与胰腺癌相关的抗原、针对它的抗体以及诊断和治疗方法

专利名称：：与胰腺癌相关的抗原、针对它的抗体以及诊断和治疗方法
背景技术：
：1、发明领域本发明的基础在于在胰腺腺癌细胞表面发现了一种特异性的抗原并发现了高特异性和选择性针对该抗原的单克隆抗体。抗原和针对它的抗体都可以用于在动物、特别是人中诊断和治疗胰腺癌。2、相关技术描述胰腺癌是一种几乎完全致命的疾病，被诊断患有该病的病人的中值存活时间只有80到90天。在美国，按照病人死亡的数量来说，胰腺癌也是最致命的癌症类型之一。从诊断之日算起，只有不到4％的病人能活5年，没人能活到大约7年。目前，尚没有能够鉴定体液或分泌物中胰腺癌特异性抗原的胰腺癌特异性标记物、胰腺癌特异性抗体或胰腺癌特异性分析方法。胰腺癌(PaCa)每年仅在美国就新夺去29000人的生命，因此占据了与癌症相关的死亡率序位的第四位，其一个原因是缺少早期的诊断工具。有效的早期诊断工具需要一种标记物，它应该特异性针对PaCa，并且可以在治疗性干预还来得及成功地阻止致命疾病的发展的时间内得到鉴定。目前，迫切需要能够在早期可治愈的阶段用于检测胰腺腺癌的性价比高的、非侵入性化验方法。在诊断时，只有8％的病人是局部病变，与此相比有远处病变的病人为51％(Jemal2003)；前者的5年存活率是17-30％，与此相比后者是2％(Jemal2003，Yeo，1995)。极高的死亡率、临床症状出现时85％的胰腺病灶的不可切除性、缺少有效的治疗方法、以及即使是小于2cm的病灶(通常是意外发现的)也可能已经转移或可能仍然具有高的致死率这样的事实，对发展用于早期诊断胰腺恶性肿瘤的化验方法提出了令人畏惧的挑战(Birkmeyer等1999，Russell1990，Nix等1991，Tsuchiya等1986)。据估计，用于胰腺腺癌的社会费用，仅仅是用于治疗就达每年26亿美元(Elixhauser和Halpern，1990)，这个数字还没有考虑损失的收入和其它受该病发病和致死所影响的因素。目前，唯一广泛使用的用于诊断胰腺腺癌以及监测疾病的进程和对治疗方法的反应的临床血清学化验是针对糖抗原19-9(CA19-9)的ELISA分析方法。CA19-9使用针对一个结肠腺癌细胞系抗原的单克隆抗体来检测(Koprowski等，1979)，它是一个唾液酸-乳酸-N-藻糖戊糖神经节苷脂(Magnani等，1982)，在许多胰腺腺癌中高水平表达，但是在正常胰腺、胆管和胃肠道的细胞中也存在(Arends1982，Rollhauser和Steinberg1998)。因此，这些组织的炎症或损伤将导致CA19-9流失到血液中，导致在正常的非肿瘤性的疾病如胰腺炎、肝硬化和阻塞性胆管炎中出现假阳性的升高(Rollhauser和Steinberg1998)。CA19-9ELISA的假阳性率据报道是从2％到54％(Jalanko等1984，Eskelinen和Haglund1999)，这使得CA19-9分析方法不能用于胰腺腺癌的早期筛查。此外，在一系列非胰腺恶性肿瘤包括胆管腺癌、肝细胞腺癌、胃肠道(结肠、胃、食道)腺癌和几种其它癌症中CA19-9的水平也升高(Steinberg1990，Maestranzi等1998，Carpelan-Holmstrom等2002)。CA19-9的灵敏度据报道当使用推荐的截止值37U/ml时为68％到93％(Steinberg1990，Jalanko等1984，Eskelinen和Haglund1999)。与检测不可切除的病灶相比检测可切除的病灶时灵敏度明显下降低；在一个代表性研究中，对后者的灵敏度是90％，在检测可切除的病灶时降低到74％(Safi等，1998)。CA19-9的寡糖链也定义了Lewisa血型抗原(Magnani等，1992)。大约10-15％的人群不表达该抗原(Tempero等，1987)，使得CA19-9在这部分人群中不仅不能用于早期诊断，而且不能通过CA19-9的降低或升高来监测对治疗方法的反应和疾病复发(例外的是有少数Lewisa阴性的病人在胰腺癌时表达CA19-9抗原(Yazawa等，1987；Takasaki等，1988；vonRosen等，1993))。另一个更近在胰腺腺癌细胞上发现的具有临床诊断上作为潜在的血清学标记物的分子靶是连接了磷脂酰肌醇的表面蛋白间皮素(mesothelin)(Chang等，1992)，它在绝大多数胰腺腺癌中过量表达(Argani等2001)。间皮素在正常的间皮细胞中表达，并且在95％的卵巢腺癌(从卵巢表面修饰的间皮细胞衍生的肿瘤)中、在间皮瘤以及大量的非小细胞肺腺癌、乳腺、子宫内膜、宫颈、胃和结肠腺癌中存在(Chang和Pastan，1994；Scholler等，1999)。一种被建议用于胰腺腺癌的早期检测的技术包括检测粪便样品中的畸变的DNA。该方法的创立是为了对结肠腺癌进行早期检测，在几个小型研究中被证明也可用于胰腺腺癌的检测(Caldas，1994)。检测一种对胰腺癌细胞具有特异性但是在正常组织中完全不表达、并且在其它组织中没有发现(或者仅发现有痕量)的抗原的血清学诊断分析方法，将被证明远比CA19-9免疫分析方法或间皮素标记物更为有效。本发明的基础在于发现了一种胰腺腺癌特异性的抗原，被命名为3C4-Ag(或PaCa-Ag1)。该抗原主要位于大鼠和人胰腺癌细胞的表面，到目前为止的测试中，除了在正常卵巢中有痕量外，还没有在正常的非转化的细胞中检测到。因此，本发明阐述了在胰腺癌检测和治疗领域的一个非常需要的进步。PaCa-Ag1抗原也存在于胰腺腺癌病人的血清和其它体液中。此外，本发明还涉及了特异性与PaCa-Ag1抗原结合的抗体。本发明还提供了该抗原和抗体在胰腺癌的诊断和治疗方法中的应用。发明简述在本发明中，以基本上被纯化的形式提供了胰腺腺癌特异性的抗原3C4-Ag(PaCa-Ag)。3C4-Ag的性质包括使用SDS-PAGE确定的分子量为大约43或43.5kDa，通过等电聚焦确定的pI为大约4.5到大约5.0，以及缺少显著的糖基化修饰。3C4-Ag主要位于大鼠和人的胰腺癌细胞的表面，在正常的非增殖性细胞中没有检测到。PaCa-Ag抗原也出现于胰腺癌病人的血清和其它体液中，但在健康的个体的血液或血清中没有出现。本发明也包含了3C4-Ag的免疫活性片段。此外还提供了对胰腺腺癌特异性抗原3C4-Ag具有结合特异性的抗体或其结合片段，其中该抗原的性质包括使用SDS-PAGE确定的分子量为大约43或43.5kDa，通过等电聚焦确定的pI为大约4.5到大约5.0，缺少显著的糖基化修饰，以及主要位于大鼠和人的胰腺癌细胞的表面和胰腺癌病人的血清中，在正常的非增殖性细胞或正常个体的血清中不能检测到。该抗体可以是单克隆的、也可以是多克隆的，还可以是人源化的形式。此外，该抗体可以用荧光团、化学发光团、化学荧光试剂、光敏剂、悬浮粒子、放射性同位素或酶进行标记。在另一个实施方案中，该抗体可以被结合或连接到诊断性的、治疗性的药物或毒素上。本发明还提供了能够产生与3C4-Ag抗原发生特异性免疫反应的单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞系。另一方面，本发明提供了在试验动物中检测胰腺癌的方法。该方法包括下列步骤(a)将来自受试者的细胞、组织或体液样品，与至少一种能够与3C4-Ag或其具有免疫活性的片段特异性结合的抗体或其结合片段、单克隆抗体mAb3C4、或者能够与单克隆抗体mAb3C4所结合的表位相结合的抗体、或与3C4抗原蛋白的另一个表位结合的抗体，在允许该抗体与样品中的抗原特异性结合以形成抗体-抗原复合物的条件下相接触；(b)检测样品中的抗体-抗原复合物；以及(c)将样品中检测到的与对照样品相比抗体-抗原复合物水平的升高与胰腺癌的出现相关联。在本发明的另一个实施方案中，提供了适合于检测病人细胞、组织或体液样品中的3C4-Ag的诊断试剂盒。该试剂盒可以包含多种不同的成分，例如(a)与3C4-Ag或其具有免疫活性的片段特异性结合的抗体或其结合片段，(b)抗体或其结合片段的特异性结合配体的结合物，以及(c)用于检测结合抗体的标记物。另一方面，本发明提供了治疗病人的胰腺癌的方法。该方法包括了给病人使用有效剂量的与3C4-Ag或其具有免疫活性的片段特异性结合的抗体或其结合片段的步骤，其中该抗体或其结合片段与治疗性的药物或毒素结合或连接。此外还提供了药物组合物，其中含有与3C4-Ag特异性结合的抗体或其结合片段，并与可药用的载体相混合。在药物配方中，与3C4-Ag特异性结合的抗体或其结合片段可以结合或连接到治疗性的药物或毒素上。附图简述图1A到1F是显示了NNK在BMRPA1细胞中诱导的形态学变化的显微照片。图1A显示了未处理的BMRPA1细胞的正常外观。图1B到1F显示了在用NNK对BMRPA1进行了一次16小时的处理后细胞的连续传代(1-12)。图2A到2C是免疫荧光(IF)染色的显微照片，分别为用ISHIP小鼠血清(A)、3C4杂交瘤废培养基(B)染色的活BMRPA1.NNK细胞和用3C4杂交瘤废培养基染色的正常的未转化的BMRPA1细胞(C)。在图2B中以线性的环状荧光图清楚地显示了3C4-Ag在BMRPA1.NNK细胞表面的表达，而BMRPA1细胞完全没有任何染色。图3的1-4道是从腹水中通过G蛋白亲和纯化的mAb3C4在染色的SDS-PA凝胶上电泳的照片。1道注射了杂交瘤的小鼠腹水；2道低pH洗脱液，其中IgG被定量地从凝胶珠上释放出来。第3道显示了第2道还原的大约160kD的蛋白(IgG)。道1B和2B描述了使用HRP-SaMIgG和ECL反应试剂盒对第1道和第2道的IgG进行的免疫杂交和放射自显影照片(化学发光成像照片)，证实了约160kD的蛋白是IgG。图4是放射自显影照片，显示了来自啮齿动物和人的胰腺腺癌细胞的细胞裂解液蛋白进行SDSPAGE，然后用mAb3C4进行免疫杂交。图5A是凝胶照片，显示了不用mAb3C4(道1)以及用mAb3C4和蛋白G珠子(道2)处理BMRPA1.NNK细胞的裂解液的银染结果。图5B是对从图5A(BMRPA1.NNK细胞)的裂解液中获得的免疫沉淀物进行的3C4-Ag免疫杂交。道1为不用mAb3C4处理、用mAb3C4和HRP-SαMIgG进行免疫杂交获得的免疫沉淀物；道2是用mAb3C4处理、用mAb3C4和HRP-SaMIgG进行免疫杂交，鉴定到3C4-Ag是43kD的多肽；道3是用mAb3C4处理、不用mAb3C4但用HRP-SaMIgG进行的免疫杂交。图6A、6C、6E、6G和6I是用mAb3C4染色的啮齿动物和人的活胰腺腺癌细胞的相差可见光显微照片。图6B、6D、6F、6H和6J是经过同样的处理并显示了膜荧光的紫外光照片。图6A和6BBMRPA1.NNK细胞；图6C和6DBMRPA1.TUC3细胞；图6E和6FCAPAN-1细胞；图6G和6HCAPA2-2细胞；6I和6J是BxPC3细胞。6A-6D是啮齿动物胰腺腺癌细胞。6E-6J是人胰腺腺癌细胞。图7显示了转化的和未转化的啮齿动物和人的PaCa细胞的荧光活化细胞分类(FACS)分析。(A)BMRPA1.Tuc3；(B)BMRPA1.NNK；(C)人的MIAPaCa。左边的图是指示根据mAb3C4的结合所测量的细胞群的散点图。右边的图显示了选定的细胞群的荧光强度。标记的峰(1)指示了只用FITC-RαMIgG(没有第一抗体)处理的细胞得到的背景荧光(背景对照)；峰(2)指示了细胞与mAb3C4和FITC-RαMIgG反应得到的荧光。图8图示了mAb3C4在存在活性补体的情况下的细胞毒性。X轴兔血清(补体)稀释度；Y轴在暴露到mAb3C4和兔补体后存活的细胞的百分数。每组的第一个条显示了只用新鲜的兔血清(活性补体的来源)在37℃处理细胞45分钟。每组的第二个条代表了用mAb3C4和新鲜的兔血清(活性补体的来源)在37℃处理了45分钟的细胞。每组的第三个条代表了用mAb3C4然后用热灭活(56℃30-45分钟)的兔血清(灭活的补体)处理的细胞。图9A和9B是使用mAb3C4对组织提取物进行的免疫杂交；图9A大鼠；图9B人。来自不同组织(胸腺、卵巢、脑、心脏、肺、肝脏、睾丸，图9A)以及人的胰腺腺泡细胞、白细胞和胰腺导管细胞的提取物中的被还原的蛋白在12％的SDSPAGE上分离，电转移到硝酸纤维素上，然后用或不用mAb3C4处理，接着用ECL化学发光放大。MIA-PaCa和小鼠IgG用作对照。“+”意味着与初级mAb反应。“-”意味着与初级mAb无反应。MIA-PaCa和小鼠IgG用作阳性对照。“*”表明组织提取物是在含有TritonX-100的裂解缓冲液中通过Dounze匀浆获得的。“#”表明表明组织提取物是在含有TritonX-100的裂解缓冲液中通过高频脉冲超声获得的。图10显示了不同的癌化人组织使用mAb3C4进行免疫杂交的放射自显影照片。图11是BMRPA1.NNK细胞裂解物中的蛋白通过二维凝胶电泳(2-D-Gel)按照大小和等电点分离的凝胶照片，通过银染鉴定。图12是化学发光照片，显示了BMRPA1.NNK细胞裂解物中的蛋白通过图11中所描述的二维凝胶电泳分离，电转移到PVDF膜上然后用mAb3C4进行的杂交。箭头指示了3C4抗原的位置。图13图示了体内使用mAb3C4对肿瘤生长的影响。图14A-14F是说明了用mAb3C4进行间接的免疫荧光染色的紫外光照片；14A是活的啮齿动物BMRPA1.NNK细胞；14B是正常的未转化的BMRPA1细胞；14C是BMRPA1.TUC3细胞；14D是CAPAN-1，14E是CAPAN-2；14F是BxPC3细胞；14A-C是啮齿动物胰腺腺癌细胞，14D-F是人的胰腺腺癌细胞。这些图清楚地表明了膜限制PaCa-AG1-mAb3C4复合物的形成。A、B、D、E，细胞在悬浮液中染色C、F，黏附细胞。图15A和15B是结合到不用(A)和用(B)胰蛋白酶处理的BMRPA1.TUC3细胞上的PaCa-Ag1的mAb3C4的FACS分析。A中的开口的峰是非特异性的IgG染色(背景)。图16A和16B分别是SDSPAGE凝胶和免疫杂交的照片，表明PaCa-Ag1的酶促脱糖基化不改变多肽的分子量(图16B)。图16A是对照，显示了平行的胎球蛋白(大约51kD)的脱糖基化产生了较小的43-45kD的多肽，表明了在平行地用于PaCa-Ag1蛋白的脱糖基化中的保温条件下酶的活性是完整的。图17A到17D图示了PaCa-Ag1的一个抗体-抗原吸附ELISA。图18是来自被证实患有胰腺癌的病人和健康的志愿者的血清蛋白与mAb3C4的免疫杂交图。2、3、4道上样了来自3个胰腺癌病人的分别的血清样品。这些道中的箭头指示了mAb3C4与大约36-38kD的多肽的反应产物。5道上样了来自健康的志愿者的血清样品。6道上样了添加等量的第3道病人的PaCa-Ag1阳性血清的健康志愿者的样品。6道中的箭头指示36-38kD的产物。发明详述本发明涉及胰腺腺癌特异性的抗原和特异性与其结合的抗体。胰腺腺癌特异性的抗原(胰腺癌相关抗原)，在本文中可以与3C4-Ag或PaCa-Ag1互换使用，其分子量用SDS聚丙烯酰胺电泳(SDSPAGE)测定为大约43到43.5kDa，主要位于胰腺癌细胞的表面。3C4-Ag在正常的非增殖的细胞中没有检测到，只在肾、前列腺和可能结肠腺癌中检测到非常低的水平。本发明还涉及了可溶形式的3C4-Ag(PaCa-Ag1)，它存在于胰腺癌病人的血清或其它体液中，并可从中分离，其分子量大约为35kDa。3C4-Ag最初是通过间接的免疫荧光(IF)作为细胞表面抗原在完整的活的胰腺癌细胞和完整的固定的胰腺癌细胞(大鼠和人细胞系)上被鉴定到的，使用了小鼠的单克隆抗体mAbC4作为第一抗体，然后通过荧光标记的绵羊或兔抗小鼠IgG(FITC-S或Ranti-MIgG)和荧光显微镜来鉴定的。单克隆抗体mAb3C4是使用免疫减除超免疫法(ISHIP)产生的，该方法在申请者的临时专利申请中进行了完全的描述，该申请标题为“耐受诱导的定向抗体生产(TITAP)”，美国系列号60/413703，2003年1月29日提交，其公开的内容在此以其全文引为参考，如同在此完全地提出一般。按照ISHIP方案，环磷酰胺在小鼠中诱导了对出现在未转化的大鼠胰腺细胞(BMRPA1细胞)上的抗原的耐受性，然后用使用已知的致癌物4-(甲基-亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮进行致瘤转化的BMRPA1细胞(在后文中称为BMRPA1.NNK细胞)接着进行超免疫，导致分泌针对BMRPA1.NNK细胞的抗体的浆细胞向小鼠的脾脏的迁移增强。然后将免疫的小鼠的脾细胞与P3U1骨髓瘤细胞融合，产生了能够分泌与BMRPA1.NNK表面的胰腺癌相关抗原(3C4-Ag)进行特异性反应、但不与未转化的细胞反应的抗体的杂交瘤。本发明提供了基本上是纯化形式的胰腺腺癌特异性抗原3C4-Ag。3C4-Ag的特征在于使用SDS-PAGE确定的分子量为大约43或43.5kDa；通过等电聚焦确定的pI为大约4.5到大约5.0；并且缺少显著的糖基化修饰；在50mMTris-HCl，1％NP40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，5mMEDTA，1μg/ml胃蛋白酶抑制剂，2μg/ml抑蛋白酶肽，1mMPMSF和5mM碘乙酰胺中可以溶解；主要位于大鼠和人的胰腺癌细胞的表面，在正常的非转化的细胞中没有检测到。此外本发明还提供了对胰腺腺癌特异性抗原3C4-Ag具有结合特异性的抗体，其中该抗原的特征在于使用SDS-PAGE确定的分子量为大约43或43.5kDa；通过等电聚焦确定的pI为大约4.5到大约5.0；在50mMTris-HCl，1％NP40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，5mMEDTA，1μg/ml胃蛋白酶抑制剂，2μg/ml抑蛋白酶肽，1mMPMSF和5mM碘乙酰胺中可以溶解；以及主要位于大鼠和人的胰腺癌细胞的表面和胰腺癌病人的血清中，在正常的非转化的细胞中不能检测到。与3C4-Ag特异性结合的该目标抗体可以是单克隆的、也可以是多克隆的抗体。在优选的情况下，抗体是单克隆抗体(mAb)。在更优选的情况下，mAb是3C4。上述的抗体对胰腺腺癌特异性抗原3C4-Ag也具有结合特异性，其中该抗原是可溶的形式，并且可以从胰腺癌病人的血清或其它体液中分离。还提供了产生能够同3C4-Ag进行特异性免疫反应的单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞系。在优选情况下，鼠杂交瘤细胞系产生mAb3C4。胰腺癌相关抗原3C4-Ag可以使用多种现有的方法来制备。使用免疫减除杂交或RNA差异显示方法可以鉴定3C4-Ag并获得其基因序列。在特定的宿主细胞中起作用的启动子控制下的编码3C4-Ag的基因可以用来转染该种宿主细胞以表达抗原。此外，3C4-Ag也可以使用现有的方法进行化学合成。胰腺癌相关抗原3C4-Ag可以使用本领域现有的方法来纯化，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE；参见例如Harrington，M.C.(1990)MethodsEnzymol.，182488-495)和孔径排阻层析。其它的纯化技术也可以使用，例如使用与3C4-Ag结合的抗体如mAb3C4的免疫亲和层析。这样的方法在本文的实施例8中有示例。在SDSPAGE之后，大约为43kDa的3C4-Ag带可以从凝胶中切下，洗脱到适当的缓冲液中。3C4-Ag的进一步纯化可以利用例如凝胶过滤、离子交换层析和/或高效液相色谱(HPLC)。HPLC是优选的纯化方法。纯化的3C4-Ag或其免疫活性片段可以被用来接种动物，以产生与3C4-Ag反应的多克隆抗体。“免疫活性片段”是指大约43或43.5kDa的3C4-Ag蛋白的片段，该片段足够刺激抗体的产生，该抗体当3C4-Ag暴露在胰腺癌细胞表面时能够与3C4-Ag暴露的表位进行特异性反应，或能够与可以从胰腺癌病人的血清或其它体液中分离出来的可溶性的3C4-Ag反应。因此，除了mAb3C4，本发明还设想了其它的多克隆或单克隆抗体，它们与3C4-Ag或其免疫活性片段发生特异性反应，这些抗体可以结合也可以不结合到3C4-Ag上与mAb3C4结合的同样的表位上。动物如哺乳动物例如小鼠、山羊、大鼠、绵羊或兔，或其它的动物例如禽类如雏鸡，可以用3C4-Ag或其免疫活性片段进行接种，在优选情况下将它们与适当的载体蛋白结合，以产生多克隆抗体。这样的免疫接种如果需要可以以最多几个星期的间隔重复进行，以获得足够滴度的抗体。从动物收集血液以确定抗体是否产生，抗血清被检测对3C4-Ag或其免疫活性片段的反应，然后如果需要则进行加强。在某些情况下，在最后一次抗原加强后，将动物处死并取出脾脏细胞。从免疫的动物获得的血清中纯化免疫球蛋白。这些免疫球蛋白然后可以用于诊断性免疫分析，以检测样品中抗原的存在，也可以用于治疗。在优选情况下，制备与3C4-Ag或其免疫活性片段特异性反应的单克隆抗体。生产单克隆抗体的方法在本
技术领域：
内是现成的，例如在Kohler和Milstein(1975)Nature256495-497中所描述的方法，在此以其全文引为参考。例如，动物可以用3C4-Ag或其免疫活性片段进行免疫，然后从免疫的动物获得脾脏细胞。然后将分泌抗体的淋巴细胞与骨髓瘤细胞或能够在细胞培养中无限制复制的转化的细胞进行融合。获得的杂交瘤可以被培养，在产生的克隆中筛选能够产生所需的单克隆抗体的克隆。产生抗体的克隆可以在体内也可以在体外生长以产生大量的抗体。杂交瘤细胞系可以在体外增殖，含有高浓度的mAb(例如mAb3C4)的培养基通过倾析、过滤或离心来收获。此外，该抗体例如mAb3C4的样品可以被注射到组织相容的动物种类中，该动物用于为最初的融合提供体细胞和杂交瘤细胞，例如小鼠。在注射的动物中发展出分泌mAb的肿瘤，该动物的体液例如腹水、体液或血浆产生高浓度的mAb。使用标准的现有技术，例如使用聚乙二醇(PEG)或其它的融合试剂例如在Milstein和Kohler(1976)Eur.J.Immunol.6511，Brown等(1981)J.Immunol.127(2)539-46，Brown等(1980)J.Biol.Chem.，2554980-83和Yeh等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.(USA)76(6)2927-31中所描述的那些，这些文献在此以其全文引为参考，进行与哺乳动物骨髓瘤细胞或其它能够在细胞培养中无限复制的融合配体的融合是有效的。这样的永生细胞系优选来自小鼠，但是也可以来自其它哺乳动物物种例如大鼠和人的细胞。在优选情况下，细胞系缺少利用某种营养所需的酶，能够快速生长，具有良好的融合能力。这样的细胞系对于本领域的专业技术人员来说是熟知的。纯化单克隆抗体的方法包括硫酸铵沉淀、离子交换层析和亲和层析，例如在Zola等的《单克隆杂交瘤抗体技术与应用》，Hurell主编，5-52页(CRC出版社1982)中描述的方法，该文献在此以其全文引为参考。如同在本申请实施例7中描述的那样，可以用3C4杂交瘤细胞注射小鼠，然后收集腹水。mAb3C4可以从腹水中使用G蛋白亲和珠纯化。在用适当的缓冲液冲洗珠子后，结合的mAb3C4可以用洗脱缓冲液从珠子上洗脱下来，通过简单的离心与珠子分开。除了利用完整的抗体之外，本发明的方法还包括了能够与3C4-Ag或其免疫活性片段特异性结合的抗体的结合片段的使用。这样的结合片段包括Fab片段、F(ab’)2片段和Fc片段。这些抗体片段可以通过常规的步骤制备，例如在Goding的《单克隆抗体原理与实践》，98-188页，纽约学术出版社(1983)中所描述的蛋白水解片段化步骤，该文献在此以其全文引为参考。本发明还提供了在病人中检测胰腺癌的诊断方法。该诊断方法是基于免疫分析方法，通过与特异性结合3C4-Ag或其免疫活性片段的抗体的反应来检测病人样品中胰腺腺癌特异性抗原(3C4-Ag)的存在。病人样品源的例子包括细胞、组织、组织裂解液、组织提取物或从来自血液的样品(如血液、血清或血浆)、尿液或粪便。在优选情况下样品是体液。优选的体液样品是血清，但是也可以是其它的体液例如胸膜液或腹水。样品中检测到的3C4-Ag水平的增加与病人中胰腺癌的诊断相关。有许多不同类型的免疫分析方法可用于本发明的方法。任何众所周知的免疫方法都可以被改编以检测病人的血清样品或其它样品中与特异性结合3C4-Ag的抗体发生反应的3C4-Ag的水平，例如酶联免疫吸附分析(ELISA)、荧光免疫吸附分析(FIA)、化学偶联免疫吸附分析(CLIA)、放射性免疫分析(RIA)和免疫杂交(IB)。对于可以使用的不同免疫分析方法的综述，可以参见《免疫分析手册》，DavidWild主编，Stockton出版社，纽约，1994；Sikora等主编《单克隆抗体》，32-52页，Blackwell科学出版社(1984)。例如，检测病人胰腺癌的免疫分析方法包括将来自病人的样品与第一抗体或其结合片段(例如mAb3C4)接触，该抗体或其结合片段在优选情况下是可溶的，可以与样品中的3C4-Ag形成抗体-抗原复合物而被检测。该复合物与能够识别第一抗体重链恒定区的第二抗体接触。例如第二抗体可以是能够识别与mAb3C4反应的小鼠免疫球蛋白的重链恒定区的抗体(抗小鼠抗体)。第二抗体用荧光团、化学发光团、化学荧光试剂、光敏试剂、悬浮微粒或放射性同位素标记。将游离的标记的第二抗体与结合的抗体分开。然后根据所用的信号产生系统测量样品所产生的信号。与来自正常病人的样品相比光密度或放射活性的增加与病人中胰腺癌的诊断相关联。此外，酶标的抗体例如β-半乳糖苷酶标记的抗体也可以使用，加入标记的酶可以与其反应的适当的底物，然后保温。可以使用现有的连接方法将酶与本发明的方法中使用的3C4-Ag反应性抗体进行共价连接。例如，碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶可以使用戊二醛连接到抗体上。辣根过氧化物酶也可以使用高碘酸方法来连接。用于将酶与抗体连接的商品化的试剂盒可以广泛地获得。酶联的抗人和抗小鼠免疫球蛋白特异性抗体可以从多个商业化来源获得。酶标的抗体依赖于底物可以产生不同的信号源。信号的产生包括向反应混合物中加入底物。常用的过氧化物酶的底物包括ABTS(2，2’-吖嗪双(乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯)、OPD(o-苯二胺)和TMB(3，3’，5，5’-四甲基对二氨基联苯)。这些底物需要过氧化氢的存在。对硝基苯基磷酸酯是常用的碱性磷酸酶的底物。在保温过程中，酶逐渐将一部分底物转化为最终的产物。在保温过程结束时，加入能够终止酶活性的终止试剂。通过测量光密度来测定信号的强度，这通常是通过分光光度计来进行的。碱性磷酸酶标记的抗体也可以通过荧光光度法来测量。因此，在本发明的免疫分析中，可以使用底物4-甲基伞基磷酸酯(4-UMP)。碱性磷酸酶将4-UMP脱磷酸化，形成4-甲基伞形酮(4-MU)这种荧光发色团。入射光是365nm，发射光是448nm。作为酶标抗体的替代物，荧光化合物例如荧光素、若丹明、藻红蛋白、靛青、生物素、藻青蛋白、青色素5、青色素5.5、青色素7、青色素3、氨基甲基香豆素(AMCA)、多甲藻素叶绿素、光谱红或德克萨斯红可以被化学连接到抗体上而不改变它们的结合能力。当用特定波长的光照射进行活化后，荧光团标记的抗体吸收了光的能量，在分子中诱导了可激发状态，然后发射出具有特征颜色的光，可以用光学显微镜检测到。象在EIA中那样，将荧光标记的抗体与第一抗体-半抗原复合物结合。在将未结合的试剂洗掉后，再将剩下的三体复合物暴露到适当波长的光下。观察到的荧光表明了所需半抗原的存在，在此处是指3C4-Ag。免疫荧光和EIA技术在本领域内都是非常成熟的技术，对于本发明的方法特别适合。但是，其它的报告分子例如放射性同位素、化学发光试剂或生物发光分子也可以使用。对于熟练的技术人员来说，如何改变一个步骤以适应于所需的目的是相当明显的。目标抗体也可以用一组能够与抗体结合的二级标记配体来检测。例如，使用常规的技术，可以将生物素连接到按照本发明产生的抗体上。然后将生物素化的抗体与3C4-Ag接触并结合。然后将用已知标记物标记的链亲和素或亲和素与抗体/3C4-Ag复合物接触，导致标记的链亲和素或亲和素与生物素化的抗体的生物素部分结合。可以加入过量的生物素，然后加入更多的标记的链亲和素或亲和素。因为每个链亲和素或亲和素分子能够结合四个生物素分子，因此产生了包括大量标记物的相对大的三维网络，这些标记物可以通过常规的荧光显微技术或射线照相技术检测。其它的免疫分析技术也可以用在本发明中，可以参见美国专利Nos.4016043、4424279和4018653。这当然包括了单点的和双点的或“夹心”式的非竞争类型的分析方法，以及上述的传统的竞争性结合分析方法。存在许多对夹心分析技术的修饰，它们都被包含在本发明中。在典型的正向夹心分析中，对3C4-Ag或其免疫活性片段具有特异性的第一抗体被共价地或被动地结合到固体表面上。固体表面一般是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固相支持物可以采取管、珠、碟或微孔板的形式，或任何其它适合于进行免疫分析的表面。结合过程在本
技术领域：
内是众所周知的，一般包括将分子交联、共价结合或物理吸附到不溶性的载体上。结合后，洗涤聚合物-抗体复合物以制备测试样品。然后将被测试的样品的等份试样加到固相复合物中，保温足够的时间以使抗体结合。保温时间长短不固定，但是一般在大约2到40分钟的范围内。保温后，抗体亚基固相被洗涤、干燥，然后与特异性针对半抗原片段的第二抗体一起保温。第二抗体上连接有报告分子，用于指示第二抗体与半抗原的结合。对正向分析方法的修饰包括同步分析，其中样品和标记的抗体同时被加入到结合抗体中，或一个反向的分析，其中标记的抗体与测试样品首先混合、保温，然后加入未标记的表面结合抗体。这些技术对于本领域的专业技术人员来说是众所周知的，做出少量的改动对于本领域的专业技术人员来说是相当简单的。适用于将标记物与抗体连接的交联剂是广为人知的。同单功能或异双功能的交联剂都适合。可以与交联剂交联的反应基团包括一级胺、巯基、羰基、糖类和羧酸。可以获得具有不同长度隔离臂或桥的交联剂。适合与一级胺反应的交联剂包括同双功能的交联剂例如亚氨酸酯和N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯。具有两个或多个不同反应基团的异双功能交联剂适合用于本发明。其例子包括在一端具有氨基反应性在另一端具有巯基反应性的交联剂例如4-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-(2-吡啶基二硫基)-甲苯、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯和马来酰亚胺交联剂。反应中存在的颜色、荧光、化学发光或放射活性(依赖于所用的信号产生系统)的量与病人样品中与目的抗体如mAb3C4反应的3C4-Ag的量成正比。光密度的定量可以使用分光光度法来进行。放射性标记信号的定量可以使用闪烁计数来进行。与目的抗体如mAb3C4反应的3C4-Ag的水平高于正常组织的水平，可以与病人中胰腺癌的诊断相关联。本发明还提供了用于进行前面描述的方法的试剂盒。在一个实施方案中，诊断试剂盒包括(1)与3C4-Ag或其免疫活性片段特异性结合的抗体或其结合片段，(2)抗体的特异性结合配体的结合物，以及(3)用于检测结合抗体的标记物。在优选实施方案中，与3C4-Ag特异性结合的抗体是mAb3C4。mAb3C4的特异性结合配体的结合物的例子是特异性结合mAb3C4的抗体。如果标记物是酶，那么含有酶的底物的第三个容器可以被提供。试剂盒也可以包含其它成分例如缓冲试剂和蛋白稳定试剂，如多糖等。此外，该试剂盒可以包含信号产生系统的其它试剂，例如减少背景干扰的试剂、对照试剂和适合于进行诊断测试的成分。这样的组合可以包括例如固体表面，如玻璃或聚合物，如纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固相支持物可以采取管、珠、碟或微孔板的形式，或任何其它适合于进行免疫分析的表面。本发明的抗体也可用于体内诊断应用，以检测胰腺肿瘤，优选为人的胰腺肿瘤。例如，胰腺肿瘤可以通过肿瘤成像技术来检测，使用用产生可检测的信号的适当的成像试剂标记的mAb3C4。成像试剂以及用这些试剂标记抗体的方法是现有的。参见例如Wensel和Meares，《放射免疫成像和放射免疫疗法》，Esevier，纽约(1983)；Colcher等，Meth.Enzymol.121802-816(1986)。标记的抗体然后可以通过例如射电核扫描来检测，该方法在Bradwell等《用于癌症检测和治疗的单克隆抗体》，Baldwin等编辑，65-85页，Academic出版社(1985)中有描述。本发明还提供了治疗患有胰腺癌的病人的治疗方法。例如，mAb3C4可以单独使用来定位肿瘤细胞，也可以与适当的治疗试剂结合使用以治疗胰腺癌。当与3C4-Ag或其免疫活性片段结合的抗体被单独使用时，这种治疗可以通过起始内源的宿主免疫功能、例如补体介导的或抗体依赖性的细胞内细胞毒性(ADCC)而发挥效力。ADCC涉及在存在人淋巴细胞或巨嗜细胞的情况下能够杀死肿瘤细胞、或在存在人类补体的情况下变成对肿瘤细胞具有细胞毒性的抗体。为了引发ADCC，可以对本发明的与AC4-Ag进行特异性反应的抗体进行修饰，这可以使用为生产嵌合抗体所发展的技术，这在Oi等，(1986)Biotechnologies4(3)214-221；和Fell等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA868507-8511中有描述。在优选实施方案中，特异性结合3C4-Ag或其免疫活性片段的抗体可以结合或连接到治疗药物或毒素上，以将治疗药剂投送到癌症位点上。具有酶活性的毒素及其片段包括但不限于diptheria毒素A片段、diptheria毒素的非键合活性片段、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的外毒素A、篦麻毒素的A链、红豆毒素的A链、modeccin的A链、α-sacrin、某些Aleuritesfordii(油桐)蛋白、某些Dianthin蛋白、Phytolaccaamericana蛋白(PAP、PAPII和PAP-S)、Morodicacharantia抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、Saponariaofficinalis(肥皂草)抑制剂、gelonin、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素、和紫杉醇的衍生物(包括人工合成的衍生物)等。国际专利申请WO84/03508和WO85/03508描述了这些免疫毒素具有酶活性的多肽的制备方法，在此以其全文引为参考。其它的细胞毒性基团包括但不限于那些从阿霉素、苯丁酸氮芥、道诺霉素、氨甲蝶呤、新制癌菌素和铂得到的基团。将苯丁酸氮芥与抗体偶联的方法在Flechner(1973)EuropeanJ.Cancer9741-745；Ghose等(1972)BritishMedicalJ.3495-499，以及Szekerke等，(1972)Neoplasma19211-215中有描述，在此以其全文引为参考。将道诺霉素和阿霉素与抗体偶联的方法在Hurwitz等(1975)CancerResearch351175-1181和Arnon等(1982)CancerSurveys1429-449中有描述，在此也引为参考。制备抗体-篦麻毒素连接物的方法在美国专利No.4414148和Osawa等(1982)CancerSurveys1373-388以及其引用的参考文献中有描述，在此以其全文引为参考。欧洲专利申请86309516.2也描述了偶联的方法，在此以其全文引为参考。最近已经发现一组多肽对胰腺癌细胞有特别的细胞毒性。参见共同待决的2003年3月12日提交的美国专利申请系列号10/386737，以及其中引用的应用(2002年3月12日提交的美国临时专利申请系列号60/363785，2001年4月5日提交的美国系列号09/827683，以及2000年4月5日提交的美国系列号60/195102)，其公开的内容在此以其全文引为参考。这些毒性肽包含了p53蛋白中的一段氨基酸序列。p53蛋白是一个393个氨基酸的蛋白，是细胞周期的重要调控者。p53蛋白的缺失与细胞转化和恶性疾病有关联。Haffner，R&Oren，M.(1995)Curr.Opin.Genet.Dev.584-90。如同在美国系列号10/386737及其引用的专利申请中描述的那样，对胰腺癌细胞有毒的肽可以从具有下列氨基酸序列的肽衍生而来PPLSQETFSDLWKLL(SEQIDNO1)。在优选情况下，肽含有SEQIDNO1提出的氨基酸序列或其类似物或衍生物中至少大约6个连续的氨基酸。这样的肽的例子包括PPLSQETFSDLWKLL(SEQIDNO1)或其类似物或衍生物，PPLSQETFS(SEQIDNO2)或其类似物或衍生物以及ETFSDLWKLL(SEQIDNO3)或其类似物或衍生物。因此，本发明提供了特异性结合PaCa-AgI的抗体或其免疫活性片段，这些抗体结合或连接到至少一个上述的肽(SEQIDNOs1-3，或其类似物或衍生物)上。在优选情况下，为了改善通过赘生性细胞膜的运输，在肽或其类似物或衍生物的羧基末端加上前导序列。在优选情况下，前导序列含有主要带正电荷的氨基酸残基。可以用于本发明的前导序列的例子包括但不限于penetratin、Arg8、HIV1的TAT、D-TAT、R-TAT、SV40-NLS、核质蛋白-NLS、HIVREV(34-50)、FHV外壳(35-49)、BMVGAG(7-25)、HTLV-IIREX(4-16)、CCMVGAG(7-25)、P22N(14-30)、LambdaN(1-22)、DeltaN(12-29)、酵母PRP6、人U2AF、人C-FOS(139-164)、人C-JUN(252-279)、酵母GCN4以及pvec。在优选情况下，前导序列是来自anntennapedia蛋白的penetratin序列，其具有氨基酸序列KKWKMRRNQFWVKVQRG(SEQIDNO4)。在优选实施方案中，提供了治疗胰腺癌的治疗组合物，其中含有如前所述的对胰腺腺癌特异抗原3C4-Ag(PaCa-Ag1)具有结合特异性的抗体或其结合片段，其中的抗体或其结合片段结合或连接到具有SEQIDNO3所提出的氨基酸序列的肽上，其中的具有SEQIDNO3所提出的氨基酸序列的肽的羧基端连接到具有SEQIDNO4所提出的氨基酸序列的penetratin前导序列上。针对3C4-Ag的抗体及其结合部分也可以用于药物/药物前体的治疗方式中。例如，本发明的第一抗体或其结合片段与药物前体连接，该药物前体只有在非常靠近药物前体激活剂的情况下才被激活。药物前体激活剂与第二抗体或其结合片段连接，在优选情况下结合到胰腺癌细胞或其它与胰腺癌细胞相关的生物材料、如患病的胰腺细胞产生的另一个蛋白上。参见例如Senter等(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.(USA)854842-46；以及Blakely等，(1996)CancerRes.563287-3292，二者都引为参考。此外，抗体或其结合片段可以偶联到高能的辐射体上，例如放射性同位素如131I、γ辐射体，当它们定位到肿瘤位点后，可以产生几个细胞直径的杀伤力。参见例如Order的《用于癌症检测和治疗的单克隆抗体》，Baldwin等编，303-16页，Academic出版社，(1985)。67Cu也是有效的，可以通过适当的能与抗体结合的金属鏊合剂与目标抗体结合。其它适用的放射性同位素包括α粒子辐射体例如212Bi、213Bi和211At以及β粒子辐射体例如186Re和90Y。为了用于治疗，对鼠抗体来说嵌合的(小鼠-人)人源化单克隆抗体可能是优选的，因为用小鼠抗体治疗的人类患者倾向于产生抗小鼠的抗体。抗体可以通过设计和合成组合的可变区来“人源化”，这些组合的可变区含有整合到人抗体可变区的框架区(FRs)中的小鼠互补决定区(CDRs)的氨基酸。产生的抗体保留了最初的小鼠抗体的特异性和结合亲和性，但是足够的人源化，以致于病人的免疫系统不会将这些抗体识别为外源的。将小鼠单克隆抗体进行人源化的技术包括例如在Vaswani等，(1998)Ann.AllergyAsthmaImmunol.81105-119和Studnicka等的美国专利No.5766886中所描述的那些，在此以其全文引为参考。另一方面，本发明还提供了含有人科赛奇腺病毒受体的外质区和特异性针对前述的PaCa-Ag1的抗体的可变区的真核表达载体。该表达载体可用于对病毒载体例如Ad载体进行重新定向，以便增加组织特异性的感染能力。基于使用双特异性连接物或显示在病毒表面的单链抗体、即被定向到一种病毒成分的抗体和定向抗体或配体之间的连接物的免疫重新定向策略在本
技术领域：
内是现有的。参见例如Douglas等，1996；Weitmann等1992；和Hammond等，2001，在此以其全文引为参考。本发明还提供了可用于前述的治疗方法的药物配方。药物配方含有药物有效量的特异性识别和结合3C4-Ag或其免疫活性片段的抗体或其结合片段，以及可药用的载体。可药用的载体的例子包括灭菌的液体如水和油，加上或不加表面活性剂和其它药物学和生理学上可接受的载体，包括佐剂、赋形剂或稳定剂。油的例子包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油或矿物油。一般来说，水、盐水、葡萄糖水溶液和相关的糖的溶液，以及二醇例如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体载体，特别是对于可注射的溶液来说。人血清白蛋白、离子交换剂、矾土、卵磷脂、缓冲物如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾以及盐或电解质如硫酸鱼精蛋白也可以使用。因此该药物配方含有特异性结合3C4-Ag或其免疫活性片段的抗体或其结合片段，它们或者未修饰地与治疗试剂(例如前述的药物、毒素、酶或第二抗体)连接，或者采取重组的形式例如嵌合的抗体。为治疗胰腺癌，药物配方还可以含有其它的抗体或连接物，例如抗体混合物。不论本发明的抗体或其结合片段是用于胰腺癌的治疗还是体内检测，它们都可以通过口服、肠胃外、皮下、静脉内、淋巴内、肌肉内、腹膜内、鼻内滴注、腔内或膀胱内滴注、动脉内、病灶内给药，或在外科手术过程中应用于组织的表面(包括肿瘤表面或直接用于肿瘤内)。本发明的抗体可以单独给药，也可以与前述的药物学或生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂一起使用。该抗体可以以固体或液体的形式，例如片剂、胶囊、粉剂、溶液、悬浮液、乳剂、聚合的微胶囊或微泡、脂质体以及可注射或可注入的的溶液。本发明的抗体配方的有效给药状态和剂量使用方式主要依赖于病人的年龄、体重和疾病的进展状态。因而对于具体的病人剂量应该定制。一般来说，本发明的抗体制剂的有效剂量可以在大约1到大约5000mg/m2的范围内。下面的实施例对本发明进行了说明，但并不对其范围进行任何的限制。实施例1通过胰腺细胞系BMRPA.430的肿瘤性转化开发出细胞系BMRPA.430.NNK材料1640RPMI培养基，青霉素-链霉素储液(10000U/10000mg/mL)(P/S)，N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)缓冲液，0.2％胰蛋白酶及乙二胺四乙酸(胰蛋白酶-EDTA)，以及锥虫蓝都来自GIBCO(NewYork)。胎牛血清(FBS)来自AtlantaBiologicals(Atlanta，GA)。不含Ca2+和Mg2+的Dulbecco′s磷酸盐缓冲液(PBS)以及完全培养基所用的所有微量元素购自Sigma化学品公司(ST.Louis，MO)。组织培养瓶(TCFs)来自Falcon-BectonDickinson(MountainView，C.A.)，组织培养平皿(TCDs)从Corning(Corning，NY)获得，24孔组织培养板(TCP)和96孔TCP来自Costar(Cambridge，MA)。滤膜(0.22，0.45μm)来自Nalgene(Rochester，NY)。复合的RPMI(cRPMI)细胞培养基的制备cRPMI用RPMI、谷氨酰胺(0.02M)、HEPES缓冲液(0.02M)、溶解在乙酸中的牛胰岛素(每升培养基含0.02mg/mL乙酸)、氢化可的松(0.1μg/mL)以及微量元素配制，微量元素包括ZnSO4(5×10-7M)、NiSO4·6H2O(5×10-10M)、CuSO4(10-8M)、FeSO4(10-6M)、MnSO4(10-9M)、(NH4)6Mn7O24(10-7M)、Na2SeO3(每升培养基0.5mg)、SnCl2·2H2O(5×10-10M)和氨基甲酰氯(10-5M)，将pH调整到7.3。将培养基过滤灭菌。细胞及培养BMRPA.430(BMRPA1)是从正常的大鼠胰腺建立的自然产生的永生的细胞系(Bao等，1994)。TUC3(BMRPA1.K-rasVal12)是通过用含有第12位密码子发生了致癌突变的(Gly-＞Val)活化的人K-ras的质粒进行转染而被转化的BMRPA1细胞(Dr.M.Perucho，加利福尼亚生物研究所，LaJolla)。所有的细胞系在日常维持在cRPMI(10％FBS)培养基中，在37℃的95％空气-5％CO2培养箱中。细胞用胰蛋白酶-EDTA传代。细胞冷冻储存在50％用过的培养基和50％冷冻的培养基制成的混合物中，冷冻培养基中含有具有10％FBS和10％DMSO的新鲜的cRPMI。通过锥虫蓝排除来评估细胞存活率。NNK暴露所有含有致癌物质的培养基制备液都在一个单独实验室的NCI设计和认证的化学通风橱中使用规定的保护措施来制备。4-(N-硝基甲氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK，美国卫生基金会，N.Y.)被配成10mgNNK在PBS中的储液，然后加到无FBS的cRPMI中，使终浓度为100、50、10、5和1μg/ml。传代36代(p36)的BMRPA1细胞在60mm的TCDs中接种105个，生长6天。在除去培养基时，细胞用预热的(37℃)无FBS的cRPMI洗2次，然后用含有不同浓度NNK的无FBS的cRPMI(4ml/TCD)处理。含有BMRPA1细胞的第六组TCDs在不加NNK的无FBS的cRPMI中保温作为对照。对6组不同培养条件的每一组所使用的8个TCDs被放回到37℃的95％空气-5％CO2培养箱中。16小时后，从所有的TCDs中倒出含有NNK的培养基，细胞用PBS洗3次，然后加入新鲜的cRPMI-10％FBS(4ml/TCD)，继续保温。不加NNK的对照培养进行平行的处理。每2天用新鲜的cRPMI-10％FBS替换掉一半用过的培养基以培养细胞。当细胞满底时从所有的TCDs收集细胞，每组中的细胞被集中合并，以2×104的浓度传代到新鲜的TCDs中。克隆的分离为了便于从转化的细胞的每个克隆中挑取细胞，含有克隆的细胞培养物以每个100mmTCDs105个细胞的浓度重新接种，并生长7天。将灭菌的巴氏滴管的窄端灼烧，快速拉伸，在其最细的地方打断，产生很细的拉长的玻璃针，其窄得足以只挑取富含细胞的克隆的核心。只有用NNK处理的细胞才含有富含细胞的球状的克隆。挑取了8个显著的克隆的中心核心，每个核心含有大约80-200个紧密堆积的细胞，将其放入24孔板的每个分开的孔中。因此有4个克隆的细胞被转移成活并展开。细胞生长分析为了测量细胞在10％FBS中的生长，在每个含有4mlcRPMI-10％FBS的60mmTCD中接种5×104个细胞。每过3天，每种被研究的细胞系取出三个TCDs，细胞用胰蛋白酶-EDTA释放，在存在锥虫蓝的情况下计数。为了评估含有减少浓度的FBS的cRPMI对细胞生长的影响，等量的(1.5×x04个细胞/ml/孔)NNK处理的和未处理的BMRPA1细胞被接种到24孔TCDs的3个孔中。细胞在cRPMI-10％FBS中吸附过夜，用PBS洗涤，然后用含有指定百分浓度FBS的cRPMI继续保温。细胞生长通过一种修饰的结晶紫相对增殖分析方法(Serrano，1997)来评估。简而言之，细胞用PBS洗涤，固定在10％缓冲的甲醛溶液中，然后用蒸馏水冲洗。然后将细胞用0.1％结晶紫在室温(RT)染色30分钟，用蒸馏水冲洗，干燥。细胞结合的染料用1ml10％的乙酸抽提，等分试样用蒸馏水稀释一倍，转移到96孔微孔板上进行OD600nm测量。细胞的生长用相对于在24小时时读到的OD600nm的值来计算。BrdU的掺入细胞(5×104)铺在60mmTCD中，在cRPMI-10％FBS中生长。3天后，加入含有BrdU(10μM)的新鲜培养基，3小时后洗涤细胞，用胰蛋白酶-EDTA释放，通过FACS分析按照制造商(BectonDickison)建议的方法使用FITC偶联的抗-BrdU抗体(BectonDickison)检测掺入的BrdU。简单来说，106胰蛋白酶-EDTA释放的细胞用PBS-1％BSA洗涤2次，在70％乙醇中固定30分钟，在37℃悬浮在RNAase(0.1mg/mL)中30分钟。洗涤细胞后，其DNA用2NHCl/TritonX-100变性30分钟，用0.1MpH8.5的Na2B4O7·10H2O中和。然后用含有0.5％Tween20的PBS-1％BSA洗涤细胞，重新悬浮在50μL含有0.5％Tween的PBS-1％BSA溶液中，加入20μLFITC偶联的抗BrdU抗体。37℃保温45分钟后，洗涤细胞，重新悬浮在1mL含有碘化丙啶(PropidiumIodide)(0.005mg/mL)和RNAase(0.1mg/mL)的柠檬酸钠缓冲液中。使用BectonDickisonCo.的FACScan分析仪进行荧光激发细胞分类或流式细胞计量术(FACS)分析以检测掺入的BrdU和进行PI染色，分析仪装备了氩离子激光器，使用488nm的激发波长。数据分析使用LYSYSII程序。独立的样品t试验被用于显示在统计上以百分率表示的掺入了BrdU的未转化的和转化的细胞的显著性差异(p＜0.05)。DNA指数按照以前描述的方法(Barlogie等，1983；Alanen等，1990)从DNA直方图计算出来，以检测的转化细胞中G0/G1峰的PI染色测量除以未转化的BMMRPA1细胞中G0/G1峰的PI染色测量的比率来表示。不依赖固着物的生长4ml0.5％的琼脂培养基混合物(琼脂在64mL水中高温灭菌，在水浴中冷却到50℃，加入15mL5XcRPMI、19mLFBS和1mLP/S)的等分试样被注入25cm2的TCFs中，在4℃放置过夜以硬化。在铺细胞之前，将培养瓶放置在37℃的CO2-空气培养箱中5小时，以便于pH和温度的平衡。细胞用胰蛋白酶-EDTA收集，0.1mL细胞悬浮液(每mLcRPMI40000个细胞)被仔细地分散在每个培养瓶的琼脂表面，放回到37℃的95％O2-5％CO2培养箱中继续培养。24小时后，将覆盖了琼脂的TCFs反转以排出过量的培养基。在9天和14天后使用蔡司倒置显微镜观察培养物以检查克隆的生长。Nu/Nu小鼠中的肿瘤生成Nu/Nu小鼠(7周龄)从Harlan实验室(Indianapolis，IN)获得。用于注射的细胞通过胰蛋白酶-EDTA释放，在cRPMI中洗涤，以每mL108个细胞的密度重新悬浮在PBS中。每个试验小鼠用0.1ml这种细胞悬浮液进行皮下(s.c.)注射。在前4周每天检查肿瘤的发展，以后每周检查。从肿瘤的核心切下小块的肿瘤(1-2mm3)，放置在4％的多聚甲醛中，4℃过夜。然后在PBS中洗涤组织，在30％的蔗糖中再放置24小时。冷冻在Lipshaw包埋基质(Pittsburgh，PA)中的肿瘤组织的切片用Jung低温恒温器(Leica)制备，放置在明胶包被的载玻片上，-20℃保存。H&E染色按照标准方法进行。从离体的Nu/Nu小鼠肿瘤建立TUNNK细胞系从皮下移植到Nu/Nu小鼠的BMRPA1.NNK细胞生长出来的肿瘤的细胞，其分离采用与Amsterdam，A.和Jamieson，J.D.，1974，J.CellBiol.631037-1056中描述的方法相似的方法来进行，只是进行了几个步骤上的改变。带有肿瘤的Nu/Nu小鼠通过CO2窒息处死，放置在冰冷的解剖台上，肿瘤上的皮肤被打开，通过外科手术快速无菌地将肿瘤取出，放置在L-15培养基(GIBCO，GrandIsland，NY)中，置于冰上，马上进行加工。组织在冰冷的L-15培养基中切碎成小块，然后进行2个循环的酶法消化和机械破碎。L-15培养基中的消化混合物由胶原酶(1.5mg/ml)(136U/mg；WorthingtonBiochem.Corp.)、大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)(0.2mg/ml)(SigmaChem.Corp.)和牛血清白蛋白(BSA；晶体)(2mg/ml)(Sigma)组成。在第一循环的消化(25分钟，37℃)后，细胞和组织片段在250xg离心沉淀，用冰冷的无Ca2+和Mg2+的含有SBTI(0.2mg/ml)、BSA(2mg/ml)、EDTA(0.002M)和HEPES(0.02M)(BoehringerMannheimBiochem.，Indianapolis)的磷酸盐缓冲液(PD)(S缓冲液)洗一次。细胞再次离心沉淀，重新悬浮在消化混合液中，进行第二循环的消化(50分钟，37℃)。保持在消化混合液中，通过用吸管和逐渐减小针头口径的注射器反复吹吸细胞悬浮液将残余的细胞块打散。然后将细胞悬浮液连续地通过灭菌的200μ筛眼和20μ筛眼的尼龙Nytex筛网(TetkoInc.，Elmsford，NY)进行剪切，在S缓冲液中洗涤，重新悬浮在2-3ml1-15培养基中，于4℃在50xg离心5分钟。收集细胞沉淀，在PBS中洗涤，重新悬浮在cRPMI中。该级分的样品通过锥虫蓝(FisherSci.)排除法(MichlJ.等，1976，J.Exp.Med.144(6)，1484-93)进行活细胞计数，然后进行细胞化学分析。细胞以每个35mm的孔105个细胞的量接种到6孔TCD的含有cRPMI的孔中并培养。显微照相细胞培养物的所有观测和照相都是在装备了相光学系统和Leitz照相机的Leitz倒置显微镜上进行的。观测被记录在TMXASA100黑白胶片上。实施例2结果NNK对BMRPA1的形态学影响在多种啮齿动物和人的胰腺癌体外实验模型中，已经观察到重复地暴露于NNK和其它硝基胺类化合物可以诱导细胞毒性和赘生性形态学变化(Jones，1981；Parsa，1985；Curphey，1987；Baskaran等，1994)。为了确定这些变化是否可以由单独暴露于NNK以及相对小的NNK浓度所诱导，将BMRPA1细胞暴露于含有100、50、10、5和1μgNNK/mL的无血清培养基中16小时。同以前用胰腺细胞进行的研究所观察到的相同，较大浓度的NKK导致了细胞毒性的变化，由黏附性差、退化、垂死的细胞以及细胞生长的减慢组成，但在暴露于5和1μgNNK/mL的细胞中观察到的这样的变化有相当的减少。用100、50、10μgNNK/mL处理产生的退化性变化在1周内产生了表现型的变化，显示出致瘤性的转化例如纺锤状细胞形态和病灶的过分拥挤。用1μgNNK/mL处理的BMRPA1细胞也显示出以致瘤性转化为特征的表型的变化，但是速度较慢，经过数周才出现。如同用其它的诱变剂时所建议的那样(Srivastava和Old，1988)，在低剂量下观察到的变化更可能反映了NNK诱导的病变的特异性、倾向性的分子位点，因为该剂量接近在人体环境中所遇到的剂量。此外，在1μg/mL时这些变化的逐渐产生使得可以对NNK诱导的转化过程中的早期和晚期事件进行逐代的研究。因此，下面显示的结果是用暴露于1μgNNK/mL无FBS培养基中16小时的BMRPA1细胞获得的。经过35代连续培养的BMRPA1细胞组织成单层的鹅卵石状的形式，这是未转化的接触抑制的上皮细胞典型的形式(图1A)。在暴露于1μgNNK/mL两周后，BMRPA1细胞表现出小的形态学变化在几个分散的区域中的细胞开始失去它们的多边形形状，含有纺锤状细胞的细胞岛开始形成，这些细胞具有较少的细胞质和较暗的核(图1B，第2道或p2)。从p6开始可以在顶部和紧密堆积的纺锤状细胞的链中观察到增加数量的圆形细胞，表明失去了接触抑制(图1C)。到p7时拥挤细胞的岛状区域(病灶)变得明显(图1D，箭头)，球状的细胞聚集体开始在这些病灶的顶部以克隆形式形成(p7-11)。第一个清楚可辨的克隆在p8-9中可以看见，这是在暴露到NNK后大约3个月的时候。最初克隆很小(图1D，箭头)并且很少，但是它们出现于所有6个传代了NNK处理的BMRPA1细胞的TCFs中。克隆继续在水平和垂直方向生长，成为具有更少的附着性的紧密的团(图1E)，例如，成团的细胞可以通过胰蛋白酶处理和反复地吹吸容易地分开，这表明这些培养物中可能含有肿瘤细胞。这些克隆可以通过胰蛋白酶处理快速破碎，这与未转化的BMRPA430(BMRPA1)细胞正相反。平行地进行连续培养并暴露于不含NNK的无FBScRPMI中16小时后的对照BMRPA1细胞没有显示出任何变化，与最初的单层BMRPA1细胞不能区分。为了便于克隆形成细胞的表现型和分子特征的研究，用细的拉长的玻璃针分离了几个克隆的核心，每个分离到的80-200个细胞被分别培养，作为被称为“克隆的BMRPA1.NNK”的细胞系。分离的细胞表现出纺锤形或三角形的形状，通常是多核化的，具有不同大小的核，其中含有1个或多个明显的核。当重新接种到新的培养瓶中时，这些细胞维持了形成病灶和克隆的能力(图1F)。有趣的是，在NNK转化的BMRPA1中观察到的NNK诱导的表现型变化与用人致癌蛋白K-rasVal12转化BMRPA1的过程中观察到的变化相似，但程度较低。在H&E染色后可以被肉眼和显微镜容易地观察到的NNK诱导的嗜碱的病灶，与用致癌蛋白K-rasVal12转染所转化的BMRPA1细胞所形成的病灶相似。相反，在未处理的BMRPA1细胞的生长过程中既没有病灶也没有克隆形成。NNK在BMRPA1细胞中诱导的形态的变化也与其它体外培养的转化细胞的已被接受的特征相似低细胞密度下纺锤形或三角形的细胞形状，在高细胞密度下为圆形带有类似晕圈的外观，以及失去接触抑制，这可以由它们在病灶中和相邻细胞的顶部生长来说明(Chung，1986)。NNK诱导的过度增殖NNK对BMRPA1细胞的长期的、永久性的影响首先通过对在含有10％FBS的复合培养基(cRPMI)中培养的NNK处理和未处理的细胞的细胞生长进行比较来评估。BMRPA1、未克隆的NNK处理的BMRPA1细胞、以及“克隆的”BMRPA1.NNK细胞、即本实施例中前述的产生的分离的细胞，以同样的密度接种到TCDs中。在预定的天数将TCDs中的细胞用胰蛋白酶-EDTA处理来释放，收集，在存在锥虫蓝的情况下计数。未处理的46代(p46)BMRPA1细胞在大约第9天达到平台期，表现出了生长的接触抑制。相反，在NNK处理后平行地生长了11代的NNK处理的细胞在前9天表现出较快的生长，随后生长减慢，这可能是由于没有被NNK影响的未转化的BMRPA1细胞的连续存在所引起的。从NNK诱导的克隆(图1F)的核心分离的克隆的BMRPA1.NNK细胞在12天的培养过程中，以与未处理的细胞相比相当快的速度连续地不被干扰地生长，产生了非常浓密的过高种群密度。因为只有在高的细胞密度下由于接触受抑制的生长以及细胞死亡可能对观察到的细胞生长产生重要影响，细胞的生长曲线才能揭示出NNK处理的和未处理的BMRPA1细胞在生长上的显著区别，因此通过测量这些细胞掺入BrdU的能力，对NNK处理的细胞在低细胞浓度下增加的固有增殖能力进行了进一步的评估。测量在RNAase处理的细胞中BrdU的掺入通常被用来评估增殖的细胞的S期过程中DNA的合成(AlbertsB.，Johnson，A.，Lewis，J.，Raff，M.，Roberts，K.，Walter，P.，2002，《细胞分子生物学》，GarlandScience，Taylor&Francis，第四版，NY)。通过对未转化的BMRPA1.p58、转化的未克隆的BMRPA.NNK.p11和转化的克隆的BMRPA.NNK.p23细胞中掺入的BrdU进行FACS分析获得的结果，提供了更进一步的证据，表明NNK处理导致BMRPA1中产生了永久的过度增殖性的变化。这些观察提供了实验上的证据，表明NNK能够通过诱导病灶失去接触抑制和过度增殖来转化BMRPA1细胞。剥夺血清对未转化和NNK转化的BMRPA1细胞的影响转化细胞的一个经常被引用的特点是它们在低浓度的生长因子和血清的条件下具有选择性的生长优势，这些条件对最初的未转化的细胞的生长支持很弱(Chung，1986；Friess等，1996；Katz和McCormick，1997)。为了建立未转化的和NNK转化的BMRPA1的血清依赖性，细胞被转移到含有1％、5％和10％FBS的cRPMI培养基中，以同样的细胞数接种到24孔TCPs的孔中，生长12天。使用结晶紫分析方法评估相对的细胞生长(Serrano，1997)。这种分析方法与胰蛋白酶-EDTA释放的细胞的计数相比有极大的优势，因为它消除了由于在低血清浓度下细胞对TCDs的强烈附着而发生的细胞的损失(不完全的释放和细胞死亡)。在所有试验的FBS浓度下都发现转化的BMRPA1.NNK细胞对未处理的细胞有选择性生长优势。即使是在含有1％FBS的cRPMI培养基中，NNK转化的细胞也比在含有10％FBS的cRPMI中培养的未处理的BMRPA1细胞生长得更好。观察到的BMRPA1.NNK细胞在严重的血清剥夺条件下支持细胞生长的能力，对通过暴露于NNK转化BMRPA1细胞提供了进一步的支持。不依赖固着物的细胞生长已经显示许多细胞的恶性转化产生了新获得的在不依赖固着物的条件下在琼脂上生长的能力(chung，1986)。克隆的BMRPA1.NNK细胞和未处理的BMRPA1细胞在琼脂上生长的能力通过以低的密度将细胞分散在软琼脂表面上来检测(参见实施例1)。这些细胞在14天的时期内形成克隆的能力被显示在表1中。表1对照的BMRPA1和NNK处理的BMRPA1细胞在琼脂上的不依赖固着物的克隆形成*克隆使用目镜计数格网在一系列30个连续的1mm2视野内计数。显示了来自5个TCFs+/-SEM的平均的克隆数目。BMRPA1细胞不能在琼脂上生长并且死亡，这证实了以前的观察(Bao等，1994)。相反，BMRPA1.NNK细胞显示了很强的生长和形成克隆的能力。在琼脂上生长表明了致瘤性转化。Nu/Nu小鼠中的肿瘤生成作用在琼脂上生长的细胞通常具有象肿瘤在Nu/Nu小鼠中那样生长的能力(Shin等，1975；Colburn等，1978)。细胞在Nu/Nu小鼠中象肿瘤那样生长的能力据信是恶性转化的强烈指标(Chung，1986)。结果，将107个克隆的活的BMRPA1.NNK细胞通过皮下(s.c.)注射到Nu/Nu小鼠的臀侧区域。另一组小鼠在同样的条件下用未转化的BMRPA1细胞皮下注射。第三组Nu/Nu小鼠用BMRPA1.K-rasVal12细胞注射作为阳性对照，因为这些细胞以前已经被显示能够在Nu/Nu小鼠中形成肿瘤。表2BMRPA1.NNK细胞在Nu/Nu小鼠中的肿瘤生成作用BMRPA1细胞在5只被注射的Nu/Nu小鼠中不能形成肿瘤，而BMRPA1.K-rasVal12形成快速生长的小瘤(＜0.5cm)，在接种后4周内变成肿瘤(＞1cm)。在用克隆的BMRPA1.NNK细胞注射的Nu/Nu小鼠中显著不同的是肿瘤形成的过程。在用克隆的BMRPA1.NNK细胞注射后1周内，在所有6只小鼠的注射位点形成了2-3mm的小瘤。在两个月内在3只小鼠中小瘤消失了。但是在最多4个月的休眠期后，在剩余的3只小鼠中的小瘤在接下来的12-16周内演化成直径超过1cm的肿瘤。其中一只带有大的肿瘤块的小鼠进一步发展出了腹水，表明转移的肿瘤细胞的出现。从BMRPA1.NNK细胞注射的Nu/Nu小鼠中生长的一个肿瘤通过机械破碎和胶原酶消化相结合的方法，建立了一个命名位TUNNK的细胞系。TUNNK转变出与注射到Nu/Nu小鼠中的克隆的BMRPA1.NNK细胞同样的形态特征。迄今为止，这两株细胞之间唯一可以明显区分的表现型特征是TUNNK在体外当细胞聚集时倾向于浮动，这表明在体内的选择性生长过程中在细胞的附着性质上发生的明显的改变。实施例3耐受诱导的定向抗体的生产(TITAP)材料和方法材料RPMI1640、含有5.5mM葡萄糖的DMEM(DMEM-G+)、青链霉素、HEPES缓冲液、含有2mMEDTA的0.2％胰蛋白酶、牛血清白蛋白(BSA)、山羊血清和锥虫蓝来自GIBCO(NewYork)。胎牛血清(FBS)来自AtlantaBiologicals(Atlanta，GA)。用于选择性HAT和AT培养基的次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶(T)以及PEG1500购自BoehringerMannheim(Germany)。二氨基联苯胺(DAB)来自BioGenex(Dublin，CA)。PBS和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG[F(ab’)2HRP-GαMIgG]从Cappel实验室(Cochranville，Pa)获得。抑蛋白酶肽、抑胃酶肽、PMSF、脱氧胆酸钠、碘乙酰胺、多聚甲醛、TritonX-100、Trizma碱、OPD、HRP-GαMIgG以及用于完全培养基的所有微量元素购自Sigma(ST.Louis，MO)。过硫酸铵、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、尿素、CHAPS、低分子量标准以及预染(Kaleidoscope)的标准从BIORAD(Richmond，CA)获得。增强的化学发光(ECL)试剂盒来自Amersham(ArlingtonHeights，IL)。巯基乙醇(2-ME)和胶片来自EastmanKodak(Rochester，N.Y.)。组织培养瓶(TCF)来自Falcon(MountainView，CA)，组织培养平皿(TCDs)来自Corning，NY)，24孔TC板(TCPs)和96孔TCPs来自Costar(Cambridge，MA)。组织培养仓/架子(每架8个仓)来自Miles(Naperville，IL)。细胞和培养所有的大鼠胰腺细胞系都在含有10％FBS的cRPMI中生长。除了大鼠的毛细血管内皮细胞(E49)是来自Dr.M.DelPiano(MaxPlanckInstitute，Dortmund，Germany)之外，其它的细胞系都是从美国组织培养保藏中心(ATCC)获得。白细胞来自健康的献血者，人胰腺组织(不匹配的移植组织)由Downstate医学中心器官移植部的Dr.Sommers提供。细胞的存活率通过锥虫蓝排除法估计。免疫减除超免疫法(ISHIP)ISHIP法在共同待决的专利申请系列号60/443703中进行了详细的描述，其公开的内容在此以其全文引为参考。活的(106个)和多聚甲醛固定的以及洗涤的(106个)细胞用于每次腹膜内(ip)免疫。使用了6只雌性Balb/c小鼠(12周龄)两只小鼠在标准的免疫过程中用BMRPA1细胞注射4次；其余的4只小鼠同样用BMRPA1细胞注射3次，在最后一次加强注射后5小时开始，在接下来的5天内每天每克体重腹膜内注射60μg环磷酰胺。这些免疫抑制的小鼠中的两只在最后一次环磷酰胺注射后重新注射BMRPA1细胞。剩余的两只免疫抑制的小鼠每周注射3次以上转化的BMRPA1.NNK细胞，一周后，在融合前7天内进行5次附加的注射对小鼠进行超免疫(ISHIP小鼠)。在指定数目的免疫后1周内从所有的小鼠获得血清。杂交瘤和mAb的纯化杂交瘤如以前描述的那样(Kohler和Milstein，1975；Pytowski等，1988)通过将P3U1骨髓瘤细胞与来自免疫抑制最深的ISHIP小鼠的脾细胞进行融合来获得。杂交瘤细胞在24孔TCPs的288个孔中培养。杂交瘤最初在HATDMEM-G+(20％FBS)培养基中生长10天，然后在含有HT的培养基中生长8天，然后在DMEM-G+(20％FBS)培养基中生长。在融合后的前3周，通过细胞-酶免疫分析(Cell-EIA)对杂交瘤上清液测试3次以检测特异性反应性的出现，然后通过免疫荧光显微法筛选特异性的mAbs用于进一步分析，并进行免疫组化研究。实施例4检测NNK转化的和未转化的BMRPA1细胞之间的抗原性区别从288个孔收集的杂交瘤上清液被用来通过细胞-酶免疫分析方法(Cell-EIA)测试与干燥的NNK转化和未转化的BMRPA1细胞具有反应性的IgG抗体的存在。BMRPA1和BMRPA1.NNK细胞被接种到96孔TCPs中，每个孔含0.1mLcRPMI-10％FBS和3×104个细胞。使细胞黏附24小时，空气干燥，在真空下于室温储存。然后用PBS-1％BSA将细胞重新水化，接着在每个孔中加入杂交瘤上清液或两倍连续稀释的小鼠血清，在室温(RT)下放置45分钟。然后将未结合的抗体洗掉，加入OPD底物，室温下放置45分钟。使用微孔板读板器(Bio-Rad3550)在OD490nm评估底物颜色的发展。对于杂交瘤上清液来说，OD490nm值大于0.20(是用未反应的细胞获得的阴性对照OD490nm值的5倍)被认为是阳性的。在融合后18到21天进行的评估表明，在检测的288个孔中有265个(92％)孔中含有一个或多个生长的杂交瘤。通过Cell-EIA发现，这些孔中的73个(23.5％)的上清液中含有与转化的BMRPA1.NNK细胞反应的抗体。相反，只有47个(或16.3％)的上清液与BMRPA1细胞反应，表明BMRPA1.NNK细胞表达了未转化的BMRPA1细胞所没有表达的抗原。此外，所有的47个与BMRPA1细胞反应的上清液都表现出与转化的BMRPA1.NNK细胞的交叉反应性。实施例5筛选的杂交瘤上清液与完整的未转化和转化的BMRPA1细胞的免疫反应性因为Cell-EIA测试是使用干燥的破碎的细胞来进行的，上清液中的抗体可以评估和结合细胞内的和质膜上的抗原。为了获得与被识别的抗原的细胞位置有关的原始信息，从一开始就选择了5个杂交瘤的上清液通过对完整细胞的间接免疫荧光分析(IFA)来进一步测试，因为通过Cell-EIA，这些上清液总是显示出或者只与BMRPA1.NNK细胞(上清液3A2；3C4；3D4)、或者与BMRPA1.NNK和BMRPA1细胞(上清液4AB1；2B5)都有非常强的反应性。上清液3C4、4AB1和2B5对完整细胞的细胞表面的染色与Cell-EIA的结果一致。细胞通过与含有0.02MEDTA的PBS保温来释放，用PBS-1％BSA洗涤，在冰冷的温度下处理以保持存活，进行免疫荧光分析。细胞悬浮于杂交瘤上清液或血清中保温1小时，在PBS-1％BSA中洗涤3次，暴露到用PBS-1％BSA稀释40倍的FITC-GαMIgG中。45分钟后，未结合的抗体被洗掉，细胞用落射荧光显微镜检查。值得注意的是，3C4以环状的形式染色BMRPA1.NNK(图2B)和BMRPA1.K-rasVal12细胞(参见共同待决的临时专利申请系列号60/443703)，但是对未转化的BMRPA1细胞的细胞表面不染色(图2C)，表明3C4-Ag只存在于转化的细胞的膜表面。实施例6被通透化的细胞和组织切片的免疫过氧化物酶染色细胞和组织的制备转化和未转化的BMRPA1细胞接种于组织培养仓中，每个仓含有0.3mLcRPMI和1×104个细胞。2天后，细胞被固定在含4％多聚甲醛的PBS中，4℃过夜。然后用PBS-1％BSA将细胞洗两次，用于免疫细胞化学染色。用于免疫组化染色的胰腺组织从用含有4％多聚甲醛的pH7.2的0.1M磷酸盐缓冲液灌注的成年大鼠制备。从固定的大鼠中取出固定的胰腺，放置于含4％多聚甲醛的缓冲液中，4℃保存过夜。然后将胰腺洗涤，置于30％蔗糖中过夜。冷冻的组织切片(10μm)用Jung低温恒温器(Leica)制作，置于明胶包被的玻璃载玻片上，-20℃保存。然后将细胞系或组织切片在含4％多聚甲醛的缓冲液中后固定1分钟，在Tris缓冲液(TrisB)(0.1M，pH7.6)中洗涤，于室温在TritonX-100(溶于TrisB，浓度0.25％)中放置15分钟。然后如前所述(Guz等，1995)进行免疫组化分析。用mAb3C4染色活的啮齿动物和人的PaCa细胞，将3C4-Ag定位于完整细胞的质膜上(图6A到6J)。用IFA和FACS检测的3C4染色，在用胰蛋白酶/EDTA代替只用EDTA来释放细胞时，被完全终止，这表明3C4抗原是对胰蛋白酶敏感的蛋白，被发现于转化的BMRPA1细胞的外膜上。实施例7转化和未转化的啮齿动物和人的胰腺腺癌细胞的荧光激活细胞分类分析(FACS)活细胞置于冰上，按顺序与mAb3C4和荧光素异硫氰酸酯(FITC-)标记的兔-αMIgG(FITC-RαMIgG)反应，在含2％多聚甲醛的缓冲液中固定过夜，洗涤，在BDFACSIV分析仪上分析。对染色的BMRPA1.TUC3细胞的FACS分析为细胞表面上抗原的存在提供了半定量的评估，证实了在大于99％的细胞上有荧光，表明在每个PaCa细胞群中超过99％的细胞表达了3C4-Ag。这些结果被显示在图7的散点图和荧光强度图中。实施例8mAb3C4的纯化用3C4杂交瘤细胞注射小鼠(107个细胞/小鼠)。收集腹水，使用G-蛋白亲和珠从腹水中纯化mAb3C4IgG1。G-蛋白珠与从产mAb3C4的杂交瘤细胞腹膜内注射(i.p.)的小鼠中提取的腹水在恒定的转速下于4℃保温过夜。然后将G蛋白珠离心，舍弃上清，按顺序用缓冲液A(10mMTrisHCl，2mMEDTA，100mMNaCl，pH7.5)、缓冲液B(10mMTrisHCl，200mMNaCl，2mMEDTA，0.2％TritonX-100，0.25mMPMSF，pH7.5)和缓冲液C(10mMTrisHCl，0.25mMPMSF，pH7.5)洗涤珠子以除去非特异性吸附的蛋白。结合的mAb3C4用2倍珠体积的洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸pH2.7)从珠上洗脱下来，通过简单的离心与珠分开后，洗脱液用1MTris-HClpH9.0中和。mAb3C4IgG的纯化被SDS-PAGE和免疫杂交(IB)所证实。mAb3C4的SDSPAGE和免疫杂交(IB)从G蛋白珠柱子分离和洗脱的mAb3C4在还原和非还原的条件下进行SDSPAGE并进行免疫杂交(IB)。mAb3C4样品以及下述的其它样品与等体积的非还原样品缓冲液(125mMTris-HCl，2％SDS，0.1％溴酚兰，20％v/v甘油，pH6.8)和还原样品缓冲液(125mMTris-HCl，2％(v/v)2-巯基乙醇，2％SDS，0.1％溴酚兰，20％v/v甘油，pH6.8)混合。每个样品的蛋白(20μg/孔)如前述(Laemmli，1970)用SDS-PAGE分离，电转移到硝酸纤维素膜上。凝胶道的上样如下道样品1＝注射杂交瘤的小鼠的腹水2＝从与腹水保温的G蛋白珠用低pH缓冲液洗脱的蛋白3＝2道的蛋白经过还原后1B＝道1的IB2B＝道2的IB将膜与含有5％(w/v)奶粉的TBS-T保温1小时后，按照制造商的推荐方法使用HRP-GαMIgG抗体(ECL试剂盒，Amersham)。每个用ECL测试的样品中mAb3C4蛋白的存在通过暴光于X-OMAT胶片(Kodak)来检测。图3的1-3道是从腹水通过G蛋白纯化的mAb3C4的考马斯亮兰染色的SDS-PA凝胶电泳的照片。1道显示有大量mAb3C4被释放到腹水中，可以从大约150-160kD区域的膨起的条带看出。2道低pH的洗脱液，其中IgG从珠子上定量释放。3道显示了被还原的2道的大约160kD的蛋白(IgG)。大约160kD蛋白的消失和IgG典型的大约55kD的重链和大约28kD的轻链的出现，证实了抽提的160kD的蛋白实际上就是IgG。道1B和2B描绘了1道和2道的IgG使用HRP-SaMIgG和ECL反应试剂盒进行的免疫杂交盒放射自显影(化学发光显影)，证实了大约160kD的蛋白是IgG。纯化提取了腹水中存在的大约2/3的抗体，成功地去除了多于98％的污染物。同种型特异性的ELISA分析鉴定了mAb3C4属于带有κ轻链的小鼠IgG的IgG1亚型。实施例93C4抗原(PaCa-Ag1)的鉴定来自啮齿动物和人的胰腺腺癌细胞的细胞裂解物蛋白的SDSPAGE及随后用mAb3C4进行的IB被用来鉴定3C4-Ag蛋白的性质和分子量(MW)(图4和图5)。细胞在25mm2的TCDs中生长至满底，用冰冷的PBS洗涤，与0.5mLRIPA裂解缓冲液(pH8)在冰上保温，RIPA裂解缓冲液含有50mMTris-HCl、1％NP40、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、5mMEDTA、1μg/mL抑胃酶肽、2μg/mL抑蛋白酶肽、1mMPMSF和5mM碘乙酰胺。30分钟后，将剩余的细胞碎片刮入裂解缓冲液，细胞裂解液在11500xg离心15分钟以除去不溶的碎片。每个裂解液的蛋白浓度通过Bradford分析(BioRad)测定。细胞提取液与等体积的非还原样品缓冲液(125mMTris-HCl，2％SDS，0.1％溴酚兰，20％v/v甘油，pH6.8)或还原样品缓冲液(125mMTris-HCl，2％(v/v)2-巯基乙醇，2％SDS，0.1％溴酚兰，20％v/v甘油，pH6.8)混合。每个样品的蛋白(20μg/孔)如前述(Laemmli，1970)用SDS-PAGE分离，电转移到硝酸纤维素膜上。图4中的凝胶道的上样如下道样品1＝BMRPA1.NNK+mAb3C4；带有HRP-GαMIgG2＝BMRPA1+mAb3C4；带有HRP-GαMIgG3＝BMRPA1.NNK无mAb3C4但带有HRP-GαMIgG4＝BMRPA1.TUC3和mAb3C4；带有HRP-GαMIgG5＝非还原的人MIAPaCa-2无mAb3C4但带有HRP-GαMIgG6＝还原的MIAPaCa-2无mAb3C4但带有HRP-GαMIgG7＝还原的MIAPaCa-2和mAb3C4，带有HRP-GαMIgG8＝非还原的MIA-PaCa-2和mAb3C4，带有HRP-GαMIgG使用HRP-GαMIgG进行ECL放大。水平线指示分离胶的顶端和底端。将膜与含有5％(w/v)奶粉的TBS-T保温1小时后，参照制造商的说明使用mAb3C4和HRP-GαMIgG抗体(ECL试剂盒，Amersham)。每个用ECL测试的样品中所需蛋白的存在通过暴光于X-OMAT胶片(Kodak)来检测。如图4描绘的免疫杂交所示，在啮齿动物和人的胰腺腺癌细胞裂解液中，在非还原(1-5和8道)和还原(6和7道)条件下，mAb3C4清楚地鉴定了3C4-Ag是大约43-43.5kD的蛋白。该蛋白不存在于正常的未转化的BMRPA1细胞的裂解液中，存在于NNK转化的细胞和人PaCa细胞系MIAPaCa-2的裂解液中。还原不改变3C4-Ag的迁移形式，这个事实表明抗原不含有亚基。图5显示了来自BMRPA1.NNK细胞的3C4抗原与mAb3C4和G蛋白免疫亲和珠的免疫沉淀。在A中，蛋白胶的银染显示一个在1道(只用G蛋白处理)中出现但在2道(用mAb3C4和G蛋白珠处理)中没出现的大约43kD的多肽带被除去了。被提取的带在图5B的2道中通过用mAb3C4进行免疫杂交被鉴定为一个大约43kD的单一条带。实施例10二维等电聚焦/SDS-Duracryl凝胶电泳分离多肽BMRPA1.NNK细胞在存在蛋白酶抑制剂的情况下进行原位裂解，离心除去它们的核，细胞裂解液的蛋白浓度通过Bradford分析(BioRad)测定。细胞蛋白(0.4mg)被转移到等电聚焦样品缓冲液中，该缓冲液含有尿素/NP-40溶液(8.15ml)、0.2ml2-巯基乙醇和1.65ml蒸馏水[尿素/NP-40储存溶液24克尿素溶解于含有0.84mlNP-40(Nonidet)的18ml蒸馏水中]。然后将样品缓冲液中的裂解液放置于IEF毛细管凝胶顶部，凝胶由丙烯酰胺/双丙烯酰胺(0.5ml)、尿素/NP-40溶液(3.76ml)、Biolyte混合物(0.25ml)、硫酸铵(0.015ml10％w/v溶液)和TEMED(0.004ml)组成。丙烯酰胺/双丙烯酰胺混合物用9克丙烯酰胺和0.54克双丙烯酰胺溶解在30ml蒸馏水中制成。Biolyte(两性电解质)混合物通过将覆盖范围3-10(0.4ml)和5-7(0.1ml)的Biolyte混合而制成。蛋白在IEF凝胶上在200V分离2小时，然后在500V5小时，800V16小时。确定被分离的蛋白的分子量的第二维是以每块胶20mA的电流在12％的SDS-PAGE凝胶(BioRad)上分离。几块IF和SDS-PAGE凝胶平行地在同样的条件下运行，用银染(GenomicSolutionsInc.)处理(图11)，电转移到PVDF膜上(SchleicherandScholl)用mAb3C4进行免疫杂交(图12)，电转移到Immobilon膜上以分离3C4-Ag的点用来进行蛋白测序。预染的分子量标准被用来证实蛋白从IF胶到膜上的转移是正确的。图11的银染显示了细胞裂解液中大量不同蛋白的存在以及它们按照其等电点值在IF胶内的适当分离。图12中的免疫杂交作图是使用ECL化学发光方法在X-光胶片上成像的。mAb3C4杂交的化学发光成像显示只有一个单一的发光点(箭头)，它将3C4-Ag鉴定为大约43kD的多肽，等电点在4.6-4.8之间。分离的多肽或者在半干的条件下以1.25mA/cm2的电流(484mA)用1小时的时间快速转移到PVDF膜上，或者用银染试剂盒按照制造商的说明(GenomicsSolutions，MA)进行染色。PVDF膜被用于3D4-Ag的检测，通过Western杂交分析，然后用RevPro(GenomicsSolutions，MA)或氨基黑染色。第一维中的pH梯度如以前所述(O’Farrell，1975)从1.0cm的小段测定。二维分离的多肽的银染用计算机凝胶扫描来记录。实施例113C4-Ag的表达高度局限于胰腺癌细胞并且在正常组织中不存在为了研究3C4-Ag在正常大鼠、人类组织和转化的人类组织中的分布，使用mAb3C4进行了组织提取物的免疫杂交。从来自不同组织(胸腺、卵巢、脑、心、肺、肝、睾丸，见图9A)的组织提取物以及人胰腺腺泡细胞、白细胞和胰腺导管细胞(见图9B)获得的还原的蛋白在12％的SDS-PAGE上分离，电转移到硝酸纤维素膜上，用和不用mAb3C4进行处理，然后用ECL化学发光试剂放大(AmershamPharmacia)。人的胰腺腺泡(PA)和导管组织(PD)分别用10倍和4倍以上的蛋白量上样，以便显示出哪怕是少量的抗原表达的存在。MIAPaCa-2细胞裂解液和IgG被用做对照。结果显示在图9中，表明3C4抗原在正常组织中不存在，但存在于胰腺癌细胞中。然后用mAb3C4进行了不同的人腺癌组织(成胶质细胞瘤、肺癌、表皮癌、结肠直肠ACA、乳腺ACA、表皮ACA、肾脏ACA、MIAPaCa)的免疫杂交，结果显示在图10中。结果证明了mAb3C4对强烈表达于人PaCa、MIAPaCa-2细胞上的大约43.5kD的抗原——3C4抗原具有高度选择性的反应活性。当在IB中省略了mAb3C4或用非特异性的IgG代替时，在所有组织样品中都不存在任何蛋白带，这进一步证实了反应活性的特异性。在肾脏、前列腺以及可能在结肠腺癌中显示出存在少量的3C4-Ag，尽管与PaCa细胞表达的量相比在数量上显得微不足道，在显示的道中只分离到0.02mg蛋白。放在一起考虑，通过IB和IC获得的结果强烈地支持mAb3C4对倾向于在大鼠和人PaCa细胞中表达的抗原3C4-Ag具有特异性。通过Western杂交发现正常的人类胰腺组织(n＝2)以及纯化的人类胰腺腺泡和导管细胞对mAb3C4没有反应性。此外，通过与mAb3C4的Western杂交，来自舌、食管、胃、十二指肠、回肠、空肠、盲肠、结肠、脑、心、气管、肺、肝、肾、乳腺和前列腺的最适保存的人类组织提取物(来自BectonDickenson)和外周白细胞对mAb3C4没有反应性。然而，与大鼠卵巢相似，通过与mAb3C4的Western杂交，用正常的人类卵巢组织观察到一条微弱阳性的43.5kDa的条带。实施例12PaCa-Ag1的特征、组织分布和相对表达水平的进一步研究固定在多聚甲醛或甲醇/丙酮中的转化的细胞的免疫细胞化学和间接免疫荧光(IIF)(图14A、C-F)显示出膜的染色的衰减，但是未转化的细胞(图14B)没有显示出这种现象(图14)。细胞在冰上冷却，然后与mAb3C4反应，再与FITC-GaMIgG反应，固定在含有2％多聚甲醛的缓冲液中。A、B、C、D使用40x的物镜；E、F使用64x的物镜；Fuji400ASA胶片。完整细胞的胰蛋白酶消化导致PaCa-Ag1的降解，这与其定位于质膜上相一致(图15)。但是，暴露到外切和内切糖苷酶(Prozyme)(Iwase等，1993；Altmann等，1995；Lee和Pack，2002)既不能消除抗原性又不能对电泳迁移率产生重要程度的改变(图16B)，表明PaCa-Ag1没有糖基化或仅有极小的糖基化，并且PaCa-Ag1上被单克隆的mAb3C4识别的表位可能是一个纯的肽而不是一个含糖的区域。这可以减少交叉反应性的可能性，因为与肽表位相比含糖的表位可能更易于发生交叉反应。PaCa-Ag1被发现是一种丰富的蛋白在存在带有标准量的荧光团的珠子(QuickCalQuantum-26，BangsLab)的情况下(Zagursky等，1995；Borowitz等，1997；Schwartz等，1998)，使用荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的mAb3C4和细胞荧光测定法(FACS)，确定了在每个细胞中转化的BMRPA1细胞表达2-4.4×105个PaCa-Ag1拷贝。与mAb3C4的反应性在未转化的BMRPA1细胞中通过免疫荧光和免疫杂交发现是零，在正常大鼠胰腺中通过免疫杂交发现是零(图9和10)。此外，在正常大鼠的口腔鳞片状上皮、食管、胃、小肠、大肠、肝(包括肝细胞和胆管上皮)、肺、心、胸腺、睾丸、脑和外周血细胞中没有检测到mAb3C4反应性蛋白。唯一具有mAb3C4反应性的正常大鼠组织是成熟的卵巢，它显示了与大约43.5kD蛋白的痕量反应性。表3用于试验PaCa-Ag1表达的人类细胞系系和组织肿瘤性转化细胞系系实施例13mAb3C4对PaCa细胞的补体介导的细胞毒性的证明mAb3C4的细胞毒性被测定如下人MIAPaCa-2细胞与mAb3C4在4℃保温，然后以新鲜兔血清作为补体(C)来源在37℃保温。结果显示在图8中，表明使用恒定浓度的mAb3C4，随着补体浓度的增加获得了增加数量的细胞裂解。相反，即使在最高的浓度下，HI-C(HI-C是在56℃下热失活45分钟的兔血清)在显示对MIAPaCa-2细胞的细胞毒性方面，与没有加mAb3C4而只加补体时同样无效。当BMRPA1.NNK和BMRPA1.Tuc3细胞用于本分析时也获得了同样的结果。所有的稀释和反应都是在含有Ca++和Mg++的PBS中进行的。实施例14mAb3C4对体内肿瘤生长的影响用BMRPA1.TUC3细胞(每只小鼠5×106个细胞)对Nu/Nu小鼠(n＝10)进行皮下异体移植。允许肿瘤发展和生长到其直径达到10到14mm。此时，对每只小鼠腹膜内(ip)注射106个分泌mAb3C4的3C4杂交瘤细胞。随后，每隔两天观察肿瘤的发展并测量肿瘤的直径。在4天内，肿瘤生长停止了，在16天内，肿瘤大小缩小到直径在4-6mm之间，即明显低于在3C4杂交瘤腹膜内注射时最初测量到的大小。参见图13。使用混合模型测量的肿瘤缩小的显著性值小于0.00066。实施例15对3C4-Ag呈递细胞具有高度特异性的腺病毒载体的构建腺病毒载体的构建按照Kanovsky等2001发表的肽序列对应的DNA序列由Invitrogen公司合成了两条单链DNA片段。除了肽的序列，它还含有一个起始密码子、一个Kozak基序、一个终止密码子、Not1和Kpn1两个限制性酶位点，并在每一端添加了4的碱基对，使得限制性酶可以适当地结合。序列如下-5’-ATCCGGTACCAA’GAGACCTTTTCTGACCTCTGGAAACTCCTC’AAGCGGCCGCACTC-3’5’端酶Kpn1；3’端酶Not1-3’-TAGGCCATGGTTTAC’CTCTGGAAAAGACTGGAGACCTTTGAGGAG’ATCTTCGCCGGCGTGAG-5’3μgGOI-frw和3μgGOI-rev与2.5μl10XPCR缓冲液(Qiagen)、0.5μldNTPs(各10mM，Qiagen)、0.5μlTaq聚合酶(Qiagen)和19.5μl灭菌水混合，使总反应体积达到25μl。样品在94℃变性5分钟，50℃退火1分钟，72℃保温10分钟。细菌的克隆和转染取出4μl上面的反应液进行TA克隆。反应液被加入到化学感受的大肠杆菌TOP-10(Invitrogen)中，细菌在42℃处理30秒使其通透，然后在SOC培养基(Invitrogen)中于37℃保温1小时。细菌被铺于含有卡那霉素(50μg/ml)的选择性LB琼脂平板上，37℃保温过夜。细菌克隆的分析随机选择12个克隆，在液体培养基(含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基)中生长过夜。然后收集3ml培养液中的细菌，使用Qiagen的质粒小量分离试剂盒提取质粒。取每种被分离的质粒10μl用10单位的EcoRI限制性酶于37℃消化1小时，每种被消化的质粒取一半在2％的琼脂糖凝胶上进行分析。显示出插入了预期大小片段的质粒被送到GenewizInc.NJ公司测序。转入载体的构建40μg含有所需序列的质粒在50μl反应体积中用40单位Not1(NEB)在37℃消化1小时。然后加入一半体积1∶1的苯酚∶氯仿溶液，将样品旋涡混合，以最高速度离心3分钟。将上层转移到新的管中，用3M乙酸钠溶液和100％乙醇沉淀(Sambrook等，1989)。质粒被再次洗脱，用40UKpnI(NBE)在50μl反应体积中在37℃消化1小时。40μg的载体pENTR11(Invitrogen)进行平行的处理。两个反应都在2％的琼脂糖凝胶上分析，然后将全部混合物在1％琼脂糖凝胶上分离。将合适的条带切下，使用Qiagen的凝胶提取试剂盒从凝胶中提取。因为在该试剂盒中一个柱的最大结合能力是10μgDNA，消化的pENTR11反应液被分成三个部分进行分别处理，然后再合并。取1OD样品进行连接反应，使用T4-DNA连接酶(NEB)和适当浓度的5’末端，在16℃保温4小时(Sambrook等，1989)。如前述的方法用4μl连接反应液转化大肠杆菌。取12个克隆分析GOI的存在，阳性克隆被选出用于后面的实验。含有PNC-28的腺病毒载体(Ad/CMV/V5/PNC-28)的构建按照制造商说明书的描述，用300ngpENTR11-PNC-28和同样量的Ad/CMV/V5载体进行λ重组反应，在25℃保温2小时(Invitrogen，Carlsbad，CA)。(Ad/CMV/V5/PNC-28)在293A细胞中的增殖1μl上述的现在含有Ad/CMV/V5/PNC-28的反应混合物被转入化学感受的大肠杆菌TOP10中，在氨卞青霉素平板(100μg/ml)上生长。选出克隆，尝试将它们在含氯霉素的LB培养基(30μg/ml)中生长。如果不能生长，说明它是真正的阳性克隆，将该细菌在含有氨卞青霉素(100μg/ml)的LB培养基中增殖，如前所述进行分离。为了进行转染，在6孔平皿的每个孔的2ml正常生长培养基中为每个转染铺上106个293A细胞。4μg载体在50μl反应体积中用4单位Pacl(NEB)在37℃消化1小时，如前述用苯酚∶氯仿抽提，沉淀，洗脱，浓度调整为1μg/μl。在细胞铺板18小时后的培养基用无抗生素的正常生长培养基代替。铺板24小时后的细胞以DNA∶Lipofectamine2000为2∶5的比率在0.5ml无抗生素和FBS的OPYI-MEM培养基(Invitrogen)中用Ad/CMV/V5/PNC-28-Lipofectamine2000(Invitrogen)转染。转染24小时后培养基用含有抗生素和FBS的正常生长培养基代替。48小时后转染的细胞被转移到10cm2的平皿中，每2天加入培养基直到观察到60％细胞病变效应(CPE)为止，在达到80％CPE时按照制造商提供的方法收获病毒。293A和3C4杂交瘤细胞的cDNA分析从每种细胞系收集3×107个细胞。使用Rneasyminikit(Qiagen)分离总RNA，使用Clontech的NucleotrapmRNA纯化试剂盒分离poly-A+mRNA。每个细胞系的1μg纯化的mRNA被用来合成DNA，使用SMARTPCRcDNA合成试剂盒(Clontech)。合成的cDNA在1％的琼脂糖凝胶上分析以证实其完整性。CAR的细胞质外区域的PCR扩增参阅www.ncbi.nih.gov网站上的人CAR序列，合成了细胞质外区域两侧的引物并添加了一个Sfi1(5’)和一个Not1(3’)限制性酶位点(Invitrogen)。序列如下-5’-atcc’ggcccagccggcc’gcgctcctgctgtgcttcgtg-3’Sfi1CAR-frw-5’-atcc’gcggccgc’agcgcgatttgaaggagggac-3’Not1CAR-revPCR反应如下进行。每种引物各10pmol与2.5μl10XPCR缓冲液(Qiagen)、0.5μldNTPs(各10mM，Qiagen)、0.5μlTaq聚合酶(Qiagen)和19.5μl灭菌水混合，使总反应体积达到25μl(Saiki等，1985)。循环条件是95℃5分钟，(95℃1分钟，60℃1分钟，72℃2分钟)，共30个循环，72℃10分钟。PCR产物进行TA克隆(TA克隆试剂盒，Invitrogen)，克隆分析和测序如前述进行。mAb-3C4的重链(VH-3C4)和轻链(VL-3C4)可变区的PCR扩增由重链和轻链可变区侧面的恒定区域组成的引物从Novagen购买。VH-3C4和VL-3C4的PCR扩增使用Advantaq聚合酶混合物(Clontech)按照公司的建议进行。PCR产物进行TA克隆(TA克隆试剂盒，Invitrogen)，克隆分析和测序如前述进行。为匹配获得的序列设计了新的引物，其中含有附加的限制性位点，使其可以适当地插入表达载体。引物由Invitrogen(Carlsbad，CA)合成。引物序列是VHfrw-5’-atcc’gcggccgc’-3-Not1rev-5’-atcc’cctagg’-3’BamH1VLfrw-5’-atcc’ggatcc’t’ggt’atggagacagacacactc-3’BamH1rev-5’-atcc’ctcgag’c’tttccagcttggtccccc-3’Xho1PCR反应如下进行。每种引物各10pmol与2.5μl10XPCR缓冲液(Clontech)、0.5μldNTPs(各10mM，Clontech)、0.5μlTaq聚合酶(Clontech)和19.5μl灭菌水混合，使总反应体积达到25μ。循环条件是95℃5分钟，(95℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟)，共30个循环，72℃10分钟。PCR产物进行TA克隆(TA克隆试剂盒，Invitrogen)，克隆分析和测序如前述进行。选择含有所需序列的克隆构建表达载体。构建含有CAR、VH-3C4和VL-3C4的真核表达载体含有预期的CAR序列的质粒40μg在50μl反应体积中用40U的Not1(NEB)在37℃消化1小时。然后加入一半体积的1∶1的苯酚∶氯仿混合液，将样品涡旋混合，以最高速度离心3分钟。将上层转移到新的管中，用3M乙酸钠溶液和100％乙醇沉淀。质粒被再次洗脱，在50μl反应体积中用40U的Sfi1(NEB)在50℃消化1小时。40μg被选定的真核表达载体pSecTaq2A(Invitrogen)进行平行的处理。两个反应都在2％的琼脂糖凝胶上分析，然后将整个混合物在1％的琼脂糖凝胶上分离。切下适当的条带，使用Qiagen的凝胶提取试剂盒从凝胶中抽提。因为在该试剂盒中一个柱的最大结合能力是10μgDNA，消化的pENTR11反应液被分成三个部分进行分别处理，然后再合并。取1OD样品进行连接反应，使用T4-DNA连接酶(NEB)和适当浓度的5’末端，在16℃保温4小时(Sambrook等，1989)。如前述的方法用4μl连接反应液转化大肠杆菌，只是将抗生素改变为氨苄青霉素(100μg/ml)。取20个克隆通过PCR筛选分析CAR的存在。对于这个实验，每个克隆如上述的CAR的PCR扩增所描述的那样准备1个反应管，只是不含模板。循环条件如前所述。PCR产物在2％琼脂糖凝胶上分析，选出一个阳性克隆用于后面的实验，从此后将其命名为pSecTaq2A-CAR2。对于VL-3C4使用前面指示的限制性酶重复这个过程，质粒被命名为pSecTaq2A-VL-3C4。为了制备最后的构建物，含有VH-3C4的TOPO-TA载体40μg用BamH1和Not1消化，同时每种载体(pSecTaq2A-CAR2和pSecTaq2A-VL-3C4)各40μg如前所述分别用Not1和BamH1消化，通过将VH-3C4连接在其它两个基因之间获得一个中间的构建物，这两个基因的一侧都相接线性化的pSecTaq2A载体。该构建物用Xho1消化，如前述进行凝胶纯化并连接到表达载体中，现在命名为pSecTaq2A-CAR2-VH-3C4-VL-3C4。实施例16在啮齿动物和人类样品中检测可溶形式的PaCa-Ag从腹膜内(i.p.)移植了ras转化的亚株BMRPA1.TUC3细胞(n＝3)的去胸腺小鼠收集的腹水以及在s.c.移植了这些细胞的去胸腺小鼠中(n＝2)形成的腹水显示可溶形式的PaCa-Ag1，一种分子量36-38kD的mAb3C4反应性蛋白。相反，通过i.p.移植了P3U-1小鼠杂交瘤细胞诱导的对照腹水不含有mAb3C4反应性蛋白。同样地，从已经用BMRPA1.TUC3进行s.c.异体移植并长出了256-1220mg肿瘤的小鼠获得的血清和腹水，通过一个抗体抗原-吸附ELISA分析，被发现mAb3C4对已经吸附了血清蛋白的96孔板的孔的结合是阳性的(图17C)。一个抗体抗原-吸附ELISA使用mAb3C4定位和结合孔中存在的PaCa-Ag1，使用的第二抗体是HRP(辣根过氧化物酶)标记的绵羊抗小鼠IgG(HRP-SαMIgG)，然后加入HRP底物TMB(四甲基二氨基联二苯)，在OD450nm测量吸收值。图17A显示了mAb3C4对半纯的PaCa-Ag1浓度的滴定。插入显示了电洗脱的PaCa-Ag(n＝2)。在图17B中，PaCa-Ag1出现在胰腺癌细胞(BMRPA1.NNK)的用尽的(18h)的细胞培养基(未浓缩)中。红色的方块显示了mAb3C4与被吸附的PaCa-Ag1通过可溶性PaCa-Ag1(n＝2)结合为最大结合的一半时的有效竞争。图17C显示了PaCa-Ag1存在于用胰腺腺癌BMRPA1.TUC3细胞(n＝5)异体移植的小鼠的腹水中，但不存在于P3U1移植(n＝2)后的对照腹水中(未显示)。图17D显示了胰腺癌病人(n＝1)的胰腺导管汁(ERCP)中的PaCa-Ag1。从对照孔测量到的背景被减去。通过一个抗体抗原-吸附ELISA证实了在转化的BMRPA1和人MiaPaCa-2细胞的组织培养液中存在可测量量的PaCa-Ag1(图17B)。细胞存活率大于98％，使得ELISA阳性是由于细胞的分解引起而不是由于活细胞释放了PaCa-Ag1或其片段这种可能性降到了最低。通过Western杂交检测了来自3个患有胰腺腺癌病人的血清样品对mAb3C4的反应性。所有3个血清都显示了与mAb3C4强烈的反应性，由单一的分子量为36-38kD的蛋白组成(图18，2-4道)，其分子量与小鼠腹水中发现的可溶形式的PaCa-Ag1的分子量基本相同。来自健康人的对照血清样品没有显示出与mAb3C4的反应性。在已知患有胰腺腺癌病人的内窥倒退胆管胰腺造影(ERCP)过程中获得的胰腺导管分泌物样品，也表现出存在与mAb3C4具有反应性的蛋白。这被一个抗体抗原-吸附ELISA所证实PaCa-Ag1存在于ERCP液中的蛋白已经与之吸附了一定时间的孔中(图17D)。实施例17PaCa-Ag1的分离和纯化致瘤转化的大鼠BMRPA1细胞和人MIAPaCa-2胰腺癌细胞的细胞分级已经表明PaCa-Ag1专门存在于膜/可溶级分中，而不存在于微粒或核级分中，这与其它的发现是一致的。PaCa-Ag1在非变性电泳和等电聚焦凝胶中也已经用mAb3C4鉴定。已经显示出是电洗脱的43.5kD的PaCa-Ag1而不是其它分子较大或较小的蛋白，能够与mAb3C4有效并且剂量依赖性地竞争与胰腺癌细胞上的PaCa-Ag1结合，以及与一个抗体(mAb3C4)抗原(PaCa-Ag1)吸附ELISA中的抗原蛋白结合。基于这些发现，来自人MiaPaCa-2胰腺腺癌衍生细胞系的质膜级分的PaCa-Ag1可以被免疫沉淀，通过电泳将PaCa-Ag1蛋白与其它污染物分离，并进行电洗脱以用于质谱鉴定其氨基酸序列。方法由于可以获得PaCa-Ag1特异性的mAb3C4，使得从细胞裂解物中通过方便的免疫亲和提取PaCa-Ag1成为一种直接的分离43.5kD多肽的方法。Mia-PaCa-2细胞可以用于分离PaCa-Ag1蛋白，因为这些人类胰腺腺癌衍生细胞，与啮齿动物胰腺腺癌细胞BMRPA1.NNK和BMRPA1.TUC3相比，在质膜上表达了10倍以上的PaCa-Ag1。对于实际的通过亲和对细胞分级的方法以及膜蛋白分离的步骤，可以使用以前描述在Schneider等，1982和Deissler等，1995中的方法。在准备从溶解的膜级分中通过免疫亲和提取PaCa-Ag1时，4-8mg亲和纯化的mAb3C4可以在溶于硼酸钠缓冲液(0.1M，pH8.2)的二甲基pimelimidate(DMP，0.1M)存在的情况下与1mlG蛋白珠(Amersham-Pharmacia)交联(Schneider等，1982)。mAb3C4衍生的珠子的样品可以通过SDS-PAGE分析不可逆结合的抗体。易于使用的mAb3C4-G蛋白珠可以重新悬浮在溶解缓冲液(见下)中形成50％的悬浮液以备立即使用。空白的G蛋白珠将在不含任何mAb的情况下进行平行的处理。从MIAPaCa-2的大量培养液(大约109个细胞，30-40个大的组织培养瓶)，可以收集密度为80％-90％的细胞，清洗，250xg离心，重新悬浮(10倍细胞体积)于匀浆缓冲液中[NaPO4(0.02M)pH7.4，蔗糖(0.25M)，稀释100倍的蛋白酶抑制剂混合物(Invitrogene)]，置于冰上在Omni匀浆器中(Omni)于30000rpm匀浆2分钟。匀浆液离心(1000xg)后(沉淀1＝P1，上清液1＝S1)，收集S1，在140000xg超速离心1小时以便将沉淀(P2)中的不溶性膜级分(含有PaCa-Ag1)与可溶性的蛋白(S2)级分分开。沉淀通过超速离心(30000xg，30分钟)洗涤1次，直接重新悬浮在溶解缓冲液中[Tris-HCl(0.04M)pH7.5，NaCl(0.2M)，CaCl2(0.001M)，MgCl2(0.001M)，n-辛基-β-D-葡糖苷(0.05M)，脱氧胆酸(0.14％)，稀释100倍的蛋白酶抑制剂混合物]，用于PaCa-Ag1的免疫亲和提取。在细胞匀浆过程中从步骤P1、S1、S2和P2收集的蛋白样品(0.05mg蛋白)可以通过SDS-PAGE(Laemmli，1970)检测标明有效细胞分级的不同蛋白形式(Beaufy等，1976)。蛋白可以通过将膜在溶解缓冲液中[在Tris-HCl(0.04M)pH7.5，NaCl(0.2M)，CaCl2(0.001M)，MgCl2(0.001M)，脱氧胆酸(0.14％)，稀释100倍的蛋白酶抑制剂混合物中含有0.05Mn-辛基-β-D-葡糖苷]保温1.5小时，并不时涡旋混合而释放。为确定使用的具体蛋白溶解缓冲液而进行的预备试验显示，与TritonX-100相比，n-辛基-β-D-葡糖苷在同样的时间内能够从肿瘤细胞释放大约2倍量的PaCa-Ag1。经过1.5小时的释放过程后，含有被溶解蛋白的可溶性级分可以通过在100000xg超速离心而与不溶性的物质分离开。回收的蛋白的量可以通过OD280nm的读数或使用BioRad的蛋白分析试剂进行比色法分析而测定。可以取出少量进行SDS-PAGE，用于确定蛋白的含量，通过Western杂交确定PaCa-Ag1的存在。实际的提取可以通过在每0.2ml蛋白提取物中加入0.05mlmAb3C4，然后继续保温1小时来进行。对照珠可以用同样量的细胞蛋白处理。在用大量溶解缓冲液洗珠子后，结合的蛋白可以通过与低pH的释放缓冲液(0.01M甘氨酸，pH2.8)保温而释放，释放后需要通过加入准确量的碱性磷酸缓冲液(0.1MNa2HPO4，pH12)将每个收集的级分马上中和。每个样品的蛋白含量可以被测量，级分通过SDS-PAGE然后用银染和/或Western杂交来分析。作为使用低pH进行释放的一种替代方法，亲和结合的PaCa-Ag1也可以使用pH12的碱性三乙醇胺来释放(Deissler等，1995)。PaCa-Ag1一旦释放后，可以通过真空离心将其浓缩，通过SDS-PAGE检测浓度以证实其纯度足够被用于氨基酸序列的质谱分析。如果蛋白的纯度仍然低，PaCa-Ag1可以通过二维凝胶分离进一步纯化，其中加入了另一个等电聚焦的分离步骤(O’Farrell，1975)。PaCa-Ag1蛋白点在凝胶中的位置可以通过Western杂交使用mAb3C4在6块相同的凝胶中的1块上进行鉴定。实施例18夹心ELISA的改进与1个抗体抗原-吸附分析相反，两个抗体或“夹心”ELISA可以使人们即时地在精确定义的条件下测试大量的96孔ELISA板，其中已知量的特异性针对PaCa-Ag1的抗体被结合到孔的表面上。因为每个孔结合的抗PaCa-Ag1抗体可以被测量，可以用纯化的PaCa-Ag1滴定抗PaCa-Ag1(捕获抗体)的最适的量以建立对PaCa-Ag1的反应条件，这使得可以测量患有胰腺腺癌的病人血清中的皮摩尔量的PaCa-Ag1。为了完成PaCa-Ag1的“夹心”ELISA中的测量，如果用于捕获来自血清的PaCa-Ag1的孔中的抗体不是来自小鼠而是其它的物种，现有的意义明确的mAb3C4可以与第二个HRP-SαMIgG结合使用(Ito等，2002；Plested等，2003)。其它的能够与BMRPA1.NNK和BMRPA1.TUC3细胞反应但不与未转化的BMRPA1细胞反应的杂交瘤可以通过Wesern杂交分析与纯化的PaCa-Ag1的mAb反应性的存在(见上)。那些被鉴定为与PaCa-Ag1具有反应性的蛋白然后可以被检测其对mAb3C4结合的同样的表位的可能的结合能力。在Western杂交中新鉴定的mAbs与mAb3C4结合PaCa-Ag1的竞争性分析使得人们可以鉴定那些直接与mAb3C4的表位结合或结合得足够紧密以至于能够阻止mAb3C4与PaCa-Ag1结合的单克隆抗体。这些单克隆抗体将不能用于“夹心”ELISA分析中。不和mAb3C4竞争与PaCa-Ag1的结合的单克隆抗体可以优选使用在“夹心”ELISA分析中，如果它们与mAb3C4(IgG1，κ)属于不同的亚型的话。新的单克隆抗体应该是IgM或IgA亚型。这是必需的，以避免第二(指示)抗体HRP-SαMIgG与捕获单克隆抗体和mAb3C4发生交叉反应。第二抗体HRP-SαMIgG被用来在分析的最后步骤中鉴定结合的mAb3C4，这将显示出孔中捕获抗体、即新定义的抗PaCa-Ag1单克隆抗体、对PaCa-Ag1的保留程度。每个96孔板可以在整个板的各个位置含有对照孔，以鉴定阳性(纯化的PaCa-Ag1)以及阴性(卵清蛋白)和背景结合。一组对照孔可以用完整的mAb3C4和HRP-SαMIgG和TMB处理，同时其它的孔只用第二抗体HRP-SαMIgG处理，以便建立背景测量。病人的样品可以检测三份，每个孔使用0.05到0.1ml血清、腹水、ERCP液或尿液来保留PaCa-Ag1蛋白。有可能不同亚型和同种型的特异性针对PaCa-Ag1的单克隆抗体不能够被鉴定以便允许在分析中使用二级HRP标记的抗体。在这种情况下，商业性公司可以直接将mAb3C4衍生化至HRP上。在这种方法中，人们可以使用HRPA-mAb3C4直接测量在孔中捕获的PaCa-Ag1。此外，在基于荧光团的分析方法中也可以使用FITC-mAb3C4，因为FITC-mAb3C4与PaCa-Ag1阳性的胰腺腺癌细胞的表面的结合与未标记的mAb3C4的结合同样好。实际上，FITC-mAb3C4被用于对FACS建立的PaCa-Ag1位点进行定量(见上文)。除了上面引用的方法之外，纯化的PaCa-Ag1蛋白[衍生到匙孔血蓝蛋白(KLH)或优选情况下衍生到免疫惰性载体例如高分子量FicollMW400000上(Schneider等，1971)可以被用于在其它的动物中(兔，山羊)产生多克隆的PaCa-Ag1特异性抗体(pαPaCa-Ag1抗体)。pαPaCa-Ag1抗体的使用在抗原捕获分析中可能具有优势，因为几个或许多抗PaCa-Ag1抗体可以共同作用将加到孔中的血清蛋白混合物中的PaCa-Ag1保留住。但是应该指出，在不同动物的pαPaCa-Ag1制备物中，可能按照动物对PaCa-Ag1蛋白的免疫反应发生从低到高亲和性的pαPaCa-Ag1抗体的重新分配。pαPaCa-Ag1-IgG的纯化将不影响这种态势。用从不同动物获得的pαPaCa-Ag1-IgG制备的用于PaCa-Ag1的ELISA板在同样的板上可能给出不同的读数。因此，用pαPaCa-Ag1-IgG包被的ELISA板的制备将需要严格的质量控制，以校正不同批次pαPaCa-Ag1-IgG的差别。如果产生大的pαPaCa-Ag1-IgG的库来制备用于该研究的ELISA板，这样的差别可以减小。在使用pαPaCa-Ag1抗体的96孔ELISA板中阳性和阴性对照的排列将与前述的有很多相同之处。然后可以使用mAb3C4接着用HRP-SαMIgG作为抗体来指示阳性血清中PaCa-Ag1的保留。参考文献AhlgrenJD.Epidemiologyandriskfactorsinpancreaticcancer.(胰腺癌中的流行病学和危险因素)SeminOncol23241-250，1996Aisenberg，A.C.，andDavis，C.(1968).Thethymusandrecoveryfromcyclophosphamide-inducedtolerancetosheeperythrocytes.(胸腺和从环磷酰胺诱导的对绵羊红细胞的耐受中恢复)J.Exp.Med.128(1)，35-46.Aisenberg，A.C.(1967).Studiesoncyclophosphamide-inducedtolerancetosheeperythrocytes.(对环磷酰胺诱导的对绵羊红细胞的耐受的研究)J.Exp.Med.125，833-845.Alanen，K.A.，Joensuu，H.，Klemi，P.J.，andNevalainen，T.J.，(1990).ClinicalSignificanceofnuclearDNAcontentinpancreaticcarcinoma.(胰腺腺癌中核DNA含量的临床重要性)J.Path.160，313-320.AlbertMB，SteinbergD，HenryJP.ElevatedserumlevelsoftumormarkerCA19-9inacuteandbiliarydisease.(在急性和胆管疾病中肿瘤标志物CA19-9血清水平的上升)DigDisSci，331223-1225，1988.AlmoguerraC，ShibataD，ForresterK，MartinJ，ArnheimN，PeruchoM.Mosthumancarcinomasoftheexocrinepancreascontainmutantc-K-rasgenes.(大多数人类外分泌胰腺的腺癌含有突变的c-K-ras基因)Cell53549-554，1988.AltmannF，SchweiszerS，WeberC.KineticcomparisonofpeptideN-glycosidas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ctcctctagaagcggccgcac60tc62<210>6<211>62<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>primer<400>6taggccatggtttacctctggaaaagactggagacctttgaggagatcttcgccggcgtg60ag62<210>7<211>38<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>primer<400>7atccggcccagccggccgcgctcctgctgtgcttcgtg38<210>8<211>33<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>primer<400>8atccgcggccgcagcgcgatttgaaggagggac33<210>9<211>12<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>primer<400>9atccgcggccgc12<210>10<211>10<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>primer<400>10atcccctagg10<210>11<211>32<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>primer<400>11atccggatcctggtatggagacagacacactc32<210>12<211>29<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>primer<400>12atccctcgagctttccagcttggtccccc29权利要求1.基本上纯化形式的胰腺腺癌特异抗原3C4-Ag，其特征在于使用SDS-PAGE确定的分子量为大约43.5kDa；通过等电聚焦确定的pI为大约4.5到大约5.0；是非糖基化或很少糖基化的；以及主要位于大鼠和人的胰腺癌细胞的表面，但在正常的非增殖性细胞中没有检测到。2.可溶性胰腺腺癌特异抗原3C4-Ag，通过SDS-PAGE确定其分子量为大约36到大约38kD，并可以从胰腺癌病人的血清和其它体液中分离。3.权利要求1的胰腺腺癌特异抗原3C4-Ag的免疫活性片段。4.对胰腺腺癌特异抗原3C4-Ag具有结合特异性的抗体或其结合片段，其中该抗原的特征在于使用SDS-PAGE确定的分子量为大约43kDa；通过等电聚焦确定的pI为大约4.5到大约5.0；是非糖基化或很少糖基化的；以及主要位于大鼠和人的胰腺癌细胞的表面，但在正常的非增殖性细胞中没有检测到。5.权利要求4的抗体或其结合片段，也与可溶性胰腺腺癌特异抗原结合，该抗原通过SDS-PAGE确定其分子量为大约36到大约38kD，并可以从胰腺癌病人的血清和其它体液中分离。6.权利要求4或5的抗体，其是多克隆抗体。7.权利要求4或5的抗体，其是单克隆抗体。8.产生单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞系，该单克隆抗体与权利要求1或2的3C4-Ag抗原进行特异性免疫反应。9.产生权利要求4的单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞系。10.权利要求9的杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体mAb3C4。11.权利要求7或10的单克隆抗体mAb3C4的人源化形式。12.权利要求4或5的抗体，其中的抗体用荧光团、化学发光团、化学荧光试剂、光敏试剂、悬浮颗粒、放射性同位素或酶标记。13.权利要求10的抗体，其中的抗体用荧光团、化学发光团、化学发光试剂、光敏试剂、悬浮颗粒、放射性同位素或酶标记。14.权利要求4或5的抗体，其中的抗体偶联或连接到治疗性药物或毒素上。15.权利要求14的抗体，其中的治疗性药物或毒素是具有SEQPPLSQETFSDLWKLL(SEQIDNO1)所示氨基酸序列中的至少大约6个连续氨基酸的肽或其类似物或衍生物。16.权利要求15的抗体，其中的来自antennapedia蛋白的penetratin序列位于肽的羧基末端，其具有氨基酸序列KKWKMRRNQFWVKVQRG(SEQIDNO4)。17.权利要求10的抗体，其中的抗体偶联或连接到治疗性药物或毒素上。18.在动物对象中检测胰腺癌的方法，该方法包括下列步骤(a)将来自对象的细胞、组织或体液样品与特异性结合3C4-Ag或其免疫活性片段的至少一个抗体或其结合片段、单克隆抗体mAb3C4、或结合被单克隆抗体mAb3C4结合的表位的抗体，在允许该抗体特异性结合样品中的抗原以形成抗体-抗原复合物的条件下接触；(b)检测样品中的抗体-抗原复合物；以及(c)将检测到的样品中抗体-抗原复合物水平的升高与胰腺癌的存在相关联。19.适合于检测病人的细胞、组织或体液样品中的3C4-Ag的诊断试剂盒，该试剂盒包括(a)特异性结合3C4-Ag或其免疫活性片段的抗体或其结合片段；(b)抗体或其结合片段的特异性结合配体的连接物；以及(c)检测结合的抗体的标记物。20.在患有胰腺癌的病人中治疗该病的方法，包括给病人施用有效量的与3C4-Ag或其具有免疫活性的片段特异性结合的抗体或其结合片段，其中该抗体或其结合片段与治疗性的药物或毒素结合或连接。21.权利要求20的方法，其中该抗体是mAb3C4。22.权利要求20或21的方法，其中的治疗性药物或毒素是具有SEQPPLSQETFSDLWKLL(SEQIDNO1)所示氨基酸序列中的至少大约6个连续氨基酸的肽或其类似物或衍生物。23.药物组合物，含有特异性结合3C4-Ag1的抗体或其结合片段，并与可药用的载体混合。24.权利要求23的药物组合物，其中特异性结合3C4-Ag的抗体或其结合片段与治疗性的药物或毒素结合或连接。全文摘要本发明涉及了在大鼠和人胰腺癌细胞表面发现的抗原，并提供了高特异性和选择性针对该抗原的抗体以及分泌该对象抗体的杂交瘤。此外还提供了诊断和治疗胰腺癌的方法。胰腺腺癌的组织标记物——一种被命名为PaCa－AgI的大约43.5kD的表面膜蛋白——在正常胰腺中完全不表达，但是在胰腺腺癌细胞中表达丰富。此外，使用目标抗体，在胰腺癌病人的血清和其它体液中容易地鉴定到了可溶形式的PaCa－AgI的存在，其分子量为大约36到大约38kD。文档编号C07K5/00GK1761482SQ200480007347公开日2006年4月19日申请日期2004年1月16日优先权日2003年1月17日发明者约瑟夫·米希尔,斯特凡·M·布拉杜,拉奎布·汉南,马修·R·平卡斯申请人:纽约州立大学研究基金会