乳动物)的NGF(如小鼠NGF、大鼠NGF、灵长类NGF)，以及用于使用其他神经营养蛋白的方案，如相关的神经营养蛋白NT3、NT4/5和/或BDNF。
在一些实施方案中，所述抗体结合人NGF，并且不显著结合来自另一脊椎动物物种(在一些实施方案中，哺乳动物)的NGF。在一些实施方案中，NGF拮抗剂结合人NGF以及一种或多种来自其它脊椎动物物种(在一些实施方案中为哺乳动物)的NGF。在一些实施方案中，所述抗体结合NGF并且不与其他神经营养蛋白(如相关的神经营养蛋白NT3、NT4/5和/或BDNF)显著交叉反应。在一些实施方案中，所述抗体结合NGF以及至少一种其他神经营养蛋白。在一些实施方案中，所述抗体结合哺乳动物物种(如马或狗)的NGF，但是不显著结合另一哺乳动物物种的NGF。
表位可以是连续的或不连续的。在一个实施方案中，所述抗体结合与选自如Hongo等，Hybridoma，19215-227(2000)中描述的Mab911、MAb912、和MAb 938抗体基本相同的hNGF表位。在另一实施方案中，所述抗体与MAb 911结合基本上相同的hNGF表位。还在一实施方案中，所述抗体与MAb 909结合基本上相同的hNGF表位(Hongo等，前文)。例如，所述表位可以含有hNGF可变区1(第23-35位氨基酸)中的K32、K34及E35残基、hNGF可变区4(第81-88位氨基酸)中的F79及T81残基、可变区4中的H84及K88残基、hNGF可变区5(第94-98位氨基酸)与hNGF C端(第111-118位氨基酸)之间的R103残基、hNGF前可变区1(第10-23位氨基酸)中的E11残基、hNGF可变区2(第40-49位氨基酸)与hNGF可变区3(第59-66位氨基酸)之间的Y52、hNGF C端中的L112及S113残基、hNGF可变区3中的R59及R69残基、或hNGF前可变区1中的V18、V20及G23残基中的一个或多个。此外，表位可包含一个或多个hNGF的可变区1、可变区3、可变区4、可变区5、N-端区域和/或C端区域。在又一实施方案中，抗体显著降低hNGF R103残基的溶剂可接近性。应当理解虽然以上描述的表位与人NGF相关，普通技术人员可比对人NGF与其它物种NGF的结构并鉴定这些表位的可能相似物。
一方面，可抑制NGF的抗体(例如人抗体、人源化抗体、小鼠抗体、嵌合抗体)可用表达全长或部分NGF序列的免疫原制备。另一方面，可使用包含过表达NGF细胞的免疫原。可使用的免疫原的另一实例为包含全长NGF的NGF蛋白质或部分的NGF蛋白质。
可用本领域已知的任何方法制备抗NGF抗体。如本文进一步描述的，免疫宿主动物的途径及方案与一般用于抗体刺激及产生的已建立的常规技术一致。用于产生人及小鼠抗体的一般技术是本领域已知的并在本文有所描述。
预计可操纵包括人的任何哺乳动物受试者或其抗体产生细胞用于产生哺乳动物(包括人)杂交瘤细胞系的基础。一般地，用一定量的免疫原(包括如本文描述的免疫原)经腹膜内、肌内、经口、皮下、足底内和/或皮内接种宿主动物。
杂交瘤可用Kohler，B.和Milstein，C.(1975)Nature 256495-497的一般体细胞杂交技术或如通过Buck，D.W.等，In Vitro，18377-381(1982)改进的体细胞杂交技术从淋巴细胞及无限增殖化骨髓瘤细胞制备。在杂交中可应用可获得的骨髓瘤细胞系，包括(但不限于)X63-Ag8.653及来自美国加利福尼亚圣地亚哥Salk研究所的细胞分布中心的骨髓瘤细胞系。大体上，该技术涉及用融合剂(如聚乙二醇)或通过本领域技术人员公知的电手段融合骨髓瘤细胞和淋巴样细胞。融合后，将细胞自融合培养基分离并在选择生长培养基(如次黄苷-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基)中生长以去除未杂交的亲本细胞。本文描述的添加或未添加血清的任何培养基可用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为细胞融合技术的另一备选方法，EBV无限增殖化B细胞可用于产生本发明所述的抗NGF单克隆抗体。将杂交瘤扩增并亚克隆，并根据需要通过常规免疫测定法步骤(例如放射免疫测定法、酶联免疫测定法或荧光免疫测定法)测定上清液的抗免疫原活性。
可用作抗体源的杂交瘤包含产生NGF特异单克隆抗体或其部分的所有亲代杂交瘤衍生物、子代细胞。
可用公知步骤在体外或体内生长产生此类抗体的杂交瘤。根据需要，可通过常规免疫球蛋白纯化操作(如硫酸铵、凝胶电泳、透析、层析、超滤)，自培养基或体液中分离单克隆抗体。如果存在不需要的活性，可通过例如让制备物流经由附着在固相上的免疫原制备的吸附剂，并将目的抗体自免疫原洗脱或释放而除去不希望的活性。用人NGF或包含靶氨基酸序列的片段免疫宿主动物可产生抗体(例如单克隆抗体)群体，所述靶氨基酸序列缀合有对将免疫的物种具有免疫原性的蛋白质，如匙孔槭血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂，所述缀合使用双功能剂或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2或RIN＝C＝NR，其中R及R1为不同烷基。
根据需要，可对目的抗NGF抗体(单克隆或多克隆)测序，然后将编码抗NGF抗体多肽的多核苷酸序列克隆到用于表达或增殖的载体中。编码目的抗体的序列可保持在宿主细胞内的载体，然后可扩增宿主细胞并冷冻以便以后使用。在备选方案中，多核苷酸序列可用于遗传操作以“人源化”抗体或改善抗体的亲和力或其它特征。例如，将恒定区进行改造以更类似人恒定区，以避免如果抗体用于临床试验及治疗时在人中的免疫应答。可能需要遗传操作抗体序列以获得对NGF的更大亲和力及更大的抑制NGF功效。显然，本领域技术人员可对抗NGF抗体进行一个或多个多核苷酸改变且仍保持它对NGF的结合能力。
人源化单克隆抗体一般有四个步骤。它们是(1)确定起始抗体轻链及重链可变结构域的核苷酸及预测的氨基酸序列；(2)设计人源化抗体，即确定在人源化过程中使用哪个抗体构架区；(3)实际的人源化方法学/技术；以及(4)人源化抗体的转染及表达。见，例如美国专利No.4,816,567、5,807,715、5,866,692、6,331,415、5,530,101、5,693,761、5,693,762、5,585,089及6,180,370。
已经描述了许多包含衍生自非人免疫球蛋白的抗原结合位点的“人源化”抗体分子，包括具有啮齿动物或经修饰啮齿动物V区域和它们与人恒定结构域融合的相关互补决定区(CDR)的嵌合抗体。见，例如Winter等，Nature 349293-299(1991)；Lobuglio等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 864220-4224(1989)；Shaw等，J Immunol.1384534-4538(1987)以及Brown等，Cancer Res.473577-3583(1987)。其它参考文献描述了在与适当人抗体恒定区融合前，嫁接到人支持构架区(FR)的啮齿动物CDR。见，例如Riechmann等，Nature 332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 2391534-1536(1988)以及Jones等，Nature 321522-525(1986)。另一参考文献描述了通过重组修饰啮齿动物构架区提供的啮齿动物CDR。见，例如欧洲专利号公布号519,596。这些“人源化”分子被设计来最小化针对啮齿动物抗人抗体分子的有害免疫应答，所述应答限制这些部分在人受者中治疗性应用的持续时间及功效。例如，可改造抗体恒定区，使它为免疫惰性(例如不引发补体裂解)。见，例如PCT/GB99/01441；英国专利申请No.9809951.8。也可应用的其它人源化抗体的方法由Daugherty等，Nucl.AcidsRes.192471-2476(1991)以及美国专利No.6,180,377、6,054,297、5,997,867、5,866,692、6,210,671及6,350,861以及PCT公布号WO01/27160公开。其他方法描述于美国序列No.10/745,775。
在又一备选方案中，可通过用经改造以表达特异人免疫球蛋白的可商业途径获得的小鼠得到完全人抗体。设计产生更合意(例如完全人抗体)或更强效免疫应答的转基因动物也可用于产生人源化或人抗体。此类技术的实例为来自Abgenix，Inc.(Fremont，CA)的XenomouseTM以及来自Medarex，Inc.(Princeton，NJ)的HuMAb-Mouse及TC Mouse。
显然尽管上面的讨论涉及人源化抗体，但是所讨论的一般原理可应用于定做用于例如狗、猫、灵长类动物、马和牛的抗体。还显然可以组合本文描述的人源化抗体的一个或多个方面，例如CDR移植、构架突变和CDR突变。
在备选方案中，抗体可用本领域已知的任何方法重组制备及表达。在另一备选方案中，抗体可通过噬菌体展示技术重组制备。见，例如美国专利No.5,565,332、5,580,717、5,733,743、6,265,150，以及Winter等，Annu.Rev.Immunol.12433-455(1994)。备选地，可用噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature 348552-553(1990))自未经免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因所有组成成分体外产生人抗体或抗体片段。根据此技术，将抗体V结构域基因框内克隆到丝状噬菌体(如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中，并作为功能性抗体片段在噬菌体颗粒表面展示。由于丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体功能特性的选择也导致编码显示这些特性的抗体基因的选择。因此，噬菌体模仿了B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行；综述见，例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology 3564-571(1993)。若干来源的V基因片段可用于噬菌体展示。Clackson等，Nature 352624-628(1991)从来自经免疫小鼠脾的V基因小随机组合文库中分离了一批不同的抗唑酮抗体。可构建来自未免疫人供体的V基因所有组成成分以及根据Mark等，J.Mol.Biol.222581-597(1991)或Griffith等，EMBO J.12725-734(1993)描述的技术基本上分离针对不同抗原(包括自身抗原)的抗体。在天然免疫应答中，抗体基因以高速率积累突变(体细胞高变)。一些导入的变化将赋予更高的亲和力，并且在随后抗原攻击中优选复制及分化显示高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞。此天然过程可通过用称作“链改组”的技术模拟(Marks等，Bio/Technol.10779-783(1992))。在此方法中，通过噬菌体展示获得的“原初”人抗体的亲和力可通过用获自未免疫供体的V结构域基因的天然存在变体(所有组成成分)所有组成成分依次取代重链及轻链V区域基因得到改善。此技术能够产生亲和力在pM-nM范围的抗体及抗体片段。Waterhouse等，Nucl.Acids Res.212265-2266(1993)描述了制备非常大噬菌体抗体所有组成成分(也称为“所有文库之母”)的策略。基因改组也可用于自啮齿动物抗体衍生人抗体，其中人抗体与起始啮齿动物抗体具有相似亲和力及特异性。根据也称为“表位印记”的方法，用人V结构域基因的所有组成成分取代通过噬菌体展示技术获得的啮齿动物抗体的重链或轻链V结构域基因，产生啮齿动物-人嵌合体。抗原的选择导致分离能恢复功能性抗原结合位点的人可变区，即表位支配(印记)配偶体的选择。当为了替代剩余啮齿动物V结构域重复此方法时，得到人抗体(见1993年4月1日公布的PCT专利申请WO 9306213)。不同于通过CDR移植的啮齿动物抗体的常规人源化，此技术提供了没有啮齿动物来源的构架或CDR残基的完全人抗体。显然尽管上面的讨论涉及人源化抗体，但是所讨论的一般原理可应用于定做用于例如狗、猫、灵长类动物、马和牛的抗体。
可通过首先自宿主动物分离抗体及抗体产生细胞，获得基因序列并用基因序列在宿主细胞(例如CHO细胞)中重组表达抗体而重组制备抗体。其它可用的方法为在植物(例如烟草)或转基因乳(transgenic milk)中表达抗体序列。已公开了用于在植物或乳中重组表达抗体的方法。见，例如Peeters等，Vaccine 192756(2001)；Lonberg，N.和D.Huszar Int.Rev.Immunol 1365(1995)；以及Pollock等，J Immunol Methods 231147(1999)。制备抗体衍生物(例如人源化抗体、单链抗体等)的方法是本领域已知的。
免疫测定法及流式细胞分选技术如荧光激活细胞分选术(FACS)也可用于分离对NGF特异的抗体。
抗体可与许多不同的载体结合。载体可为活性和/或惰性的。公知载体的实例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、玻璃、天然及修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖及磁体。根据本发明的目的，载体的性质可为可溶解或不溶解。本领域技术人员知道结合抗体的其它合适载体或能够用常规实验确定结合抗体的其它合适载体。
用常规方法(例如，通过使用能特异结合编码单克隆抗体重链及轻链基因的寡核苷酸探针)易于分离并测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后转染进宿主细胞，如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白蛋白质的骨髓瘤细胞，以在所述重组宿主细胞中合成单克隆抗体。也可以修饰DNA，例如，通过用人重链及轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci.816851(1984))或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的所有或部分编码序列连接。以那种方式，制备了具有本文抗NGF单克隆抗体结合专一性的“嵌合”或“杂合”抗体。如本文所描述的，编码抗NGF抗体拮抗剂(如人源化抗人NGF拮抗剂抗体)的DNA可用于通过所需细胞递送和表达抗NGF抗体拮抗剂。本文进一步描述了DNA递送技术。
可使用本领域公知的方法表征抗NGF抗体。例如，一种方法是鉴定它结合的表位，即“表位作图”。本领域有许多方法用于对蛋白质上表位位置作图及表征，包括例如在Harlow和Lane，《Using Antibodies，aLaboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，纽约，1999一书的第11章中描述的解决抗体-抗原复合体的晶体结构、竞争测定法、基因片段表达测定法以及基于合成肽的测定法。在额外实例中，表位作图可用于确定抗NGF抗体结合的序列。表位作图可自多种商业途径获得，例如Pepscan Systems(Edelhertweg 15，8219 PHLelystad，荷兰)。表位可为线性表位，即包含一串氨基酸序列，或通过不一定含于一串序列的氨基酸的三维相互作用形成的构象表位。可分离或合成(例如重组合成)不同长度肽(例如至少4-6个氨基酸长)并用于使用抗NGF抗体的结合测定法。在另一实例中，抗NGF抗体结合的表位可在系统筛选中通过用来自NGF序列的重叠肽并测定抗NGF抗体的结合进行确定。根据基因片段表达测定法，编码NGF的可读框随机或通过特异遗传构建片段化并测定表达的NGF片段与欲进行检测的抗体的反应性。例如，基因片段可通过PCR产生，并在存在放射性氨基酸时，在体外并译成蛋白质。然后通过免疫沉淀法或凝胶电泳法测定抗体与放射性标记NGF片段的结合。也可通过用在噬菌体颗粒表面展示的随机肽序列大文库(噬菌体文库)鉴定某些表位。备选地，在简单结合测定法中测试重叠肽片段的限定文库与受试抗体的结合。在其它实例中，可进行抗原结合结构域诱变、结构域交换实验及丙氨扫描诱变以鉴定表位结合所需、足够和/或必需的残基。例如，可用突变NGF进行结构域交换实验，其中NGF用来自密切相关，但抗原性不同的蛋白质(如神经营养蛋白家族的另一成员)的序列取代(交换)NGF多肽的各种片段。通过评估抗体与突变体NGF的结合，可评估特定NGF片段对抗体结合的重要性。
可用于表征抗NGF抗体的另一方法是用已知结合相同抗原(即NGF上多种片段)的其它抗体的竞争测定法，以确定抗NGF抗体是否结合与其它抗体相同的表位。竞争测定法对本领域技术人员是公知的。如在Hongo等，Hybridoma 19215-227(2000)中描述的，可在本发明竞争测定法中应用的抗体实例包括MAb911、912、938。
其他NGF拮抗剂可以使用抗NGF抗体之外的NGF拮抗剂。在本发明的一些实施方案种，NGF拮抗剂含有至少一种反义分子，其能够阻断或降低功能NGF、或者功能trkA和/或p75受体的表达。NGF、trkA和p75的核苷酸序列是公知的并且容易从可以公开得到的数据库得到。见，例如Borsani等，Nuc.Acids Res.1990，18，4020；登录号NM 002506；Ullrich等，Nature 303821-825(1983)。按常规制备特异结合NGF、trkA或p75 mRNA而不与其他多核苷酸交叉反应的反义寡核苷酸分子。靶定的代表性位点包括(但不限于)起始密码子、5’调节区、编码区和3’非翻译区。在一些实施方案中，寡核苷酸长为约10到100个核苷酸、约15到50个核苷酸、为约18到25个核苷酸，或者更多。寡核苷酸可以含有主链修饰，本领域中熟知的硫代磷酸酯键、和2’-O糖修饰。见，例如Agrawal和Zhao(1998)，Antisense &Nucleic Acid Drug Development 8,135-139。代表性反义分子包括美国公布号20010046959中描述的NGF反义分子；还参见http//www.rna-tec.com/repair.htm。
备选地，使用基因敲减法、吗啉代寡核苷酸、RNAi、或者核酶，本领域中公知的方法可以减小NGF表达和/或释放。见，例如Rossi，J.J.等编，《Intracellular Ribozyme ApplicationsPrinciples and Protocols》，Horizon Scientific Press(Duarte，CA，1999)；US 6,506,559、WO02/244321、WO 01/192513、WO 01/29058。
在其他实施方案中，NGF拮抗剂包含至少一种NGF抑制化合物。本文所用的，“NGF抑制化合物”指不同于抗NGF抗体的化合物，其直接或者间接降低、抑制、中和或者消除NGF生物活性。NGF抑制化合物应该表现出任何一种或多种下面的特征(a)结合NGF和抑制NGF生物活性和/或NGF信号转导功能介导的下游途径；(b)治疗或者预防疼痛的任何方面，尤其与NSAID联合使用治疗或者预防疼痛的任何方面；(c)阻断或者降低NGF受体活化(包括trkA受体二聚化和/或自身磷酸化)；(d)增加NGF的清除；(e)抑制(降低)NGF抑制、产生或释放；(f)增强NSAID的疼痛治疗。代表性NGF抑制化合物包括美国公布号20010046959中描述的小分子NGF抑制剂；如PCT公布号WO 00/69829中描述的抑制NGF与p75结合的化合物；如PCT公布号WO 98/17278中描述的抑制NGF与TrkA/p75结合的化合物。NGF抑制化合物的额外实例包括PCT公布号WO 02/17914、WO 02/20479、美国专利No.5,342,942、6,127,401、和6,359,130中描述的NGF抑制化合物。其他代表性NGF抑制化合物为NGF的竞争性抑制剂。见美国专利No.6,291,247。此外，本领域技术人员可以制备其他小分子NGF抑制化合物。
在一些实施方案中，NGF抑制化合物结合NGF。代表性靶(结合)位点包括(但不限于)结合TrkA受体和/或p75受体的NGF的部分和与受体结合区域相邻并部分负责受体结合部分的正确的三维形状的那些NGF的部分。在另一实施方案中，NGF抑制化合物结合NGF受体(如TrkA和/或p75)并抑制NGF生物活性。代表性靶位点包括结合NGF的TrkA和/或p75的那些部分。
在包括小分子的实施方案中，小分子可以具有约100到20,000道尔顿、500到15,000道尔顿，或者1000到10,000道尔顿之一的分子量。可以通过商业途径获得小分子文库。可以用本领域中公知的任一方法施用小分子，所述方法包括吸入、腹膜内、静脉内、肌内、皮下、鞘内、心室内、经口、经肠、肠胃外、鼻内、或者经皮。在一些实施方案中，当NGF拮抗剂为小分子时，其将以0.1到300mg/kg患者体重的比率分成1到3次或多次剂量施用。对于正常体重的成年患者，可以施用每剂1mg到5g。
在其他实施方案中，NGF拮抗剂含有至少一种NGF结构类似物。本发明中“NGF结构类似物”指与NGF的部分具有相似三维结构并且在体外或体内生理条件下结合NGF受体的化合物。在一个实施方案中，NGF结构类似物结合TrkA和/或p75受体。代表性NGF结构类似物包括(但不限于)PCT公布号WO 97/15593中描述的二环肽、美国专利No.6,291,247中描述的二环肽；美国专利No.6,017,878中描述的环状化合物；和PCT公布号WO89/09225中描述的NGF衍生肽。可以通过NGF受体结合的分子建模设计适宜的NGF结构类似物，例如通过PCT公布号WO98/06048中描述的方法。NGF结构类似物可以是相同或不同结构的任一需要的组合以得到提高的亲和力和生物学效应的单体或二聚体/寡聚体。
在其他实施方案中，本发明提供了含有TrkA受体和/或p75受体的至少一种显性失活突变体的NGF拮抗剂。本领域技术人员可以制备例如TrkA受体的显性失活突变体从而该受体将结合NGF并从而作为捕获NGF的“接收器”。然而，显性失活突变体结合NGF时将不具有受体的正常生物活性。代表性显性失活突变体包括(但不限于)下面参考文献中描述的突变体Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，95，10884；Eide等，J.Neurosci.1996，16，3123；Liu等，J.Neurosci 1997，17，8749；Klein等，Cell 1990，61，647；Valenzuela等，Neuron 1993，10，963；Tsoulfas等，Neuron 1993，10，975；和Lamballe等，EMBO J.1993，12，3083，这些参考文献被本文全文引入作为参考。显性失活突变体可以以蛋白质形式或者使显性失活突变体(例如突变的TrkA受体)在体内表达的表达载体形式施用。可以用本领域中公知的任何方法施用所述蛋白质或表达载体，如腹膜内、静脉内、肌内、皮下、鞘内、心室内、经口、经肠、肠胃外、鼻内、经皮或者通过吸入施用。例如，表达载体的施用包括局部或者全身施用，包括注射、经口施用、基因枪或者插管施用和局部施用。在另一实施方案中，将蛋白质或者表达载体直接施用于交感神经或者sensory trunk或者神经节。本领域技术人员熟悉表达载体的施用以得到外源蛋白质在体内的表达。见，例如美国专利No.6,436,908、6,413,942、6,376,471。
还可以靶向递送含有反义多核苷酸、表达载体或者亚基因组多核苷酸的治疗组合物。受体介导的DNA递送技术在例如Findeis等，TrendsBiotechnol.(1993)11202；Chiou等，Gene TherapeuticsMethods AndApplications Of Direct Gene Transfer(J.A.Wolff编)(1994)；Wu等，J.Biol.Chem.(1988)263621；Wu等，J.Biol.Chem.(1994)269542；Zenke等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1990)873655；Wu等，J.Biol.Chem.(1991)266338中有所描述。以基因治疗方案局部施用含有约100ng到约200mg(或更多)DNA的多核苷酸的治疗组合物。在一些实施方案中，在基因治疗方案期间还可以使用小于约500ng，约500ng到约50mg，约1μg到约2mg，约5μg到约500μg，约20μg到约100μg或者更高的DNA浓度范围。可以使用基因递送载体递送本发明的治疗性多核苷酸和多肽。基因递送载体可以是病毒或者非病毒来源(一般见，Jolly,Cancer Gene Therapy(1994)151；Kimura，Human Gene Therapy(1994)5845；Connelly，Human Gene Therapy(1995)1185；和Kaplitt，Nature Genetics(1994)6148)。可以使用内源哺乳动物或者异源启动子和/或增强子诱导这些编码序列的表达。编码序列的表达可以是组成性或受调节的。
用于递送所需多核苷酸并在目的细胞中表达的基于病毒的载体是本领域中熟知的。代表性基于病毒的载体包括(但不限于)重组逆转录病毒(见，例如PCT公布号WO 90/07936、WO 94/03622、WO 93/25698、WO 93/25234、WO 93/11230、WO 93/10218、WO 91/02805、美国专利No.5,219,740、4,777,127、英国专利号2,200,651和欧洲专利No.0345242)、基于甲病毒的载体(例如辛德比斯病毒载体、Semliki森林病毒(ATCCVR-67、ATCCVR-1247)、罗斯河病毒(Ross River virus)(ATCC VR-373、ATCC VR-1246)及委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923、ATCC VR-1250、ATCC VR1249、ATCC VR-532)，以及腺伴随病毒(AAV)载体(见，例如PCT公布号WO 94/12649、WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938、WO 95/11984及WO 95/00655)。也可施用如Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3147中描述的与灭活腺病毒连接的DNA。
也可使用非病毒递送载体及方法，包括(但不限于)仅与灭活腺病毒连接或不连接的聚阳离子浓缩DNA(见，例如Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3147)；配体连接的DNA(见，例如Wu，J.Biol.Chem.(1989)26416985)；真核细胞递送载体细胞(见，例如美国专利No.5,814,482、PCT公布号WO 95/07994、WO 96/17072、WO 95/30763及WO 97/42338)以及核电荷中和或与细胞膜融合。也可用裸露DNA。代表性裸露DNA导入方法在PCT公布号WO 90/11092及美国专利No.5,580,859中有所描述。可作为基因递送载体的脂质体在美国专利No.5,422,120；PCT公布号WO95/13796、WO 94/23697、WO 91/14445以及EP专利No.0524968中有所描述。其它方法在Philip，Mol.Cell Biol.(1994)142411及在Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)911581中有所描述。
显然，表达载体还可用以指导本文描述的任一种基于蛋白质的NGF拮抗剂(例如抗NGF抗体、TrkA免疫黏附素等等)的表达。例如，编码抗NGF抗体拮抗剂的多核苷酸也可以用于递送和在目的细胞中表达抗NGF抗体拮抗剂。显然，表达载体可用于指导抗NGF抗体拮抗剂的表达。该表达载体可以腹膜内、静脉内、肌内、皮下、鞘内、心室内、经口、经肠、肠胃外、鼻内、经皮或者通过吸入施用。例如，表达载体的施用包括局部或全身施用，包括注射、经口施用、基因枪或者插导施用和局部施用。如本文进一步讨论的，本领域技术人员熟悉表达载体的施用以获得外源蛋白质在体内的表达。见，例如美国专利No.6,436,908、6,413,942、6,376,471。能够阻断(部分到完全阻断)NGF和/或NGF生物活性的其他TrkA受体片段是本领域中公知的。
在另一实施方案中，NGF拮抗剂含有至少一种TrkA免疫黏附素。如本文所用的，TrkA免疫黏附素指含有TrkA受体的胞外结构域(或者其部分)和免疫球蛋白序列的可溶性嵌合分子，该分子保持TrkA受体的结合特异性(在一些实施方案中，基本上保持结合特异性)并且能够结合NGF。如本文所述，TrkA免疫黏附素能够阻断(降低和/或抑制)NGF生物活性。
TrkA免疫黏附素是本领域中公知的，并且已经发现其阻断(降低或抑制)NGF与TrkA受体的结合。见，例如美国专利No.6,153,189。在一个实施方案中，TrkA免疫黏附素含有能够结合NGF的TrkA受体氨基酸序列(或者基本上保持TrkA受体的结合特异性的氨基酸序列)和免疫球蛋白序列(或者基本上保持TrkA受体的结合特异性的氨基酸)的融合。在一些实施方案中，TrkA受体为人TrkA受体序列，并且与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。在其他实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域序列是免疫球蛋白重链恒定结构域序列。在其他实施方案中，两种TrkA受体-免疫球蛋白重链融合(例如，通过二硫键的共价连接)的结合导致同型二聚体免疫球蛋白样结构。免疫球蛋白轻链还可以与二硫键结合的二聚体中TrkA受体-免疫球蛋白嵌合体之一或两者结合以产生同型三聚体或者同型四聚体结构。适宜的TrkA免疫黏附素的实例包括美国专利No.6,153,189中描述的那些。
在另一实施方案中，NGF拮抗剂含有至少一种抗TrkA抗体，其能够阻断、抑制、改变、和/或降低NGF与TrkA受体和/或下游信号转导的物理相互作用，从而减小和/或阻断NGF生物活性。抗TrkA抗体是本领域中公知的。代表性抗TrkA抗体包括PCT公布号WO 97/21732、WO00/73344、WO 02/15924，和美国专利No.20010046959中描述的那些抗TrkA抗体。在另一实施方案中，NGF拮抗剂包含至少一种抗p75抗体，其能够阻断、抑制、和/或降低NGF与p75受体和/或下游信号转导的物理相互作用，从而降低和/或阻断NGF生物活性。
在另一实施方案中，NGF拮抗剂包含至少一种激酶抑制剂，其能够抑制与TrkA和/或p75受体活性相关的下游激酶信号转导。代表性激酶抑制剂为K252a或k252b，它们是本领域中公知的并且在Knusel等，J.Neurochem.59715-722(1992)；Knusel等，J.Neurochemistry 57955-962(1991)；Koizumi等，J.Neuroscience 8715-721(1988)；Hirata等，ChemicalAbstracts 111728，XP00204135中有所描述，见摘要和《12th CollectiveChemical Substance Index》，p.34237，c.3(5-7，55-60，66-69)，p.34238，c.1(41-44)，c.2(25-27，32-33)，p.3423，c.3(48-50，52-53)；美国专利No.6,306,849。
预期如果临床医生进行寻找，将鉴定许多其他类别的NGF拮抗剂。
NGF拮抗剂的鉴定使用本领域中公知的方法可以鉴定或表征抗NGF抗体和其他NGF拮抗剂，从而检测和/或测量NGF生物活性的降低、改善或者中和。例如，美国专利No.5,766,863和5,891,650中描述的激酶受体活化(KIRA)测定法可用于鉴定抗NGF剂。该ELISA型测定法适于通过测量受体蛋白质酪氨酸激酶(下文中“rPTK”)(例如TrkA受体)的激酶结构域的自磷酸化来定性或者定量测量激酶活性，以及鉴定和表征所选的rPTK(例如TrkA)的潜在拮抗剂。该测定法第一阶段包括激酶受体(如TrkA受体)的激酶结构域的磷酸化，其中所述受体存在于真核细胞的细胞膜中。受体可以是内源受体或者编码受体的核酸，或者可以将受体构建体转化进细胞。通常，第一个固相(例如第一个测定板的孔)被这些细胞(通常哺乳动物细胞系)的基本上同源的群体包被，从而细胞粘附到固相。通常，细胞是粘附性的从而自然粘附到第一个固相。如果使用“受体构建体”，其通常含有激酶受体和标记多肽的融合。在测定法的ELISA部分，标记多肽被捕获剂(通常为捕获抗体)识别。然后将分析物(如候选抗NGF抗体或者其他NGF拮抗剂)与NGF一起加入具有粘附细胞的孔中，从而酪氨酸激酶受体(例如TrkA受体)暴露(或者接触)于NGF和分析物。该测定法可以鉴定通过TrkA配体NGF抑制其活性的抗体(或者其他NGF拮抗剂)。暴露于NGF和分析物后，用裂解缓冲液(其含有增溶去污剂)溶解粘附的细胞并轻轻搅拌，从而释放细胞裂解物，其可以直接用于测定法的ELISA部分，不需要浓缩或者澄清细胞裂解物。
然后如此制备的细胞裂解物易于用于测定法的ELISA阶段。作为ELISA阶段的第一步，第二固相(一般为ELISA微滴定板的孔)用与酪氨酸激酶受体特异结合的捕获剂包被或对于受体构建体的情况，用与标记多肽特异结合的捕获剂(常常为捕获抗体)包被。进行第二固相的包被使捕获剂粘附在第二固相上。捕获剂一般为单克隆抗体，但如在本文实施例中描述的，也可用多克隆抗体。然后将获得的细胞裂解物暴露于(或接触)粘附捕获剂，使受体或受体构建体粘附(或捕获在)第二固相上。然后进行漂洗步骤，以除去未结合的细胞裂解物，留下捕获的受体或受体构建体。然后将粘附或捕获的受体或受体构建体暴露于(或接触)抗磷酸酪氨酸抗体，其鉴定酪氨酸激酶受体中磷酸化酪氨酸残基。在一个实施方案中，抗磷酸酪氨酸抗体与催化非放射性显色试剂颜色变化的酶(直接或间接)缀合。因此，可通过随后试剂的颜色变化测量受体的磷酸化。酶可与抗磷酸酪氨酸抗体直接缀合，或缀合分子(例如生物素)可与抗磷酸酪氨酸抗体缀合并且酶可随后通过缀合分子与抗磷酸酪氨酸抗体缀合。最后，通过例如显色试剂的颜色变化进行测量，抗磷酸酪氨酸抗体与捕获受体或受体构建体的结合。
也可通过孵育候选剂与NGF并监测以下任一项或多项特征鉴定抗NGF拮抗剂(a)结合NGF并抑制NGF生物活性和/或由NGF信号功能介导的下游途径；(b)阻断或降低NGF受体活化；(c)增加NGF的清除；(d)抑制NGF受体活化(包括TrkA二聚化和/或自磷酸化)；(e)治疗、减轻或预防疼痛或骨关节炎疼痛的任何方面，特别是与NSAID联合使用；(f)抑制(降低)NGF合成、产生或释放；(g)增强NSAID对疼痛的治疗。在一些实施方案中，通过孵育候选剂与NGF并监测结合和/或伴随的NGF生物活性的降低或中和鉴定抗NGF拮抗剂。可用纯化的NGF多肽或天然表达或转染表达NGF多肽的细胞进行实施结合测定法。在一个实施方案中，结合测定法为竞争性结合测定法，其中评估候选抗体与已知NGF拮抗剂竞争结合NGF的能力。此测定法可以多种形式实施，包括ELISA形式。在其它实施方案中，通过孵育候选剂与NGF并监测结合和伴随的trkA受体二聚化和/或自磷酸化的抑制鉴定抗NGF拮抗剂。
在最初鉴定后，候选抗NGF抗体拮抗剂的活性可通过已知检测定向生物活性的生物测定法进一步确定及完善。备选地，可用生物测定法直接筛选候选物。例如，NGF在应答细胞中促进许多形态可识别的变化。这些包括(但不限于)促进PC12细胞的分化及增强自这些细胞中神经突的生长(Urfer等，Biochem，364775-4781(1997)；Tsoulfas等，Neuron10975-990(1993))、促进神经突自应答感觉及交感神经节的外植体向外生长(Levi-Montalcini，R.和Angeletti，P.Nerve growth factor.Physiol.Rev.48534-569，1968)，并促进依赖NGF的神经元(如胚胎背根神经节、三叉神经节或交感神经节神经元的存活(例如Chun & Patterson，Dev.Biol.75705-711(1977)；Buchman & Davies，Development 118989-1001(1993))。因此，用于抑制NGF生物活性的测定法需要用NGF加分析物培养NGF应答细胞，所述分析物如候选抗NGF抗体和候选NGF拮抗剂。在适当时间后，测定细胞反应(细胞分化、神经突向外生长或细胞存活)。
候选NGF拮抗剂阻断或中和NGF生物活性的能力也可通过监测候选制剂在Hongo等，Hybridoma 19215-227(2000)中描述的胚胎大鼠背根神经节存活生物测定法中抑制NGF介导的存活的能力来评估。鉴定NGF活性调节剂的方法在PCT/US2004/01609中有所描述。
组合物如本文的多种实施方案描述的，本发明的组合物含有有效量的NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)和NSAID。在一些实施方案中，组合物还含有可药用赋形剂。在一些实施方案中，该组合物用于本文描述的任一方法(如治疗手术后疼痛的方法)中。这些组合物的实例，以及它们的配制方法也在前面章节和下本文有所描述。NGF拮抗剂和NSAID可以以单一组合物存在或者作为分开的组合物存在。因此，在一些实施方案中，NGF拮抗剂和NSAID存在于同一组合物中。在其他实施方案中，NGF拮抗剂和NSAID存在于分开的组合物中。
另一方面，本发明提供了NGF拮抗剂和NSAID的增效组合物。
在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗疼痛(如手术后疼痛)的含有NGF拮抗剂的药物组合物，其中所述应用包括同时和/或依次施用NSAID。在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗疼痛的含有NSAID的药物组合物，其中所述应用包括同时和/或依次施用NGF拮抗剂。在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其含有用于分开、同时和/或依次治疗疼痛的NGF拮抗剂和NSAID。在一些实施方案中，NGF拮抗剂为抗NGF抗体(如本文描述的抗体E3)。在其他实施方案中，NSAID为布洛芬。在其他实施方案中，NGF拮抗剂为抗NGF抗体并且NSAID为布洛芬。
应当理解所述组合物可以含有一种以上的NGF拮抗剂。例如，组合物可以含有一类NGF拮抗剂的一种以上的成员(例如识别NGF不同表位的抗NGF抗体的混合物)，以及不同类别的NGF拮抗剂的成员(例如抗NGF抗体和NGF抑制化合物)。其他代表性组合物含有识别相同表位的一种以上的抗NGF抗体、结合NGF的不同表位的不同物种的抗NGF抗体，或者不同的NGF抑制化合物。在其他实施方案中，所述组合物含有一种或多种NGF拮抗剂，其选自结合(物理相互作用)NGF的拮抗剂(例如抗体)、结合NGF受体(如TrkA受体或者p75受体)的拮抗剂和降低(阻碍和/或阻断)下游NGF受体信号转导的拮抗剂。
用于本发明的组合物还可以冻干制剂或者水性溶液的形式含有可药用载体、赋形剂或者稳定剂(Remington《The Science and Practice ofPharmacy》第20版(2000)，Lippincott Williams和Wilkins编，K.E.Hoover)。可接受的载体、赋形剂或者稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且可以含有缓冲剂(如磷酸、柠檬酸，和其他有机酸)、抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)、防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化己烷双胺、苯扎氯铵、苯索氯胺、苯酚、丁醇或苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚)环己醇、3-戊醇、及间甲酚)、低分子量(约10个残基以下)多肽、蛋白质(如血清白蛋白)、明胶或免疫球蛋白、亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸)、单糖、二糖及其它碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)、螯合剂(如EDTA)、糖(如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇)、形成盐的平衡离子(如钠)、金属复合体(例如锌-蛋白质复合体)和/或非离子表面活性剂(如TWEENTM、PLURONICSTM)或聚乙二醇(PEG)。本文进一步了描述可药用赋形剂。
本文描述的组合物可含有公知对疼痛治疗有用的额外的化合物。NGF拮抗剂和NSAID和它们的组合物也可以与用以增强和/或补充试剂的有效性的其他试剂联合使用。
在其他实施方案中，本发明提供了组合物(描述于本文)，其用于本文描述的任一方法，可用作药物和/或用于制作药物。
试剂盒本发明还提供了用于本发明方法的试剂盒。本发明的试剂盒包括一个或多个容器，所述容器含有NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)、NSAID，在一些实施方案中，所述试剂盒还包括按照本文描述的任一方法使用的说明书。在一些实施方案中，试剂盒含有抗NGF抗体(如本文描述的抗体E3)。在其他实施方案中，试剂盒含有抗NGF抗体，其包含抗体E3的一个或多个CDR(如E3的1、2、3、4、5或者在一些实施方案中，为所有6个CDR)。试剂盒还可以包括关于基于个体患是否有疼痛或者是否该个体处于疼痛的危险中选择适于治疗的个体的说明。在一些实施方案中，本发明提供了按照本文描述的任一方法使用的试剂盒，所述试剂盒含有NGF拮抗剂。在其他实施方案中，试剂盒含有抗NGF抗体。在其他实施方案中，试剂盒含有人源化抗NGF抗体(如本文描述的抗体E3)。在其他实施方案中，说明书包括联合施用NGF拮抗剂和NSAID以治疗、预防和/或减轻任何疼痛(如手术后疼痛、与烧伤、类风湿性关节炎、或者骨关节炎有关的疼痛)的说明。
在一些实施方案中，试剂盒含有NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)、NSAID和关于同时和/或依次施用NGF拮抗剂和NSAID以有效治疗疼痛的使用说明书。在另一实施方案中，该试剂盒含有NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)和关于联合施用NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)和NSAID以有效治疗疼痛的说明书。在其他实施方案中，试剂盒含有NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)、NSAID(如布洛芬)和关于联合施用NGF拮抗剂和NSAID以有效治疗疼痛的使用说明书。因此，本文描述的任一方法可以反映在使用说明书中。
在一些实施方案中，试剂盒含有抗NGF抗体。在其他实施方案中，抗NGF抗体为含有表1中所示重链可变区和表2中所示轻链可变区的抗体。在其他实施方案中，抗NGF抗体为本文描述的抗体E3。
NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)和NSAID可以存在于公开的或同一容器中。应当理解试剂盒可以含有一种明确的组合物或者两种或多种组合物，其中一种组合物含有NGF拮抗剂，一种组合物含有NSAID。
本发明的试剂盒适于包装。适宜的包装包括(但不限于)小瓶、瓶、广口瓶(jar)、弹性包装(例如密封的聚酯薄膜或者塑料袋)等。试剂盒可以任选提供额外的组分，如缓冲剂和说明性信息。
关于NGF拮抗剂的使用说明通常包括关于计划治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以为单位剂量、批量包装(例如多剂量包装)或者亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的使用说明书通常为标签或者包装插页(例如包括在试剂盒中的纸张)上的书写说明，但是也可以接受的机器可读的说明(例如在磁或者光储存盘上携带的说明书)。
标记或者包装插页指出该组合物用于治疗、减轻和/或预防疼痛(包括手术后疼痛)。可以提供使用说明书以实施本文描述的任一种方法。
本发明的试剂盒适于包装。适宜的包装包括，但不限于，小瓶、瓶、广口瓶、弹性包装(例如密封的聚酯薄膜或者塑料袋)等。还设想包装组合使用特定装置，如吸入器、鼻施用装置(例如雾化器)或者灌注装置(如微泵)的包装。试剂盒可以具有无菌入口(例如，容器可以为具有皮下注射针头可以刺穿的塞子的静脉溶液包或者小瓶)。容器也可以具有无菌入口(例如，容器可以是具有皮下注射针头可以刺穿的塞子的静脉溶液包或者小瓶)。组合物中至少一种活性剂为NGF拮抗剂，如抗NGF抗体。容器可以还含有另一种药物活性剂。
试剂盒可以任选地提供额外的组分，如缓冲剂或者解释性信息。通常，试剂盒含有容器和容器上或者与容器相伴的标签或者包装插页。
在一些实施方案中，本发明提供了含有上述试剂盒的内含物的产品。在一些实施方案中，试剂盒含有NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)和/或NSAID与指示用于治疗疼痛(相互联合)的信息。
NGF拮抗剂和NSAID的施用和对治疗的评估可以通过任何适宜的途径将NGF拮抗剂和NSAID施用于个体。例如，它们可以一起或者单独地经口、静脉内、舌下、皮下、动脉内、肌内、脊柱内、经直肠、胸内、腹膜内、心室内、舌下、透皮或者通过吸入施用。它们可以经口施用，例如以片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、糯米纸囊剂、口香糖、棒糖、栓剂或者本领域公知的方法制备的剂型施用。本领域中技术人员显而易见的是本文描述的实施例无意限制而是阐明可以利用的技术。
因此，在一些实施方案中，根据公知的方法对个体施用NGF拮抗剂，(如抗NGF抗体)，如静脉内施用，例如，作为快速注射或者通过一段时间内连续输液，可以通过肌内、腹膜内、脑脊内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、经口、吸入或者局部途径。通过商业途径可以得到的液体制剂的雾化器(包括喷雾雾化器和超声雾化器)可用于施用。液体制剂可以直接雾化，冻干粉剂可以重构后雾化。备选地，NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)可以经碳氟化合物制剂和带刻度的剂量吸入器雾化，或者作为冻干和碾磨的粉剂吸入。
位点专一或者靶向局部递送技术也可以用于施用。位点专一或者靶向局部递送技术的实例包括NGF拮抗剂和/或NSAID的多种可植入的贮库制剂源(depot source)，或者局部递送导管，如输液导管、内在导管，或者针头导管、合成移植物、adventitial wrap、分流装置和stent装置或者其他可植入的装置、位点专一载体、直接注射、使用患者控制的止痛(PCA)技术或者装置和/或直接应用。见，例如PCT公布号WO 00/53211和美国专利No.5,981,568。
可施用试剂(NGF拮抗剂，如抗NGF抗体或者其片段)的多种制剂。在一些实施方案中，试剂如抗NGF抗体或者其片段可以直接施用。在一些实施方案中，包括抗NGF抗体的所述试剂可以为多种制剂，包括含有可药用赋形剂的制剂。可药用赋形剂是本领域中公知的，并且是便于药物活性物质施用的相对惰性的物质。例如，赋形剂可赋予形状或者稠度，或者作为稀释剂。适宜的赋形剂(包括但不限于)稳定剂、湿润剂和乳化剂、用于改变摩尔渗透压浓度的盐、胶囊化剂、缓冲剂和皮肤渗透增强剂。赋形剂以及用于肠胃外和非肠胃外药物递送的赋形剂在Remington等《TheScience and Practice of Pharmacy》第20版，Mack Publishing(2000)中提出。
在一些实施方案中，配制这些试剂(NGF拮抗剂)以通过注射(例如腹膜内、静脉内、皮下、肌内等等)施用。因此，这些试剂可以与可药用载体如(盐水、Ringer溶液、右旋糖溶液等等)组合。具体给药方案，即剂量、时间选择和重复将取决于具体的个体和个体的病史。给药方案(包括所用NGF拮抗剂)可以随时间改变。
可以用任何适宜的方法，包括通过注射(例如腹膜内、静脉内、皮下、肌内等等)施用抗NGF抗体。如本文描述，还可以通过吸入施用抗NGF抗体。通常，对于抗NGF抗体的施用，最初候选剂量可以为约0.2mg/kg或约2mg/kg。在一些实施方案中，取决于上面提到的因素，常用的日剂量可以为约3μg/kg到30μg/kg到300μg/kg到3mg/kg到30mg/kg到100mg/kg或以上的任一种。对于数天或更长时间的反复施用，根据条件，持续治疗直到产生疾病症状所希望的抑制或者直到实现了减轻疼痛的足够的治疗水平。代表性给药方案包括施用约2mg/kg的最初剂量，然后约1mg/kg的抗NGF抗体每周维持剂量，或者每隔一周约1mg/kg的维持剂量。然而，也可以使用其他剂量方案，这取决于医生希望实现的药物动力学衰减的模式。例如，设想每周给药1-4次。其他给药方案包括每天最多1次，每周1到4次，或者更低的频率。在一些实施方案中，每周约一次、每月约1到4次施用化合物。抗NGF抗体的剂量在本文有所描述。通过常规技术和测定法可以容易地监视该治疗的进展。
在一些实施方案中，当本发明的NGF拮抗剂不是抗体时，可以将其分成1到3剂以0.1到300mg/kg患者体重比率施用，或者如本文公开的施用。在一些正常体重的患者中，可以施用约0.3到5.00mg/kg的剂量。具体剂量方案，即剂量、时间选择和反复将取决于具体的个体和个体的病史，以及个别试剂的性质(如该试剂的半寿期，和本领域中公知的其他考虑)。
NSAID可以以高达这类镇痛剂的常规剂量水平施用。在一些实施方案中，NSAID以降低的水平施用。适宜的剂量水平将取决于所选NSAID的镇痛效果，但是通常适宜的水平将为每天约0.001到25mg/kg，每天约0.005到10mg/kg，或每天约0.05到1mg/kg，或更低。该化合物可以以高达每天6次(或者更多)、每天1到4次的方案施用，或者可以施用频率更低。在一些实施方案中，NSAID连续施用，或者非常频繁地施用(如利用PCA)。
当作为单一或者分开的组合物联合施用时，神经生长因子拮抗剂和NSAID以与所希望的效果表现一致的比例施用。在一些实施方案中，按重量计，神经生长因子拮抗剂和NSAID的比例约为1∶1。在一些实施方案中，该比例可以为约0.001比约1到约1000到约1，到约0.01比约1到约100到约1，或约0.1比约1到约10到约1。也设想其他比例。
应当理解用于治疗和预防疼痛所需的神经生长因子拮抗剂和NSAID的量将不仅随着所选的具体化合物或组合物而变，而且随着施用途径、所治疗的疾病的性质，和患者的年龄和状况、治疗的过程或阶段而变，并且将最终由主治医生决定。例如，NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)的适宜剂量将取决于所用的NGF拮抗剂(或者其组合物)、待治疗的疼痛的类型和严重性、施用试剂用于预防还是治疗目的、以前的治疗、患者的临床史和对该试剂的应答，和主治医生的决定。通常，临床医生将施用NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)，直到达到实现所希望的结果的剂量。
经验考虑(如半寿期)将通常有助于剂量决定。例如与人免疫系统相容的抗体，如人源化抗体或者完全人抗体可以用于延长抗体的半寿期和防止宿主的免疫系统攻击该抗体。可以确定施用频率并随治疗过程进行调整，并且施用频率通常(但不是必需)基于疼痛的治疗和/或抑制和/或减轻和/或延迟。备选地，NGF拮抗剂和/或NSAID的持续连续释放制剂可以是适宜的。实现持续释放的多种制剂和装置是本领域公知的。
在一个实施方案中，可以在已经被一次或多次施用抑制NGF活性的试剂以治疗疼痛的个体中按照经验确定NGF拮抗剂剂量。对个体给予增量的抑制NGF的试剂(例如抗NGF抗体)并联合NSAID。为了评估治疗的功效，可以跟踪疼痛指示剂。
根据本发明的方法，取决于例如受者的生理条件、施用目的为治疗还是预防和技术人员公知的其他因素，可以连续或间歇的施用NGF拮抗剂和NSAID。抗NGF拮抗剂的施用可在预选择的时期基本上连续或可为一系列间断的剂量，所述预选择的时期例如疼痛发展之前、期间或以后；之前及以后；期间及以后；之前及期间；或疼痛发展之前、期间及以后。例如，可以在伤口、切割、创伤、手术，和可能产生疼痛的任何其他事件之前、之间和/或之后施用。
在一些实施方案中，可存在一种以上NGF拮抗剂(如抗体)。拮抗剂可以被此相同或不同。可存在至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或五种以上不同的NGF拮抗剂。大体上，这些NGF拮抗剂具有不会相互有害影响的互补活性。NGF拮抗剂可以与用以增强和/或补充试剂效力的其他试剂联合使用。
在一些实施方案中，可以存在一种以上的NSAID。NSAID可以被此相同或者不同。可以存在至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或五种以上不同的NSAID。大体上，这些NSAID具有不会相互有害影响的互补活性。NSAID可以与用以增强和/或补充试剂的效力的其他试剂联合使用。
通过将具有所需纯度的抗体与任选可药用载体、赋形剂或者稳定剂(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy第20版(2000)，MackPublishing(2000))混合，以冻干制剂或者水性溶液形式制备根据本发明使用的NGF拮抗剂(如抗体)和NSAID的治疗制剂以保存。可接受的载体、赋形剂或者稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且可以含有缓冲剂(如磷酸、柠檬酸，和其他有机酸)、盐(如氯化钠)、抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)、防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化己烷双胺、苯扎氯铵、苯索氯胺、苯酚、丁醇或苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇、及间甲酚)、低分子量(约10个残基以下)多肽、蛋白质(如血清白蛋白)、明胶或免疫球蛋白、亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸)、单糖、二糖及其它碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)、螯合剂(如EDTA)、糖(如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇)、形成盐的平衡离子(如钠)、金属复合体(例如锌-蛋白质复合体)和/或非离子表面活性剂(如TWEENTM、PLURONICSTM)或聚乙二醇(PEG)。
通过本领域已知的方法，如在Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA823688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 774030(1980)以及美国专利No.4,485,045及4,544,545中描述的方法制备包含抗NGF拮抗剂(如抗体)的脂质体。具有增强循环时间的脂质体公开于美国专利No.5,013,556。可通过反相蒸发包含磷脂酰胆碱、胆固醇及PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物产生特别有用的脂质体。脂质体通过确定孔径的滤膜挤出以产生目的直径的脂质体。
活性成分也可捕获在制备的微囊中，例如通过凝聚技术或通过界面聚合作用，例如分别在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒及纳米胶囊)或在微乳剂中的羟甲基纤维素或明胶微囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊中。此类技术公开于Remington，The Science andPractice of Pharmacy第20版，Mack Publishing(2000)中。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的适当实例包括包含抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质为有形状物体(例如膜或微曩)形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙酰乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸醇酸共聚物与醋酸亮比瑞林(leuprolide acetate)组成的可注射微球体)、蔗糖醋酸异丁酸盐及聚-D-(-)-3-羟丁酸。
用于体内施用的制剂必需为无菌的。这通过例如无菌滤膜过滤易于完成。治疗性NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)组合物一般置于具有无菌接入口的容器，例如静脉内溶液袋或具有皮下注射针头可刺穿的塞予的瓶中。
根据本发明的组合物可以为单位剂型，如片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、溶液剂或悬浮剂或栓剂，用于经口、肠胃外或直肠施用，或通过吸入或吹入施用。
对于制备固体组合物(如片剂)，混合主要活性成分与药物载体，例如常规片剂成分(如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)以及其它药物稀释剂(例如水)，以形成包含本发明化合物的同质混合物或其无毒性可药用盐的处方前固体组合物。当谈及这些处方前组合物为同质时，表示活性成分在组合物中均匀分散以便组合物可易于再分为等量有效单位剂型，如片剂、丸剂及胶囊剂。然后此处方前固体组合物再分为包含约0.01mg到约0.1mg至约500mg本发明活性成分的上述类型的单位剂型。可对新组合物的片剂或丸剂进行包衣或否则进行复合以提供具有延长作用优点的剂型。例如，片剂或丸剂可包含内部剂量及外部剂量组分，外剂量组分为内剂量组分的包膜。两种组分可通过肠层分开，该肠层在胃中抵抗分解并允许内层组分完整进入十二指肠或延迟释放。多种材料可用于此类肠层或包衣，这些材料包括许多聚合酸以及聚合酸与虫胶、鲸蜡醇及醋酸纤维素之类的材料的混合物。
其中本发明的组合物可以掺入以经口或者通过注射施用的液体形式包括水溶液、适当调味的糖浆剂、水性或油性悬浮剂，和用食用油(如棉籽油、芝麻油、椰子油、花生油)调味的乳剂，以及酏剂和类似的药物载体。用于水悬浮液的适宜的分散或悬浮剂包括合成和天然树胶(如西黄蓍胶、阿拉伯树胶)、藻酸盐、葡聚糖、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或者明胶。活性成分也可以掺入高粘性的控释产品，如蔗糖乙酸异丁酸盐或者其他。这些制剂可以用于经口施用，或者注射。注射可以导致药物的局部贮存，其在1天到3个月内局部释放。
通过注射施用的组合物包括含有NGF拮抗剂和NSAID作为活性成分，并伴随表面活性剂(或者湿润剂或表面活性剂)或者为乳剂形式(如油包水或者水包油乳剂)的那些组合物。
合适的表面活性剂包括(特别是)非离子剂，如聚氧乙烯山梨糖醇(例如TweenTM20、40、60、80或85)及其它山梨糖醇(例如SpanTM20、40、60、80或85)。具有表面活性制剂的组合物有利地包含0.05到5％，或者0.1到2.5％的表面活性剂。应当理解，如果必要，可加入其它成分，例如甘露醇或其它可药用载体。
用通过商业途径可获得的脂肪乳剂，如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM及LipiphysanTM可制备合适的乳剂。活性成分可溶解于预混合乳剂组合物或备选地溶解于油(例如大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)和基于混和磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水形成的乳剂中。应当理解可加入其它成分，例如甘油或葡萄糖，以调整乳剂的张力。合适的乳剂一般包含高达20％(例如介于5到20％)的油。脂肪乳剂可包含0.1到1.0μm(尤其是0.1到0.5μm)的脂肪滴，其pH在5.5至8.0的范围。
在一些实施方案中，乳剂组合物可为通过混合神经生长因子拮抗剂与IntralipidTM或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油及水)制备的组合物。
用于吸入或吹入的组合物包括在可药用水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬液以及粉末剂。液体或固体组合物可包含如以上指出的合适的可药用赋形剂。组合物可通过经口或鼻呼吸途径施用，用于产生局部或全身效果。在优选无菌可药用溶剂中的组合物可通过使用气体进行雾化。雾化溶液可从雾化装置直接呼吸或将雾化装置与面罩、塞条或间歇正压呼吸机连接。溶液、悬液或粉剂组合物可以适当方式从递送制剂的装置施用(包括经口或经鼻)。
治疗功效可通过本领域公知的方法进行评估。
提供下面的实施例用以阐明而非限制本发明。
实施例实施例1抗NGF单克隆抗体联合NSAID治疗手术后疼痛我们用模拟手术后疼痛的疼痛模型评估抗NGF抗体联合NSAID(布洛芬)的功效。对于每个实验，使用前将体重为200到200g的16只雄性成年Sprague Dawley大鼠(Harlan；Indianapolis，IN)在正常光照条件下室内用食物和水无限制地喂养至少1周。手术前在试验室中适应2小时后，将大鼠分成两组一组手术前15小时接受抗体，另一组在该时间接受载体(5％右旋糖/0.45％盐水USP)。以1mg/kg体重施用抗NGF抗体拮抗剂911(见，Hongo等，Hybridoma 19215-227(2000))。所有动物手术后24小时以10、200和300mg/kg的多种浓度(皮下)施用布洛芬。
手术基于Brennan等，Pain 64493-501(1996)描述的方法。用2％异氟烷和空气的混合物麻醉动物，该混合物通过头锥体(nose cone)在手术期间保持。用聚烯吡酮-碘垫制备右后爪的跖面，通过皮肤和筋膜产生1-cm中央纵向切口，其从距脚后跟边缘0.5cm开始直到脚趾。将足固定在弯曲位置中以尺子进行测量。将跖肌用弯曲镊子升高并纵向切割。通过肌肉的起点到插入之间的完全深度切割肌肉。通过纱布垫按压控制手术期间的出血。用褥式缝合封闭伤口(5-0 ethicon黑色单丝)。将这些缝合打结5-6次，第一个结松散打结。用杆菌肽溶液擦拭伤口部位。在行为试验开始前22小时允许动物恢复并在干净笼中休息。
对于每个实验，将动物分成两组(对照和抗体处理的)。在手术前15小时施用抗NGF抗体。手术后22小时评估两组中的静息疼痛(下面图中的“基线”)。手术后24小时，用布洛芬以10、30、100或300mg/kg(皮下)处理所有动物。布洛芬处理后1小时开始评估静息疼痛。
手术后不同时间用积累疼痛得分评估静息疼痛。将大鼠置于干净塑料笼中的塑料网(格子8mm2)并允许适应15分钟-20分钟。以0到2的数值范围评估行为。如果动物的重量承受在经切割的爪子(通过注意到该爪子变白或者压在网上评估)，那么得分为0。如果爪子仅皮肤接触网，皮肤没有变白或者凹陷，那么得分为1。如果爪子完全离开网，则得分为2。每隔5分钟观察每只动物1分钟，共持续30分钟。1/2小时内观察到的6个得分的总和用于评估被切割足的疼痛。
这些实验的结果在表1和图1中显示。
表1手术后1天用1mg/kg抗NGF抗体拮抗剂和0、10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg或300mg/kg布洛芬处理后，动物的累积疼痛得分。数据以平均值(SEM)显示。通过单向方差分析分析数据，然后利用Prizm软件使用用于多重比较的Bonferroni校准分析个体对。
如表1中所示，Mab911(1mg/kg)处理的的静息疼痛得分显著低于不用布洛芬的对照(p＜0.001)。类似地，1mg/kg Mab911和10mg/kg布洛芬处理的静息疼痛得分显著低于仅用10mg/kg布洛芬处理的得分(p＜0.001)；1mg/kg Mab911和30mg/kg布洛芬处理的静息疼痛得分显著低于仅用30mg/kg布洛芬处理的得分(p＜0.05)。图1给出了用或不用1mg/kg抗NGF抗体处理，和用或不用多种剂量的布洛芬处理的动物的静息疼痛得分。手术前用抗NGF抗体和布洛芬处理在降低静息疼痛中比仅用布洛芬或者仅用抗体处理更有效。将理解Mab911(1mg/kg)处理联合10mg/kg布洛芬至少和仅用300mg/kg布洛芬一样有效。
为了试验用抗NGF单克隆抗体911联合双氯酚酸钠治疗手术后疼痛的效果，如上述实施实验，只是对动物施用载体或者5mg/kg双氯酚酸钠代替布洛芬。结果在图2中显示。与仅用5mg/kg双氯酚酸钠处理相比，用1mg/kg和5mg/kg双氯酚酸钠处理观察到平均疼痛得分减小。
尽管为了明确地理解，通过说明和实施例较为详细地描述了前述发明，但是不应将所述描述和实施例理解为对本发明范围的限制。
权利要求
1.治疗个体疼痛的方法，其包括对该个体施用有效量的抗神经生长因子(NGF)抗体和NSAID。
2.权利要求1的方法，其中NSAID选自布洛芬、萘普生、消痛灵、双氯酚酸钠、酮基布洛芬、托美汀、slindac、甲芬那酸、甲氯芬那酸、二氟尼柳、氟苯沙酸、piroxim、噻氧噻嗪、伊索昔康、塞来昔布、罗非克西、DUP-697、氟舒胺、美洛昔康、6-甲氧基-2-萘乙酸、MK-966、nabumetone、尼美舒利、NS-398、SC-5766、SC-58215、T-614。
3.权利要求1的方法，其中NSAID为布洛芬。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中抗NGF抗体结合人NGF。
5.权利要求4的方法，其中抗NGF抗体以约10nM或者低于约10nM的结合亲和力结合人NGF。
6.权利要求1的方法，其中抗NGF抗体为人抗体。
7.权利要求1的方法，其中抗NGF抗体为人源化抗体。
8.权利要求7的方法，其中人源化抗体为含有SEQ ID NO1所示的重链可变区和SEQ ID NO2所示的轻链可变区的抗体。
9.权利要求1的方法，其中疼痛为手术后疼痛。
10.权利要求4的方法，其中疼痛为手术后疼痛。
11.权利要求8的方法，其中疼痛为手术后疼痛。
12.治疗疼痛的药物组合物，其含有有效量的抗NGF抗体和NSAID以及可药用载体。
13.治疗疼痛的试剂盒，其含有抗NGF抗体、NSAID和关于联合施用抗NGF抗体和NSAID以治疗疼痛的说明书。
全文摘要
本发明以治疗或预防疼痛的方法为特征，所述方法包括施用一定量的神经生长因子拮抗剂(如抗NGF抗体)和一定量的NSAID，以便它们共同提供有效的疼痛减轻。本发明还以含有神经生长因子拮抗剂和NSAID的组合物和含有神经生长因子拮抗剂和NSAID的试剂盒为特征。
文档编号A61K39/395GK1871028SQ200480007465
公开日2006年11月29日 申请日期2004年2月19日 优先权日2003年2月19日
发明者D·L·谢尔顿, G·J·韦尔加拉, C·M·洛 申请人:里纳特神经系统学公司