寡肽的制作方法

专利名称：寡肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有毛发生长促进作用的寡肽，以及含有该寡肽作为有效成分的医药品。
背景技术：
已有提示表明，上皮组织的正常形态形成受到存在于上皮组织周围的间充质细胞来源的因子的调控，此外，鉴于很多起因于上皮组织形态形成异常的疾病的病因在于间充质细胞异常，因而，间充质细胞调控上皮组织的形态形成的机制的阐明受到广泛关注。然而，由于参与调控上皮组织形态形成的物质群的表达在复杂体系中受到时间和空间性调控，将这些物质分离并对其功能进行解析是非常困难的，此外，将上皮组织的形态形成单纯化，构建实验模型体系也很难，因而，该领域的研究到目前为至还未见很大进展。为了阐明起因于上皮组织形态形成的疾病的发病机制，建立这些疾病的治疗方法等，上皮组织形态形成的调控机制的解析为人们所急切期待。
在这种情况下，参与控制上皮组织形态形成的表皮形态发生素被分离和纯化(欧洲专利公开第0562123号(美国专利第5,726,298号))。已表明，该物质是以由277到289个氨基酸构成的蛋白质作为核心蛋白质的生理活性物质，主要由间充质细胞生物合成。此外也已表明，表皮形态发生素作用于上皮细胞，具有促进上皮组织形态形成的作用，并且在表皮形态发生素不发挥作用的情况下，组织形成不能正常进行。
对于表皮形态发生素的结构，已发现表皮形态发生素分子在结构上大致分为4个片段(欧洲专利公开第0698666号)。即，构成表皮形态发生素全长的多肽，从N-末端侧起可分为卷曲螺旋(coiled-coil)区域(1)、功能区域(2)、卷曲螺旋区域(3)、以及C-末端疏水性区域。这些片段中，对于功能区域(人表皮形态发生素中，从N-末端第104到187个氨基酸的特定区域)，已有提示表明，该区域参与细胞粘附，和表皮形态发生素的生理活性表达密切相关(上述欧洲专利公开)。
由于表皮形态发生素具有促进正常形态形成的作用，该物质用作预防和治疗起因于形态形成异常的疾病等的医药品，或者是生发剂等医药品的有效成分是值得期待的。然而，由哺乳动物得到的天然型表皮形态发生素难溶于生理盐水等水溶性溶剂，作为医药品其实际应用存在困难。因而，人们正尝试研制和开发溶解性优异，同时基本上保持了天然型表皮形态发生素的形态形成促进作用的表皮形态发生素衍生物。例如已知，除去C-末端部疏水性区域得到的变异体(片段123)(欧洲专利公开第0562123号(美国专利第5,726,298号))。
已表明，具有表皮形态发生素部分结构的多肽作用于上皮细胞，促进上皮组织形态形成(欧洲专利公开第1008603号)。该多肽是可溶于生理盐水等水性溶剂的多肽，上述出版物中有该多肽具有毛发生长促进作用的的教导和启示。此外，欧洲专利公开第1288221号中公开了具有毛发生长促进作用的寡肽，其是表皮形态发生素的结构中的一部分。

发明内容
本发明的课题在于提供具有毛发生长促进作用的寡肽。本发明的另一课题在于提供纯化效率高的上述寡肽。本发明的又一课题在于提供含有上述寡肽作为有效成分的医药品。
本发明人为解决上述课题锐意努力的结果发现，通过用含有羰基的修饰基团对作为表皮形态发生素部分结构的、寡肽中的Cys残基或Lys残基进行修饰，得到的寡肽具有优良的促进毛发生长作用。进而，本发明人发现，通过在作为表皮形态发生素的部分结构的寡肽的氨基酸序列中导入连接基团，形成分子内环状结构所得到的寡肽，在显示优良的纯化效率的同时，具有优良的毛发生长促进作用。本发明是基于这些发现而完成的。
即，根据本发明，提供毛发生长促进作用的寡肽或其修饰寡肽，其是由包含下式(I)到(IV)中的任意氨基酸序列的5到100个氨基酸残基构成的寡肽。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(I)X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7(II)X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7(III)X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7(IV)
(式中，X1表示氨基酸残基Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met，或者是缺失，X2表示氨基酸残基Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、Cys或Met，或者是缺失，X3表示氨基酸残基Glu、Lys、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、Cys或Asp，X4表示氨基酸残基Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His、Cys或Lys，X5表示氨基酸残基Ser、Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met，X6表示与含有羰基的修饰基团连接的Cys氨基酸残基，或与含有羰基的修饰基团连接的Lys氨基酸残基，并且X7表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu，或者是缺失。)优选X1表示Ser氨基酸残基，X2表示Ile氨基酸残基，X3表示Glu氨基酸残基，X4表示Gln氨基酸残基，X5表示Ser氨基酸残基，X6表示与含有羰基的修饰基团连接的Cys氨基酸残基，并且X7表示Glu或Ala氨基酸残基。
优选提供由上述式(I)到(IV)任意氨基酸序列构成的包含5到7个氨基酸残基的寡肽。
根据本发明的其他方面，提供具有毛发生长促进作用的寡肽或其修饰寡肽，其是由包含下式(XI)到(XIV)的任意氨基酸序列的6到100个氨基酸残基构成的寡肽。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(XI)XI-X2-X3-X4-X6-X5-X7-X8-X9(XII)X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7-X8-X9(XIII)X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7-X8-X9(XIV)(式中，X1表示氨基酸残基Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met，或者是缺失，X2表示氨基酸残基Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、Cys或Met，或者是缺失，X3表示氨基酸残基Glu、Lys、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、Cys或Asp，X4表示氨基酸残基Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His、Cys或Lys，X5表示氨基酸残基Ser、Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met，X6表示与含有羰基的修饰基团连接的Cys氨基酸残基，或与含有羰基的修饰基团连接的Lys氨基酸残基，X7表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu，或者是缺失，X8表示氨基酸残基Gln，并且X9表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu。)优选X7和X9中的至少一个是氨基酸残基Asp以外的氨基酸残基。
进而优选X1表示Ser氨基酸残基，X2表示Ile氨基酸残基，X3表示Glu氨基酸残基，X4表示Gln氨基酸残基，X5表示Ser氨基酸残基，X6表示与含有羰基的修饰基团连接的Cys氨基酸残基，X7表示Glu或Ala氨基酸残基，X8表示Gln氨基酸残基，并且X9表示Glu氨基酸残基。
优选提供由上述式(XI)到(XIV)中的任意氨基酸序列构成的包含7到9个氨基酸残基的寡肽。
优选X6表示末端连接有具有羰基的修饰基团的Cys氨基酸残基，或末端连接有具有羰基的修饰基团的Lys氨基酸残基。
优选在修饰基团内部羰基连接于碳原子数为2到10的烃链。
优选在修饰基团内部羰基连接于碳原子数为3到7的烃链。
优选修饰基团是N-β-马来酰亚胺丙酸来源的修饰基团，N-ε-马来酰亚胺己酸来源的修饰基团，或N-κ-马来酰亚胺十一酸来源的修饰基团。
优选提供以下任意寡肽或其修饰寡肽。
Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Xaa-Ala-Gln-Glu(序列1)Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Xaa-Glu-Gln-Glu(序列2)Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Xaa-Glu-Gln-Glu-Ala(序列3)
(式中，Xaa表示连接有N-ε-马来酰亚胺己酸来源的修饰基团的Cys氨基酸残基。)根据本发明的其他方面，提供包含上述记载的任意寡肽或其修饰寡肽或其生理学上可接受的盐作为有效成分的医药品和毛发生长促进剂。
根据本发明的又一方面，提供上述寡肽或其修饰寡肽或其生理学上可接受的盐，在制备上述医药品或毛发生长促进剂中的用途；以及毛发的生长促进方法，该方法包含将有效量的上述寡肽或其修饰寡肽或其生理学上可接受的盐施用于包含人在内的哺乳动物的步骤。
根据本发明的又一方面，提供由下述式(1)的氨基酸序列构成的具有毛发生长促进作用的环状寡肽或其修饰寡肽。
(式中，X1表示氨基酸残基Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met，或者是缺失，X2表示氨基酸残基Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、或Met，或者是缺失，X3表示氨基酸残基Glu、Lys、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、或Asp，X4表示氨基酸残基Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His、或Lys，X5表示氨基酸残基Ser、Trp、Phe、Thr、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met，X6表示氨基酸残基Cys，X7表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu，或者是缺失，Y缺失或者表示1-90个氨基酸序列，L表示连接基团。)优选X1表示Ser氨基酸残基，X2表示Ile氨基酸残基，X3表示Glu氨基酸残基，X4表示Gln氨基酸残基，X5表示Ser氨基酸残基，X6表示Cys氨基酸残基，X7表示Glu或Ala氨基酸残基。
优选Y缺失或者是表示1-12个氨基酸序列。
优选提供具有由下式(2)构成的氨基酸序列的，具有毛发生长促进作用的环状寡肽或其修饰寡肽。
(式中，X1表示氨基酸残基Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met，或者是缺失，X2表示氨基酸残基Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、或Met，或者是缺失，X3表示氨基酸残基Glu、Lys、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、或Asp，X4表示氨基酸残基Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His、或Lys，X5表示氨基酸残基Ser、Trp、Phe、Thr、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met，X6表示氨基酸残基Cys，X7表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu，或者是缺失，X8表示氨基酸残基Gln，X9表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu，L表示连接基团。)优选X7和X9中的至少一方是氨基酸残基Asp以外的氨基酸残基。
优选X1表示Ser氨基酸残基，X2表示Ile氨基酸残基，X3表示Glu氨基酸残基，X4表示Gln氨基酸残基，X5表示Ser氨基酸残基，X6表示Cys氨基酸残基，X7表示Glu或Ala氨基酸残基，X8表示Gln氨基酸残基，并且X9表示Glu氨基酸残基。
根据本发明的其他方面，提供由下式(3)的氨基酸序列构成的，具有毛发生长促进作用的环状寡肽或其修饰寡肽。
(式中，X1表示氨基酸残基Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met，或者是缺失，X2表示氨基酸残基Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、或Met，或者是缺失，X3表示氨基酸残基Glu、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、或Asp，X4表示氨基酸残基Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser或his，X5表示氨基酸残基Ser、Trp、Phe、Thr、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met，X6表示氨基酸残基Lys，X7表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu，或者是缺失，Y缺失或者表示1-90个氨基酸序列，L表示连接基团，Z表示能够和Lys反应而连接的基团。)优选X1表示Ser氨基酸残基，X2表示Ile氨基酸残基，X3表示Glu氨基酸残基，X4表示Gln氨基酸残基，X5表示Ser氨基酸残基，X6表示Cys氨基酸残基，X7表Glu或Ala氨基酸残基。
优选Y缺失或者是表示1-12个氨基酸序列。
优选提供具有由下式(4)构成的氨基酸序列，具有毛发生长促进作用的环状寡肽或其修饰寡肽。
(式中，X1表示氨基酸残基Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met，或者是缺失，X2表示氨基酸残基Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、或Met，或者是缺失，X3表示氨基酸残基Glu、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、或Asp，X4表示氨基酸残基Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser或his，X5表示氨基酸残基Ser、Trp、Phe、Thr、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met，X6表示氨基酸残基Lys，X7表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu，或者是缺失，X8表示氨基酸残基Gln，
X9表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu，L表示连接基团，Z表示能够和Lys反应而连接的基团。)优选X7和X9中的至少一方是氨基酸残基Asp以外的氨基酸残基。
优选X1表示Ser氨基酸残基，X2表示Ile氨基酸残基，X3表示Glu氨基酸残基，X4表示Gln氨基酸残基，X5表示Ser氨基酸残基，X6表示与含有羰基的修饰基团连接的Cys氨基酸残基，X7表示Glu或Ala氨基酸残基，X8表示Gln氨基酸残基，并且X9表示Glu氨基酸残基。
优选连接基团L的碳原子数为6到8。
优选在连接基团L内羰基连接于碳原子数为5到7的烃链。
优选连接基团L是-CO-(CH2)n-NH-(式中，n表示5-7的整数)。
优选连接基团L中的-CO和X1连接，连接基团L中的NH-和连接于X6的Cys残基或Z表示的基团连接。
尤其优选提供以下任意环状寡肽或其修饰寡肽。
根据本发明的又一方面，提供包含上述任意环状寡肽或其修饰寡肽或其生理学上可接受的盐作为有效成分的医药品和毛发生长促进剂。
根据本发明的又一方面，提供包含上述任意环状寡肽或其修饰寡肽或其生理学上可接受的盐，以及米诺地尔作为有效成分的毛发生长促进剂。
根据本发明的又一方面，提供上述寡肽或其修饰寡肽或其生理学上可接受的盐，在制备上述医药品或毛发生长促进剂中的用途；以及毛发的生长促进方法，该方法包含将有效量的上述寡肽或其修饰寡肽或其生理学上可接受的盐施用于包含人在内的哺乳动物的步骤。


图1表示以液相色谱法对合成的寡肽，以及和修饰样品的反应产物进行解析的结果。
图2表示以液相色谱法对合成的寡肽，以及和修饰样品的反应产物进行解析的结果。
图3表示采用液相色谱法对合成的寡肽，以及和修饰样品的反应产物进行解析的结果。
图4表示各种寡肽的毛发生长促进作用的评价结果。
图5表示各种寡肽的毛发生长促进作用的评价结果。
图6表示化合物(11)的HPLC分析结果。
图7表示化合物(12)的HPLC分析结果。
图8表示化合物(13)的HPLC分析结果。
图9表示化合物(14)的HPLC分析结果。
图10表示本发明的环状寡肽的毛发生长促进作用。
图11表示本发明的环状寡肽的毛发生长促进作用。
图12表示本发明的环状寡肽和米诺地尔并用时的毛发生长促进作用。
具体实施例方式
以下对本发明的实施方式进行详细说明。
本发明的第一种实施方式的寡肽是包含下式(I)到(IV)的任意氨基酸序列的由5到100个氨基酸残基构成的、具有毛发生长促进作用的寡肽。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(I)X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7(II)X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7(III)X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7(IV)(式中，X1表示氨基酸残基Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met，或者是缺失，X2表示氨基酸残基Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、Cys或Met，或者是缺失，X3表示氨基酸残基Glu、Lys、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、Cys或Asp，X4表示氨基酸残基Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His、Cys或Lys，X5表示氨基酸残基Ser、Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met，X6表示与含有羰基的修饰基团连接的Cys氨基酸残基，或与含有羰基的修饰基团连接的Lys氨基酸残基，并且X7表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu，或者是缺失。)本发明的第二种实施方式的寡肽是包含下式(XI)到(XIV)的任意氨基酸序列的由6到100个氨基酸残基构成的寡肽，是具有毛发生长促进作用的寡肽。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(XI)X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7-X8-X9(XII)X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7-X8-X9(XIII)X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7-X8-X9(XIV)(式中，X1到X7表示和上述一样的氨基酸残基，X8表示Gln氨基酸残基，X9表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu。)此外，本发明中，优选X7和X9中的至少一方是氨基酸残基Asp以外的氨基酸残基。原因在于，当X7和X9中的至少一方是氨基酸残基Asp以外的氨基酸残基时，不会发生当X7和X9均为Asp氨基酸残基时所出现的起因于天冬氨酸的β转换(琥珀酰亚胺)，使得合成收率提高。尤其优选X7是氨基酸残基Asp以外的氨基酸残基。这是因为X7的Asp常发生β转换。
上述氨基酸序列(I)到(IV)以及(XI)到(XIV)，是对欧洲专利公开第1008603号公开的多肽(II)的从C-末端起的11个氨基酸残基进行改造，即将其从N-末端起的1个氨基酸残基(Lys)和从C-末端起的2个氨基酸残基(Asp-Glu)除去后得到的氨基酸序列，或在该氨基酸序列中进一步将半胱氨酸残基(Cys)的位置予以改变而得到的氨基酸序列，是将该Cys残基替换为连接有含有羰基的修饰基团的Cys氨基酸残基，或连接有含有羰基的修饰基团的Lys氨基酸序列而得到的氨基酸序列作为基础，再缺失、替换、以及/或添加1-几个氨基酸而得到的氨基酸序列。包含上述氨基酸序列(I)-(IV)以及(XI)到(XIV)的寡肽，如以下实施例所具体显示的那样，具有优良的毛发生长促进作用。
在氨基酸序列(I)到(IV)以及(XI)到(XIV)中，X6表示连接有含有羰基的修饰基团的Cys氨基酸残基，或连接有含有羰基的修饰基团的Lys氨基酸残基。
根据本发明的优选实施方式，修饰基团是末端具有羰基的修饰基团。此外，根据本发明的进一步优选实施方式，在修饰基团内部羰基连接于碳原子数为2到10的烃链，更优选碳原子数3到7的烃链。
本发明中，在X6表示与含有羰基的修饰基团连接的Cys氨基酸残基时，作为修饰基团的具体例子，可以举出优选N-β-马来酰亚胺丙酸来源的修饰基团，N-ε-马来酰亚胺己酸来源的修饰基团，或N-κ-马来酰亚胺十一酸来源的修饰基团。这种修饰基团通过使N-β-马来酰亚胺丙酸、N-ε-马来酰亚胺己酸或N-κ-马来酰亚胺十一酸等试剂和寡肽反应，使得寡肽中的半胱氨酸残基的巯基和上述试剂反应，从而可导入到寡肽中半胱氨酸残基。
此外，本发明中，在X6表示与含有羰基的修饰基团连接的Lys氨基酸残基时，作为修饰基团的具体例子，和上述X6表示与含有羰基的修饰基团连接的Cys氨基酸残基的情况一样。
本发明的寡肽，是包含式(I)到(IV)或(XI)到(XIV)任意氨基酸序列的由5到100个氨基酸残基构成的寡肽。例如，氨基酸残基的数目下限值可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，上限值可以是15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100。氨基酸残基的数目优选是5到40，更优选6到30，尤其优选7-20，进而优选7-15，进而优选7-12，特别优选7-10。在氨基酸残基的数目选择上，期待使得寡肽可溶于生理盐水或水等水性溶剂，具有生物学活性。
本发明的第三种实施方式中的多肽，是由下式(I)的氨基酸序列构成的、具有毛发生长促进作用的环状寡肽或其修饰寡肽。
(式中，X1表示氨基酸残基Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met，或者是缺失，X2表示氨基酸残基Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、或Met，或者是缺失，X3表示氨基酸残基Glu、Lys、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、或Asp，X4表示氨基酸残基Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His、或Lys，X5表示氨基酸残基Ser、Trp、Phe、Thr、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met，X6表示氨基酸残基Cys，X7表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu，或者是缺失，Y缺失或者表示1-90个氨基酸序列，L表示连接基团。)作为上述寡肽的优选具体例子，可举出具有由下式(2)构成的氨基酸序列的，具有毛发生长促进作用的环状寡肽或其修饰寡肽。
(式中，X1-X7以及L和式(1)同义，X8表示氨基酸残基Gln，X9表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu。)本发明的第四种实施方式的寡肽，是由下式(3)的氨基酸序列构成的具有毛发生长促进作用的环状寡肽或其修饰寡肽。
(式中，X1表示氨基酸残基Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met，或者是缺失，X2表示氨基酸残基Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、或Met，或者是缺失，X3表示氨基酸残基Glu、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、或Asp，X4表示氨基酸残基Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser或his，X5表示氨基酸残基Ser、Trp、Phe、Thr、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met，X6表示氨基酸残基Lys，X7表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu，或者是缺失，Y缺失或者表示1-90个氨基酸序列，L表示连接基团，Z表示能够和Lys反应而连接的基团。)作为上述寡肽的优选具体例子，可以举出具有由下式(4)构成的氨基酸序列并具有毛发生长促进作用的环状寡肽或其修饰寡肽。
(式中，X1-X7、L以及Z和式(3)同义，X8表示氨基酸残基Gln，X9表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu。)此外，本发明中，优选X7和X9中至少一方是氨基酸残基Asp以外的氨基酸残基。原因在于，在X7和X9中至少一方是氨基酸残基Asp以外的氨基酸残基时，不会发生当X7和X9均为Asp氨基酸残基时所出现的起因于天冬氨酸的β转换(琥珀酰亚胺)，使得合成收率提高。尤其优选X7是氨基酸残基Asp以外的氨基酸残基。这是因为X7的Asp常发生β转换。
上述氨基酸序列是对欧洲专利公开第1008603号公开的多肽(II)的从C-末端起的11个氨基酸残基进行改造，即将其从N-末端起的1个氨基酸残基(Lys)和从C-末端起的2个氨基酸残基(Asp-Glu)除去，以该得到的氨基酸序列为基础的氨基酸序列。
上述本发明的环状寡肽如下述实施例所具体显示的那样，在以30％乙腈、0.1％三氟乙酸处理，然后干燥后，也可以发挥优良的毛发生长促进作用。以30％乙腈、0.1％三氟乙酸处理，由于也是以逆相色谱法纯化时寡肽的供给条件，因而本发明的环状寡肽可以使用逆相色谱纯化，从而能够进一步提高纯化效率。
在氨基酸序列(1)到(4)中，X6表示Cys或Lys氨基酸残基，尤其优选X6表示Cys氨基酸残基。
本发明的环状寡肽的特征在于，X1和X6经由-L-Cys-(式中，L表示和X1连接的连接基团，Cys表示和X6连接的Cys残基)或-L-Z(式中，L表示和X1连接的连接基团，Z表示能够和Lys反应而连接的基团)而连接形成分子内环状结构。作为能够和Z所表示的能够和Lys反应而连接的基团的具体例子，可以举出N-羟基琥珀酰亚胺酯基，酰亚胺酯基、羟基甲膦等。
作为L所表示的连接基团的具体例子，可以举出碳原子数为6到8的连接基团，例如，可以举出羰基连接于碳原子数为5到7的烃链的连接基团等。作为连接基团L的具体例子，可以举出-CO-(CH2)n-NH-(式中，n表示5-7的整数)。在上述连接基团L中，-Co可和X1连接，NH-可和连接于X6的Cys残基或Z连接。
本发明的环状寡肽，是具有式(1)或(3)的氨基酸序列的由5到98个氨基酸残基构成的寡肽。氨基酸残基的数目优选范围是5到20，更优选是7到15，进而优选是7到12，尤其优选是7到10。在氨基酸残基数目的选择上，期望使寡肽可溶于生理盐水或水等水性溶剂，并具有生物学活性。
以下，将从上述第一种实施方式到第四种实施方式的寡肽(即，包含式(I)到(IV)中的任意氨基酸序列的5到100个氨基酸残基构成的、具有毛发生长促进作用的寡肽；包含式(XI)到(XIV)的任意氨基酸序列的由5到100个氨基酸残基构成的、具有毛发生长促进作用的寡肽；由式(1)的氨基酸序列构成的、具有毛发生长促进作用的环状寡肽；以及由式(3)氨基酸序列构成的具有毛发生长促进作用的环状寡肽)称为本发明的寡肽。
本发明寡肽中的氨基酸残基的种类没有特别限制，可以是天然型氨基酸残基、非天然型氨基酸残基或它们的衍生物。即，氨基酸可以是L-氨基酸，也可以是D-氨基酸，还可以是它们的混合物。此外，作为氨基酸的种类，可以是α-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸、δ-氨基酸，优选是天然型氨基酸α-氨基酸。
本说明书中所说非天然型氨基酸是指，除了构成天然蛋白质的20种天然型氨基酸(甘氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸)以外的全部氨基酸，具体可以举出，(1)将天然型氨基酸中的原子替换为其他物质而得到的非天然型氨基酸、(2)天然型氨基酸侧链的光学异构体、(3)天然型氨基酸侧链中导入取代基而得到的非天然型氨基酸、以及(4)将天然型氨基酸的侧链予以取代，从而改变疏水性、反应性、电荷状态、分子大小、氢结合能等而得到的非天然型氨基酸等。
本发明的寡肽的其他实施方式，是包含上述氨基酸序列(I)到(IV)、(XI)到(XIV)的由5到100个氨基酸残基构成的寡肽，是具有毛发生长促进作用的寡肽的修饰寡肽，是和上述本发明的寡肽具有相同的毛发生长促进作用的修饰寡肽。
本发明的寡肽的其他实施方式，是包含上述氨基酸序列(1)到(4)的任意序列的由7到98个氨基酸构成的寡肽，是具有毛发生长促进作用的寡肽的修饰寡肽，是和上述本发明的寡肽具有相同的毛发生长促进作用的修饰寡肽。
通过本说明书实施例中详细且具体记载的实验方法，或这是将上述实验方法适宜更改或调整，本领域技术人员可很容易确认出，本发明的寡肽或修饰寡肽具有毛发生长促进作用。作为该种方法的具体例子，可举出以下方法，但并不局限于这些方法。
(1)已经知道，C3H和C57BL/6小鼠从出生后第45天到95天前后，约有50天的休止期。皮肤的颜色在该休止期为粉红色，而在成长期为灰色或黑色，因而很容易判定毛发周期。将待检物质施用于该小鼠，通过判断其是否促进向成长期推进，可评价育毛活性。
(2)使用特异性识别存在于上皮性新生毛囊中的抗原(例如可举出，约220Kda的抗原)的单克隆抗体(例如，保藏号为FERM BP-8121的杂交瘤产生的单克隆抗体)或其片段来评价育毛活性。更为具体地，在待检物质存在下培养生物体来源的皮肤组织，然后回收该皮肤组织片，使其和上述单克隆抗体或其片段反应，通过检测或测定和皮肤组织片反应的该单克隆抗体或其片段，可测定存在于上皮性新生毛囊中的抗原的表达量，评价育毛活性。或者是，切下皮肤，将其在待检物质存在下培养，再将培养物中的蛋白质和前述单克隆抗体反应，由该反应结果可评价育毛活性。
本发明的修饰寡肽中，“修饰”一词是包含化学修饰和生物学修饰，应该解释为最广义的修饰。作为修饰的例子，例如可以举出，烷基化、酯基化、卤化或氨基化等官能团的导入，氧化、还原、加成、或解离等官能团改变，糖化合物(单糖、二糖、寡糖或多糖)或脂质化合物等的导入，磷酸化，或生物素化等，但并不局限于这些。
作为优选的修饰寡肽，可以举出生物素化的寡肽，作为更优选的修饰寡肽，可以举出经由间隔子(spacer)或不经过间隔子而将生物素连接于N-末端而得到的寡肽。在上述修饰寡肽中，在不损害所希望的生理活性的限度内也可对生物素进行适宜化学修饰。为了经由适宜长度的间隔子而将生物素导入到寡肽的N-末端，例如可以使用NHS-Biotin或NHS-LC-Biotin(都可从Pierce公司得到)。
上述本发明的各种寡肽(也包含修饰寡肽)，可以是游离状态，也可以酸式盐或碱式盐的形式提供。作为酸式盐，例如可以举出，盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等无机酸盐，或对甲苯磺酸盐、甲基磺酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、马来酸盐、酒石酸盐等有机酸盐。作为碱式盐，例如可以举出，钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等金属盐，铵盐、甲铵盐、三甲基铵盐等有机铵盐。有时和甘氨酸等氨基酸形成盐，有时在分子内形成配对离子。
此外，这些寡肽或其盐，有时作为水合物或溶剂合物存在。上述寡肽具有多个手性碳。各手性碳的立体结构没有特别限定，但优选氨基酸残基是L-氨基酸。基于这些手性碳的光学活性体、非对映(diastero)异构体等立体异构体、立体异构体的任意混合物，外消旋体等也都包含在本发明范围内。
本发明的寡肽，可以通过肽合成中常使用的固相法和液相法等化学方法合成。有关肽合成过程中的氨基等保护基和缩合反应的缩合剂，有大量现成的书籍可以参考。固相法可以使用市售各种肽合成装置。根据需要，可以通过官能团的保护和脱保护，更有效进行合成反应。有关保护基的导入和去除方法，例如可以参考Protective Groupsin Organic Synthesis，T.W.Greene，John Wiley & Sons，Inc.(1981年)。此外，包括化学修饰或生物修饰等在内的修饰寡肽的制造方法，已为本领域技术人员所周知，可以使用任何方法。
此外，依据通常的基因表达操作等生物学方法，制备包含编码上述寡肽的DNA序列的重组载体后，由该载体制备经过转化的微生物(转化体)，可从培养该转化体的培养基中分离纯化得到所期望的寡肽。但上述寡肽的制造方法并不局限于这些化学和生物学方法。此外，包括化学修饰或生物学修饰等在内的修饰寡肽的制造方法，已为本领域技术人员所周知，可以使用任何方法。
接着，对本发明的寡肽是环状寡肽时的制造方法进行更具体说明。本发明的环状寡肽可依据以下(1)-(3)的顺序合成。
(1)首先，化学合成相当于连接基团L(-CO-(CH2)n-NH-)的HOOC-(CH2)n-NH2(式中，n表示5-7的整数)。
(2)接着，依照上述那样的肽合成常规方法，合成Cys-L-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(X6是Cys时)所表示的寡肽或Z-L-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(X6是Lys时)。例如，使用市售肽自动合成仪(例如，applied Biosystem公司的肽自动合成仪430A型)，依照程序由C端开始以BOC法依次延长肽链，可合成所要的保护肽树脂。
(3)最后，X6是Cys时，N末端的Cys残基和X6所表示的Cys通过共价键连接。该共价键的形成可依照常规方法进行。具体而言，通过使带有游离巯基的寡肽在醋酸溶液中发生碘氧化反应，从而进行环化反应，可形成上述共价键。
此外，X6是Lys时，N末端的Z残基和X6所表示的Lys通过共价键连接。该共价键的形成可依照常规方法进行。
本发明的寡肽可用作医药品的有效成分。本说明书中的医药品一词，除了用于包含人在内的哺乳类动物疾病的预防或治疗外，也包括有时划归于医药类外品或化妆品的毛发促进剂等，意义非常广泛。
本发明的医药品的施用对象、药效以及本发明的医药品的疾病治疗对象的具体例子列举如下(1)本发明的寡肽表现出血管再生作用、再生促进作用、心脏血管再生作用、血管内皮细胞诱导作用等，可有效预防和治疗慢性闭塞性动脉硬化症、闭塞性血栓性脉管炎、重症心绞痛、动脉硬化症等(ExpCell Res 1996 Jan 10，222(1)189-98)。
(2)本发明的寡肽参与肾脏上皮的形态形成，可有效预防和治疗糖尿病等(J Cell Bio 2001，Mar 5；152(5)911-22)。
(3)本发明的寡肽参与肝脏的形成(再生)，可有效预防和治疗肝代谢障碍(Biochem Biophys Res Commun 1998 Sep18；250(2)486-90)。
(4)本发明的寡肽参与骨骼和牙齿形成，可有效预防和治疗牙周病、骨折、骨癌、骨缺损、骨质疏松(Arch Oral Biol 1995Feb；40(2)161-4)。
(5)本发明的寡肽参与肺分枝形态形成和肺纤维病，可有效预防和治疗肺病(Biochem Biophys Res Commun 1997 May19；234(2)522-5；以及Am J Respir Cell Mol Biol 2000Aug；23(2)168-74)。
(6)本发明的寡肽参与肠褶皱的形成，可有效预防和治疗肠道疾病(AM J Physiol 1998 Jul；275(1pt1)G 114-24)。
(7)本发明的寡肽参与肌肉构造的维持，例如，可有效预防和治疗肌肉distrophy(Histochem J 1998 Dec；30(12)903-8)。
(8)本发明的寡肽参与胆囊上皮的形成，可有效预防和治疗胆囊疾病(Cell Tissue Res 2000 May；300(2)331-44)。
(9)本发明的寡肽参与乳腺上皮的形成形成，可有效预防和治疗乳腺病(J Cell Biol 2001 May 14；153(4)785-94)。
这些之中，最优选作为毛发生长促进剂使用。
本说明书中使用的“毛发生长促进剂”一词应该理解为包含新生毛发促进、毛发生长促进以及毛发脱落预防等很长广的含义，并且也不能理解为局限于任何含义。
此外，本发明的环状寡肽或其修饰寡肽或其生理学上可接受的盐作为毛发生长促进剂使用时，也可以和米诺地尔组合使用。
作为本发明的医药品，可以从上述寡肽或其生理学上可接受的盐中选择的1种或1种以上的物质直接使用，但通常优选将1种或1种以上的上述物质作为有效成分，并添加制剂学上允许的1种或1种以上制剂用添加剂，制成医药组合物使用。含有1种或1种以上的上述寡肽作为有效成分的毛发生长促进剂，可以作为乳膏剂、喷雾剂、涂抹用溶液剂或贴剂等外用剂使用，也可作为注射剂直接用于患处，可制成适用于作为毛发生长促进剂使用的适宜形态的制剂。
例如，可配合洗发香波、营养护发剂使用作为有效成分的上述寡肽，也可将上述寡肽封入脂质体等中制成制剂。这种形态的组合物也包含在本发明的医药品中。为了使作为有效成分的寡肽通过皮肤的角质层有效透皮吸收，在乳膏剂等中配合使用适宜的表面活性剂或脂溶性物质等是很合适的。
为了对哺乳动物局部施用，本发明的组合物可供作为包括洗液、乳膏、凝胶剂、药签(sticks)、喷雾剂、软膏、糊状剂等在内(但并不局限于这些)的多种形态的剂型使用。这些剂型包含包括溶液、乳浊液、凝胶剂、固体以及脂质体等在内的多种调和形态。
本发明的组合物配制成溶液局部使用时，其有用组成一般可举出药学上可接受的水性或有机溶剂。“药学上可接受的有机溶剂”是指可分散或溶解本发明的寡肽的，并且安全性(例如，刺激性和敏感性等)符合要求的溶剂。作为适宜的有机溶剂的具体例子，可以举出，丙二醇、聚乙二醇(200-600)、聚丙二醇(425-2025)、甘油、1，2，4-丁三醇、山梨醇酯、1，2，6-己三醇、乙醇、异丙醇、丁二醇以及它们的混合物等。
在将局部用组合物配制成溶胶剂，作为喷雾剂用于皮肤时，在溶液组合物中添加推进剂。作为推进剂的具体例子，可以举出氯化、氟化或氟氯化的低分子量烃，但并不局限于此。
局部用组合物可以配制成包含软化剂的溶液。软化剂是指用于防止或缓解干燥，以及皮肤保护的物质。已知的多种适宜的软化剂都可用于本发明。
作为可由包含本发明的寡肽的组合物配制其他剂型，有乳膏剂和洗剂。
作为可由包含本发明的寡肽的组合物配制的其他剂型，有软膏。软膏可包含动物或植物油或半固体碳化氢(油性)基剂。软膏还可包含吸收水而形成乳浊物的吸收软膏基剂。软膏也可是水溶性的。
其他剂型是乳浊剂。乳化剂可以是非离子性、阳离子性或阴离子性，作为乳化剂的例子，例如美国专利第3,755,560号以及4,421,769号中记载。
乳剂以及乳膏剂，可以配制成乳浊剂和溶液。用于水包油型以及油包水型乳剂和乳膏剂等局部调配物的单一乳浊剂已为大家所知。水包油包水型等多相乳浊组合物也是公知的，例如美国专利第4,254,105号中所记载。3重乳浊剂也可用于本发明的局部使用，可以举出硅包水包油型液体乳浊物等，例如美国专利第4,960,764号所记载。
可用于局部组合物的其他乳浊剂是微乳液体系。例如，包含约9-约15％的角鲨烷，约25％-约40％的硅油、约8-约20％的脂肪醇、约15％-约30％的聚氧乙二醇山梨醇单脂肪酸(市售商品名TWEENS)或其他非离子剂、以及约7-约20％水的体系。
脂质体剂也可用于包含本发明的寡肽的组合物。脂质体组合物，通过将包含本发明的寡肽的组合物和二棕榈酰磷脂酰胆碱等磷脂、胆固醇以及水依据规定方法混合制备。也可用适用于脂质体形成的组合物的表皮脂质代替磷脂。将脂质体调配物浸入到上述的一种局部用调配剂(例如，凝胶剂或水包油型乳浊剂)中，可得到脂质体制剂。有关局部用脂质体的其他组成和药学用途，例如Mezei(1985)Topics inPharmaceutical Sciences，Bremer et al.eds.，Elsevier Science，New York，N.Y.，pp345-358所记载。
上述毛发生长促进剂的使用量可根据使用目的、剂型、有效成分的种类等适当选择，例如，可参考本说明书实施例具体显示的使用量来选择。例如，成人一天的有效成分的使用量在1μg/kg/天-10mg/kg/天，优选10μg/kg/天-1mg/kg/天左右的范围内。
此外，在实施本发明方面，可以使用分子生物学(包含基因重组技术)、细胞生物学、生物化学以及免疫学等常用技术，这些都是本领域技术人员所掌握的知识。这种技术，例如Molecular CloningALaboratory Manual，Second Edition(Sambrook et al.，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；Animal CellCulture(R.I.Freshney，ed.，1987)；Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Wei & C.C.Blackwell，eds.)；Gene Transfer Vectors forMammalial Cells(J.M.Miller & M.P.Calos，eds.，1987)；CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987and annual updates)；PCRThe Polymerase Chain Reaction(Mulliset al.，eds.，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.，eds.，1991 and annual updates)。
实施例以下，通过实施例进一步具体说明本发明，但本发明的范围并不局限于以下实施例。
实施例1修饰寡肽的制备以下述氨基酸序列所表示的寡肽通过使用了Fmoc的固相法合成。
Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala-Gln-Glu(序列4)Sef-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Glu-Gln-Glu(序列5)Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Glu-Gln-Glu-Ala(序列6)接着，使合成的寡肽和以下修饰试剂依据该试剂的使用说明书进行反应。寡肽和修饰试剂的比例恰好以1∶1的摩尔比进行反应。
EMCA(N-ε-马来酰亚胺己酸)Pierce公司生产KMUA(N-κ-马来酰亚胺十一酸)Pierce公司生产BMPA(N-β-马来酰亚胺丙酸)Pierce公司生产苯基马来酰亚胺Sigma公司生产将合成的寡肽和修饰试剂的反应产物，以液相色谱进行解析，结果示于图1到图3。液相色谱的条件如下所示。
注入样品20μl洗脱条件TFA、乙腈20-75％在210nm吸收观察肽的洗脱位置。
图1到图3表示的是使寡肽和修饰试剂(EMCA)恰好以摩尔比1∶1的比例反应，反应前后的液相色谱。
图1中的左图表示的是以序列1表示的合成寡肽的结果，右图表示的是其半胱氨酸残基以EMCA修饰后的寡肽的结果。
图2中的左图表示的是以序列2表示的合成寡肽的结果，右图表示的是其半胱氨酸残基以EMCA修饰后的寡肽的结果。
图3中的左图表示的是以序列3表示的合成寡肽的结果，右图表示的是其半胱氨酸残基以EMCA修饰后的寡肽的结果。
实施例2新生毛囊特异性单克隆抗体的制备从处于成长期(第48天到50天)的B57BL小鼠的皮肤割取鼠毛，将其置于含有8M尿素、2％SDS、100mM DTT的PBS中37℃孵育一夜后，提取蛋白质。此外，在实体显微镜下采集B56BL小鼠胡须的毛囊(毛囊球部带有色素者；成长期)，在PBS中匀浆。将上述2种试料(以蛋白质的量计，0.5mg)后，和等量的辅助佐剂混合，制备胶体。
将上述得到的胶体(0.2mg)于大鼠(Wister)皮下分3处施用，进行免疫。首次免疫1个月后，和上述一样进行增强免疫。然后在两周后和上述一样进行第二次增强免疫。在第二次增强免疫3天后，取出免疫大鼠脾脏，用筛网回收血细胞成分。在该血细胞成分中含有抗体生产细胞。将上述回收的血细胞成分(全量)和小鼠多发性骨髓瘤P3U1以聚乙二醇1500混合后，悬浮于Dulbecco/Ham F12混合培养基中，加入到96孔培养板中，100μl/孔。第二天，将等量(100μl)HAT培养基(Sigma公司)添加入各孔。2天后，从各孔分别吸取100μl弃去，再在各孔中加入150μl新的培养基。将96孔培养板静置于37℃CO2孵箱内。
将成长期B57BL小鼠的胡须的毛囊在8M尿素中以超声波粉碎机粉碎，溶解。将硝酸纤维素膜在该溶液中浸泡5分钟后，以PBS充分洗净，装到Biorad斑点印迹膜上，对从上述96孔培养板各孔回收得到的杂交瘤上清进行一次筛选。首先，将上述制备的硝酸纤维素膜以溶解有5％脱脂奶粉的Tris缓冲液(TBST)封闭后，在以该硝酸纤维素膜为底的各孔中添加杂交瘤上清100μl。孵育1小时后，以Tris缓冲液洗净，添加二抗辣根过氧化物酶标记的抗大鼠IgG(1μg/ml TBST)。添加显色底物ECL试剂(Amersham pharmacia公司生产)，由是否显色筛选出和生长期的胡须毛囊反应的抗体(总共50种)(一次筛选)。
针对上述一次筛选得到的抗体(50种)，以成长期胡须毛囊的冷冻切片(10μm)，筛选出特异反应的抗体(二次筛选)。具体而言，将成长期胡须毛囊的冷冻切片置于载玻片上，添加一次筛选得到的杂交瘤上清，以二抗显色。具体而言，将使用Cryostat冷冻切片机(Bright公司)制备的成长期胡须毛囊冷冻切片以-20℃甲醇处理后，以TBST封闭1小时后，和杂交瘤上清反应1小时。以Tris缓冲液洗净后，和FITC标记的抗大鼠IgG(TBST中以100μg/ml溶解)反应。以Tris缓冲液洗净后，盖上盖玻片，以荧光显微镜观察。
二次筛选的结果是，共筛选得到8种抗体。这些抗体和表皮不发生反应，而和毛囊特异性反应。这8种抗体以有限稀释法克隆。
针对这8种抗体，Western印迹法观察其对成长期胡须毛囊或休止期胡须毛囊的反应性，进而使用毛囊正在形成的14日龄小鼠胎儿皮肤的切片试料观察其反应性。其结果是，得到和成长期胡须毛囊以及形成过程中的毛囊(新生毛囊)特异性反应，而和休止期胡须毛囊不反应的单克隆抗体mAb27。产生单克隆抗体mAb27的杂交瘤，已于平成2001年11月2日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本茨城县筑波市东一丁目1番地1中央第6)，保藏号为FERM P-18578，并于平成2002年7月22日转为国际保藏，保藏号为FERM BP-8121。
实施例3各种寡肽的毛发生长促进作用的评价使用实施例制备的各种寡肽，评价毛发生长促进作用。使用的寡肽如下所示。
Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Xaa-Asp(序列7)上述式中，Xaa表示连接有EMCA(N-ε-马来酰亚胺己酸)、KMUA(N-κ-马来酰亚胺十一酸)、BMPA(N-β-马来酰亚胺丙酸)或苯基马来酰亚胺来源的修饰基团的半胱氨酸(Cys)残基。
Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Xaa-Asp-Gln-Asp-Glu(序列8)Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Xaa-Ala-Gln-Glu(序列9)Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Xaa-Glu-Gln-Glu(序列10)(上述式中，Xaa表示连接有EMCA(N-ε-马来酰亚胺己酸)来源的修饰基团的Cys氨基酸残基。)于实体显微镜下采取第12天的ICR小鼠胎儿的上颚皮肤组织，分成左和右，回收5部分。将回收的5部分皮肤以左和右各5个的方式置于一个核孔膜(孔径8μm、直径13mm)上，以实体显微镜观察，将外侧置于上方。在24孔盘的2个孔中添加含有1％BSA的glubecoMEM/humF12培养基500μl，一个孔中添加待检寡肽溶液(溶剂为PBS)，终浓度为20μM，另一个孔中添加等量溶剂(PBS)作为对照。待检寡肽，使用上述(1)制备的未修饰寡肽和修饰寡肽。
使载置有皮肤组织的膜漂浮于上述孔中的溶液中，1个/孔，37℃培养6天。从膜上回收5个组织片，置于SDS样品缓冲液(SDS0.02g/ml、甘油0.2g/ml、pH6.8)100μl中，以超声波粉碎器溶解。对照也进行同样处理。上述处理得到的溶液以SDS-PAGE(丙烯酰胺4-20％)电泳(35mA、1.5小时)后，转移到PVDF膜，再在含5％脱脂奶粉的Tris缓冲液(TBST)中孵育1小时。和实施例2得到的mAb27(TBST中10μg/ml)反应1小时后，以TBS洗净，和二抗反应，二抗为以TBST稀释为1/1000的过氧化物酶标记抗大鼠IgG(Amersham公司)，反应后充分洗净，以ECL试剂盒(Amersham公司)考察mAb27反应的强弱。
得到的结果示于图4和图5。图4和图5中的AHF，表示单克隆抗体mAb27识别的抗原(具体而言，由序列11所示1439个氨基酸残基构成的蛋白质)。
图4结果表明，左边第1、2和3行的条带都比左边第4和第5行的条带浓。这些结果证实，寡肽中的在半胱氨酸残基连接有含有羰基修饰基团(EMCA、KMUA、BMPA)的寡肽具有强的育毛活性，尤其比对应的未修饰寡肽、连接有不含羰基的修饰基团(苯基马来酰亚胺)的寡肽具有更强的促进毛发生长活性。上述中，EMCA的活性尤其强。
此外，图5的结果证实，以Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Xaa-Asp-Gln-Asp-Glu (序列8)Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Xaa-Ala-Gln-Glu(序列9)Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Xaa-Glu-Gln-Glu (序列10)(上述式中，Xaa表示连接有EMCA(N-ε-马来酰亚胺己酸)来源的修饰基团的Cys氨基酸残基。)表示的寡肽具有强的育毛活性。上述中，序列8和9所表示的寡肽显示尤其强的育毛活性。
实施例4环状寡肽的制备化学合成下述氨基酸序列所表示的环状寡肽。此外，还将化合物11中将-CO(CH2)5NH-取代为-CONH，进行化合物合成。
以下述顺序合成。
使用Applied Biosystem公司的肽自动合成仪(430A型Fostercity、CA、USA)，依据程序从C端依次依据BOC法延长肽链，合成所要的保护肽树脂。初始氨基酸树脂载体使用Boc-Ala-PAM(0.25mmol)，并使用Cys(MeBzl)、Ser(Bzl)、Glu(cHx)等常见氨基酸衍生物。
肽构筑于树脂上后，干燥保护肽树脂。得到的保护肽的保护基去除和肽从树脂载体分离的操作，是通过无水氟化氢处理来进行。巯基游离的粗制肽以醋酸水溶液提取后，得到冷冻干燥粉末。接着，将该巯基游离的粗制肽于醋酸溶液中由碘氧化进行环化反应，合成上述所述环状寡肽。得到的粗制肽以逆相高效色谱(岛津制作所，分离提取装置，LC8A型)，采用乙腈-0.1％三氟乙酸水的体系，进行分离提取纯化，得到目的环状寡肽。得到的纯化物通过分析用HPLC、质量分析以及氨基酸分析进行鉴定。上述合成的化合物的测定数据示于下面，PHLC结果示于图6-图9。
化合物(11)外观白色冷冻干燥体氨基酸分析值水解条件6N HCl、110℃、22小时Ser(2)1.78、Glu(4)4.00、Ala(1)0.96、Ile(1)0.98、NH3(2)2.05、Cys(2)1.86、ε-Acp(1)1.05纯度(HPLC)98.4％
ESI-MS分子量1207.7(理论值1208.3)化合物(12)外观白色冷冻干燥体氨基酸分析值水解条件6N HCl、110℃、22小时Ser(2)1.80、Glu(4)4.00、Ala(1)1.00、Ile(1)0.99、NH3(2)2.08、Cys(2)1.91、8-Aoa(1)N.D.(由于在通常分析条件下，不能洗脱，因而无法定量)纯度(HPLC)97.8％ESI-MS分子量1235.8(理论值1236.4)化合物(13)外观白色冷冻干燥体氨基酸分析值水解条件6N HCl、110℃、22小时Ser(2)1.79、Glu(2)2.01、Ala(1)1.00、Ile(1)0.97、NH3(1)1.20、Cys(2)1.94、ε-Acp(1)1.01纯度(HPLC)99.0％ESI-MS分子量950.5(理论值951.1)化合物(14)外观白色冷冻干燥体氨基酸分析值水解条件6N HCl、110℃、22小时Ser(2)1.79、Glu(2)2.00、Ile(1)0.97、NH3(1)1.18、Cys(2)1.92、ε-Acp(1)1.01纯度(HPLC)97.9％ESI-MS分子量879.6(理论值880.0)实施例5各种寡肽的毛发生长促进作用的评价实施例4合成的环状寡肽30％乙腈、0.1％三氟乙酸处理后，干燥。将该环状寡肽溶解于磷酸缓冲生理盐水(PBS)中，终浓度为0.00002重量％，在该溶液中添加等体积的100％乙醇，配制成0.00001重量％的50％乙醇-PBS溶液。PBS作为对照溶液。
已知C3H和C57BL/6小鼠在出生后第45天到第95天前后约有50天的休止期。此外，由于在休止期皮肤的颜色为粉红色，而在成长期则变为灰色或黑色，因而毛周期容易判定。使用该小鼠，通过施用本发明环状寡肽，评价是否促进了向成长期的移行。购进7周龄(48-50日龄，雌)的C 56BL/6小鼠，用动物用电动剪刀小心地将背部(约3×2.5cm2)的毛剪去，由皮肤颜色确认毛周期休止期。将上述配制的环状寡肽溶液(0.00001重量％)涂布于各组小鼠，0.2ml/只，10只/组，每天1次，每周5天，一直到实验开始后第38天结束。用不带针头的注射器进行涂布。
每周观察小鼠2次，根据毛再生面积相对于毛被剪去的面积的比例，将分数设定为6级，由多个人(2人)肉眼判定，进行评价。此外，还进行拍照。发毛分数按以下要领计算。由在毛被剪去的部分之中，皮肤颜色变为灰色或黑色部分的比例，施用以下分数。0-20％1、20-40％2、40-60％3、60-80％4、80-100％5。各组上述分数的总和作为发毛分数。每个评定者打出的发毛分数的最大值为50，由于是两个评定者，因而发毛分数最大值为100。
涂布环状寡肽的组，和对照组相比，其毛发再生得到促进。结果示于图10和图11。这些结果证实，本发明的环状寡肽具有毛发生长促进作用。
实施例6本发明的环状寡肽和米诺地尔一同使用制剂1实施例4制造的式(13)环状寡肽(0.00001％)和米诺地尔(1％)的混合液制剂2米诺地尔(1％)液(直接使用市售的“RiUP”(大正制药株式会社))制剂1和制剂2分别和实施例5一样，使用于毛囊处于休止期的C57BL/6小鼠的背中，评价是否促进毛囊向成长期移行。结果示于图12。和单独施用米诺地尔的情况比较，本发明的环状寡肽和米诺地尔一同施用时，显著促进了毛囊向成长期的移行。以Wilson法评定两者的差异，P＜0.05，有显著性差异。
实施例7细胞毒性评价实施例4制造的式(13)环状寡肽分别以0.1重量％溶液、0.01重量％溶液、0.001重量％溶液、0.0001重量％溶液、0.00001重量％溶液以及0.000001重量％溶液的浓度，进行细胞毒性实验。待检细胞为皮肤来源的HSC-5(购自财团法人人类科学振兴财团的下属机构，即人类科学研究资源库(http//www.jhsf.or.jp/index_b.html))，以1×100,000细胞/孔接种于24孔培养板中。培养基为含有10％FCS的ISCOV改良DMEM培养基，培养2天。培养结束后，计算活细胞的比例。其结果是，在所有情况下细胞均存活，未见细胞毒性。
产业上的利用可能性本发明寡肽具有毛发生长促进作用，可用作毛发生长促进剂等医药有效成分。本发明通过将修饰基团进行特定，使得其毛发生长促进作用比国际公开WO01/094382所记载的肽增强。进而，通过将X7和X9取代为Asp以外的其他氨基酸，可提高收率。此外，本发明的环状寡肽具有分子内环结构，即使暴露在有机溶剂中也是稳定的，因而，在逆相色谱等严格条件下也稳定，尤其具有纯化效率高的优点。
序列表<110>Sumitomo Electric Industries，Ltd.
<120>寡肽<130>A41291A<160>14<210>1<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>1Ser Ile Glu Gln Ser Xaa Ala Gln Glu1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>2Ser Ile Glu Gln Ser Xaa Glu Gln Glu1 5<210>3<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>3Ser Ile Glu Gln Ser Xaa Glu Gln Glu Ala1 5 10<210>4<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>4Ser Ile Glu Gln Ser Cys Ala Gln Glu
1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>5Ser Ile Glu Gln Ser Cys Glu Gln Glu1 5<210>6<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>6Ser Ile Glu Gln Ser Cys Glu Gln Glu Ala1 5 10<210>7<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>7Ser Ile Glu Gln Ser Xaa Asp1 5<210>8<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>8Ser Ile Glu Gln Ser Xaa Asp Gln Asp Glu1 5 10<210>9<211>9
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>9Ser Ile Glu Gln Ser Xaa Ala Gln Glu1 5<210>10<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>10Ser Ile Glu Gln Ser Xaa Glu Gln Glu1 5<210>11<211>1439<212>PRT<213>小家鼠(家鼠)<400>11Met Ser Pro Leu Ile Arg Ser Ile Val Asp Ile Thr Glu Val Phe Asn1 5 10 15Gln Tyr Ala Ser Gln Ser Cys Asp Gly Ala Ser Leu Ser Lys Lys Asp20 25 30Leu Lys Asn Leu Leu Glu Arg Glu Leu Gly Asp Val Leu Gln Arg Pro35 40 45His Asp Pro Glu Thr Ile Asp Leu Thr Leu Glu Leu Leu Asp Arg Asp50 55 60Cys Asn Gly Arg Val Asp Phe Asn Glu Phe Leu Leu Phe Leu Phe Lys65 70 75 80Ile Ala Gln Ala Cys Tyr Tyr Ala Leu Asp Glr Ala Ala Glu Leu Gly85 90 95Glu Lys Arg Ala Leu Pro Asn Glu Lys Arg Asn Leu Ser Gln Asp Arg100 105 110Arg Gln Glu Asp Gln Arg Arg Phe Glu Pro Arg Ser Arg Gln Leu Asp115 120 125Glu Glu Pro Gly Arg Arg Ser Trp Gln Lys Arg Arg Glu Gln Glu Glu130 135 140Arg Ala Glu Glu Gln Arg Leu Glu Gln Arg Tyr Arg Gln His Arg Asp145 150 155 160Glu Glu Gln Arg Leu Gln Arg Arg Glu Leu Gln Glu Leu Glu Glu Arg
165 170 175Leu Ala Glu Lys Glu Pro Leu Gly Trp Ser Lys Gly Arg Asp Ala Glu180 185 190Glu Phe Ser Glu Val Glu Glu Gln Gln Arg Gln Glu Arg Gln Glu Leu195 200 205Lys Gly Lys Gly Gln Thr Glu Glu Arg Arg Leu Gln Lys Arg Arg Gln210 215 220Glu Glu Leu Arg Glu Pro Leu Leu Arg Arg Asp Leu Glu Leu Arg Arg225 230 235 240Glu Gln Glu Leu Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Gln Glu Gln Arg Arg245 250 255Glu Gln Glu Leu Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Gln Glu Leu Arg Arg260 265 270Glu Gln Glu Leu Asn Arg Arg Gln Glu Leu Arg Arg Glu Gln Glu Leu275 280 285Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Gln Glu Leu Arg Arg Glu Gln Glu Leu290 295 300Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Gln Glu Leu Arg Arg Glu Gln Glu Leu305 310 315 320Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Gln Glu Leu Arg Arg Glu Gln Glu Leu325 330 335Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Gln Glu Leu Arg Arg Glu Gln Glu Leu340 345 350Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Gln Glu Leu Ala Glu Glu Asp Glu Leu355 360 365Thr Arg Ile Arg Glu Pro Asp Glu Ser Ile Thr Gln Arg Trp Gln Trp370 375 380Gln Leu Glu Asn Glu Ala Asp Ala Arg Gln Asn Lys Val Tyr Ser Arg385 390 395 400Pro Ser Arg Gln Glu Gln Arg Leu Arg Gln Glu Leu Gly Glu Arg Gln405 410 415Leu Arg Glu Gln Glu Glu Gln Arg Arg Asp Leu Gln Gln Glu Arg Pro420 425 430Ala Glu Glu Ala Arg Gln Arg Asn Gln Trp Glu Arg Pro Gln Arg Ala435 440 445Glu Glu Arg Leu Glu Gln Glu Gln Arg Phe Arg Asp Arg Glu Glu Gln450 455 460Arg Phe Arg Glu Glu Lys Leu Gln Arg Ala Glu Leu Gln Asp Ser Leu465 470 475 480Leu Asp Glu Glu Gln Arg Arg Leu Gln Glu Glu Arg Arg Glu Pro Asn485 490 495Arg Ser Arg Gln Leu Arg Glu Glu Ser Gln Arg Arg Arg Thr Leu Tyr500 505 510Ala Lys Pro Ser Gln Arg Gln Gln Arg Arg Arg Leu Gln Gln Glu Arg
515 520 525Gln Tyr Gln Glu Glu Asp Leu Gln Arg Leu Arg Asp Glu Asp Gln Arg530 535 540Arg Asp Leu Lys Trp Gln Trp Gln Pro Arg Lys Glu Asn Glu Val Arg545 550 555 560Ser Asn Arg Leu Phe Thr Lys Arg Arg Gly Asp Glu Glu Pro Ile Gln565 570 575Gln Leu Glu Asp Ser Gln Glu Arg Glu Arg Arg Gln Asp Arg Arg Pro580 585 590Leu Gln Asp Glu Glu Glu Glu Lys Arg Glu Leu Glu Gln Glu Arg Arg595 600 605Arg Arg Gln Gln Arg Asp Arg Gln Ile Leu Glu Glu Glu Gln Phe Gln610 615 620Arg Glu His Gln Arg Glu Ala Arg Arg Arg Asp Glu Thr Phe Gln Glu625 630 635 640Glu Glu Gln Leu Gln Gly Glu Ser Arg Arg Arg Gln Gln Glu Arg Glu645 650 655Gly Lys Phe Leu Glu Glu Glu Arg Gln Leu Arg Thr Glu Arg Glu Glu660 665 670Gln Arg Arg Arg Gln Glu Gln Glu Arg Glu Phe Gln Glu Glu Glu Glu675 680 685His Leu Gln Glu Arg Glu Lys Glu Leu Arg Gln Glu Cys Asp Arg Lys690 695 700Ser Arg Glu Gln Glu Arg Arg Gln Gln Arg Glu Glu Glu Gln Leu Arg705 710 715 720Arg Gln Glu Arg Asp Gln Arg Phe Arg Arg Glu Gln Glu Arg His Leu725 730 735Glu Arg Glu Glu Glu Gln Leu Arg Asp Arg Pro Ser Arg Arg Glu Gln740 745 750Glu Arg His Gln Glu Arg Glu Glu Glu Gln Leu Arg Asp Arg Pro Ser755 760 765Arg Arg Glu Gln Glu Arg His Gln Glu Arg Glu Glu Glu Gln Leu Arg770 775 780Asp Arg Pro Ser Arg Arg Glu Gln Glu Arg His Gln Glu Arg Glu Glu785 790 795 800Glu Gln Leu Arg Asp Arg Pro Phe Arg Arg Glu Gln Glu Arg Arg Leu805 810 815Glu Arg Glu Glu Glu Gln Leu Arg Asp Arg Pro Ser Arg Arg Glu Gln820 825 830Glu Arg His Gln Glu Arg Glu Glu Glu Gln Leu Arg Asp Arg Pro Ser835 840 845Arg Arg Glu Gln Glu Arg Arg Leu Glu Arg Glu Glu Glu Gln Leu Arg850 855 860Asp Arg Ser Phe Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Arg Asp Arg Lys Phe
865 870 875 880His Glu Glu Glu Glu Arg Arg Glu Glu Leu Glu Glu Glu Gln Arg Gly885 890 895Gln Glu Arg Asp Arg Leu Arg Val Glu Glu Gln Leu Arg Gly Gln Arg900 905 910Glu Glu Glu Gln Arg Arg Arg Gln Glu Cys Asp Arg Lys Leu His Arg915 920 925Glu Leu Glu Val Arg Gln Glu Leu Glu Glu Glu Arg Leu Arg Asp Arg930 935 940Lys Leu Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Arg Asp Arg Lys Phe His Glu945 950 955 960Glu Glu Glu Arg Arg His Glu Glu Phe Glu Glu Lys Gln Leu Arg Leu965 970 975Gln Glu Pro Asp Arg Arg Phe Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Gln Glu980 985 990Cys Val Glu Glu Glu Arg Leu Arg Asp Ser Lys Ile Arg Arg Glu Gln99510001005Glu Leu Arg Arg Glu Arg Glu Glu Glu Arg Leu Arg Asp Arg Lys Ile101010151020Arg Arg Asp Gln Glu Leu Arg Gln Gly Leu Glu Glu Glu Gln Leu Arg1025 103010351040Arg Gln Glu Leu Asp Arg Lys Phe Arg Glu Glu Gln Glu Leu Asp Gln104510501055Glu Leu Glu Glu Glu Arg Leu Arg Asp Arg Lys Ile Arg Arg Glu Gln106010651070Glu Leu Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Arg Glu Gln Glu Phe Arg Arg107510801085Glu Gln Glu Leu Arg Arg Glu Gln Glu Phe Arg Arg Glu Gln Glu Leu109010951100Arg Gln Glu Arg Glu Glu Glu Arg Leu Arg Asp Arg Lys Ile Arg Arg1105 111011151120Asp Gln Glu Leu Arg Gln Gly Leu Glu Glu Glu Gln Leu Arg Arg Gln112511301135Glu Arg Asp Arg Lys Phe Arg Glu Glu Gln Glu Leu Gly Gln Glu Leu114011451150Glu Glu Glu Arg Leu Arg Asp Arg Lys Ile Arg Arg Glu Gln Glu Leu115511601165Arg Arg Glu Arg Glu Gln Glu Gln Arg Arg Arg Leu Glu Arg Glu Glu117011751180Glu Gln Gln Arg Leu His Glu Arg Glu Glu Glu Gln Arg Arg Arg Gln1185 119011951200Glu Arg Glu Gln Glu Gln Gln Arg Cys Leu Glu Arg Glu Glu Glu Gln120512101215Phe Arg Phe Glu Glu Gln Gln Arg Arg Arg Gln Glu Arg Glu Gln Gln
122012251230Leu Arg Gln Glu Arg Asp Arg Arg Val Leu Glu Glu Glu Glu Leu Arg123512401245Gln Glu Arg Glu Glu Leu Leu His Arg Gln Val Gly Gly Arg Lys Phe125012551260Arg Glu Glu Glu Arg Leu Arg Leu Glu Arg Glu Glu Gln Gln Arg Arg1265 127012751280Leu Gln Glu Arg Asp Asn Arg Arg Phe Arg Glu Glu Val Glu Leu Arg128512901295Gln Glu Arg Glu Gly Gln Gln Leu Arg Gln Glu Arg Asp Arg Lys Phe130013051310Arg Glu Val Glu Glu Leu Arg Gln Glu Glu Gln Arg Arg Arg Gln Glu131513201325Arg Asp Arg Lys Phe Arg Glu Glu Lys His Pro Arg Glu Glu Arg Glu133013351340Glu Gln Gln Leu Arg Arg Glu Lys Arg Asp Gly Gln Tyr Leu Ala Glu1345 135013551360Glu Gln Phe Ala Arg Asp Thr Ile Arg Arg Gln Glu Gln Glu Leu Arg136513701375Gln Glu Glu Glu Gln Arg Arg Arg Gln Glu Arg Glu Arg Lys Phe Gln138013851390Glu Glu Gln Ile Arg Arg Arg Gln Glu Glu Gln Arg Arg Arg Gln Ile139514001405Leu Glu Pro Gly Thr Arg Gln Phe Ala Asn Val Pro Val Arg Ser Ser141014151420Pro Leu Tyr Glu Tyr Ile Gln Glu Gln Arg Ser Gln Tyr Arg Pro1425 14301435<210>12<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>12Ser Ile Glu Gln Ser Cys Ala Gln Glu1 5<210>13<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽
<400>13Ser Ile Glu Gln Ser Cys Ala1 5<210>14<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>14Ser Ile Glu Gln Ser Cys1 权利要求
1.一种具有毛发生长促进作用的寡肽或其修饰寡肽，其是包含下述式(I)到(IV)的任一氨基酸序列的由5到100个氨基酸残基构成的寡肽，X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (I)X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7 (II)X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7 (III)X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7 (IV)式中，X1表示氨基酸残基Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met，或者是缺失，X2表示氨基酸残基Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、Cys或Met，或者是缺失，X3表示氨基酸残基Glu、Lys、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、Cys或Asp，X4表示氨基酸残基Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His、Cys或Lys，X5表示氨基酸残基Ser、Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met，X6表示与含有羰基的修饰基团连接的Cys氨基酸残基，或与含有羰基的修饰基团连接的Lys氨基酸残基，并且X7表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu，或者是缺失。
2.根据权利要求1所述寡肽或其修饰寡肽，其中，X1表示Ser氨基酸残基，X2表示Ile氨基酸残基，X3表示Glu氨基酸残基，X4表示Gln氨基酸残基，X5表示Ser氨基酸残基，X6表示与含有羰基的修饰基团连接的Cys氨基酸残基，并且X7表示Glu或Ala氨基酸残基。
3.根据权利要求1或2所述寡肽或其修饰寡肽，其中，其是由式(I)到(IV)任意氨基酸序列构成的包含5到7个氨基酸残基的寡肽。
4.一种具有毛发生长促进作用的寡肽或其修饰寡肽，其是包含下式(XI)到(XIV)的任一氨基酸序列的由6到100个氨基酸残基构成的寡肽；X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (XI)X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7-X8-X9 (XII)X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7-X8-X9 (XIII)X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7-X8-X9 (XIV)式中，X1表示氨基酸残基Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met，或者是缺失，X2表示氨基酸残基Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、Cys或Met，或者是缺失，X3表示氨基酸残基Glu、Lys、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、Cys或Asp，X4表示氨基酸残基Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His、Cys或Lys，X5表示氨基酸残基Ser、Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met，X6表示与含有羰基的修饰基团连接的Cys氨基酸残基，或与含有羰基的修饰基团连接的Lys氨基酸残基，X7表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu，或者是缺失，X8表示氨基酸残基Gln，并且X9表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu。
5.根据权利要求4所述寡肽或其修饰寡肽，其中，X7和X9中的至少一个是氨基酸残基Asp以外的氨基酸残基。
6.根据权利要求4或5所述寡肽或其修饰寡肽，其中，X1表示Ser氨基酸残基，X2表示Ile氨基酸残基，X3表示Glu氨基酸残基，X4表示Gln氨基酸残基，X5表示Ser氨基酸残基，X6表示与含有羰基的修饰基团连接的Cys氨基酸残基，X7表示Glu或Ala氨基酸残基，X8表示Gln氨基酸残基，并且X9表示Glu氨基酸残基。
7.根据权利要求4-6任一项所述寡肽或其修饰寡肽，其中，其是由式(XI)到(XIV)中的任一氨基酸序列构成的包含7到9个氨基酸残基的寡肽。
8.根据权利要求1-7任一项所述寡肽或其修饰寡肽，其中，X6表示末端连接有具有羰基的修饰基团的Cys氨基酸残基，或末端连接有具有羰基的修饰基团的Lys氨基酸残基。
9.根据权利要求1-8任一项所述寡肽或其修饰寡肽，其中，在修饰基团内部羰基连接于碳原子数为2到10的烃链。
10.根据权利要求1-9任一项所述寡肽或其修饰寡肽，其中，在修饰基团内部羰基连接于碳原子数为3到7的烃链。
11.根据权利要求1-10任一项所述寡肽或其修饰寡肽，其中，修饰基团是N-β-马来酰亚胺丙酸来源的修饰基团，N-ε-马来酰亚胺己酸来源的修饰基团，或N-κ-马来酰亚胺十一酸来源的修饰基团。
12.以下任意寡肽或其修饰寡肽，Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Xaa-Ala-Gln-GluSer-Ile-Glu-Gln-Ser-Xaa-Glu一Gln-GluSer-Ile-Glu-Gln-Ser-Xaa-Glu-Gln-Glu-Ala式中，Xaa表示连接有N-ε-马来酰亚胺己酸来源的修饰基团的Cys氨基酸残基。
13.一种医药品，其含有权利要求1-12任一项所述寡肽或其修饰寡肽或其生理学上可接受的盐作为有效成分。
14.毛发生长促进剂，其含有权利要求1-12任一项所述寡肽或其修饰寡肽或其生理学上可接受的盐作为有效成分。
15.一种由下述式(1)的氨基酸序列构成的具有毛发生长促进作用的寡肽或其修饰寡肽， 式中，X1表示氨基酸残基Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met，或者是缺失，X2表示氨基酸残基Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、或Met，或者是缺失，X3表示氨基酸残基Glu、Lys、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、或Asp，X4表示氨基酸残基Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His、或Lys，X5表示氨基酸残基Ser、Trp、Phe、Thr、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met，X6表示氨基酸残基Cys，X7表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu，或者是缺失，Y缺失或者表示1-90个氨基酸序列，L表示连接基团。
16.根据权利要求15所述环状寡肽或其修饰寡肽，其中，X1表示Ser氨基酸残基，X2表示Ile氨基酸残基，X3表示Glu氨基酸残基，X4表示Gln氨基酸残基，X5表示Ser氨基酸残基，X6表示Cys氨基酸残基，X7表示Glu或Ala氨基酸残基。
17.根据权利要求15或16所述环状寡肽或其修饰寡肽，其中Y缺失。
18.根据权利要求15或16所述环状寡肽或其修饰寡肽，其中Y表1-12个氨基酸序列。
19.一种由下述式(2)的氨基酸序列构成的、具有毛发生长促进作用的寡肽或其修饰寡肽， 式中，X1表示氨基酸残基Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met，或者是缺失，X2表示氨基酸残基Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、或Met，或者是缺失，X3表示氨基酸残基Glu、Lys、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、或Asp，X4表示氨基酸残基Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His、或Lys，X5表示氨基酸残基Ser、Trp、Phe、Thr、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met，X6表示氨基酸残基Cys，X7表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu，或者是缺失，X8表示氨基酸残基Gln，X9表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu，L表示连接基团。
20.根据权利要求19所述环状寡肽或其修饰寡肽，其中，X7和X9中的至少一方是氨基酸残基Asp以外的氨基酸残基。
21.根据权利要求19或20所述寡肽或其修饰寡肽，其中X1表示Ser氨基酸残基，X2表示Ile氨基酸残基，X3表Glu氨基酸残基，X4表示Gln氨基酸残基，X5表示Ser氨基酸残基，X6表示Cys氨基酸残基，X7表示Glu或Ala氨基酸残基，X8表示Gln氨基酸残基，并且X9表示Glu氨基酸残基。
22.一种由下述式(3)的氨基酸序列构成的、具有毛发生长促进作用的环状寡肽或其修饰寡肽， 式中，X1表示氨基酸残基Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met，或者是缺失，X2表示氨基酸残基Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、或Met，或者是缺失，X3表示氨基酸残基Glu、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、或Asp，X4表示氨基酸残基Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser或His，X5表示氨基酸残基Ser、Trp、Phe、Thr、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met，X6表示氨基酸残基Lys，X7表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu，或者是缺失，Y缺失或者表示1-90个氨基酸序列，L表示连接基团，Z表示能够和Lys反应而连接的基团。
23.根据权利要求22所述寡肽或其修饰寡肽，其中，X1表示Ser氨基酸残基，X2表示Ile氨基酸残基，X3表示Glu氨基酸残基，X4表示Gln氨基酸残基，X5表示Ser氨基酸残基，X6表示Cys氨基酸残基，X7表示Glu或Ala氨基酸残基。
24.根据权利要求22或23所述寡肽或其修饰寡肽，其中Y缺失。
25.根据权利要求22或23所述寡肽或其修饰寡肽，其中Y表示1-12个氨基酸序列。
26.一种由下述式(4)的氨基酸序列构成的、具有毛发生长促进作用的环状寡肽或其修饰寡肽， 式中，X1表示氨基酸残基Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met，或者是缺失，X2表示氨基酸残基Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、或Met，或者是缺失，X3表示氨基酸残基Glu、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、或Asp，X4表示氨基酸残基Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser或his，X5表示氨基酸残基Ser、Trp、Phe、Thr、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met，X6表示氨基酸残基Lys，X7表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu，或者是缺失，X8表示氨基酸残基Gln，X9表示氨基酸残基Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu，L表示连接基团，Z表示能够和Lys反应而连接的基团。
27.根据权利要求26所述寡肽或其修饰寡肽，其中，X7和X9中的至少一方是氨基酸残基Asp以外的氨基酸残基。
28.根据权利要求26或27所述寡肽或其修饰寡肽，其中，X1表示Ser氨基酸残基，X2表示Ile氨基酸残基，X3表示Glu氨基酸残基，X4表示Gln氨基酸残基，X5表示Ser氨基酸残基，X6表示Cys氨基酸残基，X7表示Glu或Ala氨基酸残基，X8表示Gln氨基酸残基，并且X9表示Glu氨基酸残基。
29.根据权利要求15到28任一项所述寡肽或其修饰寡肽，其中，连接基团L的碳原子数为6到8。
30.根据权利要求15到29任一项所述寡肽或其修饰寡肽，其中，在连接基团L内羰基连接于碳原子数为5到7的烃链。
31.根据权利要求15到30任一项所述寡肽或其修饰寡肽，其中，连接基团L是-CO-(CH2)n-NH-(式中，n表示5-7的整数)。
32.根据权利要求31所述寡肽或其修饰寡肽，其中，连接基团L中的-CO和X1连接，连接基团L中的NH-和连接于X6的Cys残基或Z表示的基团连接。
33.以下任意环状寡肽或其修饰寡肽
34.一种医药品，其含有权利要求15-33任一项所述环状寡肽或其修饰寡肽或其生理学上可接受的盐作为有效成分。
35.一种毛发生长促进剂，其含有权利要求15-33任一项所述环状寡肽或其修饰寡肽或其生理学上可接受的盐作为有效成分。
36.一种毛发生长促进剂，其含有权利要求15-33任一项所述环状寡肽或其修饰寡肽或其生理学上可接受的盐以及米诺地尔作为有效成分。
全文摘要
本发明目的在于提供具有毛发生长促进作用的寡肽。根据本发明，可提供式(1)X1－X2－X3－X4－X5－X6－X7等所表示的寡肽(式中，X1表示Ser等氨基酸残基、X2表示Ile等氨基酸残基、X3表示Glu等氨基酸残基、X4表示Gln等氨基酸残基、X5表示Ser等氨基酸残基、X6表示连接有含有羰基的修饰基团的Cys氨基酸残基或连接有含有羰基的修饰基团的Lys氨基酸残基、并且X7表示Glu或Ala等氨基酸残基)。
文档编号A61K8/30GK1823086SQ200480020469
公开日2006年8月23日 申请日期2004年5月14日 优先权日2003年5月16日
发明者平井洋平, 中岛喜一郎 申请人:住友电气工业株式会社