ZrO₂在富集和纯化磷酸化肽过程中的应用的制作方法

专利名称：ZrO₂在富集和纯化磷酸化肽过程中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及磷酸化蛋白质组中磷酸肽的富集和纯化，具体地说是 Zr02在富集和纯化磷酸化肽过程中的应用，是一种基于Zr02纳米材料 的高度特异性和选择性富集和纯化磷酸肽的方法。
背景技术：
翻译后蛋白质的修饰是蛋白质组中研究的热点课题。蛋白质磷酸 化是最常见，最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，蛋白质磷酸化和 去磷酸化几乎调节者生命活动的整个过程，包括细胞的增殖，发育和 分化，神经活动，肌肉收縮，新陈代谢，肿瘤发生等，蛋白质磷酸化 还是目前所知道的信号的主要传递方式。
蛋白质磷酸化分析的传统方法如放射性同位素标记，Edman降解 以及薄层层析等方法。这些方法操作繁琐，需要高超的实验技巧和较 多的蛋白质，而且存在潜在的放射性危险。质谱技术已经发展成为鉴 定磷酸化蛋白的重要工具之一。
质谱在鉴定磷酸化蛋白现在仍然是一个巨大的挑战，其具体体现 在第一，磷酸化蛋白在细胞内中属于低丰度蛋白；第二，磷酸化肽 段的负电性使其在质谱检测中难以质子化；第三，酶解产物中存在的 大量的非磷酸化肽段的质谱信号通常会淹没磷酸化肽的离子信号。因 此，复杂蛋白酶解产物中磷酸化肽段的分离，纯化和富集是质谱成功 鉴定磷酸化最为重要的一步。
磷酸化蛋白组的研究中，通常运用两种不同的富集策略，富集磷 酸化蛋白和富集磷酸化肽段。磷酸化蛋白的富集主要是通过磷酸化蛋 白质的抗体和化学方法进行修饰改变磷酸基团的化学性质，然后特异 性的分离纯化。磷酸肽段的富集使用最多的是固定化金属亲和色谱 (Immobilized metal affinity chromatography, IMACXFe", Ga3+))。 近 来Ti02和Zr02微柱，Al(OH)3， Fe304/Ti02壳孔纳米颗粒等也被用来 特异纯化和富集磷酸肽。另外一种常用的方法是化学标记，通过化学 反应特异地将磷酸基团修饰成亲和位点而达到纯化和富集磷酸肽的目 的。但是利用Zr02纳米材料与磷酸化肽之间的特异性的相互作用来富 集和纯化磷酸化肽未见报道，与常规商业化的固定金属离子亲和色谱 (IMAC), Ti02 Zr02微柱，Al(OH)3等富集方法相比，Zr02纳米材料纯 化和富集磷酸肽显示出更高的特异性，选择性，结合容量和灵敏度。非专利文献l(Kweon, H. K.等，"Selective Zirconium Dioxide-Based Enrichment of Phosphorylated Peptides for Mass Spectrometric Analysis",
《Analytical Chemistry〉〉 , P1743-1749 (2006年)；Larsen, M. R.等， "Highly Selective Enrichment of Phosphorylated Peptides from Peptide Mixtures Using Titanium Dioxide Microcolumns",《Molecular & Cellular Proteomics》，P873-876 (2005年)；Chen, C. T.等，"Fe304/Ti02 Core/shell Nanoparticles as Affinity Probes for the Analysis of Phosphopeptides Using TiO2 Surface-assisted Laser Desorption/ionization Mass Spectrometry",《Analytical Chemistry》，P5912-5919 (2005年)；Zhang, Y.等，"Zeolite Nanoparticles with Immobilized Metal Ions: Isolation and MALDI-TOF MS/MS Identification of Phosphop印tides，，，《Chemical Communication》，P2882-2883 (2004年))中记载利用Zr02微颗粒填充 的Microtip头和已经发展的纳米材料及其它金属氧化物用于磷酸肽的 分离和纯化，非专利文献2 (Liu, G.等,"Electrochemical Sensor for Organophophate Pesticides and Nerve Agents Using Zirconia Nanoparticles as Selective Sorbents"， 《Analytical Chemistry》 ， P5894-5901 (2005年))中记载了利用Zr02纳米材料磷酸基团之间的强 相互作用，将Zr02纳米材料用于电化学传感器实现对有机磷农药和神 经毒剂的检测，非专利文献3( Jung, K. T.等，"The effect of synthesis and pretreatment and pretreatment conditions on the bulk structure and surface properties of zirconia", 《Journal of Molecular Catalysis A: Chemical》, P27-42 (2000年)；Li， C.等，"UV Raman spectroscopic study on the phase transformation of Zr02, Y2O3-ZrO2 and S0427Zr02，，, 《Journal of Raman Spectroscopy)) , P301-308 (2002年))中记载了 Zr02纳米材料的制备方 法。而Zr02纳米材料用于磷酸肽的富集和纯化，文献中未作任何记载， 也未作任何启示。

发明内容
为解决上述课题，申请人仔细研究了 Zr02纳米材料对磷酸肽的相 互作用，发现Zr02纳米材料能够强烈的与磷酸肽特异性的相互作用。 基于这种独特的极强的相互作用，磷酸肽能够特异的保留在Zr02纳米 材料高的比表面上。Zr02纳米材料的高的特异性比表面积使单磷酸肽 和多磷酸肽能够完全的与非磷酸肽分离，从而获得特异性的富集。所 捕获的磷酸化肽通过NH3.H20洗脱，冻干，加入基质，然后利用 MALDI-TOF质谱检测。本发明的目的在于提供Zr02在富集和纯化磷 酸化肽过程中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
Z r O 2在富集和纯化磷酸化肽过程中的应用。
所述被富集和纯化的原料样品为蛋白酶解物；Zr02应为Zr02纳 米材料；具体操作如下-
1) 将Zr02与蛋白酶解物重量比例为10-200: 1相混合，采用有 机酸调pH:2-3，平衡5分钟-12小时；过滤或离心分离，弃去上层清 液，收集沉淀；
2) 采用体积浓度为30-50%的ACN对沉淀进行清洗，弃去上层清
液；
或用摩尔浓度0.5-2M NaCl溶液对沉淀进行清洗，过滤或离心分 离，再pH=2-3的有机酸对沉淀进行清洗，弃去上层清液；
3) 将清洗后的沉淀用重量浓度10-25%NH3.H2O洗漆，沉淀与 NH3.H20的重量体积比为3mg: 10-100pLl，洗涤5-30分钟，过滤或离 心分离，收集上层清液；干燥得磷酸化肽产品。
所述有机酸可为甲酸、醋酸、三氟乙酸；步骤1)的平衡液中可 含有体积浓度为30-50%的ACN;步骤2)的清洗液中可含有体积浓度 为0.01-10%的有机酸。所述Zr02使用之前，可采用常规方法通过洗 涤、活化、酸化处理减少杂质，增加比表面积。 本发明具有如下优点
1. Zr02纳米材料因其高的特异性比表面积，与磷酸肽强烈的相互 作用,因而可以更灵敏，更高选择性的纯化和富集磷酸肽。
2. Zr02纳米材料在磷酸化蛋白质组的应用中,对磷酸化肽段显示出 高的特异性，高的选择性和高的结合容量和灵敏度。
3. Zr02纳米材料应用于蛋白质翻译后修饰中磷酸化蛋白质组。通 过Zr02特异性结合复杂蛋白酶解样品中的磷酸化肽段，结合 MALDI-TOF MS和nano-LC MS/MS大规模鉴定磷酸化蛋白和确定磷 酸化位点。


图1为Zr02纳米材料扫描电镜图。
图2为Zr02纳米材料对标准磷酸化蛋白(3-casein (5 pmol)酶解产物 中磷酸化肽纯化和富集的MALDI-TOF质谱。
图3为Zr02纳米材料对标准磷酸化蛋白a-casein (5 pmol)酶解产物 中磷酸化肽纯化和富集的MALDI-TOF质谱。
图4为Zr02纳米材料对标准磷酸化蛋白Ovalbumin (5 pmol)酶解 产物中磷酸化肽纯化和富集的MALDI-TOF质谱。
图5为Z r O 2纳米材料分别对混合的复杂的蛋白酶解样品中磷酸化 肽段的纯化和富集。(a) (3-casein: BSA=1:1 ,(b) (3-casein: BSA=1:10 ,(c) P-casein: BSA=1:100,为Zr02纳米材料富集之前的MALDI质谱，(d) 卩-casein: BSA=1:1 ,(e)卩隱casein: BSA=1:10 ,(f)卩-casein: BSA二1:100,为Zr02 纳米材料纯化和富集磷酸化肽段后的纯MALDI-TOF质谱。
图6为Zr02纳米材料对分别为(a) 5 pmol ,(b) 500 fmol ,(c) 50 fmol, (d)5 fmol p-casein酶解产物中磷酸化肽段的纯化和富集的MALDI-TOF质谱。
具体实施例方式
本发明利用Zr02纳米材料与磷酸化肽的相互作用实现磷酸化肽的 特异性富集和纯化。在实施方式上，可以分成两部分第一部分是Zr02 纳米材料的制备方法，第二部分是Zr02纳米材料用于磷酸肽的分离和 富集。以下介绍两者的具体实施方式
。
Zr02纳米材料的制备通过共沉淀方法获得。该法是利用ZrOCl2等 可溶性锆盐与沉淀剂氨水在溶液中进行共沉淀反应，然后在高温下煅 烧得到Zr02纳米材料。这种制备Zr02纳米材料的方法简单，但是获 得的纳米材料有团聚的问题。这可以从图1扫描电镜图中可以看出。 获得的Zr02纳米颗粒尺寸在20~30nm之间。
Zr02纳米材料的合成 一
在室温下，维持pH40.0缓慢搅拌下向ZrOCl2.8H20缓慢加入25% NH3.H20，获得Zr(OH)4的沉淀物用二次蒸馏水清洗，直到氯离子完全被除 去。清洗过的Zr(OH)4在110 °C下干燥12小时，然后在550 。C下煅烧4 小时，得到Zr02纳米颗粒，扫描电镜可知，所制备的Zr02纳米颗粒尺 寸在20 30 nm之间。
Zr02纳米材料用于富集磷酸肽的预处理
用于特异性和选择性富集磷酸肽的Zr02纳米材料在使用之前，洗 涤和活化是必要的。通过洗涤和活化，可以除去Zr02纳米材料制备过 程中引入的杂质，同时酸化处理增加Zr02纳米材料对磷酸肽强相互作 用的高的比表面积。
(1) 将所合成的纳米材料称取30mg，加入lmL高级乙醇超声清 洗1分钟，30000转下高速离心3分钟，除去上层清液。
(2) 加入lmL二次蒸馏水超声清洗1分钟，30000转下高速离心3 分钟，除去上层清液。
(3) 加入lmL0.2。/。HAC超声清洗1分钟，30000转下高速离心3 分钟，除去上层清液。
(4) 加入lmL 0.5% HAC超声清洗1分钟，30000转下高速离心3 分钟，除去上层清液。
(5) 将清洗过的Zr02 (30mg)纳米材料分散在1 mL 二次蒸馏水 中，室温下放置备用。
实施例1
一.样品溶液的制备1 mg的(x-酪蛋白和P-酪蛋白的分别溶解在1 mL, 50mM的碳酸氢胺溶液中(pH8.2)，按照与胰蛋白酶的质量比l:40(w/w) 的比例加入胰蛋白酶进行酶解反应，反应时间为16 h,酶解温度控制在37 °C。获得的蛋白酶解溶液置于-3(TC冰箱中保存备用。
1 mg的蛋白牛血清白蛋白和卵清蛋白分别溶解在1 mL的还原性溶液中((pH8.2，8M尿素，50mM的碳酸氢胺溶液)，室温下放置4 h,然后向装 有失活蛋白的离心管中加入DTT溶液，37。C水浴放置2h。将溶液从水浴 中取出，向每管溶液中再加入IAA溶液，室温下暗处静置30 min,经过上 述处理，蛋白完全变性，二硫键被打开，巯基被封闭。再加入胰蛋白酶以1 : 40 (w/w)的比例加入酶溶液，37。C水浴酶解16h。
二. Zr02纳米材料特异性富集和纯化磷酸化肽
(1) 标准磷酸化蛋白的酶解产物卩-casein， a-casein和Ovalbumin分 别配在50%ACN, 10%HAC (pH二2-3)中作为上样液。
(2) 取2.5pL的Zr02纳米材料，加入2.5 j^L的酶解上样液，室温 下平衡30分钟，然后在30000转下高速离心，弃去上层清液。
(3) 加入10 pL的50% ACN, 10% HAC，振摇清洗Zr02纳米粒子 5分钟，然后在30000转下高速离心，弃去上层清液。
(4) 加入10 pL的50%ACN,振摇清洗Zr02纳米粒子5分钟，然 后在30000转下高速离心，弃去上层清液。
(5) 加入5 的NH3.H20超声清洗Zr02纳米粒子5分钟，然后 在30000转下高速离心，收集上层清液。
(6) 将收集的上层洗脱后的NH3.H20放入冷冻干燥机浓縮，冻干， 加入2 pL含1%H3P04的DHB (25 mg/mL)作为基体，取0.5pL点靶， 用MALDI-TOF MS分析。
分析结果由图2，图3和图4可见，来自于磷酸化蛋白a-酪蛋白，P-酪蛋白和卵清蛋白酶解产物中的磷酸化肽被Zr02纳米材料所捕获，而非磷 酸化肽被洗脱，说明Zr02纳米材料能特异的富集和纯化磷酸化肽。
由图5可见，来自于磷酸化蛋白P-酪蛋白与非磷酸化蛋白牛血清白蛋 白的酶解产物分别按照1:1, 1:10, 1:100的摩尔比的混合物中的磷酸化肽被 Zr02纳米材料所捕获，而显示出高的特异性和选择性。
由图6可见，5 fmol磷酸化蛋白(3-酪蛋白酶解产物中的磷酸化肽能被 Zr02纳米材料富集，MALDI-TOFMS能够很好检测所富集的磷酸肽， 说明Z r O 2纳米材料对磷酸肽的纯化和富集显示出高的灵敏度。
实施例2
与实施例l不同之处在于，
二. Zr02纳米材料特异性富集和纯化磷酸化肽
(1)标准磷酸化蛋白的酶解产物P-casein, a-casein和Ovalbumin分 别配在10%HAC (pH4-3)中作为上样液。
(5)加入10 jiL的25%的NH3.H20超声清洗Zr02纳米粒子30 分钟，然后在30000转下高速离心，收集上层清液。
分析结果来自于磷酸化蛋白a-酪蛋白，(3-酪蛋白和卵清蛋白酶解产 物中的磷酸化肽被Zr02纳米材料所捕获，而非磷酸化肽被洗脱，说明Zr02纳米材料能特异的富集和纯化磷酸化肽。来自于磷酸化蛋白P-酪蛋白与非
磷酸化蛋白牛血清白蛋白的酶解产物分别按照1:1, 1:10， 1:100的摩尔比的 混合物中的磷酸化肽被Zr02纳米材料所捕获，而显示出高的特异性和选 择性。5 fmol磷酸化蛋白P-酪蛋白酶解产物中的磷酸化肽能被Zr02纳米 材料富集，MALDI-TOFMS能够很好检测所富集的磷酸肽，说明Zr02 纳米材料对磷酸肽的纯化和富集显示出高的灵敏度。 实施例3
与实施例1不同之处在于，
二. ZK)2纳米材料特异性富集和纯化磷酸化肽
(2) 取lpL的Zr02纳米材料，加入2.5 pL的酶解上样液，室温下 平衡12小时，然后在30000转下高速离心，弃去上层清液。
(3) 加入10 |uL的30% ACN, 10% HAC，振摇清洗Zr02纳米粒子 5分钟，然后在30000转下高速离心，弃去上层清液。
(4) 加入10 |iL的30%ACN,振摇清洗Zr02纳米粒子30分钟，然 后在30000转下高速离心，弃去上层清液。
分析结果来自于磷酸化蛋白a-酪蛋白，(3-酪蛋白和卵清蛋白酶解产 物中的磷酸化肽被Zr02纳米材料所捕获，而非磷酸化肽被洗脱，说明Zr02 纳米材料能特异的富集和纯化磷酸化肽。来自于磷酸化蛋白(3-酪蛋白与非 磷酸化蛋白牛血清白蛋白的酶解产物分别按照1:1, 1:10, 1:100的摩尔比的 混合物中的磷酸化肽被Zr02纳米材料所捕获，而显示出高的特异性和选 择性。5 fmol磷酸化蛋白p-酪蛋白酶解产物中的磷酸化肽能被Zr02纳米 材料富集，MALDI-TOFMS能够很好检测所富集的磷酸肽，说明Zr02 纳米材料对磷酸肽的纯化和富集显示出高的灵敏度。
实施例4
与实施例1不同之处在于，
二. Zr02纳米材料特异性富集和纯化磷酸化肽 (3)加入0.5M NaCl溶液对沉淀进行清洗，振摇清洗Zr02纳米粒 子5分钟，然后在30000转下高速离心，弃去上层清液。再用？11=2-3 的0.1%的甲酸对沉淀进行清洗，振摇清洗Zr02纳米粒子5分钟，然 后在30000转下高速离心，弃去上层清液。
分析结果来自于磷酸化蛋白a-酪蛋白，(3-酪蛋白和卵清蛋白酶解产 物中的磷酸化肽被Zr02纳米材料所捕获，而非磷酸化肽被洗脱，说明Zr02 纳米材料能特异的富集和纯化磷酸化肽。来自于磷酸化蛋白(3-酪蛋白与非 磷酸化蛋白牛血清白蛋白的酶解产物分别按照1:1, 1:10, 1:100的摩尔比的 混合物中的磷酸化肽被Zr02纳米材料所捕获，而显示出高的特异性和选 择性。5 fmol磷酸化蛋白(3-酪蛋白酶解产物中的磷酸化肽能被Zr02纳米 材料富集，MALDI-TOFMS能够很好检测所富集的磷酸肽，说明Zr02 纳米材料对磷酸肽的纯化和富集显示出高的灵敏度。
权利要求
1.ZrO2在富集和纯化磷酸化肽过程中的应用。
2. 按照权利要求1所述Zr02在富集和纯化磷酸化肽过程中的应 用，其特征在于所述被富集和纯化的原料样品为蛋白酶解物。
3. 按照权利要求1所述Zr02在富集和纯化磷酸化肽过程中的应 用，其特征在于所述Zr02为Zr02纳米材料。
4. 按照权利要求1所述Zr02在富集和纯化磷酸化肽过程中的应 用，其特征在于具体操作如下，1) 将ZK)2与蛋白酶解物重量比例为10-200: 1相混合，采用有 机酸调pI^2-3，平衡5分钟-12小时；过滤或离心分离，弃去上层清 液，收集沉淀；2) 采用体积浓度为30-50%的ACN对沉淀进行清洗，弃去上层清液；或用摩尔浓度0.5-2M NaCl溶液对沉淀进行清洗，过滤或离心分 离，再pH二2-3的有机酸对沉淀进行清洗，弃去上层清液；3) 将清洗后的沉淀用重量浓度10-25%NH3.H2O洗涤，沉淀与 NH3.H20的重量体积比为3mg: lO-lOOpLl,洗涤5-30分钟，过滤或离 心分离，收集上层清液；干燥得磷酸化肽产品。
5. 按照权利要求4所述Zr02在富集和纯化磷酸化肽过程中的应 用，其特征在于所述有机酸为甲酸、醋酸、三氟乙酸。
6. 按照权利要求4所述Zr02在富集和纯化磷酸化肽过程中的应 用，其特征在于所述步骤l)的平衡液中可含有体积浓度为30-50% 的ACN。
7. 按照权利要求4所述Zr02在富集和纯化磷酸化肽过程中的应 用，其特征在于所述步骤2)的清洗液中可含有体积浓度为0.01-10% 的有机酸。
8. 按照权利要求1所述ZK)2在富集和纯化磷酸化肽过程中的应 用，其特征在于所述ZK)2使用之前，可采用常规方法通过洗涤、活 化、酸化处理减少杂质，增加比表面积。
全文摘要
本发明涉及磷酸化蛋白质组中磷酸肽的富集和纯化，具体地说是ZrO₂在富集和纯化磷酸化肽过程中的应用。ZrO₂纳米材料对磷酸化肽段显示出高的特异性，高的选择性和高的结合容量和灵敏度；ZrO₂纳米材料对磷酸肽的特异性的亲和能力，使其能够用于蛋白质翻译后修饰中磷酸化蛋白质组中的应用。通过ZrO₂特异性结合复杂蛋白酶解样品中的磷酸化肽段，结合MALDI-TOF MS和nano-LC MS/MS大规模鉴定磷酸化蛋白和确定磷酸化位点。
文档编号C07K1/00GK101284864SQ20071001096
公开日2008年10月15日 申请日期2007年4月13日 优先权日2007年4月13日
发明者叶明亮, 周厚江, 徐松云, 邹汉法 申请人:中国科学院大连化学物理研究所