专利名称：使用特异性和选择性的电信号和电磁信号调节基质金属蛋白酶基因表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过施加由特异性和选择性的电信号和电磁信号产生的场下调软骨细胞中基质金属蛋白酶(MMP)基因的表达，用于治疗受伤的或患病的关节软骨的方法，以及产生这种信号的装置。
背景技术：
被认为存在于多种生物组织和细胞中的生物电相互作用和活动是了解最少的生理学过程中的一种。然而，最近有许多研究针对与某些组织和细胞的生长和修复有关的这些相互作用和活动。特别地，已有许多研究针对电场和电磁场的刺激及其对骨和软骨的生长和修复的影响。研究人员相信，这种研究可能用于开发对多种医学难题的新型治疗。
骨关节炎，也称为推行性骨关节病，特征在于关节软骨退化以及软骨下骨增生和骨质重塑(modeling)。其常见的症状为僵硬、运动受限、和疼痛。骨关节炎为关节炎的最普通形式，并且其现患率(prevalencerate)随年龄的增长而显著增加。已经表明，自述患有骨关节炎的年长患者拜访医生的次数是未患病的同龄人的两倍。与其它同龄人相比，这种患者还经历更多天的活动受限和卧床。在一项研究中，大多数有症状的患者在8年的随访期间变得显著无行为能力(Massardo等人，AnnRheum.Dis.48893-897，1989)。
非甾体抗炎药(NSAID)仍然是骨关节炎的主要治疗形式。现在还不知NSAID的效力是否取决于其止痛或抗炎性质，还是延缓软骨退化进程。还有一个要关心的问题是NSAID可能对患者有害。例如，公知NSAID在胃、胃肠道、肝脏和肾脏中具有毒性作用。然而，阿斯匹林抑制动物中的蛋白多糖合成和正常的软骨修复过程。一项对人进行的研究暗示吲哚美辛可能促进臀部软骨的分解。所有的副作用更多地在老年人中出现，老年人恰好是最容易患上骨关节炎的人群。
在通常被称为骨质疏松症的疾病中，骨发生脱矿质化并变得异常稀薄。骨包括细胞和基质的有机成分以及无机或矿物成分。细胞和基质包括胶原纤维框架，以及在其中充满的赋予骨以硬度的磷酸钙(85％)和碳酸钙(10％)的矿物成分。虽然通常认为骨质疏松症影响老年人，但是某些类型的骨质疏松症可能影响所有年龄的人群，他们的骨不受机能应激(functional stress)影响。在这种情况下，患者可能在延长的不能动的过程中经历显著的硬质骨和松质骨丢失。已知老年患者由于在骨折后的固定过程中骨不被使用而经历骨丢失，其可能在已经骨质疏松的骨骼中最终导致继发性骨折。降低的骨密度可能导致脊椎坍陷；臀部、前臂、腕、踝骨折；以及使活动能力丧失的疼痛。需要对这种疾病进行选择性的非手术治疗。
由于在1979年得到the Food and Drug Administration(美国食品和药物管理局)的批准，脉冲电磁场(PEMF)和电容耦合(CC)已经被广泛用于治疗非愈合性骨折(nonhealing fracture)和骨愈合中的相关难题。进行这种治疗形式试验的最初原因是观察到对骨施加的物理学应激产生极小的电流以及机械应变，认为其机制的基础是将物理学应激转导为促进骨形成的信号。与在骨不连合治疗方面取得成功的直流电场刺激一起，发现使用PEMF和电容耦合(其中将电极置于治疗区域的皮肤上)的非侵害性技术也是有效的。脉冲电磁场在高导电性细胞外液中产生小的引诱电流(法拉第电流)，而电容耦合直接在组织中产生电流，由此PEMF和CC都模拟内源性电流。
内源性电流最初被认为是由于在骨中晶体表面上出现的现象，现已证明其主要是由于包含电解质的液体在包含具有固定负电荷的有机组分的骨通道中移动产生通常所说的“流动电势(streamingpotential)”。对软骨中电现象的研究表明当软骨被机械压缩时，引起液体和电解质在软骨基质中蛋白多糖和胶原中具有固定负电荷的表面移动，出现类似于在骨中所述那些机制的机械-电转导机制。这些流动电势显然在软骨中起到类似于在骨中的目的，并且与机械应变一起产生能够刺激基质成分的软骨细胞合成的信号转导。
在过去，直流电流、电容耦合和PEMF的主要用途是在骨不连合骨折的愈合中的整形外科(Brighton等人，J.Bone Joint Surg.，632-13，1981；Brighton和Pollack，J.Bone Joint Surg.，67577-585，1985；Bassett等人，Crit.Rev.Biomed.Eng.，17451-529，1989；Bassett等人，JAMA247623-628，1982)。临床应答已经报道了成人中的臀部无血管形成性坏死和儿童中的幼年变形性骨软骨炎(Legg-Perthes’s disease)(Bassett等人，Clin.Orthop.，246172-176，1989；Aaron等人，Clin.Orthop.，249209-218，1989；Harrison等人，J.Pediatr.Ortop.4579-584，1984)。还表明PEMF(Mooney，Spine，15708-712，1990)和电容耦合(Goodwin，Brighton等人，Spine 241349-1356，1999)可显著增加腰椎融合的成功率。还有加强外周神经再生和功能和血促进管生成的报导(Bassett，Bioessays，636-42，1987)。患有类固醇注射和其它常规方法难治疗的持续性旋转套腱炎的患者，与安慰剂治疗患者相比，表现出显著的益处(Binder等人，Lancet，695-698，1984)。最后，Brighton等人已经在大鼠中证明了适当的电容耦合电场预防和逆转脊柱腰段中脊椎骨质疏松症的能力(Brighton等人，J.Orthop.Res.，6676-684，1988；Brighton等人，J.Bone Joint Surg.，71228-236，1989)。
新近，这一领域中的研究集中在刺激组织和细胞的效果上。例如，已经推测直流电流不穿透细胞膜并且经由细胞外基质分化实现控制(Grodzinsky，Crit.Rev.Biomed.Eng，9133-199，1983)。与直流电流相反，已经报道说PEMF可以穿透细胞膜并且刺激它们或直接影响细胞内的细胞器。对PEMF对细胞外基质和体内软骨内骨化的影响的检验发现软骨分子合成和骨小梁(bone trabeculae)成熟增加(Aaron等人，J.Bone Miner.Res.，4227-233，1989)。新近，Lorich，Brighton等人报道(Clin.Ortliop.Related Res.，350246-256，1998)电容耦合电信号的信号转导是通过电压控制的钙通道，导致细胞溶质钙增加，随后活化的(细胞骨骼)钙调节蛋白增加。
已经有许多研究针对组织培养以了解应答的机制。在一项研究中，发现电场增加[3H]-胸苷到软骨细胞DNA中的结合，支持了电刺激触发的Na+和Ca2+流动引起DNA合成的想法(Rodan等人，Science，199690-692，1978)。研究发现了第二信使cAMP的变化和由于电扰动引起的细胞骨骼重排(Ryaby等人，Trans.BRAGS，61986；Jones等人，Trans.BRAGS，651，1986；Brighton和Townsend，J.Orthop.Res.，6552 558，1988)。其它的研究发现了对粘多糖(葡糖胺聚糖)、硫酸盐化作用、透明质酸、溶菌酶活性和多肽序列的影响(Norton等人，J.Orthop.Res.，6685-689，1988；Goodman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，853928-3932，1988)。
本发明的发明人在1996报告了在培养的MC3T3-E1骨细胞中周期性的双向0.17％机械应变生产TGF-β1mRNA的显著增加(Brighton等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，229449-453，1996)。随后在1997进行了几个有意义的研究。在一个研究中，报道了相同的周期性双向0.17％机械应变在类似的骨细胞中生产PDGF-A mRNA的显著增加(Brighton等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，43339-346，1997)。还报道了20mV/cm的60kHz的电容耦合电场在类似的骨细胞中生产TGF-β1的显著增加(Brighton等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，237225-229，1997)。然而，在文献中没有报道这种场对其它基因的影响。
在上述参考的标题为“Regulation of Genes Via Application ofSpecific and Selective Electrical and Electromagnetic Signals”的母专利申请中，公开了测定用于产生调节患病的或受损的组织的靶基因的场的特异性和选择性的电信号和电磁信号的方法。本发明以其中所述的通过施加由特异性和选择性的电信号和电磁信号产生的场调节靶基因表达，即基质金属蛋白酶基因表达，用于治疗软骨疾病(关节炎)、软骨损伤、软骨缺陷、和瘤转移的技术为基础。
发明内容
本发明涉及通过施加由特异性和选择性的电信号和/或电磁信号产生的场调节软骨细胞中基质金属蛋白酶(MMP)基因表达。通过对电场持续时间、振幅、频率、和占空度进行剂量-应答曲线试验，发现了用于下调关节软骨软骨细胞中基质金属蛋白酶mRNA的最佳信号。最佳信号产生振幅为20mV/cm、持续时间为30分钟、占空度为100％、频率为60kHz、和正弦波形的电容耦合电场。具体地，本发明涉及通过施加由这种信号产生的场下调软骨细胞中基质金属蛋白酶(MMP)基因表达。
在本发明的优选实施方案中，提供了使用电容耦合电场、电感耦合电场、电磁场、或组合的场(combined fields)特异性地和选择性地下调MMP-1、MMP-3、和MMP-13和其它MMP的基因表达(通过mRNA测量)的方法。用电场持续时间为约30分钟、电场振幅为约10-20mV/cm、频率为约60kHz、占空度为约100％、和正弦波形的约20mV/cm的电容耦合或电感耦合电场引起MMP-1、MMP-3、和MMP-13的mRNA下调，用于治疗骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨损伤、软骨缺陷等。根据本发明的方法，“特异性和选择性的”信号为下调MMP基因表达的具有预定的振幅、持续时间、占空度、频率、和波形特征的信号(特异性)。这使得人们可选择不同的信号用于下调MMP基因表达，以实现给定的生物或治疗应答(选择性)。本发明另外涉及装置，该装置使用本文所述的方法产生特异性和选择性的信号，以用于产生下调MMP基因表达的场。
在相关的方面中，本发明涉及治疗骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨损伤、和软骨缺陷的方法和装置。本发明的方法还包括通过有系统地改变已知减少、或推测减少金属蛋白酶的细胞产生的起始信号的持续时间测定用于MMP基因表达的“特异性和选择性的”信号的方法学。在选择最佳的持续时间之后，改变信号的振幅用于通过MMP-1、MMP-3、MMP-13基因表达测定的最佳持续时间。再有系统地改变占空度、频率、和波形，同时保持其它信号特征不变。重复这些过程直到测定产生金属蛋白酶表达有最大降低的最佳信号。
在以下发明详述中说明本发明的这些和其它方面。
图1为在白细胞介素(IL-1β)的存在下使关节软骨软骨细胞暴露于20mV/cm电容耦合电场不同的持续时间时，MMP-1mRNA表达的图示。如图所示，在信号施加30分钟时出现最小的MMP-1表达。在IL-1β的存在下，MMP-1mRNA的最大表达发生在没有使用电流时。
图2为在IL-1β的存在下使关节软骨软骨细胞暴露于20mV/cm电容耦合电场不同的持续时间时，MMP-3mRNA表达的图示。如图所示，在信号施加30分钟和6小时时出现最小的MMP-3表达。在IL-1β的存在下，MMP-1mRNA的最大表达发生在没有使用电流时。
图3为在IL-1β的存在下使关节软骨软骨细胞暴露于20mV/cm电容耦合电场不同的持续时间时，MMP-13mRNA表达的图示。如图所示，在信号施加30分钟和24小时时出现最小的MMP-13表达。在IL-1β的存在下，MMP-13mRNA的最大表达发生在没有使用电流时。
图4为在IL-1β的存在下使关节软骨软骨细胞暴露于不同的占空度的20mV/cm电容耦合电场时，MMP-1mRNA表达的图示。如图所示，在100％的占空度信号时出现最小的MMP mRNA表达。在IL-1β的存在下，MMP-1mRNA的最大表达发生在没有使用电流时。
图5为在IL-1β的存在下使关节软骨软骨细胞暴露于不同的占空度的20mV/cm电容耦合电场时MMP-3mRNA表达的图示。如图所示，在100％和8.3％的占空度时出现最小的MMP-3mRNA表达。在IL-1β的存在下，MMP-3mRNA的最大表达发生在没有使用电流时。
图6为在IL-1β的存在下使关节软骨软骨细胞暴露于不同的占空度的20mV/cm的电容耦合电场时，MMP-13mRNA表达的图示。如图所示，在100％和50％的占空度时出现最小的MMP-13mRNA表达。在IL-1β的存在下，MMP-13mRNA的最大表达发生在没有使用电流时。
图7为说明用于治疗膝的骨关节炎的本发明优选实施方案的两个不同的装置的图。
具体实施例方式
以下参考图1-7详细描写本发明。
本领域技术人员可以理解，本文中给出的对于那些附图的说明只是示例性的，其不以任何方式限制本发明的范围。与本发明的范围有关的所有问题可通过参考权利要求解决。
本发明基于可以通过施加由特异性和选择性的电信号和/或电磁信号产生的特异性和选择性的场调节某些基因表达的发现。换句话说，本发明的发明人发现了产生用于调节骨、软骨和其它组织细胞中每种基因的场的特异性的电信号和/或电磁信号，并且这些特异性的信号能够特异性和选择性地调节这种细胞中的基因。具体地，根据本发明，可通过施加由特异性和选择性的电信号和/或电磁信号产生的场调节支配组织或细胞的生长、维护、修复、和退化或衰退的基因表达以产生有益的临床作用。这种发现可用于开发针对某些医疗状况的方法，包括骨折和骨缺陷、骨关节炎、骨质疏松症、癌症和其它疾病，以及用于开发了采用这种方法的装置。
具体地，本发明证明了MMP的表达可以被显著地下调以减少关节软骨中MMP的产生，如延缓或逆转软骨疾病过程所期望的那样。本发明清楚地表明本文中所述的最佳电场可以显著地下调MMP，因此，减少MMP合成，即使在IL-1β的存在下。本领域技术人员还应该理解，具有如本文所述的电容耦合但等效于具有电感耦合和其它已知的场施加技术的适当的电场可用于治疗关节炎(骨关节炎和类风湿性关节炎)、软骨损伤、软骨缺陷、和组织癌症。
如本文中使用的，短语“信号”是指多种信号，包括由装置输出的机械信号、超声波信号、电磁信号和电信号。应该理解，本文中使用的术语“场”是指靶组织内部的电场，无论是组合的场或脉冲电磁场，或是由直流电流、电容耦合或电感耦合产生的场。
短语“远程的”是指从远处起作用、作用于或控制。“远程”调节是指从远处控制基因的表达。“远程地”是指从远处提供。例如，从远程信号源提供特异性和选择性的信号可以是指从距离组织或细胞一段距离的信号源、或从身体外侧或外面的信号源提供信号。
短语“特异性和选择性的”信号是指该信号产生具有预定的振幅、持续时间、占空度、频率、和波形特征的上调或下调靶基因或功能上靶向互补基因的电场(特异性)。这使得人们可选择不同的“特异性和选择性的”信号用于上调或下调多种基因的表达以实现给定的生物或治疗应答(选择性)。
术语“调节”是指控制基因表达。应该理解调节包括上调和下调。上调是指增加基因的表达，而下调是指抑制或阻止基因的表达。
“功能上互补的”是指两个或多个基因在给定细胞或组织中的表达为互补的或协同的。
“组织”是指形成患者的构成材料中的一种的细胞及其细胞外的物质的总计。如本文中使用的，术语“组织”包括肌肉和器官组织、肿瘤组织以及骨或软骨组织。另外，本文中使用的术语“组织”还指单独的细胞。
“患者”是指动物，优选哺乳动物，更优选人。
本发明提供针对某些组织、细胞或疾病的治疗方法和装置。具体地，可以通过施加由对靶组织或细胞中的要调节基因为特异性和选择性的电信号产生的场调节与受损或患病的组织或细胞的修复过程有关的基因表达。可通过施加对每个基因或每组互补基因组为特异性和选择性的信号上调或下调基因表达以产生有利的临床效果。例如，特定的特异性和选择性的信号可产生上调某种所需的基因表达的电场，而相同的或另一个特定的特异性和选择性的信号可能产生下调某种不希望的基因表达的电场。某一个基因可由一个特定的特异性和选择性的信号产生的场上调并由另一个特异性和选择性的信号产生的场下调。本领域技术人员应该理解，可通过调节那些支配组织生长、维护、修复、和退化或衰退的基因针对某些患病的或受损的组织进行治疗。
本发明的方法和装置基于识别用于产生对与某些目标患病或受损组织有关的基因表达为特异性和选择性的场的那些信号。例如，不同形式的电流(如电容耦合、电感耦合、组合的场)可以通过对每种所选基因改变施加的场的频率、振幅、波形或占空度而特异性和选择性地调节患者体内靶组织或细胞中的基因表达。暴露于电流下的持续时间还可以影响电流特异性和选择性地调节患者体内靶组织或细胞中的基因表达的能力。特异性和选择性的信号可产生有系统地作用于每种基因的电场，直到发现提供对基因表达具有所需效果的频率、振幅、波形、占空度、和持续时间的适当组合。
应该理解，因为可以通过多个因素影响用于某种基因表达的电场的特异性和选择性，治疗可以针对多种患病的或受损的组织或疾病状态。具体地，具有适当的频率、振幅、波形、和/或占空度的电场可对某些基因的表达为特异性和选择性的，并从而用于靶向治疗。时间因素(如暴露于电场的持续时间)也可以影响电场对特定基因表达的特异性和选择性。可通过施加电场施加特定的持续时间使基因表达的调节变得更有效(或使基因表达的调节变得可能)。因此，本领域技术人员应该理解，本发明提供改变施加电场的频率、振幅、波形、占空度和/或持续时间直到发现对某种基因表达为特异性和选择性的电场，以提供针对多种患病的或受损的组织或疾病的治疗。
因此，本发明可以提供靶向治疗，因为有可能通过施加由具有适当的频率、振幅、波形和/或占空度的特异性和选择性的信号以适当的持续时间调节与特定的患病的或受损的组织有关的某些基因的表达。因此可影响产生电场的信号的特异性和选择性以调节某些基因的表达，用于靶向某些患病的或受损的组织或治疗用疾病状态。具体的，本发明提供对骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨损伤、和软骨缺陷以及转移性病灶的靶向治疗。
本发明还提供装置，其包括对基质金属蛋白酶基因表达的下调有特异性和选择性的至少一种信号的来源。本发明的装置可用于产生通过至少一个电极和通过延长线圈施加于软骨细胞的信号，所述电极适合于在电容耦合的情况中施加由特异性和选择性的信号产生的场，所述延长的线圈适合于在使用电感耦合时施加由特异性和选择性的信号产生的场。可通过施用于皮肤、结合到衣服、支撑、包扎或模型的适当的表面电极(成对的或条状的)使借助电容耦合、电感耦合(电磁场)、或组合的场递送的本文中所述的最佳的场作用于任何关节。
本发明的装置能够将由特异性和选择性的信号产生的场直接作用于患病的或受损的组织和/或作用于患者的皮肤。本发明的装置还可提供远程施加特异性和选择性的场(如从距离患病的或受损的组织一段距离施加场)，虽然应该理解电容耦合装置必须接触主体的皮肤。在电容耦合的情况中，本发明的装置可包括用于将电极附着于患者身体上受损或患病的组织附近的机构。例如，如图7中所示，可将自附着性传导电极在患有骨关节炎的膝关节的两侧附着于患者的皮肤。还如图7中所示，本发明的装置10可包括用于将装置10附着于患者身体的自附着性电极12。例如，本发明的装置10可包括连接于动力单元14的电极12，在动力单元14的反面具有VELCRO贴片16，使得动力单元14可以附着于配合在患者的小腿、大腿或腰周围的VELCRO带(未表示)。在电感耦合的情况中，本发明的装置10可包括代替电极12的连接于动力单元14的线圈(未表示)。
本发明的装置10可以通过多种方式使用。装置10可为便携式的，或者可临时或永久地附着于患者身体。优选本发明的装置10为非侵入性的。例如，可通过施加适合于与患者皮肤接触的用于施加由预定的特异性和选择性的信号产生的场的电极将本发明的装置10施用于患者的皮肤。这种信号还可通过随时间变化的电流施加，从而产生穿透组织的特异性和选择性的电磁场。还能够将本发明的装置10植入在患者中，包括植入到患者的皮下。
以下实施例说明本发明的方法可提供软骨生长和修复。可以通过对下调软骨细胞中基质金属蛋白酶表达为特异性和选择性的信号刺激软骨的生长和修复，以阻止或抑制骨关节炎患者中的关节软骨破坏或衰退。具体地，本发明的方法可下调破坏软骨的基质金属蛋白酶基因。本发明的方法可以靶向多种软骨细胞，包括关节的软骨细胞和包括关节软骨、透明软骨、和生长板软骨。
本领域技术人员应该理解，可通过本发明的方法针对性地治疗多种其它的软骨疾病和损伤。
本领域技术人员应该进一步理解，可以以多种形式提供本发明的装置，包括具有施用于一对或多对电极的编程的、多个、可转换的、特异性和选择性信号的电容耦合动力单元，或连接于具有可转换的、多个、特异性和选择性信号的动力单元的电磁线圈，和用于产生特异性和选择性的信号的具有动力供应的超声波刺激器。一般说来，装置的偏好基于患者的接受性和患者的配合性。目前本领域中已有的最小的和最便携的装置为电容耦合设备，然而，具有高度敏感皮肤的患者可能更原意使用电感耦合设备。另一方面，超声波设备需要最多的患者合作，但是某些患者可能期望使用这种。
实施例在以下实施例中说明本发明，其只是用于说明的目的而并非意在限制本发明的范围。
材料和方法从胎牛关节软骨或成年牛关节软骨制备软骨细胞培养物。将软骨细胞(5×105细胞/cm2)装板在专门改变的Cooper盘上。使细胞生长到七天，刚好在试验条件开始之前更换培养基。这些研究中的所有试验用细胞培养物经过电容耦合的60kHz正弦波信号电场，输出为44.81V峰峰值。这在盘中的培养介质中产生电流密度为300μA/cm2的20mV/cm的计算场强。对照细胞培养盘与刺激盘相同，只是电极没有连接于功能发生器。
根据厂商的说明书使用TRIzol分离总RNA并使用SuperScript II逆转录酶进行逆转录(RT)。在RT-PCR技术中使用的低聚核苷酸引物选自公开的cDNA序列或使用Primer Express软件程序设计。使用ABI Prism 7000 Sequence Detection System进行RT-PCR产物的定量实时分析。
如下系统地寻找用于所需的下调基质金属蛋白酶(MMP)基因调节(特别是MMP-1、MMP-3、和MMP-13)的最佳信号。使用已知减少(或甚至只是推测能减少)MMP的细胞产生的电信号作为用于测定产生用于MMP的基因表达(mRNA)的场的特异性信号的起始信号。首先通过改变信号的持续时间同时保持所有其它信号特征(振幅、占空度、频率、和波形)不变进行剂量-应答曲线(图1-3)。这测定了起始信号对MMP的基因表达的最佳持续时间。然后进行第二剂量-应答曲线，这次将占空度从100％(恒定)改变到8.3％或更小，同时保持振幅和其它信号特征不变(图4-6)。重复剂量-应答第三次(改变振幅)、第四次(改变频率)、和第五次(改变波形)，每次都保持其它信号特征不变。通过这种方法，测定对不同MMP的基因表达造成最大减少的最佳信号。
可通过本领域中已知的任何方法测定蛋白表达，如实时定量RT-PCR、Northern分析、免疫测定法、直接生化分析等。
关节软骨细胞的金属蛋白酶产生将关节软骨细胞暴露于60kHz的20mV/cm的电容耦合电场下。结果在图1-6中说明。
图1为在白细胞介素(IL-1β)的存在下使关节软骨软骨细胞暴露于20mV/cm电容耦合电场下不同的持续时间时MMP-1mRNA的图示。如图所示，在信号施加30分钟时发生最小的MMP-1表达。在IL-1的存在下，MMP-1mRNA的最大表达发生在没有使用电流时。
图2为在IL-1β存在下使关节软骨软骨细胞暴露于20mV/cm电容耦合电场下不同的持续时间时MMP-3mRNA表达的图示。如图所示，在信号施加30分钟和6小时时出现最小的MMP-3产生。在IL-1β的存在下，MMP-3mRNA的最大表达发生在没有使用电流时。
图3为在IL-1β存在下使关节软骨软骨细胞暴露于20mV/cm电容耦合电场下不同的持续时间时MMP-13mRNA表达的图示。如图所示，在信号施加30分钟和24小时时出现最小的MMP-13表达。在IL-1β存在下，MMP-13mRNA的最大表达发生在没有使用电流时。
图4为在IL-1β的存在下使关节软骨软骨细胞暴露于不同占空度的20mV/cm电容耦合电场下时MMP mRNA表达的图示。如图所示，在100％占空度信号时出现MMP-1mRNA的最小表达。在IL-1β的存在下，MMP-1mRNA的最大表达发生在没有使用电流时。
图5为在IL-1β的存在下，使关节软骨软骨细胞暴露于不同占空度的20mV/cm电容耦合电场时MMP-3mRNA表达的图示。如图所示，在100％和8.3％占空度时出现最小的MMP-3mRNA表达。在IL-1β的存在下，MMP-3mRNA的最大表达发生在没有使用电流时。
图6为当在IL-1β的存在下使关节软骨软骨细胞暴露于不同占空度的20mV/cm的电容耦合电场时MMP-13mRNA表达的图示。如图所示，在100％和50％的占空度时出现最小的MMP-13mRNA表达。在IL-1的存在下，MMP-13mRNA的最大表达发生在没有使用电流时。
如上所述，图7说明用于治疗患有膝骨关节炎的本发明的装置10。如图所示，两个环形的、软的、传导性的、自附着性的电极12位于膝的接缝(joint line)面两侧的皮肤上。电极12连接于动力单元14，在动力单元14的反面具有VELCRO贴片16，使得动力单元14可以附着于配合在患者的小腿、大腿或腰周围的VELCRO带(未表示)。可在患者每晚上床之前或任何其它方便的时间将电极12置于皮肤上。当然，也可使用其它适合类型的电极12或线圈(对于电感耦合而言)。
优选动力单元14是小型的(如6-8盎司)并且由标准的9伏电池提供动力，其为置于皮肤上的电极12放射5V峰峰值、6-10mA、20mV/cm、60kHz的正弦波信号。当采用适合的占空度(100％)每天提供大约30分钟的这种信号时，其表明显著地下调基因编码的基质金属蛋白酶。这种治疗应阻止关节软骨的进一步衰退或使衰退最小化，以及治愈已经损伤或退化的关节软骨。这种治疗还应该阻止肿瘤转移或使肿瘤转移最小化。
上述实施例说明MMP-1、MMP-3、和MMP-13基因的表达可被显著地下调，以减少破坏关节软骨的酶的产生，从而治疗关节炎(骨关节炎和类风湿性关节炎)、软骨损伤、和软骨缺陷。蛋白多糖以及II型胶原为关节软骨的主要有机组分，其在金属蛋白酶引起的关节炎的初期被损伤、降解和/或破坏。本发明清楚地表明，在实施例中描述的最佳电场可非常显著地下调MMP-1、MMP-3和MMP-13mRNA，从而减少软骨基质破坏，即使在IL-1β存在的条件下。本领域技术人员应该理解，本文中描述具有电容耦合的适合的电场与电感耦合和产生等价的、或接近等价的电场特征的所有电磁系统同样有效。本领域技术人员还应该理解，可通过更多数据点的更多实验发现更独特的信号特征(如100±3％的占空度，30±3分钟)，但是每种信号特征的这种相对小的变化认为是在参考了本文教导的本领域技术人员的水平范围内。
本领域技术人员还应该理解，可在本发明的范围内对本发明进行多种其它的改进。例如，可通过结合在衣服、支撑、包扎、或模型中的两个或多个适当的表面电极(成对的或条状的)施加并通过电容耦合递送本文中最佳的场使其作用于任何关节。另外，可以通过结合到衣服、支撑、包扎、或模型中的线圈或螺线管施加并通过电感耦合递送本文中所述的最佳的场，使其作用于任何关节。因此，本发明的范围不限于上述的优选实施方案，而只由权利要求限制。
权利要求
1.在软骨组织中特异性地和选择性地下调基质金属蛋白酶的基因表达的方法，其包括步骤a.产生至少一种特异性和选择性的信号，该信号基本上经过优化以下调通过mRNA测量的基质金属蛋白酶的基因表达；和b.以预定间隔使软骨组织暴露于由特异性和选择性的信号产生的场下预定的持续时间，以下调通过mRNA测量的基质金属蛋白酶的表达。
2.权利要求1的方法，其中产生信号的步骤包括选择性地改变特异性和选择性的信号的振幅、持续时间、占空度、频率、和波形直到软骨组织中通过mRNA测量的基质金属蛋白酶的基因表达被基本上减少的步骤。
3.权利要求1的方法，其中暴露步骤包括每天一次以预定间隔使关节软骨软骨细胞暴露于由特异性和选择性的信号产生的场下预定的持续时间的步骤。
4.权利要求1的方法，其中所述产生信号的步骤包括在远程信号源处产生特异性和选择性的信号的步骤，并且所述暴露步骤包括将由特异性和选择性的信号产生的场施加于软骨组织的步骤。
5.权利要求4的方法，其中暴露步骤包括将特异性和选择性的信号施加于位于软骨组织附近的(1)电极、(2)至少一个线圈、和(3)至少一个螺线管中的一种的步骤。
6.权利要求5的方法，其中暴露步骤包括通过电容耦合和电感耦合中的一种将由特异性和选择性的信号产生的场施加于软骨组织的步骤。
7.权利要求6的方法，其中特异性和选择性的信号引起电极产生电容耦合电场、电磁场、和组合的场中的一种。
8.进行以下至少一种的方法(1)治疗骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨损伤、软骨缺陷中的至少一种，(2)辅助包括细胞移植、组织工程学支架、和生长因子中的至少一种的其它治疗，(3)治疗软骨缺陷，和(4)阻止肿瘤转移，所述方法包括步骤a.产生至少一种特异性和选择性的信号，该信号下调通过mRNA测量的基质金属蛋白酶的基因表达；和b.以预定间隔使软骨组织暴露于由特异性和选择性的信号产生的场下预定的持续时间，以选择性地下调通过mRNA测量的基质金属蛋白酶的基因表达。
9.权利要求8的方法，其中暴露步骤包括对软骨组织施加电容耦合场的步骤。
10.权利要求8的方法，其中暴露步骤包括对软骨组织施加电磁场和组合的场中的一种的步骤。
11.权利要求8的方法，其中产生信号的步骤包括产生振幅为约20mV/cm、正弦波形、占空度约100％、和频率约60kHz的电场的步骤。
12.权利要求11的方法，其中暴露步骤包括每24小时对软骨组织施加持续时间约30分钟的电场的步骤。
13.权利要求8的方法，其中产生信号的步骤包括选择性地改变特异性和选择性的信号的振幅、持续时间、占空度、频率、和波形直到在软骨组织中由产生的场引起的通过mRNA测量的基质金属蛋白酶基因表达的下调被基本上减少的步骤。
14.权利要求13的方法，其中暴露步骤包括通过电容耦合和电感耦合中的一种将由特异性和选择性的信号产生的场施加于软骨组织的步骤。
15.权利要求14的方法，其中特异性和选择性的信号引起电极产生(1)电容耦合电场、(2)电磁场、和(3)组合的场中的一种。
16.用于治疗骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨损伤、软骨缺陷和肿瘤组织转移中的至少一种的装置，其包括提供至少一种信号的信号源，所述信号产生对下调通过mRNA测量的金属蛋白酶基因表达有特异性和选择性的场；和(a)电极、(b)至少一个线圈、和(3)螺线管中的一种，其连接于信号源使得接受所述至少一种特异性和选择性的信号，该信号用于以预定间隔对软骨组织施加预定持续时间的场，以选择性地在所述软骨或肿瘤组织中下调通过mRNA测量的金属蛋白酶的基因表达。
17.权利要求16的装置，其进一步包括驱动所述信号源的便携式动力单元。
18.权利要求16的装置，其另外包括将电极附着于患者软骨或肿瘤组织附近身体的机构。
19.权利要求16的装置，其另外包括将信号源附着于患者身体的机构。
20.权利要求16的装置，其中由所述至少一种特异性和选择性的信号产生的场通过电容耦合和电感耦合中的一种施加于所述软骨或肿瘤组织。
21.权利要求20的装置，其中特异性和选择性的信号具有正弦波形并产生60kHz、占空度约100％、振幅约20mV/cm的电场。
22.进行以下至少一种的方法(1)治疗骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨损伤、软骨缺陷中的至少一种，(2)辅助包括细胞移植、组织工程学支架、和生长因子中的至少一种的其它治疗，(3)治疗软骨缺陷，和(4)阻止肿瘤转移，该方法包括步骤使软骨组织暴露于由权利要求21的装置产生的特异性和选择性的场下，以下调软骨组织中(通过mRNA测量的)金属蛋白酶的基因表达。
23.测定产生下调基质金属蛋白酶的电场的选择性信号的方法，其包括步骤选择已知减少或推测影响基质金属蛋白酶的细胞产生的起始信号，选择性地改变施加所述起始信号的持续时间直到发现提供基质金属蛋白酶的减少最佳化的最佳持续时间，相对于最佳持续时间改变起始信号的振幅直到发现基质金属蛋白酶的减少最佳化，以及改变信号的占空度直到发现基质金属蛋白酶的减少最佳化。
24.权利要求23的方法，其进一步包括选择性地改变所述信号的频率和波形、同时保持其它信号特征不变，直到发现通过mRNA测量的基质金属蛋白酶基因表达的减少最大化。
全文摘要
本发明提供用于在患病的或受损的关节软骨的治疗中用于通过施加由特异性和选择性的电信号和电磁信号产生的场调节软骨细胞中基质金属蛋白酶基因表达的方法和装置。基因表达是指上调和下调过程，通过上述过程人基因组(DNA)的具体部分(基因)转录为mRNA，随后翻译为蛋白质。提供了用于针对性治疗受损的或患病的软骨组织的方法和装置，其包括产生特异性和选择性的电信号和电磁信号，所述电信号和电磁信号产生被优化以减少基质金属蛋白酶基因表达的场，和将软骨组织暴露于由特异性和选择性的信号产生的场下以调节这种软骨组织中的基质金属蛋白酶基因表达。得到的方法和装置可用于针对性治疗骨关节炎、类风湿性关节炎、软骨损伤、和软骨缺陷以及肿瘤转移。
文档编号A61P11/00GK1822807SQ200480020188
公开日2006年8月23日 申请日期2004年6月14日 优先权日2003年6月13日
发明者卡尔·T·布莱顿 申请人:宾夕法尼亚大学理事会