专利名称：用于移植的软骨细胞的制备方法
技术领域：
本发明涉及正常人软骨细胞的制备方法和根据该方法得到的正常人软骨细胞。此外，本发明还涉及使用所得到的正常人软骨细胞的软骨治疗材料。
背景技术：
软骨细胞在组织中以细胞包埋在基质中的状态存在，用酶例如胶原酶处理软骨，可从基质成分中分离出软骨细胞。可以考虑利用该分离的软骨细胞，移植治疗软骨相关的疾病、特别是进行软骨细胞的自体移植。在人以外的动物，例如兔子、牛等的可以得到大量细胞的情况下，实验证明根据该方法可进行移植治疗(例如Bentry，et al.，Nature 230385-388(1971)，Green，Clin.Orthop.124237-250(1977)，Wakitani et al.，J.Bone and Joint Surgery 71B74-80(1989)，Paige et al.，Plastic and Reconstructive Surgery961390-1398(1995)，Paige et al.，Plastic and ReconstructiveSurgery 97168-178(1996))。
至今为止，一直尝试在人中也能培养关节软骨、耳廓软骨和肋软骨等软骨细胞(Aulthouse et al.，In Vitro Cellular &Developmental Biology 25659-668(1989)，Brrittberg et al.，TheNew England Journal of Medicine 331889-895(1994)，Ting et al.，Annals of Plastic Surgery 40413-421(1998)，Rodriguez etal.，Plastic and Reconstructive Surgery 1031111-1119(1999))。
不过在人中仅能采取很少量的软骨，因此在培养开始时只能使用很少量的软骨细胞，而且使用以往的培养方法，会使人软骨细胞的增殖显著降低，并且即使增殖也会从软骨细胞转变成纤维母细胞，因此用于移植治疗的实际应用是极其困难的。即，存在下述问题，在人体中为了移植需要大量正常的软骨细胞，但却不能得到足够量的软骨细胞。
为了解决该问题，本发明人曾提出下述方案将人软骨细胞和作为饲养细胞的软骨形成期的软骨周边细胞共同培养，其中的饲养细胞能支持软骨细胞增殖，可迅速并且大量地培养人软骨细胞(WO02/12451(2002))。可是，使用人以外的动物的饲养细胞时，存在细菌或无法预料的病毒感染的问题，为了对此进行预防，需要进行烦琐的处理。
相关文献1.Bentry，et al.，Nature 230385-388(1971)2.Green，Clin.Orthop.124237-250(1977)3.Wakitani et al.，J.Bone and Joint Surgery 71B74-80(1989)4.Paige et al.，Plastic and Reconstructive Surgery961390-1398(1995)5.Paige et al.，Plastic and Reconstructive Surgery97168-178(1996)6.Aulthouse et al.，In Vitro Cellular & Developmental Biology25659-668(1989)7.Brrittberg et al.，The New England Journal of Medicine331889-895(1994)8.Ting et al.，Annals of Plastic Surgery 40413-421(1998)9.Rodrigues et al.，Plastic and Reconstructive Surgery1031111-1119(1999)10.WO 02/12451(2002)发明内容本发明的目的是提供不用担心细菌、病毒感染，且能迅速并大量地得到正常的人软骨细胞或其细胞块的方法，另外，本发明的目的是提供使用所得到的正常人软骨细胞或其细胞块的软骨治疗材料。即，本发明包括如下内容(1)人软骨细胞的制备方法，其特征在于，将从具有软骨膜的软骨中得到的软骨细胞和软骨膜共同培养。
(2)(1)记载的制备方法，其特征在于，该软骨是耳廓软骨。
(3)(1)记载的制备方法，其特征在于，将细胞单层或多层地接种1次或2次以上，培养，得到软骨细胞块。
(4)(2)记载的制备方法，其特征在于，将细胞单层或多层地接种1次或2次以上，培养，得到软骨细胞块。
(5)软骨治疗材料，其是根据上述(1)～(4)记载的制备方法得到的单独的软骨细胞或是由该软骨细胞和包埋材料所组成的。
(6)权利要求5记载的软骨治疗材料，其中的包埋材料选自胶原、聚乙二醇酸、聚乳酸、藻酸、聚环氧乙烷、纤维蛋白结合剂、聚乳酸-聚乙二醇酸共聚物、蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖或人的真皮中的一种或两种以上。
图1是将传代培养得到的软骨细胞经2周多层培养后得到的片状的凝胶块的照片。
图2是用苏木素-伊红染色图1的凝胶状软骨细胞块的结果的照片。
图3是对软骨组织的分子标记物的II型胶原进行免疫染色的结果的照片。
图4是从移植部分取出一部分，经苏木素-伊红染色(H.E)后的结果的照片。
图5是从移植部位取出一部分，对软骨组织的分子标记物的II型胶原进行免疫染色的结果的照片。
图6是从移植部分取出一部分，经甲苯胺蓝染色的结果的照片
具体实施例方式
本发明人首先对曾提出的使用饲养细胞的方法(WO02/12451(2002))进一步改良，发现可以不使用饲养细胞、更为简便地培养-增殖耳廓软骨等软骨细胞的方法。以前认为饲养细胞是软骨细胞的培养-增殖所必需的，不过，本发明人发现即使不用饲养细胞，也可以培养-增殖软骨细胞。即，可以说本发明的方法能避免使用饲养细胞时的烦琐操作，使操作简化的同时，还能够避免来自饲养细胞的感染等的危险，是最适用于人的自体移植的方法。
此外，发现用所说的方法可将增殖的人软骨细胞进一步多层培养，得到软骨块，将其以无支持物状态用于移植治疗。
本发明所用的人软骨是耳廓软骨时，出于美容的考虑，优选从耳朵后部的底部切开很少的皮肤，取出少量的软骨组织(1×1平方厘米左右)。优选在此时采取的软骨组织的一面附着有软骨膜。结果发现经过该操作，从软骨采取部位残余的软骨膜另一面上迅速地再生出软骨，整体很快愈合。
下面，为了得到用于移植所需要的细胞，将所采取的附有软骨膜的耳廓软骨切成小块(dice)，开始单层培养。此时优选向所使用的培养基中加入软骨细胞增殖所必需的细胞因子。不仅该单层培养可以移植，而且，使用该单层培养所增殖的细胞，经过多次多层培养，可以得到具有能用镊子等器具收集程度的物理强度的、移植到机体中时不被分散、吸收的组织。多层接种的次数根据希望的组织的大小而有所不同，通常优选3～4次。
将该组织装入到注射筒等中，从安装的注射针注入到软骨缺损部位，可以将其用于鼻子变形、隆鼻、脸骨变形、脸骨缺损、额头形成、头盖骨变形、头盖骨部分缺损、变形性关节炎、小耳症、伴随其他软骨缺损的疾病或软骨缺损部位的治疗、修复。此时，还可向该软骨组织中混入用作载体的胶原、聚乙二醇酸(PGA；polygycolic acid)、聚乳酸(polylactic acid)、藻酸盐(Alginate)、聚环氧乙烷、纤维蛋白结合剂、聚乳酸-聚乙二醇酸共聚物、蛋白聚糖(proteoglycans)、葡萄糖胺聚糖(glucosaminoglycan)。或者，也可以不用载体，将根据本发明的制备方法得到的软骨细胞用于实际应用。
A.人软骨细胞本发明的软骨细胞的制备方法可以用有附着于软骨膜状态的人软骨组织的培养，例如耳廓软骨、肋软骨、关节软骨、椎间软骨和气管软骨的软骨细胞，特别适合耳廓软骨的软骨细胞的培养-增殖。
供给本发明的制备方法的软骨细胞可以是根据公知的方法从附着在软骨膜上的人软骨组织得到的。通常优选用手术刀等将摘取的软骨组织切成小块，用胶原酶处理，使之培养-增殖。其流程的具体例，如下所示。
1)将摘取的软骨组织在抗生素物质(例如青霉素、卡那霉素)或抗真菌剂(例如双性霉素B)中，于4℃左右静置一晚除菌，然后用手术刀等将软骨组织切成小块。
2)将切成小块的软骨组织转移到含有II型胶原酶的培养基中，在4℃左右静置一晚。然后，在37℃下振摇4小时。
3)然后，将处理后的组织离心，将该沉淀物用于培养。
通过该方法，从1平方厘米的人耳廓软骨组织中，通过传代1代，能得到3～5×106个细胞的软骨细胞。此外，在本发明的培养方法中，可以从如FGF(例如bFGF)、IGF(例如IGF-1)和骨形成因子9(BMP9)中选择或组合使用适当的公知的增殖因子，特别是能刺激软骨增殖的物质。
B.培养人软骨细胞的方法可使用适合培养软骨细胞的公知培养基培养人软骨细胞。此外，可以向培养基中加入胎牛血清(FBS)或人血清、皮质醇(Hydrocortisone)，除此之外，还可以适当加入人bFGF、人IGF-1等增殖因子(Cuevas等，Biochem.Biophy.Res.Commun.156，611-18，1988；Froger-Gaillard等，Endocrinol.124，2365-72)。作为这种培养基的例子，如向DME(H)培养基中添加了FBS(优选10％左右)、人bFGF(优选10ng/ml左右)、皮质醇(优选40ng/ml)、人IGF-1(优选5ng/ml)的培养基。还可以用来自患者自身的血清，如果采用后者则会更安全。
本发明培养方法的具体例，如下所示。
1)原代培养向装有培养基的培养瓶中接种软骨细胞，于培养软骨细胞的适合条件(例如37℃，10％CO2的条件下)下，在二氧化碳气体培养箱中培养。培养直至增殖的细胞单层融合(或称融汇，confluent)为止(通常10～14天)。
2)传代培养传代培养可以用和原代培养相同的培养基(通常，每7天传一代)。将原代培养得到的细胞传代培养时，耳廓软骨的细胞数在P0(原代培养)→P4过程中增加了1000倍左右。而且，希望得到大量软骨细胞时可以适当增加传代次数。
3)多层培养可以通过传代培养得到的人软骨细胞多层地接种1次或2次以上，优选接种3～4次，进行培养，得到凝胶状的软骨细胞块。在所得到的软骨细胞块中，用包括蛋白聚糖等在内的软骨基质包围人软骨细胞，软骨细胞彼此之间通过蛋白聚糖等基质结合，形成凝胶状的细胞块。
C.软骨治疗材料可以用由本发明得到的上述的传代培养或多层培养的人软骨细胞或细胞块的原样状态或将其包埋到生物材料中，作为软骨治疗材料供给移植。作为包埋人软骨细胞或包埋细胞块的载体，可列举胶原、聚乙二醇酸(PGA；polygycolic acid)、聚乳酸(polylactic acid)、藻酸盐(Alginate)、聚环氧乙烷、纤维蛋白结合剂、聚乳酸-聚乙二醇酸共聚物、蛋白聚糖(proteoglycan)、葡萄糖胺聚糖(glucosaminoglycan)，也可以混合使用上述物质。
此外，通过适当选择、组合包埋软骨细胞的载体可使该软骨治疗材料不仅诱导出软骨，还能诱导出内软骨性骨化。例如人的真皮是能够诱导这种内软骨性骨化的载体。此外，使用促进骨形成的生长因子也能促进骨化，如骨形成因子(BMP)。
下面，通过实施例对本发明进行更详细的说明。不过，下面的实施例是范例，本发明不局限于这些实施例。
实施例1 培养软骨细胞培养基构成向DME(H)培养基中添加10％FBS、10ng/ml人FGF(科研制药)、40ng/ml皮质醇(Sigma)和5ng/ml人IGF-1(GIBCO)。
采取软骨从人耳朵后部底部软骨摘取大约1平方厘米的一面的附着有软骨膜的软骨。
(a)软骨细胞组分将上述得到的软骨片用青霉素G(800u/ml)、卡那霉素(1mg/ml)和两性霉素B(2.5ug/ml)除菌，然后，用手术刀切成小块后，在含有03％II型胶原酶(Worthington Biochemical制造)的F-12培养基中，于4℃下静置一晚。第二天在37℃下振摇4小时后，离心，将该沉淀物作为开始培养的细胞组分。
(b)原代培养将上述细胞组分接种到使用上述培养基的、底面积为75cm2的培养瓶中。将该培养瓶在设定CO2浓度为10％的CO2培养箱中培养，每周更换2次培养液。结果经过10～14天的培养，软骨细胞单层融合。将得到的细胞用于之后的传代培养。
经确认，使用将患者自己的血液在3000rpm下离心10分钟得到的自体血清替代FBS，也能得到相同的结果。
(c)传代培养传代培养中，将1×106个原代培养的细胞接种到底面积为175cm2的培养瓶中，按照和原代培养相同的条件进行培养。将得到的经7天培养单层融合的细胞用于下面的传代培养。结果在第4代时，细胞数增加到原代的1000倍左右。
(d)多层培养将传代培养中得到的软骨细胞按照1×106个/cm2的密度接种3次，使之成多层，实施多层培养。培养2周后，形成片状的凝胶块(图1)。对该凝胶状的软骨细胞块进行苏木素-伊红(H.E)染色时，细胞表现出多层化，细胞之间是通过基质结合的(图2)。此外，对软骨组织的分子标记物的II型胶原进行免疫染色时，细胞外基质着色，表明该细胞外基质是软骨特异性的基质(图3)。
实施例2 软骨细胞的移植首先，从传代培养或多层培养的培养瓶中去除培养基后，用细胞刮刀收集细胞，将该收集的细胞通过注射等吸引加以收获。将收获到注射筒中的软骨细胞用注射针注入到裸鼠的软骨缺损部位。该移植经过6个月后，从移植部位采取出一部分，进行组织学上的研究，确认其成活。即，用苏木素-伊红(H.E)染色所采取的组织，表现出细胞多层化，细胞之间通过基质结合的(图4)。此外，对软骨组织的分子标记物的II型胶原进行免疫染色时，细胞外基质着色，表明该细胞外基质是软骨特异性基质(图5)。而且，表现出甲苯胺蓝染色的异染性(metachromasia)，暗示存在软骨细胞的标记物蛋白聚糖(图6)。综上所述，移植的软骨细胞形成了软骨组织。
产业上的可利用性根据本发明，能够不用担心细菌-病毒的感染，可以迅速并且大量地得到正常的人软骨细胞或其细胞块。
权利要求
1.人软骨细胞的制备方法，其特征在于，将从具有软骨膜的软骨得到的软骨细胞和软骨膜一起培养。
2.权利要求1记载的制备方法，其特征在于，该软骨是耳廓软骨。
3.权利要求1记载的制备方法，其特征在于将培养细胞单层地或多层地接种1次或2次以上，培养，得到软骨细胞块。
4.权利要求2记载的制备方法，其特征在于将培养细胞单层地或多层地接种1次或2次以上，培养，得到软骨细胞块。
5.软骨治疗材料，其是根据权利要求1～4记载的制备方法得到的单独的人软骨细胞或是该软骨细胞和包埋材料组成的。
6.权利要求5记载的软骨治疗材料，其中的包埋材料选自胶原、聚乙二醇酸、聚乳酸、藻酸、聚环氧乙烷、纤维蛋白结合剂、聚乳酸-聚乙二醇酸共聚物、蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖或人的真皮中的一种或两种以上。
全文摘要
本发明的目的是提供不用担心细菌、病毒感染，且能迅速并大量地得到正常的人软骨细胞或其细胞块的方法，该人软骨细胞的制备方法的特征在于，从具有软骨膜的软骨得到软骨细胞，例如耳廓软骨，将其与软骨膜共同培养。或，该人软骨细胞的制备方法的特征在于，将培养细胞以单层或多层地接种1次或2次以上，进行培养，得到软骨细胞块。
文档编号A61L27/00GK1774502SQ20048001008
公开日2006年5月17日 申请日期2004年4月8日 优先权日2003年4月15日
发明者矢永博子 申请人:矢永博子, 矢永克