专利名称：用再水化血细胞进行化合物的递送的制作方法
技术领域：
本发明涉及给有所述需要的受试者递送活性剂的方法和组合物，和更具体而言涉及携带活性剂和对将活性剂递送至目标部位有用的固定干燥血细胞(fixed-dried blood cell)。
背景技术：
数十年来血小板被公认为携带治疗剂至血管损伤部位的有潜力的工具。然而，血小板作为治疗剂递送载体的实际应用受到限制，因为血小板必须是新近分离的，被治疗剂修饰的，然后以短时间间隔输注的。冷藏血小板和正常液体贮存的血小板递送治疗剂的应用受到贮存损害的限制和在冷冻血小板的情况下，需要消除冷藏剂的限制。因此冷藏血小板以及通常保存的血细胞的实际应用受到限制。
发明概述本发明的第一个方面是携带异源化合物、活性剂或目标化合物的固定干燥血小板、红细胞(RBCs)或其组合，以及包含它们、由它们组成或基本上由它们组成的组合物。优选这种血小板、RBCs或其组合是哺乳动物血细胞如人血小板和RBCs。该化合物或活性剂可以以任何方式与血小板和/或RBCs结合，如偶联或通过包含在血小板和/或RBCs内。血小板和/或RBCs可以是醛固定的，且在一个实施方案中，血小板的特征在于它们粘附于形成血栓的表面；粘附于形成血栓的表面后经历形状改变；使得粘附于形成血栓的表面后形成止血栓；和释放它们的颗粒状内容物。待递送的活性剂或化合物可以是抗病毒剂如核苷类似物抗病毒剂(例如病毒唑)、凝血蛋白如因子VII、核酸(例如DNA、RNA)、可检测的化合物如可检测的蛋白或肽，等等。
本发明的第二个方面是一种药物组合物，它包含例如0.01或0.1至99.9或99.99重量％的药物可接受载体(例如含水或非含水载体；固体、液体或凝胶载体等)和例如0.01或0.1至99.9或99.99重量％的在此描述的携带活性剂的固定干燥血细胞，由它们组成或基本上由它们组成，任选所述固定干燥血细胞在药物可接受载体中再水化。
本发明的又一个方面是制备给有所述需要的受试者递送目标化合物或活性剂的固定干燥血细胞的方法，包括提供携带活性剂的固定血细胞(一般是哺乳动物细胞和优选人细胞，尤其是RBCs、血小板及其组合)；使活性剂与固定血细胞结合；和干燥固定的血细胞(例如通过冷冻干燥或冻干)以产生携带活性化合物的固定干燥血细胞。该方法可以进一步包括如下步骤，即固定干燥血细胞在药物可接受载体中再水化以提供包含携带活性剂的再水化固定干燥血细胞的药物可接受组合物。结合步骤可以通过任何合适方法进行，如通过活性剂与细胞偶联或将活性剂引入细胞。细胞可以是醛固定的血小板，且在一个实施方案中，细胞是血小板，其特征在于在重构后，它们粘附于形成血栓的表面；粘附于形成血栓的表面后经历形状改变；使得粘附于形成血栓的表面后形成止血栓；和释放它们的颗粒状内容物。
本发明的又一方面是将目标化合物递送至形成血栓的表面(例如在受试者中，或递送至用于诊断或化合物试验目的的体外组织)的方法，包括提供携带在此描述的目标化合物的固定干燥血细胞；固定干燥血细胞在可接受载体(例如药物或生理可接受载体)中再水化以提供包含携带活性剂的再水化固定干燥血细胞的组合物；然后施用该药物组合物(例如施用于受试者，施用于体外组织)，从而有效量的目标化合物被递送至形成血栓的表面。该受试者一般是哺乳动物受试者，如人受试者，且目标化合物可以是诊断或治疗剂。
本发明的又一方面是将目标化合物递送至受试者中RES的巨噬细胞的方法。该受试者一般是哺乳动物受试者，如人受试者，且目标化合物可以是诊断或治疗剂。
本发明的又一方面是将活性剂递送至目标部位(例如递送至受试者，或递送至体外组织)的方法，包括提供携带在此描述的活性剂的固定干燥血细胞；固定干燥血细胞在药物可接受载体中再水化以提供包含携带活性剂的再水化固定干燥血细胞的药物可接受组合物；然后将该药物组合物施用于目标部位(例如施用于受试者，或施用于体外组织)，从而有效量的活性剂被递送至所述目标部位。有效量的活性剂可以小于内源血小板等效物的15％。该受试者一般是哺乳动物受试者，如人受试者，且活性剂可以是诊断或治疗剂。细胞可以是醛固定细胞，且受试者可以例如罹患血管损伤。
下面更详细解释本发明的上述和其它目的和方面。
附图简述
图1显示了核苷共聚物的质子NMR谱。
图2显示了聚合物修饰的RL血小板的荧光显微镜检查结果。
图3显示了对照和聚合物修饰的RL血小板的瑞斯托菌素聚集。
图4示意性阐明了血小板/AAV～Lac Z报道分子缀合物的制备。
图5显示了与RL血小板结合的rFVIIa-FITC的流式细胞术分析。
图6表明rFVIIa与RL血小板结合是浓度依赖性的。
图7表明rFVIIa在RL血小板表面是有活性的。
优选实施方案详述下面更详细解释本发明。本说明书意图不是本发明可以实施的所有不同方式或可以添加至本发明的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施方案来阐明的特征可以并入其它实施方案，和关于具体实施方案阐明的特征可以从那个实施方案中删除。此外，根据不背离本发明的公开内容，在此建议的各种实施方案的很多变型和增添对本领域技术人员来说是显而易见的。因此，下列说明书意图是阐明本发明的一些具体实施方案，而不是详尽地说明其所有排列、组合和变型。
待用本发明的方法和组合物治疗的受试者包括人受试者和为兽医和药物开发目的的动物受试者。动物受试者通常是哺乳动物受试者，包括而不限于猪、绵羊、母牛、马、山羊、猫、狗、小鼠和大鼠受试者。
在此使用的“形成血栓的表面”是指任何天然或人工的形成血栓的表面，包括但不限于创伤组织，血管斑块如动脉粥样斑块，由于局部或全身炎症引起的活化内皮，由于抗癌、抗肿瘤或抗增殖剂的施用，作为毒性副作用致使在受试者中形成血栓的脉管、表面或组织，受试者中外来或植入物品的表面，包括金属、聚合物等，如在支架、导管、生物医学植入物如起搏器和导线、整形外科植入物如人造关节等中找到的。化合物可以为任何目的施用于形成血栓的表面，例如用于治疗目的或诊断目的(例如通过任何合适的方法成像或检测形成血栓的表面，如放射成像术，活组织检查，获取植入物并确定在植入物表面是否有递送的化合物)。
实施本发明使用的“血小板”通常是动物来源，并优选哺乳动物来源(例如猪、绵羊、母牛、马、山羊、猫、狗、小鼠、大鼠、人等等)。血小板可以来源于与该血小板导入物种相同的物种，或来源于与该血小板导入物种不同的物种。在一个实施方案中，从受试者收获血小板，用于制备在此描述的活性剂，和在如此制备后在较晚的时间将其施用返回收获该血小板的相同受试者。
在此使用的“红细胞”包括任何哺乳动物来源(例如猪、绵羊、母牛、马、山羊、猫、狗、小鼠、大鼠、人等等)的红细胞。红细胞可以来源于与该红细胞导入物种相同的物种，或来源于与该红细胞导入物种不同的物种。在一个实施方案中，从受试者收获红细胞，用于制备在此描述的活性剂，和在如此制备后在较晚的时间将其施用返回收获该红细胞的相同受试者。
“固定血细胞”在此指血细胞，其可以是血小板、红细胞或其混合物，它已经用至少一种化合物进行化学处理，该化合物整合入细胞的至少一部分以在结构上稳定和/或延长细胞的保存期限。
“固定干燥血细胞”在此指血细胞，其可以是血小板、红细胞或其混合物，它已经被固定，并且另外已通过任何适用技术从中除去了水，以进一步在结构上稳定和/或延长其保存期限，所述技术如干燥、脱水、冻干或冷冻干燥等等。
“再水化固定干燥血细胞”是指固定干燥血细胞，其可以是血小板、红细胞或其混合物，它已经接触或结合水溶液，从而水被吸收到细胞内空间。
在此使用的“凝血蛋白”包括任何合适的凝血蛋白，包括但不限于因子VII、因子IX、因子X以及产生因子VII或FVIIa的凝血蛋白，如因子XII或因子XIIa、或因子X或因子Xa、C蛋白、S蛋白和凝血酶原。这种蛋白可以是天然或合成的并且包括含天然存在蛋白的小修饰的蛋白(即类似物)。在天然存在的情况下，蛋白可以是任何物种来源的，优选在此描述的哺乳动物或人，且在一个实施方案中是与它所施用的物种相同的物种来源。
在此使用的“抗凝血蛋白”包括任何合适的抗凝血蛋白，包括但不限于活化的C蛋白、S蛋白、肝素和类肝素等等。这种蛋白可以是天然或合成的并且包括含天然存在蛋白的小修饰的蛋白(即类似物)。在天然存在的情况下，蛋白可以是任何物种来源的，优选在此描述的哺乳动物或人，且在一个实施方案中是与它所施用的物种相同的物种来源。
在此使用的“AAV”是指“腺伴随病毒”。
在此使用的术语“治疗”是指对罹患疾病的患者给予益处的任何类型的治疗，包括患者状况(例如一种或多种症状)的改善、延迟疾病进展等等。
在此使用的术语“药物可接受”意思是根据疾病的严重性和治疗的必要性，化合物或组合物适于施用于受试者以实现在此描述的治疗，而无过多有害副作用。
申请人特别意欲将在此引用的所有美国专利参考文献的全部内容在此并入作为参考。
1.血小板血小板可以按照已知技术固定，如美国专利No.4,287,087；5,651,966；5,902,608；5,891,393和5,993,084描述的。通常，这种方法包括提供血小板(例如人、哺乳动物)；使所述人血小板与固定剂(例如醛)接触足以固定所述血小板的一段时间；从所述血小板除去所述固定剂；然后干燥所述血小板以制备固定干燥血小板。在优选实施方案中，接触步骤进行足以杀死所述微生物的一段时间。在优选实施方案中，接触步骤进行不足以引起所述血小板丧失重构后的如下能力的一段时间(i)粘附于形成血栓的表面；(ii)不粘附于不形成血栓的表面；(iii)粘附于形成血栓的表面后经历形状改变(铺展)；(iv)粘附于形成血栓的表面后彼此粘附以形成止血栓；和(v)释放它们的颗粒状内容物。
更具体而言，用于本发明的固定干燥血小板可以用选自甲醛、低聚甲醛和戊二醛的化合物固定，目前优选低聚甲醛。通常，洗涤的血小板可以通过一般在室温下将其在最高达1.8％醛的溶液中温育最多60分钟来固定。可供选择的技术是通过在高锰酸盐溶液(例如高锰酸钠、高锰酸钾)中温育血小板而固定血小板。通常，洗涤的血小板可以用这个技术制备，这通过将它们在0.001至1g/dL的KMnO4或NaMnO4溶液中温育5至20分钟，更优选通过将它们在0.005至0.5g/dL的KMnO4或NaMnO4溶液中温育5至15分钟来实现。
用于制备药物制剂的血小板制剂应该基本上无外来杂质，尤其是溶解的血小板，它将给施用该制剂的患者呈递游离的形成血栓的试剂。因此，在干燥前必须小心充分固定血小板(优选不破坏其活力，如上面阐述的特征显示的)，因为否则干燥步骤期间将发生不适当的溶解。例如，适合用于制备人药物制剂的血小板制剂在重构时优选显示出在1毫升溶液中109个血小板，少于每毫升10×106个微粒(溶解的血小板的碎片剩余物)，和优选显示出重悬和沉淀后，上清液中的乳酸脱氢酶小于每升150国际单位(IU)(其中，2200IU代表1毫升中109个细胞的总溶解)。
血小板固定后的干燥可以通过任何合适的方法进行，但是优选通过冻干进行。在干燥前应当小心稳定血小板制剂，因为否则可能发生不能接受的血小板溶解水平。稳定可以进行如下，将血小板悬浮在含有合适水代换分子(或“稳定剂”)的溶液中，所述分子如清蛋白或海藻糖，然后干燥该溶液。在一个实施方案中，使用0.1至20重量％的清蛋白，更优选使用1至10重量％的清蛋白，和最优选使用5至10重量％的清蛋白。对于受试者的施用，制剂中的清蛋白应该是与受试者相同的物种的(例如人清蛋白)。可供选择地，可以用不同物种的清蛋白干燥制剂，重构时清蛋白与血小板分开，并将相同物种的清蛋白加回到重构的制剂以用于施用于受试者，但是应当小心除去所有非物种特异性的清蛋白，因为它在所治疗的受试者中可能是抗原性的。一旦被干燥，血小板就可以与待递送的化合物偶联或结合以制备本发明的“活性剂”，如下面进一步描述的。
2.冻干的RBCs。
本发明的交联和冻干的RBCs可以用具有反应部分的同聚体(homomeric)或杂聚体(heteromeric)的双功能交联剂来制备醛、酮、酰肼、N-羟磺基琥珀酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、顺丁烯二酰亚胺、亚氨酸酯、活性卤素、吡啶基-二硫化物、异氰酸酯、硝基苯甲酰氧基琥珀酰亚胺(nitrobenzoyloxysuccinimides)、硝基苯、亚氨酸酯、光活化叠氮苯基和叠氮聚芳烃，以及零间隔基(zero-spacer)碳二亚胺催化剂。多(聚)功能试剂也被认为是两种或更多交联剂的组合，与RBCs连续反应或与RBCs一起反应。
RBCs是用标准静脉切开放血术、单采血液成分术或驱血法，根据批准的IACCOC协议从哺乳动物血液获得的。通过差速离心使RBCs不含血浆血小板、白细胞和血浆蛋白，然后用化学交联剂处理。RBCs与交联剂的反应通常在20℃至37℃的温度，以预定的RBCs浓度进行限定的一段时间。如下面更详细讨论的，必须小心充分固定血小板，否则在冻干制品再水化时就测量到不适当溶解。交联步骤可以在抗氧化剂和自由基清除剂存在下进行，且交联反应可以通过添加含有伯胺的化合物来猝灭。交联后，用差速离心、层析和/或透析从过量交联剂和反应产物中移出RBCs。
交联后RBCs的冷冻可以在很宽的冷却速度范围内，在环境或高气压压力下进行。如果RBCs(具有零或降低浓度的交联剂)冰冻至冰的高压相状态(例如冰II/III)，那么优选样品被等温增压，然后恒压冷却至低于-120℃，这是冰II/III处于亚稳定的点。RBCs可以在“稳定剂”小分子(例如甘油)、蛋白(例如清蛋白)和聚合物(例如PEG)存在下冰冻，它们在冰晶体基质中代替水。优选的“稳定剂”是终浓度为1％(w.v)的PEG 8,000。“稳定剂”的类型和水平必须是再水化时可输注的。冻干从0℃以下的温度进行，如果RBCs在冰I的环境压力下冰冻，则优选40℃，和对于从冰II/III相状态的分子蒸馏，优选接近或低于-120℃。
RBC膜与交联剂的化学修饰给细胞赋予了被网状内皮系统识别和血小板的接触激活作用形成血栓的“外来”性质。表面膜由此被空间上覆盖细胞膜的共价附加聚合物闭塞。可以用来实施本发明的聚合物，尤其是水溶性聚合物通常是天然存在的聚合物，如多糖，或合成的聚合物，如聚环氧烷，如聚乙二醇(PEG)、聚(亚烷基)二醇、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯，如聚甲基丙烯酸羟乙基酯、聚乙烯醇和聚氨基甲酸酯。聚合物可以是线性的、分支的或树枝状的并且可以是取代或非取代的。如上文指出的，聚合物可以是亲水的、亲脂性的或亲水和亲脂性的。聚合物通过膜通过反应性化学官能团共价附着，所述官能团包括但不限于醛、酮、酰肼、N-羟磺基琥珀酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、顺丁烯二酰亚胺、亚氨酸酯、活性卤素、吡啶基-二硫化物、异氰酸酯、硝基苯甲酰氧基琥珀酰亚胺、硝基苯、亚氨酸酯、光活化叠氮苯基和叠氮聚芳烃，以及零间隔基碳二亚胺催化剂。优选的聚合物是带有通过席夫碱形成与表面赖氨酸共价附着的末端醛的PEG 5,000。我们发现大尺寸红细胞制剂的大多数洗涤和固定步骤可以有利地在封闭系统中进行，这通过利用称作IBM2991 Cell Washer的器具实现，它最初是为血库设计的，以促进紧靠在输血前，洗涤冷冻红细胞单位以除去冷冻保护剂，象DMSO或甘油。对我们的目的来说，在制备冷冻干燥的红细胞中使用这个装置的优点是它提供洗涤和固定的多个步骤的无菌环境，否则需要在开放容器中操作红细胞，并且在每步之后，Cell Washer诱导比用手重悬方法更小的剪切应力来重悬叠集的红细胞。举例来说，我们将150-200mL体积白细胞耗尽(leukodepleted)的红细胞的悬浮液，以3-4×109个/mL的细胞计数引入Cell Washer加工袋，并如操作说明书所述的附着管状固定用具(harness)。然后我们引入200-250mL体积含有0.1％BSA的磷酸盐洗涤缓冲液，无菌通过管状固定用具并实施洗涤循环#1。在编程输入2991的搅拌和旋转期结束时，上清液洗涤流体被自动挤出到废液中，并通过固定用具引入新鲜缓冲液进行共三次洗涤。在第三次洗涤的旋转步骤后，在旋转之前，在室温下引入含溶于Hank氏缓冲盐溶液[HBSS]的0.05％戊二醛的固定液进行20分钟的定时温育，然后用磷酸盐缓冲液进行另外三次洗涤步骤。此时，从2991加工袋取出固定洗涤的红细胞悬浮液，并在用于散装和冷冻干燥步骤的小瓶和瓶子中操作。
3.待递送的化合物。
可以与血小板偶联来制备本发明活性剂的化合物实例包括但不限于核酸如RNA、DNA、蛋白或肽(酶、抗体等等)、病毒、细菌、小有机化合物(例如单体)、合成和半合成的聚合物、纳米颗粒(nanoparticle)、螯合金属和离子等等。这种化合物可以具有任何合适的功能或活性，这取决于治疗或方法的具体目的，所述功能或活性包括但不限于抗微生物、抗细菌或抗病毒活性；凝血或抗凝血活性；报道分子或可检测活性等等。可以与血小板偶联来制备本发明活性剂的化合物的另外实例包括但不限于血管活性剂、抗氧化剂、抗凝剂、抗癌剂、抗动脉粥样硬化药、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂和抗增殖剂化合物。应当理解所有这种化合物可以包含在依次与血小板结合或偶联的小泡、胶束或其它颗粒中。
抗病毒化合物。在本发明的一个实施方案中，由血小板携带的化合物是抗病毒化合物。可以使用任何合适的抗病毒化合物，包括但不限于唾液酸类似物、金刚烷胺、金刚乙胺、叠氮胸苷、阿糖腺苷、碘苷、三氟尿苷、磷甲酸等等。在一个实施方案中，抗病毒化合物是嘌呤核苷类似物，其实例包括但不限于无环鸟苷、双脱氧腺苷、病毒唑、更昔洛韦和阿糖腺苷和反义核苷、RNA和DNA。
在本发明的一个实施方案中，携带抗病毒化合物的血小板以足以治疗病毒感染的量施用于罹患病毒感染的患者。在一个实施方案中，患者感染了出血热病毒，如线状病毒科(Filoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、布尼病毒科(Bunyaviridae)或黄病毒科(Flaviviridae)的病毒。
凝血和抗凝血蛋白。待递送的化合物可以是药物凝血蛋白，如因子VII、因子IX、因子X、因子XII、C蛋白、S蛋白、凝血酶原，抗凝血蛋白如活化C蛋白、S蛋白、肝素和类肝素，和爬行动物或昆虫来源的前凝血蛋白或抗凝血蛋白，及其他。
这种化合物是已知的。例如，可以用于实施本发明的因子VII或因子VIIa(这个术语包括修饰的因子VII或因子VIIa或保留因子VII的凝血活性的因子VII类似物)在尤其是美国专利No.6,461,610；6,132,730；6,329,176；6,183,743；6,186,789；5,997,864；5,861,374；5,824,639；5,817,788；5,788,965；5,700,914；5,344,918和5,190,919中描述。在一个实施方案中，优选重组人因子VIIa。
在本发明的一个实施方案中，携带凝血蛋白的血小板以有效促进伤口处凝血和/或伤口愈合的量施用于患有伤口的受试者。
核酸。待由本发明的血小板携带的核酸可以编码可检测的蛋白或肽，如Lac-Z、β-葡糖醛酸糖苷酶、辣根过氧化物酶、荧光蛋白如绿色荧光蛋白等等。
在本发明的一个实施方案中，携带编码可检测的蛋白的核酸的血小板以在血管中的动脉粥样硬化组织或斑块中有效表达可检测的蛋白的量施用于受试者，由此产生改善的动脉粥样硬化动物模型。可以将推定的抗动脉粥样硬化化合物和/或抗动脉粥样硬化饮食施用于这种动物(优选是通过饮食和/或育种而对动脉粥样硬化易感的动物)，然后与没有施用推定的抗动脉粥样硬化化合物和/或抗动脉粥样硬化饮食的对照动物相比，并通过可检测的蛋白表达显现的斑块比较实验动物和对照动物中致动脉粥样硬化斑块形成的程度。
在本发明的其它实施方案中，核酸可以编码治疗性蛋白或肽。实例包括但不限于编码抗动脉粥样硬化蛋白或肽的核酸，如编码ras效应蛋白RGL2的ras结合结构域(RBD)(例如用于抑制增殖)的DNA、编码内皮氧化氮合成酶变异体(例如用于抑制血小板功能)的DNA、编码NF-κB超阻遏物(例如用于抑制炎性过程)的DNA。
4.化合物与血小板结合。
待递送的化合物可以通过任何适用技术与血小板结合，所述技术包括但不限于(1)待递送的化合物直接与血小板表面膜化学偶联；(2)待递送的化合物与聚合物缀合，接着与血小板内膜偶联；(3)待递送的化合物掺入单层或多层磷脂小泡，接着内在化至血小板；(4)待递 送 的 化 合 物 被 吸 收 或 内 在 化 至 纳 米 颗 粒 ， 例 如buckminsterfullerene，接着内在化至血小板；(5)待递送的化合物与被内在化以运输至血小板中的α颗粒的蛋白偶联；(6)待递送的化合物与被血小板吞噬的蛋白(或其它大分子)或颗粒偶联；(7)待递送的化合物被疏水分配至膜中；(8)待递送的化合物通过电穿孔、补体治疗、裂解蛋白暴露等形成的孔被物理截留在血小板细胞内空间中；(9)化合物通过非共价物理或化学吸附而吸附在细胞外表面，接着内在化至血小板。
制备化合物-血小板缀合物的交联化学。血小板与蛋白、抗病毒化合物等等偶联的化合物-血小板缀合物可以用同双功能或异双功能交联剂来制备，所述交联剂可以含有但不限于下列反应部分醛、酮、酰肼、N-羟磺基琥珀酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、顺丁烯二酰亚胺、亚氨酸酯、活性卤素、吡啶基-二硫化物、异氰酸酯、硝基苯甲酰氧基琥珀酰亚胺、硝基苯、亚氨酸酯、光活化叠氮苯基和叠氮聚芳烃，以及零间隔基碳二亚胺催化剂。也考虑具有这些部分中的一个或多个的多(聚)功能试剂，同样也考虑两种或更多交联剂的组合，它们是连续反应或一起反应的。交联步骤可以在抗氧化剂和自由基清除剂存在下进行，且通过添加含有伯胺的化合物可以猝灭交联反应。交联后，可以用包括但不限于差速离心、层析和/或透析的方法除去过量试剂。
病毒包衣壳化。在待递送核酸的情况下，核酸可以包衣壳入或装入病毒衣壳或颗粒内，接着病毒衣壳或颗粒可以与血小板缀合或偶联。核酸可以被包衣壳入其中的一个合适病毒是腺伴随病毒(AAV)。AAV病毒是已知的，且待递送的目标核酸可以按照已知技术被包衣壳入或包裹在其中。参见例如美国专利No.6,548,286；6,491,907；6,489,162；6,458,587；6,410,300；6,268,213；6,204,059；6,093,570；6,057,152；6,040,183；5,869,305；5,863,541；5,773,289；5,753,500；5,478,745；5,436,146和5,139,941。除了AAV，应当理解其它病毒，包括但不限于如腺病毒、慢病毒、肝炎病毒、疱疹病毒也可以用来将核酸包衣壳，以与血小板结合来实施本发明。
一旦目标核酸被包衣壳入或包装在病毒颗粒中，病毒颗粒就可以按照已知技术与血小板结合或偶联。
通常，待递送的化合物与血小板偶联或结合，从而使得每个血小板携带或在其上结合至少1,000，和更优选至少10,000个待递送化合物的单个分子。
一旦被制备，具有结合的待递送化合物的血小板将包含以冷冻形式、冷藏、或室温下贮藏(依赖于所需的保存期限)用于随后重构和使用的“活性剂”。
5.活性剂的重构和施用。
本发明的药物制剂可以只是包含携带活性剂的干燥(优选冻干的)血细胞，其无致热原和无菌，处于无菌包装中。如上文指出的，可以包括清蛋白。药物制剂也可以包含在药物可接受载体中重构的本发明的血小板制剂。另外的试剂，如缓冲液、防腐剂和其它治疗活性剂也可以包括在重构制剂中。参见例如美国专利No.4,994,367(其公开内容在此引入作为参考)。血细胞和药物载体的量不关键且取决于血细胞的具体应用、它们是否已被再水化等等，但是通常是1或10重量％的血细胞至最高为90或99或甚至99.9重量％的血细胞，和0.01、1或10重量％的药物可接受载体至最高为90或甚至99重量％的药物可接受载体。在尚未再水化的固定干燥血细胞的一些实施方案中，组合物可以基本上由固定干燥血细胞组成或完全由它们组成，而无任何特殊载体。
如上所述的固定干燥血细胞可以按照已知技术配制用于在药物载体中施用。参见例如Remington，The Science And Practice ofPharmacy(9th Ed.1995)。在制备根据本发明的药物制剂中，固定干燥血细胞可以与尤其是可接受的载体混合。当然，载体在与制剂中任何其它成分相容的意义上必须是可接受的，且必须不对患者有害。载体可以是固体(包括粉末)，且优选与血细胞配制和包装成单位剂量制剂，例如，通过添加水溶液可以重构的一瓶冻干粉末。
对于再水化血细胞，可以使用再水化血小板从而使得它们具有上面列举的特征并适于静脉内注射的任何含水载体(例如无菌、无致热原的生理盐溶液)。例如，含水载体可以注射到含有冻干粉末形式的本发明药物制剂的瓶子中，如果需要，搅动内容物，接着从瓶中抽出再水化的固定干燥血细胞的含水悬浮液形式的药物制剂，和通过注射施用于患者。
优选内部施用本发明的化合物，例如经口或静脉内，其形式为常规药物组合物的形式，例如在含有有机和/或无机惰性载体的常规肠或肠胃外药物可接受赋形剂中，如水、明胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石、植物油、树胶、醇、凡士林等等。药物组合物可以是常规固体形式，例如片剂、糖衣丸、栓剂、胶囊等等，或常规液体形式，如悬浮液、乳剂等等。如果想要，它们可以被灭菌和/或含有常规药物佐剂，如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、缓冲液或用于调整渗透压的盐。药物组合物还可以含有其它治疗活性材料。可以使用制药领域已知的常规方法制备本发明的药物组合物。
重构的本发明的药物制剂一般通过肠胃外施用(例如静脉内注射、动脉内注射)而施用于人患者。施用的药物制剂的量将根据患者的体重和状况而变化，但是一般将是20至350毫升的体积，和每毫升1×109至3×109个血小板(和更优选每毫升2×109至3×109个血小板)的浓度。药物制剂可以包装在无菌、无致热原容器中来以单位剂量提供这些体积和剂量。具体施用途径不关键并将取决于所治疗的状况，对这种损伤和它们的相应治疗也使用至贯穿伤口部位的局部施用或应用。
三种应用，包括伤口部位成像、凝血因子递送和抗病毒剂递送在下列讨论中考虑的应用中。
a)用磁共振成像进行伤口定位的RL血小板-RL血小板可以负载当再水化细胞定位于血管损伤部位时可以起MRI造影剂作用的顺磁性纳米颗粒。两个新近发展提供了制备RL血小板-MRI造影剂制剂的工具。首先，可输注的钆(Gd)-螯合物已经被FDA批准(例如MagnevistTM)并且证明可有效作为弛豫造影剂，以用于血管病理学的评估(例如Rofsky和Adelman，2000)。用于伯胺附着到大分子的广泛化学活化的Gd-螯合剂是可利用的，并且引起特殊血管造影成像应用的研究探针的开发(参见综述Artemov，2003)。例如，已经用检测易损斑块的Gd-抗血纤蛋白抗体探针定位了血纤蛋白凝块(Flacke等人，2001)。
其次，磁性纳米颗粒的制备已经取得了主要进步(见Pankhurst等人，2003综述)。特别重要的是粒径分布狭窄的氧化铁(磁赤铁矿和磁铁矿)纳米颗粒的合成(Chatterjee等人，2003)。此外，已经开发了用用于大分子附着的聚合物修饰氧化铁颗粒的方法(Chatterjee等人.2003)并用于在磁场中分离血细胞(Chen，等人，2000)。RL血小板代表将氧化铁纳米探针(nanoprobe)构造和Gd-螯合物靶向血管损伤部位的独特平台。
b)用于在凝血病状况下止血的RL血小板-凝血因子缀合物-凝血因子(如FVIIa)与RL血小板表面的连接(tether)和/或α-颗粒等加载凝血因子(进行血凝块稳定的FXIIIa、进行光活化的笼形凝血酶(Arroyo等人，1997))是将置换因子递送给具有针对标准置换治疗剂的循环抗体抑制剂的血友病患者(难治的血友病患者)以及具有其它类型凝血病的患者的合理策略。已假设重组FVIIa通过在血小板表面起效的两种机制提供止血。首先，已经建立理论认为重组因子VIIa(rFVIIa)在血友病患者中提供止血的能力(Hedner和Glazer，1992)包括血小板表面上因子Xa的直接活化(例如参见Monroe等人，1997和2000)，由此“避免”了对因子IX和VIII的需要。这个rec FVIIa的“避免”活性可能是Novo Nordisk产物在A型和B型血友病中作为止血剂应用的功能基础。其次，在正常水平凝血因子存在下，rFVIIa可以通过活化血小板表面上的因子IX来增加止血机制。因此，rFVIIa对血小板表面上凝血酶的产生的介导可以补偿血小板减少症中血小板的缺乏或血小板机能不全中适当血小板功能的缺乏。rFVIIa可以改善血小板减少症(例如Poon等人，2000，Kristensen等人，1996)、血小板机能不全(例如A1 Douri等人，2000)或受到两种血小板缺陷影响的患者，如创伤(例如Dutton等人，2003)的患者止血的临床观察支持rFVIIa可以起血小板功能的“补偿”作用的假说。然而，止血常常需要高剂量rFVIIa，这也许是由于凝血因子与血小板表面的亲和力低(Kd～90nM)(Monroe等人，1997)。因此我们猜测rFVIIa与血小板表面的直接化学连接将提高重组蛋白作为终止活性出血的止血剂的疗效(指数)。
c)用冻干的血小板进行抗病毒剂递送-RL血小板和RL RBCs有希望向感染引起出血热和肝炎的单链RNA病毒的巨噬细胞递送抗病毒治疗剂。这很重要，因为网状内皮系统(RES)的巨噬细胞参与病毒感染的最初阶段，以及血管损伤部位的巨噬细胞参与感染的随后急性出血阶段。沙粒病毒科(例如拉沙热病毒)、线状病毒科(例如欧鲍拉病毒和马尔堡病毒)、布尼病毒科(例如立夫特山谷病毒)和黄病毒科(例如黄热病毒)的病毒引起病毒诱发的对血管组织的细胞损害，这引起出血。类似地，丙型肝炎病毒(一种黄病毒科成员)增殖常常与出血剧烈的肝手术有关。病毒唑作为广谱抗病毒RNA诱变剂，有希望治疗这些出血相关病毒。然而，不利的毒性限制了这种核糖核苷作为抗病毒化疗剂的临床应用。我们设法通过使用RL血小板递送该核糖核苷来增加病毒唑的治疗功效。因此RL血小板的固有止血作用将使病毒微环境中的病毒唑浓缩，以增加在RES和血管伤口部位的巨噬细胞中的化疗功效。
以下列非限制性实施例更详细描述本发明。
实施例1-5病毒唑与血小板的附着这些实施例描述了含有病毒唑和与其偶联的rFVIIa的重构血小板的制备和表征的方法。
实施例1病毒唑-聚赖氨酸聚合物的合成将病毒唑化学磷酸化为病毒唑一磷酸盐(RMP)，如Yoshikawa等人，Tetrahedron Lett.50，5065-5068(1967))详述的。按照DiStefano和Fiume(Trends in Glycosci.and Glycotech.50，461-472(1997))的方法或基于咪唑-病毒唑加合物的形成的简化方法(参见Chu等人，Nuc.Acids.Res.11，6513-6529(1983))，将病毒唑一磷酸盐(RMP)通过pH敏感性磷酰胺键与聚赖氨酸偶联。用尿嘧啶而不是病毒唑检验核糖核苷聚合物合成的缀合化学过程。我们预期尿嘧啶和病毒唑之间含氮碱基结构的差异对合成不会产生大的影响。
聚赖氨酸(<分子量>＝约1,400个残基赖氨酸/分子为205kDa)与FITC(异硫氰酸荧光素)和SANPAH(N-琥珀酰亚胺基-6-[4′-叠氮基-2′-硝基苯氨基]己酸盐)起反应而分别提供荧光标记和可光活化的部分，以用于最终产物与血小板的共价附着。通过首先用咪唑以EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺)作为催化剂活化UMP，使尿嘧啶与赖氨酸侧臂偶联。然后将活化的UMP-咪唑复合物添加到FITC/SANPAH-修饰的赖氨酸链以形成磷酰胺键。基于质子NMR分析的峰大小(α-碳质子对含氮碱基质子，参见图1，“核苷共聚物的质子NMR谱”)，12％赖氨酸残基与UMP偶联在一起。1400个残基共聚物的最终平均组成是分别用尿嘧啶、SANPAH和FITC修饰的168、20和4个赖氨酸侧臂，留下～1200个赖氨酸残基未修饰。
在不同系列的反应中，聚赖氨酸(Sigma-Aldrich，<分子量>＝200,000kDa)的ε氨基被FITC修饰以提供荧光团标记和被异双功能交联剂SANPAH(Pierce)修饰以提供下一步(b)中用于与血小板光化学附着的部分。FITC和SANPAH附着于聚赖氨酸，得到一个FITC部分/～300个赖氨酸残基和一个SANPAH部分/～30个赖氨酸残基。RMP被咪唑化，然后与FITC、SANPAH聚赖氨酸偶联在一起，以形成病毒唑共聚物的磷酰胺键，如Chu等人(上述)详述的。目的是用RMP残基饱和赖氨酸残基。进行质子和13C NMR以表征聚合物修饰的程度。
通过在pH为2.4至7.4的缓冲液中温育病毒唑共聚物1小时而证实磷酰胺键的pH敏感性(参见Fume等人，Pharm.Acta.Helv.137-139(1988))。温育后，将pH调节至中性并对着PBS透析以除去游离RMP。用质子NMR检查样品以确定水解程度。pH从中性降低时，水解速度应该增加。
我们选择用尿嘧啶而不是病毒唑检验核糖核苷聚合物的缀合化学过程，这是因为就在伊拉克军事行动之前和期间抗病毒剂的暂时无供应。我们预期尿嘧啶和病毒唑之间含氮碱基结构的差异对合成不会产生大的影响。
实施例2用于负荷病毒唑的冻干的血小板的病毒唑-聚赖氨酸聚合物的附着制备冷干的血小板的方法包括四个步骤从过量血浆蛋白移出血小板，适度低聚甲醛交联以稳定细胞结构，从未反应的交联剂移出血小板和冻干(Read等人，美国专利No.5,651,966)。除去过量低聚甲醛后，血小板与各种浓度的病毒唑聚合物混合并暴露于可见光以活化SANPAH部分，以用于与血小板表面共价键的形成。然后用标准程序冻干血小板。用不同量病毒唑制备血小板，这通过改变偶联步骤中病毒唑-共聚物的浓度实现。通过细胞与递送聚合物在可见光谱的光下温育以光活化用于共价偶联的SANPAH部分来研究核糖核苷共聚物与RL血小板共价偶联的能力。离心洗涤除去未反应的共聚物，然后用荧光显微镜检查检测血小板。图2，“聚合物修饰的RL血小板的荧光显微镜检查”显示了与细胞结合的荧光标记的核糖核苷共聚物。基于血小板的平均荧光强度，用24,800共聚物共价标记每个细胞。
实施例3病毒唑-血小板的表征用生理盐水再水化按照上面实施例2制备的病毒唑-血小板，然后接受分析以证实共聚物附着的化学性质、血小板的功能和病毒唑-血小板释放核糖核苷的能力。
病毒唑-聚赖氨酸聚合物的表面密度和细胞分布。使负荷病毒唑的血小板接受液体闪烁计数，然后由放射性标记的比活计算每个血小板附着的[3H]病毒唑共聚物的量。还可以进行流式细胞术以估计荧光强度和每个血小板的共聚物数目之间的关系。用聚焦显微镜检查可从FITC部分的荧光确定[3H]病毒唑-共聚物的细胞定位。
通过将病毒唑-血小板放置于低pH缓冲液中以水解核苷来证实病毒唑单位的化学完整性。于是样品将接受TLC分析(如Fischer等人，Brit.J.Haem.111，167-175(2000)详述的)以确定[3H水解产物是否与[3H]病毒唑一磷酸盐标准物共同洗脱。
病毒唑-血小板的活化反应。负荷增加量的[3H]病毒唑-共聚物的血小板接受用于表征为输血目的制备的重构的冻干血小板的相同类型分析。简言之，用扫描和透射电子显微镜检查活化和未活化的病毒唑-血小板的形态学。vWf介导的粘附可以用瑞斯托菌素聚集进行研究。可以用流式细胞术确定磷脂酰丝氨酸、p-选择蛋白、活化的GPIIb/IIIa和纤维蛋白原的表面密度。这些方法可以用来证实可以获得的但不过度不利影响止血作用并因此最优化任何特定制备方案的共聚物修饰的最大程度。
用于药物释放和抗病毒活性分析的巨噬细胞对病毒唑-血小板的内吞作用。这个分析利用在别处已经详述的基于组织培养的脾巨噬细胞吞噬系统(Fischer等人，Art.Cell.Blood Subs.Imm.Biotech.29，439-451(2001))。病毒唑-RL血小板的抗病毒活性可以通过Punta Toro病毒的Adames株感染大鼠脾巨噬细胞来估计，因为该株可以在2级生物安全条件下操作，且为感染啮齿动物巨噬细胞所公知，引起感染小鼠致命性肝坏死和对病毒唑体内和体外的抗病毒作用敏感。或者可以使这些研究任选适应小鼠巨噬细胞培养物，已知它高度允许Punta Toro病毒复制。
使[3H]病毒唑-共聚物-RL血小板与巨噬细胞在轻柔摇动、37℃下温育。以时间函数取出样品并接受分别遵循a)血小板内在化以进行病毒灭活和b)病毒唑代谢的两种类型分析。
血小板吞噬作用和病毒灭活。这些研究使用荧光显微镜和流式细胞术分析，以鉴定巨噬细胞(来自抗巨噬细胞-PE的PE荧光)和病毒唑-RL血小板吞噬作用(来自[3H]病毒唑-共聚物FITC荧光)。使细胞混合物与抗巨噬细胞-PE缀合物(MCA-342，Serotec)一起温育来标记巨噬细胞，然后实施流式细胞术和聚焦荧光显微镜术以监视内在化和吞噬过程。可以依靠流式细胞术提供定量数据，而可以进行聚焦显微镜检查来检验停靠在巨噬细胞和/或被巨噬细胞内在化的病毒唑-血小板的分布。
用病毒唑-RL血小板或对照血小板处理的巨噬细胞亚群可以一式三份被Punta Toro病毒感染，以感染复数为10在37℃感染一小时。在此时，将细胞用室温生长培养基洗涤3次，并维持在37℃的生长培养基中。完成洗涤后，从每孔中移出生长培养基样品通过噬菌斑测定进行病毒水平分析。以四小时间隔移出另外的样品以确定上清液内的病毒水平。通过噬菌斑测定估计Vero细胞上的病毒滴度，该细胞允许Punta Toro病毒感染并且以前已经用于通过噬菌斑测定滴定Punta Toro病毒水平。或者，在用病毒唑-RL或对照血小板处理前，用Punta Toro病毒感染细胞。这将估计病毒唑-RL血小板是否可以控制以前建立的感染。作为这些研究的阳性对照，用Punta Toro病毒一式三份感染巨噬细胞组。然后用病毒唑(不加载血小板)以每毫升4-10微克的浓度处理这些培养物，该浓度范围是以前表明抑制体外Punta Toro病毒复制的浓度范围。如果病毒唑-RL血小板使处理的培养的巨噬细胞中的病毒滴度降低至可以与常规病毒唑处理所观察的相比较的水平，那么它们被认为显示出抗病毒作用。
病毒唑代谢。通过用TX-100裂解细胞混合物，然后用TLC分析分离游离核苷(Fischer等人，2000，上述)来检查[3H]病毒唑一磷酸盐释放和代谢的时程。将这个信息用来证实[3H]病毒唑一磷酸盐从共聚物的释放以及转变为[3H]病毒唑二磷酸盐和三磷酸盐。
实施例4血小板的表征优选通过如上所述方法(或对本领域技术人员显而易见的其改进方法)获得每个细胞具有至少100,000个病毒唑共聚物的血小板，该血小板在瑞斯托菌素聚集分析中以90％的效率起作用。基于两个理由选择这些标准。第一，瑞斯托菌素体外止血参数10％的减少对RL血小板的体内止血作用具有微不足道的影响，如根据在血小板减少症兔中纠正出血的能力判断的。第二，单个血小板上100,000个病毒唑-共聚物分子的递送代表～3×108个病毒唑部分(或～5×10-16摩尔病毒唑)。如果单个巨噬细胞(细胞内体积～103um3)内在化单个病毒唑-血小板，那么病毒唑作用的细胞内浓度将是～5×10-19摩尔/um3或～5×10-4摩尔/升(500uM)。这是远远超过在组织培养物中显示抗病毒活性的病毒唑范围(10-100uM)的浓度(参见例如Crotty等人，J.Mol.Med.80，86-95(2002))。
与RL血小板体内止血功效最相关的体外度量与GPIb-vonWillebrand因子介导的粘附有关。因此我们使用瑞斯托菌素介导的聚集进行核糖核苷标记的RL血小板的初步功能表征。图3“对照和聚合物修饰的RL血小板的瑞斯托菌素聚集”证明再水化后，标记的细胞保留了～70％功能，如根据聚集曲线的起始斜率和外延判断的。
实施例5病毒唑内在化至血小板中在上述可供选择的实施方案中，病毒唑被修饰以进行血小板内在化。例如，这通过短链病毒唑聚赖氨酸共聚物与用于α颗粒摄取的IgG或纤维蛋白原偶联来进行。或者，胶乳纳米颗粒负载着用于血小板内吞作用的病毒唑，然后将加工细胞以冻干。
实施例6-8
递送核酸的冻干的血小板这些实施例描述了使用可再水化、冻干的(RL)血小板将核酸递送至血管损伤部位以用于药物开发、诊断或治疗目的的方法。核酸可以编码任何目标蛋白或肽，如用于诊断或药物筛选目的的报道蛋白或肽。
在此如图4“血小板/AAV～Lac Z报道分子缀合物的制备”所描述的制备RL血小板/AAV～Lac Z缀合物。该方法是Read等人的美国专利No.5,651,966描述的方法的变形。
实施例6抗AAV抗体与血小板的附着用于抗体附着的血小板的制备。按照已知技术，用差速离心(以获得富含血小板的血浆)和Sepharose CL2B层析(以从血浆蛋白分离血小板)分离新鲜猪血小板(Read等人，1Proc.Natl.Acad.Sci.USA92，397-401(1995))。然后用低聚甲醛稳定细胞并离心洗涤以除去未反应的交联剂。这些步骤将使用在别处(Read等人，上述)已详述的已知方案。
抗AAV抗体对血小板的修饰和附着。按照已知技术(参见Carlsson等人，Biochemistry J.173，723-737(1978))，使抗AAV衣壳蛋白VP1多克隆抗体(Research Diagnostics Inc，PleasantHill，NJ，ALS24107)多克隆抗体(衣壳蛋白上残基278-289)与N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基硫代]丙酸盐(SPDP)反应，以在交联剂和抗体之间形成赖氨酸-亚胺键。用大小层析除去过量交联剂，然后使巯基活化的抗体与如上制备的醛稳定的血小板温育2小时，以用于抗体通过巯基部分与血小板表面的附着。反应化学计量是每个血小板10,000个抗衣壳抗体。用两次离心洗涤除去未结合的抗体。
用于冻干的血小板/AAV～Lac Z缀合物的AAV～Lac Z与血小板的附着。用“三重质粒”转染方法制备AAV～Lac Z，其中用三个质粒共转染293细胞含Lac Z的pAAV、含Rep和Cap基因的第二个质粒和编码介导“拯救”步骤的腺病毒蛋白的第三个质粒(见Monahan和Samulski，J.Virol.61，3096-3950(2000))。用这个策略，293细胞不必用腺病毒感染来“拯救”重组AAV颗粒，因此避免了最终AAV制剂的腺病毒污染。根据已知技术，用硫酸铵沉淀和密度梯度纯化，从293细胞组织培养物中分离AAV～Lac Z。
为了使AAV～Lac Z与血小板表面附着，使血小板与如上制备的血小板-抗衣壳IgG缀合物温育三小时。通过两次离心洗涤除去过量AAV～Lac Z。然后冷冻血小板/AAV～Lac Z缀合物，冻干并贮存在-20℃。制备了冷冻干燥的血小板/AAV～Lac Z缀合物，以致于在再水化后，血小板和AAV～Lac Z的浓度将分别是1×108个血小板/ml和1×1012个AAV～Lac Z载体/ml。
实施例7血小板/AAV～Lac Z缀合物的表征血小板上AAV～Lac Z的表面密度。通过使样品接受SDS-PAG电泳和蛋白印迹分析来定量附着于血小板表面的抗衣壳蛋白抗体和AAV～Lac Z的量。将抗兔IgG用来检测抗AAV，而将抗衣壳VP1用来探测AAV蛋白。目的是向每个血小板附着大约100,000个AAV～Lac Z载体。如果通过任何特殊方法获得较低化学计量，那么抗体浓度可以向上调节，和/或血小板与AAV～Lac Z的反应的温育时间可以增加。
Lac Z的附着对血小板功能的影响。用AAV～Lac Z修饰血小板表面对RL血小板功能的影响可以根据已知技术通过进行聚集测定和Baumgardner分析来确定(Khandelwal等人，FASEB J.11，1812(1997)；Bode等人，J Lab.Clin.Med.133，200-211(1999))。
AAV～Lac Z的附着对转导效率的影响。通过使AAV～Lac Z缀合物与猪脾巨噬细胞温育，然后用X-gal染色探测基因转移来估计表面附着对AAV～Lac Z转导效率的影响。可以对等同于用血小板递送的病毒颗粒数目的AAV～Lac Z的滴度进行对照实验。
AAV作为基因治疗工具的开发过程中的重要问题是获得高滴度制剂中的困难(例如见Monahan和Samulski，上述)。通过AAV～Lac Z与血小板表面的免疫吸收，将制备局部浓度很高的探针。
AAV与血小板的偶联可能影响病毒和血小板系统两者的功能。如果探针附着以可测定的程度影响Baumgardner和聚集测定中血小板的性能，则AAV～Lac Z的表面密度可能降低。如果发现结合血小板的AAV以显著降低的效率转导脾巨噬细胞，则病毒载体的表面密度可能增加。或者，可以利用其它病毒连接策略。
实施例8报道基因递送至血管损伤部位将研究RL血小板/AAV～Lac Z缀合物将Lac Z基因转导入血管损伤部位的能力。在这个实施例中，食用致动脉粥样化饮食的猪动脉粥样硬化脉管受损，输注RL血小板/AAV～Lac Z缀合物，和继续给动物致动脉粥样化饮食以在损伤部位产生另外的斑块发展。这种设计模拟了内皮被动脉粥样硬化斑块破裂和/或血管成形术干扰后，动脉粥样硬化斑块再次闭塞脉管时发生的事件的结果。后随实验的详细说明。这个系统在检测药物如抑制素等等，或饮食干预对于治疗或减轻受试者动脉粥样硬化的活性中有用。
动脉粥样硬化的诱发。使用四个Lpb1/1基因型30-40kg(年轻成体)雄性猪。Lpb1/1(Lpg＝L(脂蛋白)、b(apoB100)、p(猪))是在UNC-Chapel Hill的Francis Owen Blood Research Laboratory的封闭群体中饲养的多形基因型。以常染色体共显性方式遗传，Lpb1/1动物在致动脉粥样化饮食下发展为稳定程度的高胆固醇血症并一致地发展为与饮食胆固醇水平密切相关的中等严重的动脉粥样硬化症(Nichols等人，Am.J.Pathyol.140，403-415(1992))。两只猪处于高胆固醇食物下而两只保持在标准低胆固醇饲料。
血管损伤和用RL血小板/Lac Z构建体进行治疗。接收对照或致动脉粥样化饮食两月后，麻醉动物并手术分离右侧股动脉部分。血管损伤部位是用Goldblatt钳以两厘米间隔压碎动脉形成的。在10cm长脉管上建立五处伤口。建立伤口后立即在10ml无菌盐水中再水化109个AAV～Lac Z修饰的血小板并向外周耳静脉输注。修复手术切口，然后将动物维持在对照或高胆固醇饮食中另外两月。
组织的死后分析。手术后在对照或高胆固醇饮食上两月后，对动物实施安死术。用X-gal染色组织化学检测股动脉的损伤部分以及对侧脉管的相似部分以探测Lac Z基因产物半乳糖苷酶的表达。也可以分析脾、肺、心脏和肝脏组织中转基因的表达。
实施例9
凝血蛋白缀合和递送至血管伤口部位凝血蛋白-血小板缀合物的制备可以利用异双功能交联剂，如具有用于共价附着的伯胺反应性和可光活化部分的SANPAH(N-琥珀酰亚胺基6-[4″-叠氮基-2′-硝基苯氨基]己酸盐)。可以使用各种凝血蛋白，包括recFVIIa(Novo Nordisk产品)、FVII或FVIIa和来自各种表达系统的相关突变体，以及产生FVIIa的凝血蛋白，如FXIIa或FXa。为了制备RL血小板-redFVIIa缀合物，在无水DMSO中制备100mM SANPAH原液，然后1/100稀释为1mg/ml recFVIIa(例如来自Novo Nordisk)的磷酸缓冲盐水(10mM磷酸盐、150mM NaCl、pH＝7.4)溶液，并允许在黑暗中温育1小时。通过对着PBS过夜透析该混合物或在Sepharose CL4B上进行凝胶过滤来除去未反应的SANPAH。
使血小板接受醛稳定，然后如美国专利No.5,651,966详述除去过量低聚甲醛，接着使SANPAH-recFVIIa与细胞缀合。然后使SANPAH-recFVIIa和固定的血小板在PBS中混合为100,000个血小板/ul和0.1mg/ml SANPAH-蛋白缀合物，接着暴露于来自标准荧光源的可见光区1小时以实现SANPAH-recFVIIa缀合物与血小板表面的光偶联。然后在Sepharose CL-2B上层析以使未反应的蛋白与血小板分离，接着如美国专利No.5,651,966详述冻干recFVIIa-血小板缀合物。
实施例10重组因子VIIa与冻干的血小板表面通过天然结合部位的偶联异硫氰酸荧光素(FITC)标记的重组因子VIIa(rFVIIa)的制备-将4.8mg rFVIIa(NovaNordisk，输注级)用4.8ml蒸馏水再水化为[rFVIIa]＝20uM。将rFVIIa对着磷酸缓冲盐水(PBS)透析过夜，然后在室温(r.t.)与40uM FITC温育30分钟。将反应混合物对着PBS透析过夜，然后对着柠檬酸盐化的盐水透析过夜以获得rFVIIa-FITC。
rFVIIa-FITC与再水化、冻干的血小板的表面附着-用蒸馏水水化冻干的血小板为1.89×109个细胞/ml。混合血小板和rFVIIa-FITC并在室温下温育30分钟，其中浓度为0至10uM的rFVIIa-FITC和0至1.89×109个细胞/ml。将血小板用盐水离心洗涤一次，然后稀释于PBS+2％低聚甲醛中以用于流式细胞术分析。
rFVIIa-FITC基于对称的流式细胞术直方图以同质方式与冻干的血小板结合(参见图5，“与RL血小板结合的rFVIIa-FITC的流式细胞术分析”)。
rFVIIa-FITC与冻干的血小板的结合程度是总rFVIIa-FITC浓度的递增函数(参见图6，“rFVIIa与RL血小板结合是浓度依赖性的”)。
这些结果表明显著量的rFVIIa可以通过以超生理浓度简单共温育而附着于冻干的血小板。
与冻干的血小板表面结合的rFVIIa的活性通过测量这些制剂催化凝血酶原向凝血酶转变的能力来分析。RL血小板-rFVIIa的制备方法是使rFVIIa(10uM、3uM、1uM 0.3或0uM)与RL血小板(1×105/ul)在含10mM CaCl2的柠檬酸盐化的盐水中温育一小时。将RL血小板-rFVIIa颗粒离心洗涤一次以除去未结合的rFVIIa，然后将该制剂(以及对照缓冲液或单独类似浓度的rFVIIa)1/10稀释于正常或含有荧光凝血酶底物D-phe-pro-arg-ANSNH的因子IX缺陷的血浆。测量凝血酶底物产生的起始时间和最大速度。图7的结果表明RL血小板-结合的rFVIIa至少与摩尔基础上游离的rFVIIa一样有活性(参见图7，“RL血小板-rFVIIa和游离rFVIIa以类似方式催化IIa生成”)。
参考文献Al Douri，M.，Shafi，T.，Al Khudairi，D.，Al Bokhari，E.，Black，L.，Akinwale，N.，Osman，M.，Al Homaidhi，A.，Al Fagih，M.and Borum，R.(2000)Effect of theadministration of recombinant activated factor VII in the management of severeuncontrolled bleeding in patients undergoing heart valve replacement surgery.BloodCoag.and Fib.11，S121-S127.
Arroyo，J.，Jones，P.，Porter，N.and Hatchell，D.(1997)In vivophotoactivation of caged thrombin.Thrombosis and Hemostasis 78，791-793.
Artemov，D.(2003)Molecular magnetic resonance imaging with tartetedcontrast agents.J.Cellular Biochem.90，518-525.
Bode，A.，Read，M.，Reddick，R.(1999)Activation and adherence oflyophilized human platelets on canine vessel strips in the Baumgartner perfusioncbamber.J.Lab.Clin.Med.133，200-211.
Carlsson.J.，Drevin，H.，and Axen，R.(1978)Protein thiolation and reversibleprotein-protein conjugation.Biochemistry J.173，723-737.
Chatterjee，J.，Haik，Y.and Chen，C.(2003)Size dependent magneticparperties of iron oxide naoparticles.J.Magnetism and Magnetic Materials 257，113-118.
Chu，B.，Wahl，G.and Orgel，L.(1983)Derivatization of unprotectedpolynucleotides.Nuc.Acids Rec.11，6513-6529.
Crotty，S.，Cameron，C.，Andino，R.(2002)Rivavirin’s antiviral mechaismofactionLethal mutagenesis？J.Mol.Med 80，86-95.
Di Stefano，G.and Fiume，L.(1997)Liver glycotargeting of antiviralnucleoside analogues.Trends in Glycosci.and Glycotech.50，461-472.
Dutton，R.，Hess，J.and Scalea，T.(2003)Recombinant factor VIIa for controlof hemorrhageearly experience in critically ill trauma patients.J.Clin.Aneth.15，184-188.
Fischer，T.，Merricks，E.，Russell，K.，Raymer，R.，White，G.，Bode，A.，Nichols，T.and Read，M.(2000)Intracellular Signaling in Rehydrated，LyophilizedPlatelets.Brit.J.Haem.111，167-175.
Fischer，T.，Merricks，E.，Bellinger，D.，Hayes，P.Smith，R.，Raymer，R.，Read，M.，Nichols，T.and Bode，A.(2001a)Splenic clearance mechanisms ofrehydrated，lyophilized platelets.Art.Cell.Blood Subs.Imm.Biotech.29，439-451.
Flacke，S.，et al.(2001)Novel MRI contrast agent for molecular imaging offibrin.Circulation104，1280-1285.
Fume et al.，(1988)Pharm.Acta.Helv.63，137-139.
Hedner，U.and Glazer，S.(1992)Management of bemophilia patients withinhibitors.Hematology/Oncology Clinics of North America 6，1035-1046.
Khandelwal，G.，Sanders，W.，Bode，A.，Nichols，T.，Erickson，G.and Read，M.(1997)von Willebrand factor binding to rehydrated lyophilized platelet surfaceGPlb and inhibition by monoclonal antibody to GPlb.FASEB J.11，1812.
Kristensen，J.，Killander，A.，Hippe，E.，Helleberg，C.，Ellegaard，J.，Holm，H.，Kutte，J.，Mellqvist，U.，Johansson，J.，Glazer，S.and Hedner，U.(1996)Clinicalexperience with recombinant factor VIIa in patients with thrombocytopenia.Haemostasis 256，159-164.
Monohan，P.and Samulski，J.(2000)Adeno-associated virus vectors for genetherapymore pros than cons？(Mol.Med.Today 6，433-440.
Monroe，D.，Hoffman，M.，Oliver，J.and Roberts，H.(1997)Platelet activity ofhigh dose factor VIIa is independent of tissue factor.Br.J.Haematol.99，542-547.
Monroe，D.，Hoffman，M.，Allen，M.and Roberts，H.(2000)The factor VII-platelet interplayEffectiveness of recombinant factor VIIa in the treatment ofbleeding in severe thrombocytopenia.Seminars in Thrombosis and Hemostasisi 26，373-377.
Nichols，T.，Bellinger，D.，Davis，K.，Koch，G.，Reddick，R.，Read，M.，Rapacz，J.，Hasler-Rapacz，J.，Brinkhous，K.，Griggs，T.(1992)Porcine vonWillebrand disease and atherosclerosisInfluence of polymorphism in apolipoproteinB100 genotype.Am.J.Pathol.140，403-415.
Pankhurst，Q.，Connolly，J.，Jones，S.and Dobson，J.(2003)Applications ofmagnetic manopartilces in biomedicine.J.Phys.DApplied Phys.36，R167-R181.
Poon，M.and d’Oiron，R.(2000)Recombinant activated factor VII treatmentof platelet-related bleeding disorders.International Registry of recombinant factorVIIa and congenital platelet disorders group.Blood Coag.and Fib.11，S55-S68.
Read M.S.，Reddick R.L.，Bode A.P.，Bellinger D.A.，Nichols T.C.，TaylorK.K.，Smith S.V.，McMahon D.K.，Griggs T.R.，and Brinkhous K.M.(1995)Preservation of hemostatic and structural properties of rehydrated lyophilizedplateletsPotential for long-term storage of dried platelets for transfusion.Proc.Natl.Acad.Sci.92397-401.
Rofsky，N.and Adelman，M.(2000)MR angiography in the evaluation ofatherosclerotic peripheral vascular disease.Radiology 214，326-338.
Yoshikawa，M.，Kato，T.and Takenishi，T.(1967)A novel method forphosphorylation of nucleosides to 5’nucleosides.Tetrahedron Lett 50，5065-5068.
上述是本发明的阐明，而不应认为是本发明的限制。本发明由下列权利要求限定，其中包括权利要求的等同方案。
权利要求
1.携带活性剂的固定干燥血细胞，所述固定干燥血细胞选自固定干燥红细胞、固定干燥血小板及其组合。
2.权利要求1的固定干燥血细胞，其中所述固定干燥血细胞包括哺乳动物固定干燥血细胞。
3.权利要求1的固定干燥血细胞，其中所述固定干燥血细胞包括人固定干燥血细胞。
4.权利要求1的固定干燥血细胞，其中所述活性剂与该细胞的内部或表面共价或非共价偶联。
5.权利要求1的固定干燥血细胞，其中所述活性剂包含在该细胞内。
6.权利要求1的固定干燥血细胞，其中所述固定干燥血细胞包括醛固定的血小板。
7.权利要求1的固定干燥血细胞，其中所述固定干燥血细胞是固定干燥血小板，其在重构后附着于形成血栓的表面；附着于形成血栓的表面后经历形状改变；使得附着于形成血栓的表面后形成止血栓；和释放它们的颗粒状内容物。
8.权利要求1的固定干燥血细胞，其中所述固定干燥细胞是固定干燥红细胞。
9.权利要求1的固定干燥血细胞，其中所述活性剂包括抗病毒剂。
10.权利要求1的固定干燥血细胞，其中所述活性剂包括凝血蛋白。
11.权利要求1的固定干燥血细胞，其中所述活性剂包括抗凝血蛋白。
12.权利要求1的固定干燥血细胞，其中所述活性剂包括核酸。
13.一种药物组合物，其包含药物可接受载体；和携带活性剂的固定干燥血细胞，所述固定干燥血细胞在所述药物可接受载体中再水化，所述固定干燥血细胞选自固定干燥红细胞、固定干燥血小板及其组合。
14.权利要求13的药物组合物，其中所述载体是无菌载体。
15.权利要求13的药物组合物，其中所述载体是固体载体。
16.权利要求13的药物组合物，其中所述载体是液体载体。
17.权利要求13的药物组合物，其中所述载体是含水载体。
18.权利要求13的药物组合物，其中所述固定干燥血细胞包括哺乳动物固定干燥血细胞。
19.权利要求13的药物组合物，其中所述固定干燥血细胞包括人固定干燥血细胞。
20.权利要求13的药物组合物，其中所述活性剂与所述固定干燥血细胞偶联。
21.权利要求13的药物组合物，其中所述活性剂包含在所述固定干燥血细胞内。
22.权利要求13的药物组合物，其中所述固定干燥血细胞包括醛固定细胞。
23.权利要求13的药物组合物，其中所述固定干燥血细胞是固定干燥血小板，其在重构后附着于形成血栓的表面；附着于形成血栓的表面后经历形状改变；使得附着于形成血栓的表面后形成止血栓；和释放它们的颗粒状内容物。
24.权利要求13的药物组合物，其中所述固定干燥血细胞是固定红细胞。
25.权利要求13的药物组合物，其中所述活性剂包括抗病毒剂。
26.权利要求13的药物组合物，其中所述活性剂包括凝血蛋白。
27.权利要求13的药物组合物，其中所述活性剂包括抗凝血蛋白。
28.权利要求13的药物组合物，其中所述活性剂包括核酸。
29.一种制备携带活性剂的固定干燥血细胞的方法，其包括提供固定血细胞，所述固定血细胞选自固定红细胞、固定血小板及其组合；使所述活性剂与所述固定血细胞结合；和干燥该固定血细胞以制备携带所述活性剂的固定干燥血细胞。
30.权利要求29的方法，其中携带所述活性剂的所述固定干燥血细胞在药物可接受载体中再水化，以提供包含携带所述活性剂的再水化固定干燥血细胞的药物可接受组合物。
31.权利要求29的方法，其中所述固定血细胞包括固定的哺乳动物血细胞。
32.权利要求29的方法，其中所述固定血细胞包括固定的人血细胞。
33.权利要求29的方法，其中所述结合步骤通过使所述活性剂与所述固定血细胞共价或非共价偶联进行。
34.权利要求29的方法，其中所述结合步骤通过将所述活性剂引入所述固定血细胞而进行。
35.权利要求29的方法，其中所述固定血细胞包括醛固定血细胞。
36.权利要求30的方法，其中所述再水化的固定干燥血细胞包括再水化的固定干燥血小板，所述血小板附着于形成血栓的表面；附着于形成血栓的表面后经历形状改变；使得附着于形成血栓的表面后形成止血栓；和释放它们的颗粒状内容物。
37.权利要求29的方法，其中所述固定血细胞是固定红细胞。
38.一种将目标化合物递送至形成血栓的表面或RES的巨噬细胞的方法，其包括提供携带所述目标化合物的固定干燥血细胞，所述固定干燥血细胞选自固定干燥红细胞、固定干燥血细胞及其组合；将所述固定干燥血细胞在药物可接受载体中再水化，以提供包含携带所述目标化合物的再水化的固定干燥血细胞的药物可接受组合物；和施用所述药物组合物，从而使得有效量所述目标化合物递送至所述形成血栓的表面或RES的巨噬细胞。
39.权利要求38的方法，其中所述固定干燥血细胞包括哺乳动物固定干燥血细胞。
40.权利要求38的方法，其中所述固定干燥血细胞包括人固定干燥血细胞。
41.权利要求38的方法，其中所述形成血栓的表面处于受试者中，且该受试者是哺乳动物受试者。
42.权利要求38的方法，其中所述形成血栓的表面处于受试者中，且该受试者是人受试者。
43.权利要求38的方法，其中所述目标化合物与所述细胞共价或非共价偶联。
44.权利要求38的方法，其中所述目标化合物包含在所述细胞内。
45.权利要求38的方法，其中所述固定干燥血细胞包括醛固定细胞，且其中形成血栓的表面处于罹患血管损伤的受试者中。
46.权利要求38的方法，其中所述再水化的固定干燥血细胞是再水化的固定干燥血小板，所述血小板附着于形成血栓的表面；附着于形成血栓的表面后经历形状改变；使得附着于形成血栓的表面后形成止血栓；和释放它们的颗粒状内容物。
47.权利要求38的方法，其中所述固定干燥血细胞是固定干燥红细胞。
48.权利要求38的方法，其中所述目标化合物是诊断或治疗剂。
49.一种将活性剂递送至目标部位的方法，其包括提供携带所述目标活性剂的固定干燥血细胞，所述固定干燥血细胞选自固定干燥红细胞、固定干燥血小板及其组合；将所述固定干燥血细胞在药物可接受载体中再水化，以提供包含携带所述活性剂的再水化的固定干燥血细胞的药物可接受组合物；和将所述药物组合物施用于受试者，从而使得有效量所述活性剂递送至所述目标部位。
50.权利要求49的方法，其中所述固定干燥血细胞包括哺乳动物固定干燥血细胞。
51.权利要求49的方法，其中所述固定干燥血细胞包括人固定干燥血细胞。
52.权利要求49的方法，其中所述受试者是哺乳动物受试者。
53.权利要求49的方法，其中所述受试者是人受试者。
54.权利要求49的方法，其中所述活性剂与所述固定干燥血细胞偶联。
55.权利要求49的方法，其中所述活性剂包含在所述固定干燥血细胞内。
56.权利要求49的方法，其中所述固定干燥血细胞包括醛固定干燥血细胞，且其中所述目标部位是血管损伤。
57.权利要求49的方法，其中所述再水化的固定干燥血细胞是再水化的固定干燥血小板，所述血小板附着于形成血栓的表面；附着于形成血栓的表面后经历形状改变；使得附着于形成血栓的表面后形成止血栓；和释放它们的颗粒状内容物。
58.权利要求49的方法，其中所述固定干燥血细胞是固定干燥红细胞。
59.权利要求49的方法，其中所述活性剂包括抗病毒剂。
60.权利要求49的方法，其中所述活性剂包括凝血蛋白。
61.权利要求49的方法，其中所述活性剂包括抗凝血蛋白。
62.权利要求49的方法，其中所述活性剂包括核酸。
全文摘要
描述了携带活性剂的固定干燥血细胞，以及制备它的方法、使用它的方法和含有它的组合物。血细胞可以是红细胞或血小板。
文档编号A61K31/00GK1822765SQ200480020027
公开日2006年8月23日 申请日期2004年5月14日 优先权日2003年5月16日
发明者T·C·尼科尔斯, T·H·费希尔, M·S·里德 申请人:北卡罗来纳查佩尔山大学