用于抑制血栓形成的组合物的制作方法

专利名称：用于抑制血栓形成的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于抑制血栓形成的组合物。
背景技术：
血栓是在血管中形成的血凝块，被称为血纤维蛋白原的蛋白质被激活，转化为血纤维蛋白，同时与血小板、白细胞等一起形成不溶性的聚合物，凝结在血管的内壁上。身体正常时，发挥溶解该血栓的来源——血纤维蛋白的功能的纤溶酶可预防血栓，但如果纤溶酶不足，则无法溶解血纤维蛋白，形成血栓。血栓有一期止血(血小板凝集)和二期止血(血液凝固)。血管破裂发生出血，血小板粘附、凝集在血管壁破裂口处，首先进行止血。将其称为一期止血，形成的血栓成为一期血栓。血浆中的水溶性凝固因子(血纤维蛋白原)变为非水溶性(血纤维蛋白)，在血小板之间连成丝状的网，使原发性血栓强化。将其称为二期止血，形成的血栓称为继发性血栓。
血小板凝集是由于血管壁破裂，壁上的胶原暴露出来，血小板粘附于暴露的胶原上，并且血小板之间凝集而产生。血液凝固的机理有内源性凝血和外源性凝血。内源性凝血是XII因子与具有阴性电荷的内皮下组织接触，XII因子被激活，接着XI因子被活性XII因子激活，内源性的凝血因子依次被激活，最终，I因子——血纤维蛋白原受到II因子(凝血酶原)的活性型——凝血酶的限制性分解，形成血纤维蛋白，形成血栓。外源性凝血是通过组织因子和VII因子激活，由X因子的激活转移至与内源性具有共通的凝血机理上，最终作为I因子的血纤维蛋白原受到II因子(凝血酶原)的活性型——凝血酶的限制性分解，形成血纤维蛋白，形成血栓。
形成的血栓附着于血管，使血管的截面积减小，阻碍血液循环，结果出现血液无法在细胞和组织中正常供给营养成分和氧，细胞和组织的代谢废物无法排出，毒性被蓄积等的问题。
血管中，将血栓所引发的症状称为广义的血栓形成(以下简称为“血栓形成”时也是指广义的血栓形成)，血栓为病因而引发的病态分为狭义的血栓形成和栓塞。狭义的血栓形成是血栓在形成处部分或完全阻塞血流而导致的症状，栓塞是血栓从形成处剥离，随血流移动，在其他部位部分或完全阻塞血流而引起的病态。
所述血栓形成根据产生血栓的血管部位的不同而诱发各种疾病。其中特别是在脑血管、心脏血管中产生时，会发生脑卒中、脑出血、脑梗塞、心力衰竭、心肌梗塞、心脏麻痹等严重的症状，还可能引发半身不遂，严重时可能导致死亡。
引发这些心脏疾病、脑血管疾病等的重大血栓与血流的淤积带下形成的血纤维蛋白血栓的机理不同，是在动脉等血流比较快、存在丰沛血流下形成的。在血流中，凝血因子即使被激活，也会被血流稀释，不至于有效形成血栓。不过，粘附、凝集于损伤血管壁、提高局部浓度的成分——血小板在血栓的形成中发挥了重要的作用。
血管内皮细胞出现障碍，产生剥离，则血管内皮细胞下组织的胶原暴露，通过在血管内皮细胞中合成的冯维勒布兰德因子(vWFVII因子)，胶原和vWF受体(GpIb)之间形成交联(粘附)。并且，血小板被例如凝血酶等激动剂激活，通过血纤维蛋白原受体(GpIIb-IIIa)，经由血纤维蛋白原与其它血小板结合，引起血小板凝集，形成血小板血栓。因此，是否可抑制胶原和GpIb之间通过vWF形成交联，或与其它血小板经由血纤维蛋白原的GpIIb-IIIa结合，这成为预防血栓形成的一个重要要件。
已知瑞斯托菌素是促进胶原和GpIb之间通过vWF形成交联的激动剂，已知通过胶原和凝血酶等各种物质从血管系的血小板和损伤的血液细胞、内皮或组织释放出来的腺苷二磷酸(腺苷-5’-二磷酸钠ADP)是促进与其它血小板经由血纤维蛋白原的GpIIb-IIIa结合的激动剂。
血栓形成的治疗中，主要进行抑制血栓生成的抗血栓剂和血栓形成预防剂、使生成的血栓溶解的溶栓剂的研究开发。
抗血栓剂有血小板剂和抗凝药。抗血小板剂的目的是抑制与血栓形成初期阶段有关的血小板的功能，开发了阿司匹林等很多可口服的药物，但目前它们被用于脑梗塞、心肌梗塞等的复发预防、以及各种旁路手术后的阻塞预防等，与其说是血栓形成的治疗药，其实是作为血栓形成预防药使用。抗凝药中，通过促进抗凝血酶III对凝血酶的抑制而起作用的肝素和口服抗凝药香豆素衍生物——华法林等在临床中使用。华法林通过在凝血酶原合成中抑制转化后的维生素K依赖性γ-羧基化来抑制凝血酶的产生。但是，肝素必须是非口服给药，这发挥了抗凝血酶III的辅因子的功能，因此如果没有该抑制剂就没有效果。华法林表达效果非常缓慢，个人的给药量必须频繁试验调整。这些抗凝药并不是仅对凝血酶特异性，它们也抑制其它的丝氨酸-蛋白酶，如果不正确地调节两者的给药量，则可能诱发出血。另外，最近二十碳五烯酸(EPA)、前列环素(PG12)衍生物等被制成商品。但是，这些药物没有特异性，在机体内对血栓以外的部分也有影响，残留在机体内时，可能引起出血等。除此之外，还报道了水蛭素、合成抗凝血酶、噻氯匹定等的抗血栓活性，但尚未实现应用化。
溶栓剂已知有链激酶、尿激酶等纤溶酶原激活药，通常采用将纤溶酶原激活药对形成了血栓的患者进行静脉注射，以激活体内溶栓系统的疗法。该溶栓效果在很多临床试验中得到了验证，但与抗血栓剂或血栓形成预防剂同样，对血栓没有特异性，治疗血栓过程中有全身出血等副作用。另外，组织型纤溶酶原激活药(tPA)对血栓的选择性高，可认为是理想的溶栓剂，但实际应用于临床治疗时，依然有全身出血的副作用，只是程度有差异。另外，在血液内的半衰期非常短，药效持续时间短，因此为在体内维持药效，必须加大给药量，因此治疗费用比以往的溶栓剂高非常多。
上述药物用于预防血栓的形成，但对于血栓的去除没有体现太显著的效果，并诱发严重的副作用，因此，最近，比起药物治疗，对于具有通过饮食方式预防疾病、调节或激活体质的功能的成分或食品的研究日益受到人们的关注。
已知食品成分有多元不饱和脂肪酸、葡糖胺、洋葱膜(例如参照专利文献1)等材料，但它们风味或性状等方面存在问题，无法广泛应用于食品。
最近，有人公开了猕猴桃提取物(例如参照专利文献2)的专利，但它有在中性区的活性弱的缺点。
还已知纳豆激酶(ナツトウキナ一ゼ)(例如参照专利文献3)，纳豆激酶具有溶栓效果，但同时也含有产生凝血因子的维生素K。
专利文献1日本特开2002-171934号公报(第2页)
专利文献2日本特开2003-171294号公报(第2-5页)专利文献3日本特开2004-65047号公报(第3页)发明内容本发明的课题在于提供用于抑制血栓形成的组合物，该组合物含有可在饮料食品、准药(医药部外品)、药物、饲料中使用的规定的植物成分。
本发明人利用各种天然植物，检索血栓形成抑制成分，并进行多角度研究探讨，结果发现来自印度醋栗(アムラ一)、茶、木槿(ハイビスカス)、苍耳(オナモミ)、匙羹藤(ギムネマ)、羊栖菜(ヒジキ)、角叉菜聚糖(カラギナン)的规定的植物成分具有优异的血栓形成抑制作用，从而完成本发明。
即，本发明的主要宗旨是[1]抗血栓组合物，其特征在于含有选自印度醋栗的果实、果汁以及它们的提取物的至少一种。
抑制血纤维蛋白形成的组合物，其特征在于含有选自印度醋栗的果实、果汁以及它们的提取物的至少一种。
抗血小板凝集组合物，其特征在于含有选自印度醋栗的果实、果汁以及它们的提取物的至少一种。
抑制血小板凝集的组合物，其特征在于含有选自印度醋栗的果实、果汁以及它们的提取物的至少一种。
用于抗血栓的组合物，其特征在于含有茶的提取物。
用于抗血小板凝集的组合物，其特征在于含有茶的提取物。
抗血液凝固组合物，其特征在于含有选自木槿的果实、果汁、叶以及它们的提取物的至少一种。
预防血小板凝集的组合物，其特征在于含有选自木槿的果实、果汁、叶以及它们的提取物的至少一种。
用于预防血小板凝集的组合物，其特征在于含有选自木槿的果实、果汁、叶以及它们的提取物的至少一种。
抑制血小板凝集性血栓的组合物，其特征在于含有选自苍耳的果实、果汁、种子以及它们的提取物的至少一种。
用于抑制血小板凝集性血栓的组合物，其特征在于含有选自苍耳的果实、果汁、种子以及它们的提取物的至少一种。
血栓形成抑制剂，其特征在于含有匙羹藤、其提取物或它们的混合物。
预防外源性凝血的组合物，其特征在于含有羊栖菜、其提取物或它们的混合物。
预防血栓的组合物，其特征在于含有羊栖菜、其提取物或它们的混合物。
用于预防血栓的组合物，其特征在于含有羊栖菜、其提取物或它们的混合物的酶处理物。
抗血栓剂，其特征在于含有角叉菜聚糖。
本发明提供用于抑制血栓形成的组合物，该组合物含有具有抑制血栓形成作用的上述规定的植物成分。该成分来自一直以来人们在日常饮食生活中使用的天然植物，因此该组合物与以往的药物不同，没有体内出血的副作用，可安全地抑制血栓形成，预防脑出血、脑梗塞、心肌梗塞、动脉硬化和冠状动脉硬化等心血管疾病。本发明的用于抑制血栓形成的组合物例如可应用于饮料食品、准药、药物、饲料中。
具体实施例方式
总而言之，本发明提供用于抑制血栓形成的组合物，具体来说，提供由作为有效成分使用的植物成分形成的各种组合物。本发明的组合物可以是有效成分本身。以下对每种使用植物分别进行说明。本发明的组合物的原料等可以任意单独或将2种或以上混合使用。
本说明书中，抗血小板凝集、血小板凝集抑制、预防血小板凝集和抗血小板等术语具有相同的含义。
(1)印度醋栗具体来说，本发明提供抗血栓组合物、抑制血纤维蛋白形成的组合物、抗血小板凝集组合物、以及抑制血小板凝集的组合物，其特征在于含有选自印度醋栗果实、果汁以及它们的提取物的至少一种作为有效成分。
本发明的组合物根据上述印度醋栗成分所具有的作用而发挥其效果，本发明中，首次发现所述印度醋栗成分具有以下的作用。
即，对上述印度醋栗成分测定活化部分凝血激酶时间(APTT)，结果显示使与内源性途径有关的因子失活、抑制血纤维蛋白的形成，抑制血管内的血栓形成的效果高。
对上述印度醋栗成分进行抑制血纤维蛋白形成的试验，结果显示在血栓形成的最终阶段，抑制凝血酶导致的由血纤维蛋白原形成血纤维蛋白的效果高。
对上述印度醋栗成分进行血小板凝集试验，结果显示抑制血小板凝集物的生成的效果高。即，对于上述印度醋栗成分，进行加入激动剂ADP时出现血小板凝集、即所谓的ADP引发血小板凝集试验，其中所述激动剂ADP引发通过GpIIb-IIIa、经由血纤维蛋白原与其它血小板结合的阶段，从而产生血小板凝集。结果显示抑制通过GpIIb-IIIa、经由血纤维蛋白原的与其它血小板的结合阶段，由此抑制血小板凝集的效果高。
对于上述印度醋栗成分，进行加入激动剂瑞斯托菌素时出现血小板凝集、即所谓的瑞斯托菌素引发血小板凝集试验，其中所述激动剂瑞斯托菌素通过vWF在胶原与GpIb之间形成交联，从而产生血小板凝集。结果显示抑制胶原与GpIb之间通过vWF形成交联的效果高。
本发明用的印度醋栗学名为エンビリカ·オフイシナル(Emblicaofficinale)或余甘子(フイランサス·エンビリカ，Phyllanthus embilica)，是属于大戟科(トウダイグサ科)叶下珠属(コミカンソウ属)的落叶亚乔木，分布在印度至马来西亚地区以及中国南部，可认为印度是原产地。根据各地区或语言的不同，分别有其特定的名称，也称为余柑子(youganzi)、油甘(yougan)、奄摩勒(Anmaroku)、エンブリツク·ミロバラン(embolic myrobalan)、ア一マラキ一(himawarik)、マラツカノキ(malaka)、，マラツカツリ一(malaka tree)、インデイアング一ズベリ一(Indian gooseberry)、アロンラ(Alonla)、アミラ(Amali)、アミラキ(Amlaki)、アミラキヤトラ(Amila chatra)、ネリカイ(Nellikayi)、ネルリ(Nelli)、タシヤ(Tasha)、カユラカ(Kayruk)、ケムラカ(Kemurak)、ナツクホンポン(Makkham pom)等。
本发明中，印度醋栗的部位优选使用果实。其形态没有特别限定，可以是未成熟果实、完全成熟果实、干燥果实等的全部或部分等任何形式。榨取果实所得的果汁也可作为有效成分使用。果汁也可以以果汁粉末等的形式使用。
使用果汁或果汁粉末时，可以直接使用，但使用鲜果实或干燥果实等含有水不溶性成分的果实时，通过提取可以除去水不溶性成分，这可提高效果，因而优选。
提取时，如果使用鲜果实，则优选在除去种子之后添加或不添加水，为了提高提取效率，使用通过搅拌机等进行了破碎、匀质化的材料作为提取原料。
使用干燥果实时，为提高提取效率，优选使用粉碎成40目或以下粒度的材料作为提取原料。
果汁也可以作为提取原料使用。
本发明的抗血栓组合物中的提取物优选如下制备。
关于提取方法，对于提取溶剂、提取温度等没有特别限定。提取溶剂可以使用水、碱、酸、其它食盐水等非有机溶剂。优选选自水、碱、酸的至少一种。
使用酸或碱作为提取溶剂时，优选使提取物中和。中和反应生成的盐可通过透析法、凝胶过滤等公知的方法除去。使用水作为提取溶剂时，无需上述中和反应，无需除去生成的盐，因此进一步优选使用水。
此时使用的酸没有特别限定，可以使用大部分的酸，优选选自盐酸和硫酸的一种或将两种并用。
碱没有特别限定，可以使用大部分的碱，优选选自氢氧化钠和氢氧化钾的一种或将两者并用。
用于提取的酸或碱的浓度没有特别限定，根据酸或碱的强度变化，优选0.01-0.5摩尔的浓度。通常，酸或碱以所述浓度的水溶液使用。
相对于100重量份干燥的提取原料，提取溶剂可优选使用500-5000重量份。提取温度优选40-70℃。提取可在静置或搅拌下进行。
本说明书中的干燥操作可以通过将干燥对象在干燥机[例如送风恒温干燥机(ヤマト公司制造)]内以60-110℃保持2-16小时来进行。例如将干燥对象在70℃保持10小时进行干燥。
上述提取中，通过对提取残余物重复进行一次或多次再次提取步骤，可以使提取率提高、收率提高，因而优选。此时提取所使用的溶剂可以是相同的，也可以使用另外的溶剂。
果汁或上述所得的提取液(含提取物的液体，以下相同)可以直接使用，但通过过滤、离心分离除去不溶性物质，可以使抗血栓作用相对提高，应用范围也广，因而优选。
除去不溶性物质之后，直接使用果汁或提取液，或者将果汁或提取液浓缩后加入乙醇、回收所得沉淀物，这可进一步使抗血栓作用提高，因而优选。乙醇的浓度没有特别限定，从提高收率和作用的角度考虑，优选乙醇的浓度为60-95％(v/v)，更优选70-90％(v/v)。本说明书中，“沉淀物”是指将含有沉淀物的液体在例如25℃、以2000rpm或以上离心分离时发生沉淀的物质。
提取液可直接使用，也可以根据所需，通过喷雾干燥、冷冻干燥等方法使其形成干燥粉末后使用。
本发明的抗血栓组合物中印度醋栗的果实含量换算成干燥物质优选为10-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选20-90重量％；印度醋栗果汁的含量换算成干燥物质优选为5-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选10-95重量％；它们的提取物的含量换算成干燥物质优选为1-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选5-95重量％。
本发明的抗血栓组合物优选为使用选自水、碱和酸的至少一种从印度醋栗的果实或果汁中提取得到的印度醋栗的果实或果汁的提取物的抗血栓组合物；还优选为含有通过乙醇从印度醋栗的果实或果汁的提取物、或果汁中分离出来的沉淀物的抗血栓组合物。
本发明的抑制血纤维蛋白形成的组合物中的提取物优选如下制备。下述记载之外的内容与上述抗血栓组合物的情况相同。
提取溶剂可以使用水、碱、酸、其它亲水性溶剂。从操作性、提取效率角度考虑，亲水性溶剂优选甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇等低级醇和丙酮。特别优选选自水、碱和酸的至少一种。
果汁或提取液可以直接使用，但通过过滤、离心分离除去不溶性物质，可以使血纤维蛋白形成抑制作用相对提高，应用范围也广，因而优选。
除去不溶性物质之后，直接使用果汁或提取液，或者将果汁或提取液浓缩后加入乙醇、回收所得沉淀物，这可进一步使血纤维蛋白形成抑制作用提高，因而优选。乙醇的浓度没有特别限定，从作用提高的角度考虑，优选20-80％(v/v)，更优选60-80％(v/v)。
使用色谱、柱，进一步对加入乙醇得到的沉淀物进行纯化，可得到血纤维蛋白形成抑制作用更高的组分，因而优选。色谱、柱没有特别限定，例如可以使用离子交换色谱、凝胶过滤色谱、疏水性色谱、吸附柱色谱、亲和色谱、反相柱色谱、离子交换柱、凝胶过滤柱、疏水性柱、反相柱。从纯化效率来看，优选凝胶过滤色谱或凝胶过滤柱。
本发明的抑制血纤维蛋白形成的组合物中印度醋栗果实的含量换算成干燥物质优选为10-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选20-90重量％；印度醋栗果汁的含量换算成干燥物质优选为5-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选10-95重量％；它们的提取物的含量换算成干燥物质优选为1-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选5-95重量％。
本发明的抑制血纤维蛋白形成的组合物优选为如下抑制血纤维蛋白形成的组合物，所述组合物为印度醋栗的果实或果汁的提取物，该提取物是使用选自水、碱、酸和亲水性溶剂的至少一种从印度醋栗的果实或果汁中提取的；还优选为含有通过乙醇从印度醋栗的果实或果汁的提取物、或果汁中分离出来的沉淀物的抑制血纤维蛋白形成的组合物。
本发明的抗血小板凝集组合物中的提取物优选如下制备。下述记载之外的内容与上述抗血栓组合物的情况相同。
果汁或提取液可以直接使用，但通过过滤或离心分离除去不溶性物质，可以使抗血小板作用相对提高，应用范围也广，因而优选。
除去不溶性物质之后，直接使用果汁或提取液，或者将果汁或提取液浓缩后加入乙醇，回收所得上清(含有可溶性组分)，这可进一步使抗血小板作用提高，因而优选。乙醇的浓度没有特别限定，从作用提高的角度考虑，优选10-90％(v/v)，进一步优选10-30％(v/v)。本说明书中，上清是指将含有沉淀物的液体在例如25℃、以2000rpm或以上离心，此时将发生沉淀的物质除去的残余液体。
本发明的抗血小板凝集组合物中的印度醋栗果实的含量换算成干燥物质优选为10-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选20-90重量％；印度醋栗果汁的含量换算成干燥物质优选为5-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选10-95重量％；它们的提取物的含量换算成干燥物质优选为1-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选5-95重量％。
本发明的抗血小板凝集组合物优选为如下抗血小板凝集组合物，所述组合物为印度醋栗的果实或果汁的提取物，该提取物是使用选自水、碱和酸的至少一种从印度醋栗的果实或果汁中提取的；还优选为含有通过乙醇从印度醋栗的果实或果汁的提取物、或果汁中分离出来的含有可溶性组分的抗血小板凝集组合物。
本发明的抑制血小板凝集的组合物中的提取物优选如下制备。下述记载之外的内容与上述抗血栓组合物的情况相同。
提取溶剂除水、碱、酸等之外，还可以使用亲水性溶剂、丙酮。从操作性、提取效率角度考虑，亲水性溶剂优选选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇等低级醇的一种或以上。特别优选选自水、碱和酸的至少一种。
果汁或提取液可以直接使用，但通过过滤、离心分离或分馏除去不溶性物质和溶剂，可以使抗血小板作用提高，应用范围也广，因而优选。
除去不溶性物质和溶剂之后，直接或者将果汁或提取液浓缩后用有机溶剂进行分配，可得到各溶剂可溶性组分。这些溶剂可溶性组分可使抗血小板作用进一步提高，因而优选。有机溶剂可以使用甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇等低级醇，乙酸乙酯、乙酸丁酯、二乙醚、甲醚、甲基异丁基酮、己烷、丙酮或氯仿。为了提高可溶性组分的纯度，可以结合其它疏水性溶剂进行分配来使用，优选使用乙醇。这些溶剂的浓度没有特别限定，从收率和作用提高的角度考虑，终浓度优选20-80％(v/v)，更优选20-60％(v/v)。
为了进一步提高纯度，可以通过使用以酚系、苯乙烯系、丙烯酸系、环氧胺系、吡啶系、甲基丙烯酸系等为母体的疏水性树脂的色谱、柱进行纯化。此时，树脂吸附后，洗脱液可以以单独或水溶液的形式使用甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇等低级醇和丙酮。
本发明的抑制血小板凝集的组合物中的印度醋栗果实的含量换算成干燥物质优选为10-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选20-90重量％；印度醋栗果汁的含量换算成干燥物质优选为5-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选10-95重量％；它们的提取物的含量换算成干燥物质优选为1-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选5-95重量％。
本发明的抑制血小板凝集的组合物优选为使用选自水、碱、酸、亲水性溶剂和丙酮的至少一种从印度醋栗的果实或果汁中提取得到的印度醋栗的果实或果汁的提取物的抑制血小板凝集的组合物；还优选为含有印度醋栗的果实或果汁的提取物通过有机溶剂、优选选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二乙醚、甲醚、甲基异丁基酮、己烷或氯仿的至少一种分离的组分的抑制血小板凝集的组合物。
以上的用于本发明的各组合物的提取物的提取操作中，通过结合酶处理，可以得到收率、风味得到改善、作用提高的提取物，因此优选在提取前和/或提取时对提取原料进行酶处理。酶处理时的pH可以以要使用的酶的最适pH和pH稳定性为指标进行适当选择。处理时的温度也可以以要使用的酶的最适温度和温度稳定性为指标进行适当选择。本发明的酶处理所使用的酶只要是食品工业用的酶即可，没有特别限定，可以是选自果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、麦芽三糖水解酶(マロトトリオヒドロラ一ゼ)、β-淀粉酶、转葡糖苷酶、脂酶、蛋白酶、谷氨酰胺酶、核酸酶、脱氨酶、葡聚糖酶、葡糖氧化酶、乳糖酶、鞣酸酶、绿原酸酯酶、支链淀粉酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、粗制凝乳酶、磷酸酯酶A2等的一种或两种或以上。可优选将选自果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、绿原酸酯酶和鞣酸酶的一种或将两种或以上并用。酶的用量没有特别限定，根据酶的种类而不同，相对于100重量份干燥的提取原料，优选使用0.05-2重量份。对印度醋栗的果实或果汁也可同样进行酶处理。
因此，作为以上的本发明的组合物，更优选含有经酶处理的印度醋栗的果实、果汁或它们的提取物的组合物。
对于本发明的抗血栓组合物的抗血栓没有特别限定，优选是抑制血栓形成的作用(抗凝作用)。例如如后述的试验例A-1所示，抗血栓效果可以是对内源性凝血系统测定抗凝活性的方法，即，通过测定活化部分凝血激酶时间(APTT)来确认。
例如如后述的试验例A’-1所示，本发明的抑制血纤维蛋白形成的组合物中抑制血纤维蛋白形成的效果。可如下确认向3ml 0.7％血纤维蛋白原试剂中加入300μl抑制血纤维蛋白形成的组合物，使其均匀，然后添加300μl凝血酶试剂(10U/ml)，使血纤维蛋白形成并凝固，测定该凝固重量，求出血纤维蛋白形成抑制率。血纤维蛋白形成抑制率通常优选20％或以上，更优选30％或以上。
本发明的抗血小板凝集组合物中的抗血小板凝集是指抑制血小板的凝集，可简称为抗血小板。例如如后述的试验例A”-1所示，抗血小板活性可如下确认使用血小板凝集测定仪，测定在向血小板的悬浮液(富血小板血浆)或采集的血液中加入引发凝集的物质(ADP、肾上腺素、胶原、花生四烯酸等)时的血小板凝集率的方法。
本发明的抑制血小板凝集的组合物中的血小板凝集抑制是指抑制血小板的凝集，可简称为抗血小板。例如如后述的试验例A-1所示，抗血小板活性可如下确认使用全血血小板凝集测定仪，测定在向采集的血液中加入瑞斯托菌素时的血小板凝集率的方法，其中所述激动剂瑞斯托菌素通过在胶原与GpIb之间通过vWF形成交联来引发血小板凝集。
本发明的组合物可应用于饮料食品、药物、饲料等，优选应用于人可轻易接触的饮料食品或药物。他们的详细的应用例子如后所述。
本发明的组合物作为饮料食品的摄取量可考虑给予对象个体的身体状况、体重、年龄、性别等，根据各种情况适当调节。对于摄取次数、时间间隔、时间等没有限制，例如可以每天一次至分数次摄取。
本发明的组合物作为饮料食品的摄取量以该组合物的形式考虑，通常每50kg体重的人为0.05-20g/天，优选0.1-5g/天。
本发明的组合物作为药物的给药量可考虑给药方法、疾病的症状、给药对象的体重、年龄、性别等，根据各种情况适当确定。对于给药次数、时间间隔、时间等没有限制，例如可以每天一次至分数次给药。
本发明的组合物作为药物的给药量以干燥重量下的有效成分量考虑，通常每50kg体重的成人为40mg-3g/天，优选100-500mg/天。
(2)茶本发明具体提供用于抗血栓的组合物和用于抗血小板凝集的组合物，其特征在于含有茶的提取物作为有效成分。
本发明的组合物根据上述茶成分所具有的作用而发挥其效果，本发明中，首次发现所述茶成分具有以下的作用。
即，对上述茶成分测定活化部分凝血激酶时间(APTT)，结果显示使与内源性途径有关的因子失活，抑制血纤维蛋白的形成、抑制血管内血栓形成的效果高。
对上述茶成分进行血小板凝集试验，结果显示抑制血小板凝集物的生成的效果高。即，对上述茶成分加入激动剂ADP时出现的血小板凝集，即所谓的ADP引发血小板凝集试验结果显示通过抑制通过GpIIb-IIIa、经由血纤维蛋白原的与其它血小板的结合阶段来抑制血小板凝集的效果高。其中所述激动剂ADP引发通过GpIIb-IIIa、经由血纤维蛋白原与其它血小板的结合阶段，发生血小板凝集。
本发明所使用的茶没有特别限定，有由植物学山茶科植物的叶制造的不发酵茶——绿茶、半发酵茶——乌龙茶、发酵茶——红茶。其中从效果角度考虑，优选使用不发酵茶——绿茶。
本发明的茶提取物中，涩味成分多酚类降低，从风味角度考虑优选。
除去涩味成分多酚的方法可利用向提取液中添加聚乙烯聚吡咯烷酮的方法(日本特开平1-218550号公报)、通过冷冻浓缩与脱出的水一起除去多酚的方法(日本特开2002-325539号公报)等公知的方法。
本发明中的多酚含量的测定方法没有特别限定，例如有酒石酸铁比色法、福林-乔卡梯奥法，优选酒石酸铁比色法。从味道方面考虑，多酚含量优选占茶提取物固体成分的15重量％或以下，进一步优选10重量％或以下。
这里，例如目的是采集多酚类时，则从茶的水或热水提取物中提取多酚类后的残余物就符合本发明的“多酚类降低的茶提取物”。多酚类具有易溶解于特定的有机溶剂的性质，因此，例如使用特定的有机溶剂进行分离时，大部分溶解于有机溶剂一侧(非水溶性组分)，几乎不含在水组分中。也就是说，用水或热水提取茶叶或茶叶粉碎后的物质，其分配到乙酸乙酯、丙酮等溶剂中时，可从进入水的组分中得到“多酚类降低的茶提取物”。近年来，鉴于多酚类所具有的各种功能性，多酚类的利用程度提高，从茶的热水提取物中提取多酚类后余留的成分被作为副产物(或残余物)处理，几乎未得到有效利用，而直接扔弃。从这点来讲，本发明使至今未被有效利用、被扔弃的成分得到有效利用，因此使茶的热水提取物毫无剩余地得到利用，具有经济性得到提高和废弃物排放量降低的优点。
本发明的茶提取物优选低咖啡因，其中所述咖啡因具有使作为凝血原因的凝血酶原和血纤维蛋白原的血中浓度增加的功能。
除去咖啡因的方法可利用使用酸性白土的方法(日本特开平06-142405号公报)、使用活性炭的方法(日本特开平08-070772号公报)、使用合成吸附剂的方法(日本特开平08-109178号公报)等常规已知方法。
咖啡因的测定方法没有特别限定，例如有高效液相色谱。咖啡因含量优选占茶提取物固体成分的2重量％或以下，进一步优选1重量％或以下。
关于从上述茶的水或热水提取物分配到乙酸乙酯或丙酮中后的分配物的水组分中分离茶提取物的方法，该方法在除去多酚的同时还可降低咖啡因，因而优选。
茶的提取方法没有特别限定，例如使用水或热水作为提取溶剂时，相对于100重量份干燥的提取原料，可优选使用500-5000重量份提取溶剂。提取温度优选40-100℃。提取可在静置或搅拌下进行。
上述提取中，通过对提取残余物重复进行一次或多次再次提取步骤，可以使提取率提高，因而优选。此时，提取所使用的溶剂可以是相同的，也可以使用另外的溶剂。
上述提取液可以直接使用，但通过过滤、离心分离除去不溶性物质，可以使抗血栓效果或抗血小板凝集效果提高，应用范围也广，因而优选。
除去不溶性物质之后，向提取液中加入乙醇，回收所得沉淀物，这可进一步使抗血栓效果或抗血小板凝集效果提高，因而优选。乙醇的浓度没有特别限定，从收率和作用提高的角度考虑，终浓度优选为10-50％(v/v)，更优选15-45％(v/v)。
提取液可直接使用，也可以根据所需干燥使用。
本发明的用于抗血栓的组合物或用于抗血小板凝集的组合物中，茶提取物的含量换算成干燥物质优选为5-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选10-90重量％。
本发明的用于抗血栓的组合物或用于抗血小板凝集的组合物优选为以下的茶的提取物的组合物，多酚类降低的茶的提取物；咖啡因降低的茶的提取物；将多酚类和/或咖啡因降低的茶提取物再用乙醇分离得到的沉淀物。
本发明的用于抗血栓的组合物中，对于抗血栓没有特别限定，优选为抑制血栓形成的作用(抗凝作用)。抗血栓效果的测定没有特别限定，例如如后述的试验例B-1所示，在对内源性凝血系统测定抗凝活性的方法中，可通过测定活化部分凝血激酶时间(APTT)来确认。
本发明的用于抗血小板凝集的组合物中，抗血小板凝集是指抑制血小板的凝集，可简称为抗血小板。例如如后述的试验例B’-1所示，抗血小板活性可如下确认使用血小板凝集测定仪，测定在向血小板的悬浮液(富血小板血浆)或采集的血液中加入引发凝集的物质(ADP、肾上腺素、胶原、花生四烯酸等)时的血小板凝集率的方法。
本发明的组合物可应用于饮料食品、药物、饲料等，优选应用于人可轻易接触的饮料食品或药物。它们的具体应用例子如后所述。
本发明的组合物作为饮料食品的摄取量可考虑给予对象个体的身体状况、体重、年龄、性别等，根据各种情况适当调节。对于摄取次数、时间间隔、时间等没有限制，例如可以每天一次至分数次摄取。
本发明的组合物作为饮料食品的摄取量以该组合物的形式考虑，通常每50kg体重的人为0.05-20g/天，优选0.1-5g/天。
本发明的组合物作为药物的给药量可考虑给药方法、疾病的症状、给药对象的体重、年龄、性别等，根据各种情况适当确定。对于给药次数、时间间隔、时间等没有限制，例如可以每天一次至分数次给药。
本发明的组合物作为药物的给药量以干燥重量下的有效成分量考虑，通常每50kg体重的成人为50mg-3g/天，优选100-500mg/天。
(3)木槿具体来说，本发明中提供抗血液凝固组合物、预防血小板凝集的组合物、以及用于预防血小板凝集的组合物，其特征在于含有选自木槿果实、果汁以及它们的提取物的至少一种作为有效成分。
本发明的组合物根据上述木槿成分所具有的作用而发挥其效果，本发明中，首次发现所述木槿成分具有以下的作用。
即，对上述木槿成分测定活化部分凝血激酶时间(APTT)，结果显示使与内源性途径有关的因子失活，抑制血纤维蛋白的形成、抑制血管内的血栓形成的效果高。
对上述木槿成分加入激动剂ADP时出现的血小板凝集，即所谓的ADP引发血小板凝集试验结果显示通过抑制通过GpIIb-IIIa、经由血纤维蛋白原的与其它血小板的结合阶段来抑制形成血小板凝集血栓的效果高。其中所述激动剂ADP引发通过GpIIb-IIIa、经由血纤维蛋白原与其它血小板结合的阶段，发生血小板凝集。
对上述木槿成分加入激动剂瑞斯托菌素时出现的血小板凝集，即所谓的瑞斯托菌素引发血小板凝集试验结果显示通过抑制胶原与GpIb之间通过vWF形成交联，其抗血小板凝集效果高。其中所述激动剂瑞斯托菌素通过在胶原与GpIb之间通过vWF形成交联，从而发生血小板凝集。
本发明使用的木槿学名为木槿(ハイビスカス，Hibiscus)，在日本被称为佛桑华(ブツソウゲ)。木槿是属于锦葵科(アオイ科)木槿属(フヨウ属)的常绿灌木，名称源自古代埃及美丽的女神依西斯(ヒビス)。原产地为中国南部、中国南部·印度东部·太平洋诸岛·热带非洲。木槿具有清爽的酸味，最近也作为法国菜或意大利菜的调味汁使用，作为草药使用的食用木槿，学名为玫瑰茄(ハイビスカスサブダリフア，Hibiscus sabdariffa)/(英)洛神葵(ロゼ一ル，roselle)·(美)フロリダクランベリ一，Florida cranberry的种类在牙买加、苏丹、埃及、泰国、中国、苏里南、马来西亚等国都有栽培。
本发明中，木槿的部位可以使用果实、果汁、叶或其提取物，优选使用来自花萼和花的果实瓣或叶的部分。其形态没有特别限定，可以是鲜果实、干燥果实、果实粉末、鲜叶、干燥叶、干燥叶粉末等的任何形式。
使用果汁或果汁粉末时，可以直接使用，但鲜果实、干燥果实、鲜叶或干燥叶等含有水不溶性成分，优选通过提取除去水不溶性成分。
提取时，如果使用鲜果实、干燥果实、鲜叶或干燥叶作为提取原料，为了提高提取效率，优选使用通过搅拌机等进行破碎、匀质化的材料。
使用干燥果实或干燥叶时，为提高提取效率，优选使用粉碎成40目或以下的粒度。
关于提取方法，对提取溶剂、提取温度等没有特别限定。提取溶剂可以使用水、碱、酸、亲水性溶剂、丙酮。作为亲水性溶剂，从操作性、提取效率考虑，选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇等低级醇的一种或以上的优选。特别优选选自水、碱、酸的至少一种。
使用酸或碱作为提取溶剂时，优选使提取物中和。由中和反应生成的盐可通过透析法、凝胶过滤等公知的方法除去。使用水作为提取溶剂时，无需上述中和反应，无需除去生成的盐，因此进一步优选使用水。
此时使用的酸没有特别限定，可以使用大部分的酸，从容易获得以及操作性方面考虑，优选选自盐酸和硫酸的一种或将两种并用。
碱没有特别限定，可以使用大部分的碱，优选选自氢氧化钠和氢氧化钾的一种或将两者并用。
用于提取的酸或碱的浓度不管是在酶处理提取物前或后都没有特别限定，根据酸或碱的强度变化，从操作性和提取效率考虑，优选使用0.01-0.5摩尔的浓度。通常，酸或碱以所述浓度的水溶液使用。
相对于100重量份干燥的提取原料，提取溶剂可优选使用500-5000重量份。提取温度优选40-70℃。提取可在静置或搅拌下进行。
上述提取中，通过对提取残余物重复进行一次或多次再次提取步骤，可以使提取率提高、收率提高，因而优选。此时的提取所使用的溶剂可以是相同的，也可以使用另外的溶剂。
上述所得的提取液可以直接使用，但通过过滤、离心分离或分馏除去不溶性物质和溶剂，可以使抗凝血效果或抗血小板凝集效果高，应用范围也广，因而优选。
以上的用于本发明的各组合物的提取物的提取操作中，通过结合酶处理，可以得到收率、风味得到改善、作用提高的提取物，因此优选在提取前和/或提取时对提取原料进行酶处理。酶处理时的pH可以以要使用的酶的最适pH和pH稳定性为指标进行适当选择。处理时的温度也可以以要使用的酶的最适温度和温度稳定性为指标进行适当选择。本发明的酶处理所使用的酶只要是食品工业用的酶即可，没有特别限定，可以是选自果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、麦芽三糖水解酶、β-淀粉酶、转葡糖苷酶、脂酶、蛋白酶、谷氨酰胺酶、核酸酶、脱氨酶、葡聚糖酶、葡糖氧化酶、乳糖酶、鞣酸酶、绿原酸酯酶、支链淀粉酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、粗制凝乳酶、磷酸酯酶A2等的一种或两种或以上。可优选将选自果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、绿原酸酯酶和鞣酸酶的一种或两种或以上并用。酶的用量没有特别限定，根据酶的种类而不同，相对于100重量份干燥的提取原料，优选使用0.05-2重量份。酶处理也可同样对木槿的果实、果汁或叶进行。
因此，作为以上的本发明的组合物，更优选含有经酶处理的木槿的果实、果汁、叶或它们的提取物的组合物。
另一方面，如上所述，在除去不溶性物质和溶剂后，可直接或用有机溶剂对果汁或提取液进行浓缩后进行分配，得到各溶剂可溶性组分。这些溶剂可溶性组分可使抗凝血效果或抗血小板凝集效果进一步提高，因而优选。有机溶剂可以使用甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇等低级醇，乙酸乙酯、乙酸丁酯、二乙醚、甲醚、甲基异丁基酮、己烷、丙酮或氯仿。为了提高可溶性组分的纯度，可以结合其它疏水性溶剂进行的分配来使用，优选使用乙醇。这些溶剂的浓度没有特别限定，从收率和效果考虑，终浓度优选20-80％(v/v)，进一步优选20-60％(v/v)。
为了进一步提高纯度，可以通过使用以酚系、苯乙烯系、丙烯酸系、环氧胺系、吡啶系、甲基丙烯酸系等为母体的疏水性树脂的色谱、柱进行纯化。此时，树脂吸附后，洗脱液可以以单独或水溶液的形式使用甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇等低级醇和丙酮。
提取液和组分可直接使用，也可以根据所需，通过喷雾干燥、冷冻干燥等方法使其形成干燥粉末后使用。
本发明的抗血液凝固组合物中，木槿果实的含量换算成干燥物质优选为10-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选20-90重量％；木槿果汁的含量换算成干燥物质优选为5-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选10-95重量％；木槿叶的含量换算成干燥物质优选为10-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选20-90重量％；它们的提取物的含量换算成干燥物质优选为1-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选5-95重量％。
本发明的预防血小板凝集的组合物或用于预防血小板凝集的组合物中，木槿果实的含量换算成干燥物质优选为10-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选20-90重量％；木槿果汁的含量换算成干燥物质优选为5-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选10-95重量％；木槿叶的含量换算成干燥物质优选为10-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选20-90重量％；它们的提取物的含量换算成干燥物质优选为1-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选5-95重量％。
本发明的抗血液凝固组合物、预防血小板凝集的组合物或用于预防血小板凝集的组合物优选为通过选自水、碱、酸、亲水性溶剂和丙酮的至少一种从木槿的果实、果汁或叶中提取得到的木槿果实、果汁或叶的提取物的组合物；还优选为含有木槿的果实、果汁或叶的提取物通过有机溶剂、优选选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二乙醚、甲醚、甲基异丁基酮、己烷、丙酮或氯仿的至少一种分离的组分的组合物。
例如如后述的试验例C-2所示，本发明的抗血液凝固组合物的抗凝血效果是通过对内源性凝血系统测定抗凝血活性的方法，即，通过测定活化部分凝血激酶时间(APTT)来确认。
本发明的预防血小板凝集的组合物中，抗血小板凝集是指抑制血小板的凝集，可简称为抗血小板。例如如后述的试验例C’-1所示，抗血小板活性可如下确认使用全血血小板凝集测定仪，测定在向采集的血液中加入激动剂ADP时的血小板凝集率的方法。其中所述激动剂ADP引发通过GpIIb-IIIa、经由血纤维蛋白原与其它血小板结合的阶段，从而发生血小板凝集。
本发明的用于预防血小板凝集的组合物中，抗血小板凝集是指抑制血小板的凝集，可简称为抗血小板。例如如后述的试验例C”-1所示，抗血小板活性可如下确认使用全血血小板凝集测定仪，测定在向采集的血液中加入激动剂瑞斯托菌素时的血小板凝集率的方法。其中所述激动剂瑞斯托菌素通过胶原与GpIb之间通过vWF形成交联，从而发生血小板凝集。
本发明的组合物可应用于饮料食品、药物、饲料等，优选应用于人可轻易接触的饮料食品或药物。它们的具体应用例子如后所述。
本发明的组合物作为饮料食品的摄取量可考虑给予对象个体的身体状况、体重、年龄、性别等，根据各种情况适当调节。对于摄取次数、时间间隔、时间等没有限制，例如可以每天一次至分数次摄取。
本发明的组合物作为饮料食品的摄取量以该组合物的形式考虑，通常每50kg体重的人为0.05-20g/天，优选0.1-5g/天。
本发明的组合物作为药物的给药量可考虑给药方法、疾病的症状、给药对象的体重、年龄、性别等，根据各种情况适当确定。对于给药次数、时间间隔、时间等没有限制，例如可以每天一次至分数次给药。
本发明的抗血液凝固组合物作为药物的给药量，以干燥重量下的有效成分量考虑，通常每50kg体重的成人为约50mg-2g/天，优选100-500mg/天。
本发明的预防血小板凝集的组合物或用于预防血小板凝集的组合物作为药物的给药量以干燥重量下的有效成分量考虑，通常每50kg体重的成人为约40mg-3g/天，优选100-500mg/天。
(4)苍耳具体来说，本发明中提供抑制血小板凝集性血栓的组合物、以及用于抑制血小板凝集性血栓的组合物，其特征在于含有选自苍耳果实、果汁、种子以及它们的提取物的至少一种作为有效成分。
本发明的组合物根据上述苍耳成分所具有的作用而发挥其效果，本发明中，首次发现所述苍耳成分具有以下的作用。
即，对上述苍耳成分加入激动剂ADP时出现的血小板凝集，即所谓的ADP引发血小板凝集试验结果显示通过抑制通过GpIIb-IIIa、经由血纤维蛋白原与其它血小板结合的阶段，抑制血小板凝集性血栓形成的效果高。其中所述激动剂ADP引发通过GpIIb-IIIa、经由血纤维蛋白原与其它血小板结合的阶段，从而发生血小板凝集。
对上述苍耳成分加入激动剂瑞斯托菌素时出现的血小板凝集，即所谓的瑞斯托菌素引发血小板凝集试验结果显示通过抑制胶原与GpIb之间通过vWF形成交联来抑制血小板凝集性血栓形成的效果高。其中所述激动剂瑞斯托菌素通过在胶原与GpIb之间通过vWF形成交联，从而发生血小板凝集。
本发明使用的苍耳学名为欧洲苍耳(キサンテイウムストルマリウム，Xanthium strumarium L.)，是属于菊科苍耳属的一年生草本，高约1米，整体有短刚毛。种子在茎上互生，形状大体呈心形，先端尖，种子边缘有不整齐的锯齿，质厚，有稍坚硬的短毛。夏季，在分开的枝头呈圆锥状生有黄绿色的头状花序。雄花位于上方，有绿色的坚硬的毛刺，雌花位于下方。果实被总苞包裹，周围有刺，附着于衣物或动物毛皮上传播。世界上有约20种苍耳，原产地为亚洲大陆，广泛分布于世界各地。特别是大多分布于美洲大陆。古代罗马人用作将头发染黄的染料，因此属名来自于希腊语的黄色(Xanthos)，在日本，可将种子揉碎，用于趋驱虫，因此名为“Namomi(生揉み)”。英文名称为Cocklebur。将苍耳的成熟果实在阳光下干燥，所得的生药称为苍耳，用作解热、发汗、头痛药。在欧洲、北非作为家畜的饲料使用，还用作治疗淋巴腺肿的药。
本发明中，苍耳的部位可以使用果实、果汁、花萼、花瓣或种子。其形态没有特别限定，果实可以是未成熟果实、成熟果实、果汁粉末等的任何形式。
使用果汁或果汁粉末时，可以直接使用，但使用鲜果实或干燥果实等含有水不溶性成分的材料时，从提到效果考虑，优选通过提取除去水不溶性成分。
提取时，如果使用鲜果实作为提取原料，优选在除去种子后添加或不添加水，为了提高提取效率，使用通过搅拌机等进行破碎、匀质化的材料。
使用干燥果实和干燥种子作为提取原料时，为提高提取效率，优选粉碎成40目或以下的粒度。
关于提取方法，对提取溶剂、提取温度等没有特别限定。提取溶剂可以使用水、碱、酸、亲水性溶剂、丙酮。作为亲水性溶剂，从操作性、提取效率考虑，优选选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇等低级醇的一种或以上的优选。特别优选选自水、碱、酸的至少一种。
使用酸或碱作为提取溶剂时，优选使提取物中和。由于中和反应而生成的盐可通过透析法、凝胶过滤等公知的方法除去。使用水作为提取溶剂时，无需上述中和反应，无需除去生成的盐，因此进一步优选使用水。
此时，使用的酸没有特别限定，可以使用大部分的酸，从容易获得和操作性方面考虑，优选选自盐酸和硫酸的一种或将两种并用。
碱没有特别限定，可以使用大部分的碱，优选选自氢氧化钠和氢氧化钾的一种或将两者并用。
用于提取的酸或碱的浓度不管是在酶处理提取物前或后都没有特别限定，根据酸或碱的强度变化，从操作性和提取效率考虑，优选使用0.01-0.5摩尔的浓度。通常，酸或碱以所述浓度的水溶液使用。
相对于100重量份干燥的提取原料，提取溶剂可优选使用500-5000重量份。提取温度优选40-70℃。提取可在静置或搅拌下进行。
上述提取中，通过对提取残余物重复进行一次或多次再次提取步骤，可以使提取率提高、收率提高，因而优选。此时的提取所使用的溶剂可以是相同的，也可以使用另外的溶剂。
提取液可以直接使用，但通过过滤、离心分离和分馏除去不溶性物质和溶剂，可以使抗血小板凝集效果高，应用范围也广，因而优选。
以上的用于本发明的各组合物的提取物的提取操作中，通过结合采用酶处理，可以得到收率、风味得到改善、作用提高的提取物，因此优选在提取前和/或提取时对提取原料进行酶处理。酶处理时的pH可以以要使用的酶的最适pH和pH稳定性为指标进行适当选择。处理时的温度也可以以要使用的酶的最适温度和温度稳定性为指标进行适当选择。本发明的酶处理所使用的酶只要是食品工业用的酶即可，没有特别限定，可以是选自果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、麦芽三糖水解酶、β-淀粉酶、转葡糖苷酶、脂酶、蛋白酶、谷氨酰胺酶、核酸酶、脱氨酶、葡聚糖酶、葡糖氧化酶、乳糖酶、鞣酸酶、绿原酸酯酶、支链淀粉酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、粗制凝乳酶、磷酸酯酶A2等的一种或两种或以上。可优选将选自果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、绿原酸酯酶和鞣酸酶的一种或两种或以上并用。酶的用量没有特别限定，根据酶的种类而不同，相对于100重量份干燥的提取原料，优选使用0.05-2重量份。酶处理也可同样对苍耳的果实、果汁或种子进行。
因此，作为以上的本发明的组合物，更优选含有经酶处理的苍耳的果实、果汁、种子或它们的提取物的组合物。
另一方面，如上所述，在除去不溶性物质和溶剂后，直接或对果汁或提取液浓缩后用有机溶剂进行分配，得到各溶剂可溶性组分。这些溶剂可溶性组分可使抗血小板凝集效果进一步提高，因而优选。有机溶剂可以使用甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇等低级醇，乙酸乙酯、乙酸丁酯、二乙醚、甲醚、甲基异丁基酮、己烷、丙酮或氯仿。为了提高可溶性组分的纯度，可以结合由其它疏水性溶剂进行的分配来使用，优选使用乙醇。这些溶剂的浓度没有特别限定，从收率和效果考虑，终浓度优选20-80％(v/v)，进一步优选20-60％(v/v)。
为了进一步提高纯度，可以通过使用以酚系、苯乙烯系、丙烯酸系、环氧胺系、吡啶系、甲基丙烯酸系等为母体的疏水性树脂的色谱、柱进行纯化。此时，树脂吸附后，洗脱液可以以单独或水溶液的形式使用甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇等低级醇和丙酮。
提取液和组分可直接使用，也可以根据所需，通过喷雾干燥、冷冻干燥等方法使其形成干燥粉末后使用。
本发明的抑制血小板凝集性血栓的组合物或用于抑制血小板凝集性血栓的组合物中，苍耳果实的含量换算成干燥物质优选为10-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选20-90重量％；苍耳果汁的含量换算成干燥物质优选为5-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选10-95重量％；苍耳种子的含量换算成干燥物质优选为10-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选20-90重量％；它们的提取物的含量换算成干燥物质优选为1-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选5-95重量％。
本发明的抑制血小板凝集性血栓的组合物或用于抑制血小板凝集性血栓的组合物优选为通过选自水、碱、酸、亲水性溶剂和丙酮的至少一种从苍耳的果实、果汁或种子中提取得到的苍耳果实、果汁或种子的提取物的组合物；还优选为含有苍耳的果实、果汁或种子的提取物通过有机溶剂、优选选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二乙醚、甲醚、甲基异丁基酮、己烷、丙酮或氯仿的至少一种分离的组分的组合物。
本发明的抑制血小板凝集性血栓的组合物中，抑制血小板凝集性血栓是指抑制血小板的凝集、抑制血栓的形成，血小板凝集可简称为抗血小板。例如如后述的试验例D-1所示，抗血小板活性可如下确认使用全血血小板凝集测定仪，测定在向采集的血液中加入激动剂ADP时的血小板凝集率的方法。其中所述激动剂ADP引发通过GpIIb-IIIa、经由血纤维蛋白原与其它血小板结合的阶段，从而发生血小板凝集。
本发明的用于抑制血小板凝集性血栓的组合物中，抑制血小板凝集性血栓是指抑制血小板的凝集、抑制血栓的形成，抑制血小板凝集可简称为抗血小板。例如如后述的试验例D’-1所示，抗血小板活性可如下确认使用全血血小板凝集测定仪，测定在向采集的血液中加入激动剂瑞斯托菌素时的血小板凝集率的方法。其中所述激动剂瑞斯托菌素通过在胶原与GpIb之间通过vWF形成交联，从而发生血小板凝集。
本发明的组合物可应用于饮料食品、药物、饲料等，优选应用于人可轻易接触的饮料食品或药物。它们的具体应用例子如后所述。
本发明的组合物作为饮料食品的摄取量可考虑给予对象个体的身体状况、体重、年龄、性别等，根据各种情况适当调节。对于摄取次数、时间间隔、时间等没有限制，例如可以每天一次至分数次摄取。
本发明的组合物作为饮料食品的摄取量以该组合物的形式考虑，通常每50kg体重的人为0.05-20g/天，优选0.1-5g/天。
本发明的组合物作为药物的给药量可考虑给药方法、疾病的症状、给药对象的体重、年龄、性别等，根据各种情况适当确定。对于给药次数、时间间隔、时间等没有限制，例如可以每天一次至分数次给药。
本发明的组合物作为药物的给药量以干燥重量下的有效成分量考虑，通常每50kg体重的成人约为40mg-3g/天，优选100-500mg/天。
(5)匙羹藤具体来说，本发明中提供血栓形成抑制剂，其特征在于含有选自匙羹藤、其提取物或它们的混合物作为有效成分。
本发明的组合物根据上述匙羹藤成分所具有的作用而发挥其效果，本发明中，首次发现所述匙羹藤成分具有以下的作用。
即，对上述匙羹藤成分进行血小板凝集试验，结果显示抑制血小板凝集物的生成的效果高。即，对上述匙羹藤成分加入激动剂ADP时出现的血小板凝集，即所谓的ADP引发血小板凝集试验结果显示通过抑制通过GpIIb-IIIa、经由血纤维蛋白原的与其它血小板结合的阶段来抑制血小板凝集的效果高。其中所述激动剂ADP引发通过GpIIb-IIIa、经由血纤维蛋白原与其它血小板结合的阶段，从而发生血小板凝集。
本发明使用的匙羹藤学名为匙羹藤(ギムネマ·スルヴエスタ，Gymnema Sylvestre)，是原产于印度、广泛分布于印度尼西亚、中国西南部等热带至亚热带地区的萝摩科(Asclepidaceae)爬蔓植物，从植物分类学上讲，是与在日本也有生长的箩摩(ガガイモ，Metaplexisjaponica)、イケマ(Cynanchum caudatum)、马利筋(トウワタ，Asclepiascurassavica)等属于同科的植物。
本发明中，匙羹藤的部位通常可以使用选自叶、茎、蔓的一种或两种或以上。其形态没有特别限定。为粉末时，可以直接使用，但优选通过用水等提取，使水不溶性成分除去。
关于提取方法，对提取溶剂、提取温度等没有特别限定。提取溶剂可以使用水、碱、酸、醇类、其它食盐水等非有机溶剂，优选选自水、碱、酸和醇类的一种或以上。
使用酸或碱作为提取溶剂时，优选使提取物中和。由中和反应生成的盐可通过透析法、凝胶过滤等公知的方法除去。使用水作为提取溶剂时，无需上述中和反应，无需除去生成的盐，因此进一步优选使用水。
此时，使用的酸没有特别限定，可以使用大部分的酸，优选选自盐酸和硫酸的一种或将两种并用。
碱没有特别限定，可以使用大部分的碱，优选选自氢氧化钠和氢氧化钾的一种或将两者并用。
用于提取的酸或碱的浓度没有特别限定，根据酸或碱的强度变化，优选使用0.01-0.5摩尔的浓度。通常，酸或碱以所述浓度的水溶液使用。
本发明中的醇类没有特别限定，优选可在饮料食品材料的制备中使用的醇类，进一步优选选自乙醇、异丙醇、丙二醇和甘油的一种或以上，最优选乙醇。
相对于100重量份干燥的提取原料，提取溶剂可优选使用500-5000重量份。提取温度优选40-70℃。提取可在静置或搅拌下进行。
上述提取中，通过对提取残余物重复进行一次或多次再次提取步骤，可以使提取率提高、收率提高，因而优选。此时的提取所使用的溶剂可以是相同的，也可以使用另外的溶剂。
上述提取液可以直接使用，但通过过滤或离心分离除去不溶性物质，可以使抑制血栓形成的效果提高，应用范围也广，因而优选。
在除去不溶性物质后，向提取液中直接或浓缩后加入乙醇，回收所得上清(含有可溶性组分)，所得的抑制血栓形成的效果进一步提高，因而优选。乙醇的浓度没有特别限定，从收率和效果考虑，终浓度优选10-95％(v/v)，进一步优选60-90％(v/v)。
提取液可直接使用，也可以根据所需，通过喷雾干燥、冷冻干燥等方法使其形成干燥粉末后使用。
本发明的血栓形成抑制剂中，匙羹藤含量换算成干燥物质优选为10-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选20-90重量％；其提取物的含量换算成干燥物质优选为1-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选5-95重量％。
本发明的血栓形成抑制剂优选为通过选自水、碱、酸、醇类的一种或以上提取得到的匙羹藤提取物的血栓形成抑制剂；还优选为匙羹藤提取物进一步通过乙醇分离得到的可溶性组分的血栓形成抑制剂。
本发明的血栓形成抑制剂中，血栓形成抑制没有特别限定，优选主要因抗血小板凝集而抑制血栓的形成。抗血小板凝集是指抑制血小板的凝集，可简称为抗血小板。例如如后述的试验例E-1所示，抑制血栓形成的效果中，抗血小板活性可如下确认使用血小板凝集测定仪，测定在向血小板的悬浮液(富血小板血浆)或采集的血液中加入引发凝集的物质(ADP、肾上腺素、胶原、花生四烯酸等)时的血小板凝集率的方法。
本发明的组合物可应用于饮料食品、药物、饲料等，优选应用于人可轻易接触的饮料食品或药物。它们的具体应用例子如后所述。
本发明的组合物作为饮料食品的摄取量可考虑给予对象个体的身体状况、体重、年龄、性别等，根据各种情况适当调节。对于摄取次数、时间间隔、时间等没有限制，例如可以每天一次至分数次摄取。
本发明的组合物作为饮料食品的摄取量以该组合物的形式考虑，通常每50kg体重的人为0.05-20g/天，优选0.1-5g/天。
本发明的组合物作为药物的给药量可考虑给药方法、疾病的症状、给药对象的体重、年龄、性别等，根据各种情况适当确定。对于给药次数、时间间隔、时间等没有限制，例如可以每天一次至分数次给药。
本发明的组合物作为药物的给药量以干燥重量下的有效成分量考虑，通常每50kg体重的成人约为50mg-2g/天，优选100-500mg/天。
(6)羊栖菜具体来说，本发明中提供预防外源性凝血的组合物、预防血栓的组合物、以及用于预防血栓的组合物，其特征在于含有选自羊栖菜、其提取物或它们的混合物的至少一种作为有效成分。
本发明的组合物根据上述羊栖菜成分所具有的作用而发挥其效果，本发明中，首次发现所述羊栖菜成分具有以下的作用。
即，对上述羊栖菜成分进行抗凝血试验，结果显示抑制外源性凝血的生成的效果高。
对上述羊栖菜成分测定活化部分凝血激酶时间(APTT)，结果显示使与内源性途径有关的因子失活，抑制血纤维蛋白的形成、抑制血管内的血栓生成的效果高。
本发明使用的羊栖菜学名为ヒジキア·フシフオルミス(Hijikiafusiforumis)，是属于褐藻类马尾藻科的海藻。是分布于日本北海道日高地方以南的太平洋沿岸、濑户内海、兵库县附近以西的日本海一侧、九州沿岸的日本近海特产。干品为黑褐色，但鲜品为黄褐色。羊栖菜生长于波浪大的外海岩礁上、低潮带附近，藻体为浓绿褐色，根为交织的纤维状，非常发达，附着在岩石上生长。藻体的茎是软骨质，呈圆柱状，粗3-4mm，长度0.5-1mm，从茎部侧生细长的圆柱状的叶和侧枝，叶片在幼苗期时肉质多、平坦，在成熟期，叶呈线型，长3-10cm，大多先端尖，中间部位整齐，但常常是先端部位呈膨大的棍棒状，中空且有气泡，春季至初夏期间生长茂盛。涩味重，不能生食，但用铁锅水煮数小时，则可去除涩味，色素也被去除，将其在日光下干燥，则成“晒干羊栖菜”。只收集晒干羊栖菜中的侧枝部分，则称为“牙羊栖菜(芽ヒジキ)、米羊栖菜(米ヒジキ)或姬羊栖菜(姬ヒジキ)”，茎状长的部分(主轴部分)称为“长羊栖菜(長ヒジキ)”。牙羊栖菜在水中复原，体积为原来的3倍，重量约为6倍。别名有ひずきも、ねいり、ゎようせんヒジキ、みゎヒジキ等。
本发明中，羊栖菜的部位没有特别限定，优选使用侧枝部分和主轴部分。其形态没有特别限定，可以是鲜羊栖菜、晒干羊栖菜、干燥羊栖菜、羊栖菜粉末等的任何形式。
使用羊栖菜粉末时，可以直接使用，但由于含有水不溶性成分，优选通过提取除去水不溶性成分。
提取时，如果使用鲜羊栖菜、晒干羊栖菜、干燥羊栖菜作为提取原料，为了提高提取效率，优选使用通过搅拌机等进行破碎、匀浆得到的材料。
使用晒干羊栖菜或干燥羊栖菜作为提取原料时，为提高提取效率，优选粉碎成40目或以下的粒度。
关于提取方法，对提取溶剂、提取温度等没有特别限定。提取溶剂可以使用水、碱、酸、亲水性溶剂、丙酮。作为亲水性溶剂，从操作性、提取效率考虑，优选选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇等低级醇的一种或以上。特别优选选自水、碱、酸和亲水性溶剂的至少一种。
使用酸或碱作为提取溶剂时，优选使提取物中和。由中和反应生成的盐可通过透析法、凝胶过滤等公知的方法除去。使用水作为提取溶剂时，无需上述中和反应，无需除去生成的盐，因此进一步优选使用水。
此时使用的酸没有特别限定，可以使用大部分的酸，从容易获得方面和操作性方面考虑，优选选自盐酸和硫酸的一种或将两种并用。
碱没有特别限定，可以使用大部分的碱，优选选自氢氧化钠和氢氧化钾的一种或将两者并用。
用于提取的酸或碱的浓度没有特别限定，根据酸或碱的强度变化，从操作性和提取效率考虑，优选使用0.01-0.5摩尔的浓度。通常，酸或碱以所述浓度的水溶液使用。
相对于100重量份干燥的提取原料，提取溶剂可优选使用500-5000重量份。提取温度优选40-70℃。提取可在静置或搅拌下进行。
以上的提取中，通过酶处理，可以得到收率、风味得到改善、作用提高的提取物，因此优选进行酶处理。酶处理时的pH可以以要使用的酶的最适pH和pH稳定性为指标进行适当选择。处理时的温度也可以以要使用的酶的最适温度和温度稳定性为指标进行适当选择。本发明的酶处理所使用的酶只要是食品工业用的酶即可，没有特别限定，可以使用选自果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、麦芽三糖水解酶、β-淀粉酶、转葡糖苷酶、脂酶、蛋白酶、谷氨酰胺酶、核酸酶、脱氨酶、葡聚糖酶、葡糖氧化酶、乳糖酶、鞣酸酶、绿原酸酯酶、支链淀粉酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、粗制凝乳酶、磷酸酯酶A2等的一种或并用两种。可优选将选自果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、绿原酸酯酶和鞣酸酶的一种或两种并用。酶的用量没有特别限定，根据酶的种类而不同，相对于100重量份干燥的提取原料，优选使用0.05-2重量份。
上述提取中，通过对提取残余物重复进行一次或多次再次提取步骤，可以使提取率提高、收率提高，因而优选。此时的提取所使用的溶剂可以是相同的，也可以使用另外的溶剂。
提取液可以直接使用，但通过过滤、离心分离和分馏除去不溶性物质和溶剂，可以使预防外源性凝血的效果或预防血栓的效果提高，应用范围也广，因而优选。
除去不溶性物质和溶剂之后，直接或将提取液浓缩后用有机溶剂进行分配，可得到各溶剂可溶性组分。这些溶剂可溶性组分可使预防外源性凝血效果或预防血栓的效果进一步提高，因而优选。有机溶剂可以使用甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇等低级醇，乙酸乙酯、乙酸丁酯、二乙醚、甲醚、甲基异丁基酮、己烷、丙酮或氯仿，更优选使用乙醇。为了提高可溶性组分的纯度，可以结合其它疏水性溶剂进行分配来使用。这些溶剂的浓度没有特别限定，从收率和效果的角度考虑，终浓度优选20-80％(v/v)，进一步优选20-60％(v/v)。
为了进一步提高纯度，可以通过使用以酚系、苯乙烯系、丙烯酸系、环氧胺系、吡啶系、甲基丙烯酸系等为母体的疏水性树脂的色谱、柱进行纯化。此时，树脂吸附后，洗脱液可以以单独或水溶液的形式使用甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇等低级醇和丙酮。
提取液和组分可直接使用，也可以根据所需，通过喷雾干燥、冷冻干燥等方法使其形成干燥粉末后使用。
本发明的预防外源性凝血的组合物、预防血栓的组合物、或用于预防血栓的组合物中，羊栖菜的含量换算成干燥物质优选为10-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选20-90重量％；其提取物的含量换算成干燥物质优选为1-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选5-95重量％。
本发明的预防外源性凝血的组合物、预防血栓的组合物、或用于预防血栓的组合物优选为通过选自水、碱、酸、亲水性溶剂和丙酮的至少一种从羊栖菜提取得到的羊栖菜提取物的组合物；还优选为含有羊栖菜提取物通过有机溶剂、优选选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇等低级醇，乙酸乙酯、乙酸丁酯、二乙醚、甲醚、甲基异丁基酮、己烷、丙酮或氯仿的至少一种分离的组分的组合物。更优选提取物经过酶处理。
例如如后述的试验例F-1所示，本发明的预防外源性凝血的组合物中，预防外源性凝血效果可通过测定对外源性凝血系统的抗凝血活性的方法、即，通过测定凝血酶原时间(PT)来确认。
本发明的预防血栓的组合物和用于预防血栓的组合物中的预防血栓的效果例如可通过测定对内源性凝血系统的抗凝血活性的方法、即，通过测定活化部分凝血激酶时间(APTT)来确认。例如对本发明的预防血栓的组合物，通过后述的试验例F’-1、对本发明的用于预防血栓的组合物，通过后述的试验例F”-1分别确认效果。
本发明的组合物可应用于饮料食品、药物、饲料等，优选应用于人可轻易接触的饮料食品或药物。它们的具体应用例子如后所述。
本发明的组合物作为饮料食品的摄取量可考虑给予对象个体的身体状况、体重、年龄、性别等，根据各种情况适当调节。对于摄取次数、时间间隔、时间等没有限制，例如可以每天一次至分数次摄取。
本发明的组合物作为饮料食品的摄取量以该组合物的形式考虑，通常每50kg体重的人为0.05-20g/天，优选0.1-5g/天。
本发明的组合物作为药物的给药量可考虑给药方法、疾病的症状、给药对象的体重、年龄、性别等，根据各种情况适当确定。对于给药次数、时间间隔、时间等没有限制，例如可以每天一次至分数次给药。
本发明的预防外源性凝血的组合物作为药物的给药量以干燥重量下的有效成分量考虑，通常每50kg体重的成人约为50mg-2g/天，优选100-500mg/天。
本发明的预防血栓的组合物和用于预防血栓的组合物作为药物的给药量以干燥重量下的有效成分量考虑，通常每50kg体重的成人为约1mg-40mg/天，优选2-10mg/天。
(7)角叉菜聚糖具体来说，本发明提供抗血栓剂，其特征在于含有角叉菜聚糖作为有效成分。
本发明的组合物根据上述角叉菜聚糖成分所具有的作用而发挥其效果，本发明中，首次发现所述角叉菜聚糖成分具有以下的作用。
即，对上述角叉菜聚糖成分测定活化部分凝血激酶时间(APTT)，结果显示使与内源性途径有关的因子失活，抑制血纤维蛋白的形成、抑制血管内的血栓生成的效果高。
本发明使用的角叉菜聚糖是从长枝沙菜(イバラノリ，Hypneacharoides Lamouroux)、麒麟菜(キリンサイ，Eucheuma)、银杏藻(ギンナンソウ，Iridaea)、线形软刺藻(スギノリ，chondracanthustenellus Hommersand)或角叉菜(ツノマ，Chondrus ocellatus Holmes)等海藻中提取、纯化的天然高分子物质，是以分子量为100,000-500,000的半乳糖、3，6-脱水半乳糖为主要成分的多糖类。
可以使用市场销售的角叉菜聚糖，优选为先用水或热水溶解、然后过滤除去不溶性成分的角叉菜聚糖。
角叉菜聚糖的种类可以是ι-角叉菜聚糖、κ-角叉菜聚糖、λ-角叉菜聚糖的任何一种，也可以是多种的组合。从效果角度看，优选ι-角叉菜聚糖或λ-角叉菜聚糖的一种或多种的组合，进一步优选λ-角叉菜聚糖。
本发明的抗血栓剂中，角叉菜聚糖的含量换算成干燥物质优选为1-100重量％，考虑到该组合物的使用便利性，更优选5-95重量％。
本发明中的抗血栓没有特别限定，优选指抑制血栓形成的作用(抗凝作用)。例如如后述的试验例G-1所示，抗血栓效果可在测定对内源性凝血系统的抗凝血活性的方法中，通过测定活化部分凝血激酶时间(APTT)来确认。
本发明的组合物可应用于饮料食品、药物、饲料等，优选应用于人可轻易接触的饮料食品或药物。它们的具体应用例子如后所述。
本发明的组合物作为饮料食品的摄取量可考虑给予对象个体的身体状况、体重、年龄、性别等，根据各种情况适当调节。对于摄取次数、时间间隔、时间等没有限制，例如可以每天一次至分数次摄取。
本发明的组合物作为饮料食品的摄取量以该组合物的形式考虑，通常每50kg体重的人为0.05-20g/天，优选0.1-5g/天。
本发明的组合物作为药物的给药量可考虑给药方法、疾病的症状、给药对象的体重、年龄、性别等，根据各种情况适当确定。对于给药次数、时间间隔、时间等没有限制，例如可以每天一次至分数次给药。
本发明的组合物作为药物的给药量以干燥重量下的有效成分量考虑，通常每50kg体重的成人约为50mg-2g/天，优选100-500mg/天。
上述(1)-(7)中记载的本发明的用于抑制血栓形成的组合物中，本发明的有效成分以外的成分例如有糊精、环糊精、クラスタ一糊精、难消化性糊精、苍耳烷、瓜耳胶、瓜耳胶分解物、藻酸等多糖类，大豆蛋白等植物性蛋白质和大豆肽等植物性蛋白质的分解物，卵黄、卵清、全卵等动物性蛋白质以及卵黄、卵清、全卵肽等动物性蛋白质的分解物，乳糖等公知的食品原料成分。本发明的组合物可以将这些公知的成分和本发明的有效成分适当混合来制备。以上的成分可以是天然产物也可以是合成产物。
(8)本发明的组合物的应用举例本发明的一个方案提供含有本发明的用于抑制血栓形成的组合物而成的饮料食品。用于抑制血栓形成的组合物是指上述任何的本发明的组合物。
本发明中的饮料食品只要是溶液、悬浮物、粉末、固体成型物等可口服摄取的形式即可，没有特别限定。该饮料食品中，本发明的用于抑制血栓形成的组合物的含量通常优选0.01-15重量％，更优选0.05-10重量％。所述饮料食品除混合本发明的用于抑制血栓形成的组合物作为原料的一部分之外，都可按照公知的饮料食品的配比组成和制造方法进行制造。
更具体地说，本发明的饮料食品的例子有快餐面、加热蒸煮食品、罐头、微波炉食品、快餐汤·酱汤类、冻干食品等快餐食品类，清凉饮料、果汁饮料、蔬菜饮料、豆乳饮料、咖啡饮料、茶饮料、粉末饮料、浓缩饮料、营养饮料、酒精饮料等饮料类，面包、通心面、面条、蛋糕粉、炸粉、面包粉等小麦粉制品，糖果、卡拉密尔糖(カラミル)、香口胶、巧克力、小甜饼、饼干、蛋糕、夹心蛋糕、小吃点心、脆点心、日式点心、甜点心等点心类，调味汁、番茄加工调味品、风味调味料、烹调调料、调料汁类、沙拉调料类、汤汁、咖喱·炖菜料中的菜等的调味品，加工油脂、黄油、人造黄油、沙拉酱等油脂类，乳饮料、酸牛奶类、乳酸菌饮料、冰激凌类、奶油类等乳制品，冷冻食品、鱼肉火腿·火腿肠、水产搅肉等水产加工品，家畜肉火腿·火腿肠等畜产加工品，农产品罐头、果酱·橙子酱类、腌渍品、煮豆、谷类食品等农产加工品，营养食品、片剂、胶囊等。
可以对本发明的用于抑制血栓形成的组合物或含有该组合物的饮料食品强化各种营养成分。
可强化的营养成分没有特别限定，可以使用维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E、烟酸(尼克酸)、泛酸、叶酸等维生素类，赖氨酸、苏氨酸、色氨酸等必需氨基酸类，钙、镁、铁、锌、铜等矿物质类，以及例如α-亚油酸、EPA、DHA、月见草油、二十八碳醇、酪蛋白磷酸肽(CPP)、酪蛋白钙肽(CCP)、水溶性食物纤维、不溶性食物纤维、低聚糖等对人体健康有益的物质类，其它认可为食品、食品添加物的有用物质的一种或两种或以上。
本发明的一个方案，提供含有本发明的用于抑制血栓形成的组合物而成的准药和药物。用于抑制血栓形成的组合物是指上述任何的本发明的组合物。
本发明的准药和药物可以将适合口服或非口服给药的赋型剂、其它添加剂和本发明的用于抑制血栓形成的组合物混合，按照常规方法制备例如口服制剂或注射剂。优选的口服制剂例如是口服固体制剂或口服液体制剂，最优选的是容易服用且保存、便于携带的口服固体制剂。该准药和药物中的本发明的用于抑制血栓形成的组合物的含量通常优选0.1-300重量％，更优选1-100重量％。
口服固体制剂有片剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、缓释剂等。所述固体制剂中可以混合适当的可药用的载体、赋型剂(例如淀粉、乳糖、白糖、碳酸钙、磷酸钙等)、粘合剂(例如淀粉、阿拉伯树胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、结晶纤维素、藻酸、明胶、聚乙烯吡硌烷酮等)、润滑剂(例如硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙等)、崩解剂(例如羧甲基纤维素、滑石粉等)等与本发明的用于抑制血栓形成的组合物混合，按照常规方法制成片剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、缓释剂等形式。
口服液体制剂包含制药学可用的乳浊剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、酏剂等，也包含常规使用的惰性稀释剂例如纯净水、乙醇。所述制剂除惰性稀释剂之外，也可以含有湿润剂、混悬剂等助剂、甜味剂、风味剂、芳香剂、防腐剂。
非口服给药用的注射剂包含无菌的水性或非水性溶液剂、混悬剂、乳浊剂。水性的溶液剂、混悬剂的稀释剂例如包含注射用蒸馏水和生理盐水。非水性的溶液剂、混悬剂的稀释剂例如有丙二醇、聚乙二醇、橄榄油等植物油、乙醇等醇类、聚山梨酯80等。注射剂还可以含有防腐剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、稳定剂(例如乳糖)、助溶剂(例如谷氨酸、天冬氨酸)等助剂。它们例如过细菌捕获过滤器进行过滤、混合灭菌剂或通过照射进行无菌化处理。它们还可以制成无菌的固体组合物，在使用前溶解于无菌水或无菌的注射用溶剂中使用。
本发明的又一方案提供含有本发明的用于抑制血栓形成的组合物而成的饲料。用于抑制血栓形成的组合物是指上述任何的本发明的组合物。
本发明的饲料除混合本发明的用于抑制血栓形成的组合物作为原料的一部分之外，其余均按公知的饲料的配比组成和制造方法来制造。该饲料中，本发明的用于抑制血栓形成的组合物的含量通常优选0.01-15重量％，更优选0.05-10重量％。
可采用该饲料的生物没有特别限定，例如有养殖动物、宠物动物等，养殖动物有马、牛、猪、绵羊、山羊、骆驼、驼羊等家畜，小鼠、大鼠、豚鼠、兔等实验动物，鸡、鸭、火鸡、驼鸟等家禽，宠物动物有狗、猫等。
本发明使用植株、其果实、叶或种子作为有效成分，它们可直接使用，除此之外，可以以干燥物、破碎物、粉碎物等按照公知的方法实施物理处理得到的各种形态使用。因此，本发明中，上述实施了物理处理的形态也作为植株、其果实、叶、种子处理。另外，若以实施了物理处理的植株、其果实、叶或种子单独或者2种或以上与例如糊精、环糊精、クラスタ一糊精、难消化性糊精、苍耳烷、瓜耳胶、瓜耳胶分解物、藻酸等多糖类，大豆蛋白等植物性蛋白质和大豆肽等植物性蛋白质的分解物，卵黄、卵清、全卵等动物性蛋白质以及卵黄、卵清、全卵肽等动物性蛋白质的分解物，乳糖等赋型剂，淀粉、纤维素、阿拉伯树胶、葡萄糖等粘合剂，明胶、琼脂、纤维素等崩解剂，硬脂酸镁、蔗糖酯类、甘油脂肪酸酯类等润滑剂混合并制成固体所得的物质也包含在本发明的组合物、饮料品、准药、药物、饲料等中。
作为上述的本发明的组合物的应用例的饮料食品等含有本发明的用于抑制血栓形成的组合物，因此通过本发明的各组合物所发挥的作用效果，可发挥抑制血栓形成的效果。
实施例以下通过实施例详细说明本发明，以下的实施例并不限定本发明的范围。按照作为有效成分使用的植物成分的来源植物给出实施例。
实施例A-1抗血栓组合物的制备1将印度醋栗干燥果实粉碎成40目或以下，向80g该粉末中加入2L蒸馏水，在55℃提取3小时。然后离心，过滤其上清，将提取物和残余物分离。向残余物中加入2L蒸馏水，再在相同条件下重复提取一次，将各提取液合并，得到本发明的抗血栓组合物A。
所得提取液的固体成分为70.8g，收率为88.5％。
试验例A-1抗血栓效果的确认利用从人血液中分离的贫血小板血浆(PPP)，用血凝分析仪(シスメツクス公司制造)测定本发明的抗血栓组合物的抗凝血活性。
向反应管中加入10μl试样、25μl APTT试剂(国际试药公司制造)、25μl 10％脑磷脂，在37℃反应3分钟，然后加入50μl PPP，反应2分钟。最后，加入50μl 25mmol的氯化钙，使其凝固，测定血浆凝固所需的时间(秒)，以此作为APTT。
此时，向对照中加入水，用同样的方法测定APTT。通过以下算式，由测定的试样的APTT计算相相对于对照的抗凝血活性(％)。
抗凝血活性(％)＝((试样的APTT-对照的APTT)/对照的APTT)×100为确认本发明的抗血栓组合物A的浓度与抗凝血活性的关系，使用0(对照)、1、3、5mg/mL的本发明的抗血栓组合物，作为固体成分浓度，测定其活性。结果如下表1所示。


上表1的结果表明本发明的抗血栓组合物显示高的抗凝血活性。还显示通过增加提取物的浓度，抗凝血活性也成比例增加。
实施例A-2抗血栓组合物的制备2将印度醋栗干燥果实粉碎成40目或以下，向80g该粉末中加入2L蒸馏水，在55℃提取3小时。然后离心，过滤其上清，将提取物和残余物分离。向残余物中加入2L蒸馏水，再在相同条件下重复提取一次，将各提取液合并，减压浓缩，制成200mL。向该浓缩液中加入乙醇，制成1L(乙醇终浓度为80％)，然后在室温下静置24小时，使不溶性成分沉淀。通过离心分离沉淀物，减压干燥后再溶解于1L水，过滤除去不溶性成分，然后将滤液冷冻干燥，得到30.8g本发明的抗血栓组合物B(收率38.5％)。
试验例A-2抗血栓效果的确认对于实施例A-2中得到的抗血栓组合物B，以5mg/mL的浓度，与试验例A-1同样地测定APTT。结果表明APTT为85.1秒，抗凝血活性为89.1％，与只用水提取的抗血栓组合物A相比，显示高的抗凝血活性。
实施例A-2中，对于乙醇可溶性成分同样测定APTT，结果，APTT为48.0秒，抗凝血活性为6.7％，可知抗血栓活性组分含在乙醇沉淀的组分中。
实施例A’-1抑制血纤维蛋白形成的组合物的制备1将印度醋栗干燥果实粉碎成40目或以下，向80g该粉末中加入2L蒸馏水，在55℃提取3小时。然后离心分离(3000rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。向残余物中加入2L蒸馏水，再在相同条件下重复提取一次，将各提取液合并，然后冷冻干燥，得到35.0g本发明的抑制血纤维蛋白形成的组合物A。收率为43.8％。
试验例A’-1抑制血纤维蛋白形成的效果的确认1关于本发明的抑制血纤维蛋白形成的组合物的抑制血纤维蛋白形成的效果，利用血纤维蛋白原试剂和凝血酶试剂，研究血纤维蛋白形成的比例。
在试管中，向3ml 0.7％血纤维蛋白原试剂中加入300μl下述物质用生理盐液将实施例A’-1得到的抑制血纤维蛋白形成的组合物A稀释至一定浓度而得到的物质。在37℃均化3分钟，然后添加300μl凝血酶试剂(10U/mL)，血纤维蛋白形成凝固，测定其凝固重量(g)，通过以下计算式求出血纤维蛋白形成抑制率。
血纤维蛋白形成抑制率(％)＝((全体溶液重量-凝固重量)/全体溶液重量)×100此时，向对照中加入生理盐水，代替抑制血纤维蛋白形成的组合物，用相同的方法测定血纤维蛋白形成抑制率。
为了确认本发明的抑制血纤维蛋白形成的组合物的浓度与血纤维蛋白形成抑制率的关系，使用0(对照)、10、25、40mg/mL的本发明的抑制血纤维蛋白形成的组合物作为固体成分浓度，测定其抑制率。结果如下表2所示。


上表2的结果表明本发明的抑制血纤维蛋白形成的组合物对于血栓形成的最终过程中血纤维蛋白的形成显示了高的抑制效果。还表明通过增加提取物的浓度，血纤维蛋白形成抑制率也成比例增加。
实施例A’-2抑制血纤维蛋白形成的组合物的制备2将印度醋栗干燥果实粉碎成40目或以下，向100g该粉末中加入2L蒸馏水，再加入0.1g果胶酶和0.1g鞣酸酶，在55℃提取2小时。然后在90℃使酶失活30分钟。然后离心分离(3000rpm、10分钟)，过滤其上清，滤液进行喷雾干燥，得到45g本发明的抑制血纤维蛋白形成的组合物B。
实施例A’-3抑制血纤维蛋白形成的组合物的制备3将印度醋栗果实粉碎成40目或以下，向80g该粉末中加入2L蒸馏水，在55℃提取3小时。然后离心分离(3000rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。向残余物中加入2L蒸馏水，再在相同条件下重复提取一次，将各提取液合并，减压浓缩，制成200mL。向该浓缩液中加入乙醇，制成250mL(乙醇终浓度为20％)，然后在4℃静置24小时，使不溶性成分沉淀。通过离心分离(3000rpm、10分钟)除去上清，将沉淀物冷冻干燥，得到8.5g本发明的抑制血纤维蛋白形成的组合物C。
向乙醇终浓度为20％的上清中加入乙醇，使乙醇的终浓度为40％，进行沉淀，同样地得到4.6g本发明的抑制血纤维蛋白形成的组合物D，再重复同样的操作，使乙醇的终浓度为60％，再制成80％，得到沉淀物，得到1.3g本发明的抑制血纤维蛋白形成的组合物E、2.4g F。
试验例A’-2抑制血纤维蛋白形成的效果的确认2对实施例A’-2得到的抑制血纤维蛋白形成的组合物B和实施例A’-3得到的抑制血纤维蛋白形成的组合物C-F分别用生理盐水稀释，以10mg/mL的试样浓度，与试验例A’-1同样地确认抑制血纤维蛋白形成的效果。。
对于实施例A’-3中60-80％乙醇下的上清成分也同样地制成试样，确认抑制血纤维蛋白形成的效果。其结果如表3所示。


由上述表3的结果可知抑制血纤维蛋白形成的组分中，乙醇沉淀组分中的60-80％乙醇沉淀组分的活性最高。
实施例A”-1抗血小板凝集组合物的制备1将印度醋栗干燥果实粉碎成40目或以下，向80g该粉末中加入2L蒸馏水，在55℃提取3小时。然后离心，过滤其上清，将提取物和残余物分离。向残余物中加入2L蒸馏水，再在相同条件下重复提取一次，将各提取液合并，然后冷冻干燥，得到35g本发明的抗血小板凝集组合物A。
试验例A”-1抗血小板活性的确认本发明的抗血小板凝集组合物的抗血小板活性如下求出。使用血小板凝集测定仪(アイエスケ一公司制造)，向400μl健康人的血小板悬浮液(富血小板血浆)中添加80μl试样，然后加入20μl ADP(1mg/mL溶液)作为引发凝集的物质，测定5分钟后血小板凝集率。
另外，添加水作为对照(试样浓度0mg/mL)，用相同方法测定血小板凝集率。通过以下算式，由测定的血小板凝集率计算相对于对照的抗血小板活性(％)。
抗血小板活性(％)＝((对照的血小板凝集率-添加试样时的血小板凝集率)/对照的血小板凝集率)×100表4表示以试样浓度2.5、5.0、7.5mg/mL测定的结果。


上表4的结果表明本发明的抗血小板凝集组合物显示高的抗血小板活性。还表明通过增加提取物的浓度，抗血小板活性也成比例增加。
实施例A”-2抗血小板凝集组合物的制备2将印度醋栗果实粉碎成40目或以下，向80g该粉末中加入2L蒸馏水，在55℃提取3小时。然后离心，过滤其上清，将提取物和残余物分离。向残余物中加入2L蒸馏水，再在相同条件下重复提取一次，将各提取液合并，减压浓缩，制成200mL。向该浓缩液中加入乙醇，制成250mL(乙醇终浓度为20％)，然后在4℃静置24小时，使不溶性成分沉淀。通过离心分离除去沉淀物，将上清减压干燥，再溶解于1L水，过滤除去不溶性成分，然后将滤液冷冻干燥，得到29g本发明的抗血小板凝集组合物B。
同样，使乙醇的终浓度为40％、60％、80％，分别得到27g、26g、25g本发明的抗血小板凝集组合物C、D、E。
试验例A”-2抗血小板活性的确认对实施例A”-2得到的抗血小板凝集组合物B-E，以5.0mg/mL的试样浓度，与试验例A”-1同样地测定抗血小板活性。
对于实施例A”-2中80％乙醇的沉淀组分也同样地制成试样，测定抗血小板活性。其结果如表5所示。


由上述表5的结果可知抗血小板活性组分包含在乙醇可溶性组分中，通过20％乙醇除去沉淀的组分的活性最高。
实施例A-1抑制血小板凝集的组合物的制备1将印度醋栗果实粉碎成40目或以下，向80g该粉末中加入2L蒸馏水，在55℃提取3小时。然后离心分离(3000rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。向残余物中加入2L蒸馏水，再在相同条件下重复提取一次，将各提取液合并，冷冻干燥，得到35.0g本发明的抑制血小板凝集的组合物A。收率为43.8％。
试验例A-1抗血小板凝集活性的确认1
本发明的抑制血小板凝集的组合物的抗血小板凝集活性如下求出。使用全血血小板凝集测定仪(WBA-Neoアイエスケ一公司制造)，向200μl健康人的血液中添加5μl试样，然后加入22μl终浓度调节为10μM的硫酸瑞斯托菌素(アメリカンバイオケミカル100mg/管)作为引发凝集的物质，测定5分钟后血小板凝集率。
另外，添加水作为对照(试样浓度0mg/mL)，用相同方法测定血小板凝集率。通过以下算式，由测定的血小板凝集率计算相对于对照的抗血小板凝集活性(％)。
抗血小板凝集活性(％)＝((对照的血小板凝集率-添加试样时的血小板凝集率)/对照的血小板凝集率)×100试样是将抑制血小板凝集的组合物A用蒸馏水稀释，制成1.25、2.5、5.0mg/mL，抑制血小板凝集的组合物A的浓度和测定各浓度下的抗血小板凝集活性(％)的结果如表6所示。


上述表6的结果表明血小板凝集中，本发明的抑制血小板凝集的组合物抑制胶原和GpIb之间通过vWF形成交联，显示抗血小板凝集效果。还表明通过增加抑制血小板凝集的组合物的浓度，抗血小板凝集活性也成比例增加。
实施例A-2抑制血小板凝集的组合物的制备2将印度醋栗果实粉碎成40目或以下，向80g该粉末中加入2L蒸馏水，在55℃提取3小时。然后离心分离(3000rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。向残余物中加入2L蒸馏水，再在相同条件下重复提取一次，将各提取液合并，减压浓缩，制成200mL。向该浓缩液中加入乙醇，制成1L(乙醇终浓度为80％)，然后在4℃静置24小时，使不溶性成分沉淀。通过离心分离除去沉淀物，减压浓缩上清，再溶解于1L水，过滤除去不溶性成分，然后将滤液冷冻干燥，得到12.5g本发明的抑制血小板凝集的组合物B(收率15.6％)。
同样地，使乙醇的终浓度为20％、40％、60％，得到本发明的抑制血小板凝集的组合物C 13.6g(收率17.0％)、D 20.8g(收率26.0％)、E 21.2g(收率26.5％)。
实施例A-3抑制血小板凝集的组合物的制备3将印度醋栗果实粉碎成40目或以下，向80g该粉末中加入2L蒸馏水，在55℃提取3小时。然后离心分离(3000rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。向残余物中加入2L蒸馏水，再在相同条件下重复提取一次，将各提取液合并，冷冻干燥，得到约37.0g干燥物。向35g该干燥物中加入1L乙醇，在4℃静置24小时，使不溶性成分沉淀。通过离心分离除去沉淀物，减压浓缩上清，再溶解于1L水，过滤除去不溶性成分，然后将滤液冷冻干燥，得到3.5g本发明的抑制血小板凝集的组合物F。
实施例A-4抑制血小板凝集的组合物的制备3将印度醋栗果实粉碎成40目或以下，向80g该粉末中加入2L蒸馏水，在55℃提取3小时。然后离心，过滤其上清，将提取物和残余物分离。向残余物中加入2L蒸馏水，再在相同条件下重复提取一次，将各提取液合并，减压浓缩，制成200mL。向该浓缩液中加入乙酸乙酯，制成500mL(乙酸乙酯终浓度为60％)，充分搅拌，然后在4℃静置24小时，分离乙酸乙酯层，减压浓缩，再将滤液冷冻干燥，得到12.5g本发明的抑制血小板凝集的组合物G。
实施例A-5抑制血小板凝集的组合物的制备4将印度醋栗干燥果实粉碎成40目或以下，向100g该粉末中加入2L蒸馏水，再加入0.1g果胶酶和0.1g鞣酸酶，在55℃提取2小时。然后在90℃使酶失活30分钟。然后离心分离(3000rpm、10分钟)，过滤其上清，滤液进行喷雾干燥，得到45g本发明的抑制血小板凝集的组合物H。
试验例A-2抗血小板凝集活性的确认2对实施例A-2得到的抑制血小板凝集的组合物B、C、D、E，实施例A-3得到的抑制血小板凝集的组合物F、实施例A-4得到的抑制血小板凝集的组合物G和实施例A-5得到的抑制血小板凝集的组合物H，以5.0mg/mL的浓度、按照与试验例A-1同样的方法测定血小板凝集率，计算抗血小板凝集活性。其结果如表7所示。


如表7所示，任何抑制血小板凝集的组合物都显示高的抗血小板凝集活性。
实施例A-6含抑制血小板凝集的组合物的食品(糖片)的制备将5g实施例A-1得到的抑制血小板凝集的组合物A、30g乳糖、12g含DHA的粉末油脂(サンコ一トDY-5；太阳化学株式会社制造)、4g蔗糖脂肪酸酯、4g酸牛奶香精混合，用旋转式压片机将该混合物加压成型，得到每片为300mg的含本发明的抑制血小板凝集的组合物的饮料食品(糖片)。
实施例A-7含抑制血小板凝集的组合物的饮料的制备将5g实施例A-2得到的抑制血小板凝集的组合物B、2.1g 1/5浓缩葡萄柚透明果汁、30g赤藓醇、2.5g柠檬酸结晶、0.5g柠檬酸三钠、0.5g L-抗坏血酸、1.93g乳酸钙、0.15g CCP、1.0葡萄柚香精与水混合并溶解，使总量为1000mL，将其填充到100mL的瓶中，用盖子密封，然后在90℃加热灭菌30分钟，得到含有本发明的抑制血小板凝集的组合物的饮料食品。
实施例A-8含抑制血小板凝集的组合物的饮料(蔬菜果汁混合饮料)的制备将0.2g实施例A-2得到的抑制血小板凝集的组合物C、3g瓜耳胶分解物(サンフアイバ一R；太阳化学株式会社制造)添加到100mL市场销售的蔬菜果汁混合饮料中并混合溶解，得到含有本发明的抑制血小板凝集的组合物的饮料食品(蔬菜果汁混合饮料)。
实施例A-9含抑制血小板凝集的组合物的小甜饼的制备将4g实施例A-2得到的抑制血小板凝集的组合物D、200g市场销售的蛋糕粉装入容器中，然后加入35g黄油，用木勺子搅拌混合。向其中加入25g打散的鸡蛋，充分搅拌，制成滑溜的生坯料。将生坯料取出放置在筛洒有小麦粉的台子上面，再筛洒小麦粉，用擀面杖擀成5mm厚度，用圆形模子取出面团，将其在170℃的烤箱中烘烤10分钟，得到每个约5g的含本发明的抑制血小板凝集的组合物的小甜饼。
实施例A-10含抑制血小板凝集的组合物的酸牛奶的制备将1g实施例A-5得到的抑制血小板凝集的组合物H、95g市场销售的脱脂乳(明治乳业公司制造。蛋白质含量34％)、以及35g市场销售的无盐黄油(雪印如业公司制造)溶解在0.8L温水中，均化，将总量调节为1L。接着在90℃加热灭菌15分钟，冷却，接种3g市场销售的乳酸菌引子(ハンゼン制造)(2g唾液链球菌嗜热亚种(ストレプトコツカス·サ一モフイラス，Streptococcus thermophilus)和1g保加利亚乳杆菌(ラクトバシラス·ブルガリクス，Lactobacillus bulgaricus)，均匀混合，分注到100mL容器中，填充，密封，在37℃发酵20小时，然后冷却，得到含本发明的抑制血小板凝集的组合物的酸牛奶。
实施例A-11含抑制血小板凝集的组合物的口服流食的制备将50g酪素钠(DMV公司制造)、42.5g卵清酶分解物(太阳化学公司制造)、100g糊精(松谷化学公司制造)溶解于1L水中，在罐内制备水相。另行将45g MCT(花王公司制造)、17.5g棕榈油(不二制油公司制造)、35g红花油(太阳油脂公司制造)、0.7g卵磷脂(太阳化学公司制造)、1g消泡剂(太阳化学公司制造)混合溶解，制成油相。向罐内的水相中添加油相，搅拌混合，然后加温至70℃，再通过均化器、以14.7MPa的压力均化。接着在90℃灭菌10分钟，然后浓缩，喷雾干燥，制成约260g中间制品粉末。向200g该中间制品粉末中添加4g实施例A-2得到的抑制血小板凝集的组合物C、156g糊精(松谷化学公司制造)、18g瓜耳胶分解物(サンフアイバ一R；太阳化学株式会社制造)、少量的维生素和矿物质以及粉末香精，均匀混合，得到约380g含抑制血小板凝集的组合物的口服流食。
实施例A-12含抑制血小板凝集的组合物的片剂的制备将10g实施例A-3得到的抑制血小板凝集的组合物F、5g结晶纤维素、13.8g玉米淀粉、32.5g乳糖、3.3g羟丙基纤维素混合，制成颗粒。向该颗粒物质中加入1.0g硬脂酸镁，均匀混合，将该混合物用旋转式压片机加压成型，得到每片为130mg的含本发明的抑制血小板凝集的组合物的片剂。
将实施例A-6至12中使用的抑制血小板凝集的组合物换成以下的实施例所示的本发明的抗血栓组合物、抑制血纤维蛋白形成的组合物、抗血小板凝集组合物、预防血栓的组合物、用于预防血栓的组合物、预防外源性凝血的组合物、抗血液凝固组合物、预防血小板凝集的组合物、用于预防血小板凝集的组合物、用于抗血栓的组合物、用于抗血小板凝集的组合物、抑制血小板凝集性血栓的组合物、用于抑制血小板凝集性血栓的组合物、抗血栓剂或血栓形成抑制剂，制备同样的组合物。

实施例B-1用于抗血栓的组合物的制备1向1kg绿茶叶中加入15kg热水，在90℃提取30分钟，为除去茶叶渣而进行过滤，向12kg该滤液中加入12kg乙酸乙酯，振荡、静置、分配。取该水组分，减压下(0.067mpa)脱溶剂，然后喷雾干燥，得到110g本发明的用于抗血栓的组合物A。
其中多酚含量为9.2％，咖啡因含量为0.7％。
试验例B-1抗血栓效果的确认利用从人血液中分离的贫血小板血浆(PPP)，用血凝分析仪(シスメツクス公司制造)测定本发明的抗血栓组合物的抗凝血活性。
向反应管中加入10μl试样、25μl APTT试剂(国际试药公司制造)、25μl 10％脑磷脂，在37℃反应3分钟，然后加入50μl PPP，反应2分钟。最后，加入50μl 25mmol的氯化钙，使其凝固，测定血浆凝固所需的时间(秒)，以此作为APTT。
此时，向对照中加入水，用同样的方法测定APTT。通过以下算式，由测定的试样的APTT计算相对于对照的抗凝血活性(％)。
抗凝血活性(％)＝((试样的APTT-对照的APTT)/对照的APTT)×100为确认本发明的用于抗血栓的组合物的浓度与抗凝血活性的关系，使用0(对照)、1、3、5mg/mL本发明的用于抗血栓的组合物作为固体成分的浓度，测定其活性。结果如下表8所示。


上表8的结果表明本发明的用于抗血栓的组合物显示高的抗凝血活性。还表明通过增加提取物的浓度，抗凝血活性也成比例增加。
实施例B-2用于抗血栓的组合物的制备2向100g实施例B-1得到的用于抗血栓的组合物A中加入2L水进行溶解，加入乙醇，制成2.22L(乙醇终浓度为20％)，然后在室温下静置24小时，使不溶性成分沉淀。通过离心分离沉淀物，减压干燥后再溶解于2L水，过滤除去不溶性成分，然后将滤液冷冻干燥，得到25g(收率25％)本发明的用于抗血栓的组合物B。
同样地，使乙醇的终浓度为40％、60％、80％，得到本发明的用于抗血栓的组合物C、D、E。
这里所得用于抗血栓的组合物B-E的多酚含量分别为B1.1％、C1.5％、D1.8％、E2.3％，咖啡因含量分别为B0.1％、C0.3％、D0.4％、E0.5％。
试验例B-2抗血栓效果的确认对于实施例B-2中得到的用于抗血栓的组合物B-E，以5mg/mL的浓度、与试验例B-1同样地测定APTT。结果如表9所示。


上表9的结果可知乙醇浓度为40％时，抗血栓效果最高。
实施例B’-1用于抗血小板凝集的组合物的制备1向1kg绿茶叶中加入15kg热水，在90℃提取30分钟，为除去茶叶渣而进行过滤，向12kg该滤液中加入12kg乙酸乙酯，振荡、静置、分配。取该水组分，减压下(0.067mpa)脱溶剂，然后喷雾干燥，得到110g本发明的用于血小板凝集的组合物A。
其中多酚含量为9.2％，咖啡因含量为0.7％。
试验例B’-1抗血小板活性的确认本发明的用于抗血小板凝集的组合物的抗血小板活性如下求出。使用血小板凝集测定仪(アイエスケ一公司制造)，向400μl健康人的血小板悬浮液(富血小板血浆)中添加80μl试样，然后加入20μl ADP(1mg/mL溶液)作为引发凝集的物质，测定5分钟后血小板凝集率。
另外，添加水作为对照(试样浓度0mg/mL)，用相同方法测定血小板凝集率。通过以下算式，由测定的血小板凝集率计算相对于对照的抗血小板活性(％)。
抗血小板活性(％)＝((对照的血小板凝集率-添加试样时的血小板凝集率)/对照的血小板凝集率)×100表10表示以试样浓度2.5、5.0、7.5mg/mL测定的结果。


上表10的结果表明本发明的抗血小板凝集组合物显示高的抗血小板活性。还表明通过增加提取物的浓度，抗血小板活性也成比例增加。
实施例B’-2用于抗血小板凝集的组合物的制备2向10g实施例B’-1中得到的用于抗血小板凝集的组合物A中加入200mL水进行溶解，加入乙醇，制成1L(乙醇终浓度为80％)，然后在室温下静置24小时，使不溶性成分沉淀。
通过离心分离沉淀物和上清，减压干燥沉淀物，然后再溶解于200mL水中，过滤除去不溶性成分，然后将滤液冷冻干燥，得到2.7g本发明的80％乙醇不溶性组分——用于抗血小板凝集的组合物B。
同样地对上清进行处理，得到7.3g 80％乙醇可溶性组分——用于抗血小板凝集的组合物C。
这里所得用于抗血小板凝集的组合物B和C的多酚含量分别为B3.8％、C9.9％，咖啡因含量分别为B0.5％、C0.8％。
试验例B’-2抗血小板活性的确认对于实施例B’-2中得到的用于抗血小板凝集的组合物B和C，以5.0mg/mL的浓度、与试验例B’-1同样地测定抗血小板活性。结果如表11所示。


上表11的结果可知80％乙醇的沉淀组分的抗血小板活性高。
实施例C-1抗血液凝固组合物的制备1将木槿的干燥的花萼和花瓣粉碎成40目或以下，向150g该粉末中加入3L蒸馏水，在100℃提取3小时。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。减压浓缩滤液，然后冷冻干燥，得到29.8g(收率19.9％)本发明的抗血液凝固组合物A。
实施例C-2抗血液凝固组合物的制备2将木槿的干燥的叶粉碎成20目或以下，向100g该粉末中加入2L蒸馏水，在100℃提取3小时。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。减压浓缩滤液，然后冷冻干燥，得到13.4g(收率13.4％)本发明的抗血液凝固组合物B。
试验例C-1类肝素活性向反应管中加入10μl调节至0.05、0.1、0.2和0.4U/mL的肝素和40μl人血液中分离的贫血小板血浆(PPP)，在37℃反应1分钟。然后加入50μl APTT试剂(国际试药公司制造)，再在37℃反应2分钟，之后，加入50μl 25mM的氯化钙，用血凝分析仪(シスメツクス公司制造)测定血浆凝固所需的时间(APTT；秒)，为评价本发明的抗血液凝固组合物的抗凝血效果，由该肝素的浓度和肝素的APTT的关系求出类肝素活性值(U/mg)的计算式。结果如下表12所示。


由表12的结果可知求出类肝素活性值的关系式如下。
类肝素活性值(U/mg)＝(0.2301×Log(试样的APTT)-0.8053)/试样浓度(mg/mL)试验例C-2抗凝血效果的确认1向反应管中加入10μl固体成分浓度分别调节至0、0.1、0.3、0.5、1.0mg/mL的实施例C-1得到的抗血液凝固组合物A和实施例C-2得到的抗血液凝固组合物B的试样以及40μl PPP，在37℃反应1分钟。然后加入50μl APTT试剂(国际试药公司制造)，再在37℃反应2分钟，之后，加入50μl 25mM的氯化钙，与试验例C-1同样地测定APTT，由试验例C-1中求出的类肝素活性值的关系式求出类肝素活性值。结果如下表13所示。


表13的结果表明本发明的抗血液凝固组合物A和B随着抗血液凝固组合物浓度的增加，APTT也增加，换算成可用作抗血液凝固剂的肝素而得到的类肝素活性值分别显示平均0.22U/mg和0.10U/mg，特别是果实部分显示高的抗凝血效果。
实施例C-3抗血液凝固组合物的制备3将木槿的干燥的花萼和花瓣粉碎成40目或以下，向150g该粉末中加入3L蒸馏水，在100℃提取3小时。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。减压浓缩滤液，制成400mL。该浓缩液中加入乙醇，制成500mL(乙醇终浓度为20％)，然后在室温下静置24小时，使不溶性成分沉淀。通过离心分离(8500rpm、10分钟)沉淀物，减压浓缩上清，然后加入1L蒸馏水再溶解。过滤除去不溶性成分，减压浓缩滤液，然后冷冻干燥，得到12.4g(收率8.3％)本发明的预防血小板凝集的组合物C。向同样得到的浓缩液中加入乙醇，使乙醇终浓度为60％、80％时的不溶性成分沉淀，进行同样的操作，分别得到本发明的预防血小板凝集的组合物D 9.8g(收率6.5％)、E 6.7g(收率4.5％)。
实施例C-3抗凝血效果的确认2
对于实施例C-3中得到的抗血液凝固组合物C、D和E，以0.5mg/mL的浓度、与试验例C-1同样地测定APTT。结果显示APTT分别为55.6秒、63.7秒和65.1秒，类肝素活性值为0.24U/mg、0.30U/mg和0.31U/mg和通过用乙醇分离，显示更高的抗凝血效果。
实施例C-3中，同样地对乙醇终浓度为20％下的沉淀成分测定APTT，结果APTT为38.1秒，类肝素活性值为0.06U/mg，可知抗血液凝固组分包含在乙醇可溶性组分中。
实施例C’-1预防血小板凝集的组合物的制备1将木槿的干燥的花萼和花瓣粉碎成40目或以下，向150g该粉末中加入3L蒸馏水，在100℃提取3小时。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。减压浓缩滤液，然后冷冻干燥，得到29.8g本发明的预防血小板凝集的组合物A(收率19.9％)。
实施例C’-2预防血小板凝集的组合物的制备2将木槿的干燥的叶粉碎成20目或以下，向100g该粉末中加入2L蒸馏水，在100℃提取3小时。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。减压浓缩滤液，然后冷冻干燥，得到13.4g本发明的预防血小板凝集的组合物B(收率13.4％)。
试验例C’-1抗血小板凝集活性的确认1本发明的抗血小板凝集组合物的抗血小板凝集活性如下求出。使用全血血小板凝集测定仪(WBA-Neoアイエスケ一公司制造)，向200μl健康人的血液中添加5μl试样，然后加入22μl终浓度调节为10μM的ADP(シグマ公司制造100mg/管)作为引发凝集的物质，测定5分钟后血小板凝集率。
另外，添加水作为对照(试样浓度0mg/mL)，用相同方法测定血小板凝集率。通过以下算式，由测定的血小板凝集率计算相对于对照的抗血小板凝集活性(％)。
抗血小板凝集活性(％)＝((对照的血小板凝集率-添加试样时的血小板凝集率)/对照的血小板凝集率)×100试样是将预防血小板凝集的组合物用蒸馏水稀释，制成1.25、2.5、5.0mg/mL进行测定，结果如表14所示。


上表14的结果表明在血小板凝集中，本发明的抗血小板凝集组合物抑制通过与ADP相关的通过GpIIb-IIIa、经由血纤维蛋白原与其它血小板结合的阶段，以此显示抗血小板凝集效果。还表明增加抗血小板凝集组合物的浓度，抗血小板凝集活性也成比例增加。
实施例C’-3预防血小板凝集的组合物的制备3将木槿的干燥的花萼和花瓣粉碎成40目或以下，向150g该粉末中加入3L蒸馏水，在100℃提取3小时。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。减压浓缩滤液，制成400mL。该浓缩液中加入乙醇，制成500mL(乙醇终浓度为20％)，然后在室温下静置24小时，使不溶性成分沉淀。通过离心分离(8500rpm、10分钟)沉淀物，减压浓缩上清，然后加入1L蒸馏水再溶解。过滤除去不溶性成分，减压浓缩滤液，然后冷冻干燥，得到12.4g本发明的预防血小板凝集的组合物C(收率8.3％)。向同样得到的浓缩液中加入乙醇，使乙醇终浓度为60％、80％时的不溶性成分沉淀，进行同样的操作，分别得到本发明的预防血小板凝集的组合物D 9.8g(收率6.5％)、E 6.7g(收率4.5％)。
试验例C’-2抗血小板凝集活性的确认2
对于实施例C’-3中得到的预防血小板凝集的组合物C、D和E，以5.0mg/mL的浓度、按照与试验例C’-1同样的方法血小板凝集率，计算抗血小板凝集活性。结果显示抗血小板凝集活性(％)分别为79.2、81.4和83.6，以及通过用乙醇分离，显示更高的抗血小板凝集效果。
实施例C’-3中，同样地对乙醇终浓度为20％下的沉淀成分测定血小板凝集率，计算抗血小板凝集活性，结果抗血小板凝集活性(％)为11.9秒，可知抗血小板凝集包含在乙醇可溶性组分中。
实施例C”-1用于预防血小板凝集的组合物的制备1将木槿的干燥的花萼和花瓣粉碎成40目或以下，向150g该粉末中加入3L蒸馏水，在100℃提取3小时。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。减压浓缩滤液，然后冷冻干燥，得到29.8g本发明的用于预防血小板凝集的组合物A(收率19.9％)。
实施例C”-2用于预防血小板凝集的组合物的制备2将木槿的干燥的叶粉碎成20目或以下，向100g该粉末中加入2L蒸馏水，在100℃提取3小时。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。减压浓缩滤液，然后冷冻干燥，得到13.4g本发明的用于预防血小板凝集的组合物B(收率13.4％)。
试验例C”-1抗血小板凝集活性的确认1本发明的抗血小板凝集组合物的抗血小板凝集活性如下求出。使用全血血小板凝集测定仪(WBA-Neoアイエスケ一公司制造)，向200μl健康人的血液中添加5μl试样，然后加入22μl终浓度调节为10μM的硫酸瑞斯托菌素(アメリカンバイオケミカル公司制造100mg/管)作为引发凝集的物质，测定5分钟后血小板凝集率。
另外，添加水作为对照(试样浓度0mg/mL)，用相同方法测定血小板凝集率。通过以下算式，由测定的血小板凝集率计算相对于对照的抗血小板凝集活性(％)。
抗血小板凝集活性(％)＝((对照的血小板凝集率-添加试样时的血小板凝集率)/对照的血小板凝集率)×100试样是将用于预防血小板凝集的组合物用蒸馏水稀释，制成1.25、2.5、5.0mg/mL进行测定，结果如表15所示。


上表15的结果表明在血小板凝集中，本发明的抗血小板凝集组合物抑制在胶原与GpIb之间通过vWF形成交联，由此显示抗血小板凝集效果。还表明增加抗血小板凝集组合物的浓度，抗血小板凝集活性也成比例增加。
实施例C”-3用于预防血小板凝集的组合物的制备3将木槿的干燥的花萼和花瓣粉碎成40目或以下，向150g该粉末中加入3L蒸馏水，在100℃提取3小时。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。减压浓缩滤液，制成400mL。该浓缩液中加入乙醇，制成500mL(乙醇终浓度为20％)，然后在室温下静置24小时，使不溶性成分沉淀。通过离心分离(8500rpm、10分钟)沉淀物，减压浓缩上清，然后加入1L蒸馏水再溶解。过滤除去不溶性成分，减压浓缩滤液，然后冷冻干燥，得到12.4g本发明的预防血小板凝集的组合物C(收率8.3％)。向同样得到的浓缩液中加入乙醇，使乙醇终浓度为60％、80％时的不溶性成分沉淀，进行同样的操作，分别得到本发明的预防血小板凝集的组合物D 9.8g(收率6.5％)、E 6.7g(收率4.5％)。
试验例C”-2抗血小板凝集活性的确认2对于实施例C”-3中得到的用于预防血小板凝集的组合物C、D和E，以5.0mg/mL的浓度、按照与试验例C”-1同样的方法，测定血小板凝集率，计算抗血小板凝集活性。结果显示抗血小板凝集活性(％)分别为91.2、93.4和94.6，以及通过用乙醇分离，显示更高的抗血小板凝集效果。
实施例C”-3中，同样地对乙醇终浓度为20％下的沉淀成分测定血小板凝集率，计算抗血小板凝集活性，结果抗血小板凝集活性(％)为13.7，可知抗血小板凝集包含在乙醇可溶性组分中。
实施例D-1抑制血小板凝集性血栓的组合物的制备1将苍耳的干燥的花萼和花瓣粉碎成40目或以下，向150g该粉末中加入3L蒸馏水，在100℃提取3小时。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。减压浓缩滤液，然后冷冻干燥，得到26.4g本发明的抑制血小板凝集性血栓的组合物A(收率17.6％)。
实施例D-2抑制血小板凝集性血栓的组合物的制备2将木槿的干燥的种子粉碎成20目或以下，向100g该粉末中加入2L蒸馏水，在100℃提取3小时。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。减压浓缩滤液，然后冷冻干燥，得到14.1g本发明的抑制血小板凝集性血栓的组合物B(收率14.1％)。
试验例D-1抗血小板凝集活性的确认1本发明的抗血小板凝集组合物的抗血小板凝集活性如下求出。使用全血血小板凝集测定仪(WBA-Neoアイエスケ一公司制造)，向200μl健康人的血液中添加5μl试样，然后加入22μl终浓度调节为10μM的ADP(シグマ公司制造100mg/管)作为引发凝集的物质，测定5分钟后血小板凝集率。
另外，添加水作为对照(试样浓度0mg/mL)，用相同方法测定血小板凝集率。通过以下算式，由测定的血小板凝集率计算相对于对照的抗血小板凝集活性(％)。
抗血小板凝集活性(％)＝((对照的血小板凝集率-添加试样时的血小板凝集率)/对照的血小板凝集率)×100试样是将抑制血小板凝集性血栓的组合物用蒸馏水稀释，制成1.25、2.5、5.0mg/mL进行测定，结果如表16所示。


上表16的结果表明在血小板凝集中，本发明的抑制血小板凝集性血栓的组合物抑制通过与ADP相关的GpIIb-IIIa、经由血纤维蛋白原与其它血小板结合的阶段，以此显示抗血小板凝集效果。还表明增加抑制血小板凝集性血栓的组合物的浓度，抗血小板凝集活性也成比例增加。
实施例D-3抑制血小板凝集性血栓的组合物的制备3将苍耳的干燥的花萼和花瓣粉碎成40目或以下，向150g该粉末中加入3L蒸馏水，在100℃提取3小时。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。减压浓缩滤液，制成400mL。该浓缩液中加入乙醇，制成500mL(乙醇终浓度为20％)，然后在室温下静置24小时，使不溶性成分沉淀。通过离心分离(8500rpm、10分钟)沉淀物，减压浓缩上清，然后加入1L蒸馏水再溶解。过滤除去不溶性成分，减压浓缩滤液，然后冷冻干燥，得到11.4g本发明的抑制血小板凝集性血栓的组合物C(收率7.6％)。向同样得到的浓缩液中加入乙醇，使乙醇终浓度为60％、80％时的不溶性成分沉淀，进行同样的操作，分别得到本发明的预防血小板凝集的组合物D 8.7g(收率5.8％)、E 5.9g(收率3.9％)。
试验例D-2抗血小板凝集活性的确认2对于实施例D-3中得到的抑制血小板凝集性血栓的组合物C、D和E，以5.0mg/mL的浓度、按照与试验例D-1同样的方法血小板凝集率，计算抗血小板凝集活性。结果显示抗血小板凝集活性分别为72.2(％)、74.6(％)和76.4(％)，以及通过用乙醇分离，显示更高的抗血小板凝集效果。
实施例D-3中，同样地对乙醇终浓度为20％下的沉淀成分测定血小板凝集率，计算抗血小板凝集活性，结果，抗血小板凝集活性为10.4(％)，可知抗血小板凝集组分包含在乙醇可溶性组分中。
实施例D’-1用于抑制血小板凝集性血栓的组合物的制备1将苍耳的干燥的花萼和花瓣粉碎成40目或以下，向150g该粉末中加入3L蒸馏水，在100℃提取3小时。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。减压浓缩滤液，然后冷冻干燥，得到26.4g(收率17.6％)本发明的用于抑制血小板凝集性血栓的组合物A。
实施例D’-2用于抑制血小板凝集性血栓的组合物的制备2将苍耳的干燥的种子粉碎成20目或以下，向100g该粉末中加入2L蒸馏水，在100℃提取3小时。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。减压浓缩滤液，然后冷冻干燥，得到14.1g本发明的用于抑制血小板凝集性血栓的组合物B(收率14.1％)。
试验例D’-1抗血小板凝集活性的确认1本发明的用于抑制血小板凝集性血栓的组合物的抗血小板凝集活性如下求出。使用全血血小板凝集测定仪(WBA-Neoアイエスケ一公司制造)，向200μl健康人的血液中添加5μl试样，然后加入22μl终浓度调节为10μM的硫酸瑞斯托菌素(アメリカンバイオケミカル公司制造100mg/管)作为引发凝集的物质，测定5分钟后血小板凝集率。
另外，添加水作为对照(试样浓度0mg/mL)，用相同方法测定血小板凝集率。通过以下算式，由测定的血小板凝集率计算相对于对照的抗血小板凝集活性(％)。
抗血小板凝集活性(％)＝((对照的血小板凝集率-添加试样时的血小板凝集率)/对照的血小板凝集率)×100试样是将用于抑制血小板凝集性血栓的组合物用蒸馏水稀释，制成1.25、2.5、5.0mg/mL进行测定，结果如表17所示。


上表17的结果表明在血小板凝集中，本发明的用于抑制血小板凝集性血栓的组合物抑制在胶原与GpIb之间通过vWF形成交联，由此显示抗血小板凝集效果。还表明增加用于抑制血小板凝集性血栓的组合物的浓度，抗血小板凝集活性也成比例增加。
实施例D’-3用于抑制血小板凝集性血栓的组合物的制备3将苍耳的干燥的花萼和花瓣粉碎成40目或以下，向150g该粉末中加入3L蒸馏水，在100℃提取3小时。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。减压浓缩滤液，制成400mL。该浓缩液中加入乙醇，制成500mL(乙醇终浓度为20％)，然后在室温下静置24小时，使不溶性成分沉淀。通过离心分离(8500rpm、10分钟)沉淀物，减压浓缩上清，然后加入1L蒸馏水再溶解。过滤除去不溶性成分，减压浓缩滤液，然后冷冻干燥，得到11.4g本发明的抑制血小板凝集性血栓的组合物C(收率7.6％)。向同样得到的浓缩液中加入乙醇，使乙醇终浓度为60％、80％时的不溶性成分沉淀，进行同样的操作，分别得到本发明的预防血小板凝集的组合物D 8.7g(收率5.8％)、E 5.9g(收率3.9％)。
试验例D’-2抗血小板凝集活性的确认2对于实施例D’-3中得到的用于抑制血小板凝集性血栓的组合物C、D和E，以5.0mg/mL的浓度、按照与试验例D’-1同样的方法，测定抗血小板凝集活性。结果显示抗血小板凝集活性(％)分别为90.5、91.3和93.4，以及通过用乙醇分离，显示更高的抗血小板凝集效果。
实施例D’-3中，同样地对乙醇终浓度为20％下的沉淀成分测定血小板凝集率，计算抗血小板凝集活性，结果抗血小板凝集活性(％)为9.8，可知抗血小板凝集包含在乙醇可溶性组分中。
实施例E-1血栓形成抑制剂的制备1将匙羹藤干燥粉末粉碎成40目或以下，向80g该粉末中加入2L蒸馏水，在55℃提取3小时。然后过滤，将提取物和残余物分离。再向残余物中加入2L蒸馏水，再在相同条件下重复提取一次，将各提取液合并，冷冻干燥，得到28g本发明的血栓形成抑制剂A。
试验例E-1抑制血栓形成的效果的确认本发明的血栓形成抑制剂的抗血小板活性如下求出。使用血小板凝集测定仪(アイエスケ一公司制造)，向400μl健康人的血小板悬浮液(富血小板血浆)中添加80μl试样，然后加入20μl ADP(1mg/mL溶液)作为引发凝集的物质，测定5分钟后血小板凝集率。
另外，添加水作为对照(试样浓度0mg/mL)，用相同方法测定血小板凝集率。通过以下算式，由测定的血小板凝集率计算相对于对照的抗血小板活性(％)。
抗血小板活性(％)＝((对照的血小板凝集率-添加试样时的血小板凝集率)/对照的血小板凝集率)×100表18表示以试样浓度2.5、5.0、7.5mg/mL测定的结果。


上表18的结果表明本发明的血栓形成抑制剂显示高的抗血小板活性。还表明增加提取物的浓度，抗血小板活性也成比例增加。
实施例E-2血栓形成抑制剂的制备2将匙羹藤干燥粉末粉碎成40目或以下，向80g该粉末中加入2L蒸馏水，在55℃提取3小时。然后过滤，将提取物和残余物分离。再向残余物中加入2L蒸馏水，再在相同条件下重复提取一次，将各提取液合并，减压浓缩，制成200mL。向该浓缩液中加入乙醇，制成1L(乙醇终浓度为80％)，然后在4℃静置24小时，使不溶性成分沉淀。
通过离心分离沉淀物和上清，减压干燥沉淀物，再溶解于2L水，过滤除去不溶性成分，然后将滤液冷冻干燥，得到7g本发明的80％乙醇不溶性组分——血栓形成抑制剂B。
同样地处理上清，得到21g 80％乙醇可溶性组分——血栓形成抑制剂C。
试验例E-2抑制血栓形成的效果的确认对于实施例E-2中得到的血栓形成抑制剂B和C，以5.0mg/mL的试样浓度，与试验例E-1同样地测定抗血小板活性。结果如表19所示。


上表19的结果可知80％乙醇可溶性组分的抗血小板活性高。
实施例F-1预防外源性凝血的组合物的制备1将干燥羊栖菜粉碎成40目或以下，向100g该粉末中加入3L蒸馏水，在100℃提取3小时。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。减压浓缩滤液，然后冷冻干燥，得到23.8g本发明的预防外源性凝血的组合物A(收率23.8％)。
试验例F-1抗外源性凝血活性的确认1本发明的预防外源性凝血的组合物的抗外源性凝血活性如下求出。使用血凝分析仪(シスメツクス公司制造)，向40μl健康人的血小板悬浮液(富血小板血浆)中添加10μl将标准肝素用蒸馏水稀释调节至0、0.05、0.1、0.2和0.3U/mL的肝素试剂的试样，在37℃反应1分钟。然后加入100μl PT试剂(国际试药公司制造)，测定血浆凝固所需的时间，测定PT。由该肝素试剂的浓度和与PT的关系求出下述类肝素活性值(U/mg)的计算式。
类肝素活性值(U/mg)＝(2.0438×Log(试样的PT)-4.8867)/试样浓度(mg/mL)用蒸馏水稀释调节试样，使本发明的预防外源性凝血的组合物A的浓度按照固体成分浓度表示为0.078、0.156、0.313、0.625、1.25mg/mL，用相同方法测定PT，带入上述计算式，求出各试样浓度相对于肝素(1U/mL)的类肝素活性值。
以0mg/mL肝素试剂浓度为对照，通过下式计算各试样浓度下的PT比。
PT比＝添加试样时的PT/对照(肝素试剂浓度0mg/mL)的PT这些结果如表20和表21所示。



表21的结果表明，本发明的预防外源性凝血的组合物A换算成可用作抗血液凝固剂的肝素得到的类肝素活性值平均为1.77U/mg，较高，另外随着预防外源性凝血的组合物浓度的增加，PT和抗外源性凝血活性也成比例增加。
实施例F-2预防外源性凝血的组合物的制备2将干燥羊栖菜粉碎成40目或以下，向200g该粉末中加入6L蒸馏水，在100℃提取3小时。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。向残余物中加入6L蒸馏水，再在相同条件下重复提取一次，将各提取液合并，减压浓缩，制成400mL。向该浓缩液中加入乙醇，制成500mL(乙醇终浓度为20％)，然后在室温下静置24小时，使不溶性成分沉淀。通过离心分离(8500rpm、10分钟)沉淀物，向该沉淀物中加入1L蒸馏水，再溶解，过滤除去不溶性成分。减压浓缩该滤液，冷冻干燥，得到32.8g本发明的预防外源性凝血的组合物B(收率16.4％)。向同样得到的浓缩液中加入乙醇，使乙醇终浓度为60％、80％时的不溶性成分沉淀，进行同样的操作，分别得到本发明的预防外源性凝血的组合物C 28.4g(收率14.2％)和D 21.2g(收率10.6％)。还向乙醇终浓度为60％的上清中加入乙醇，使乙醇的终浓度为80％，产生沉淀，进行同样的操作，得到2.8g本发明的预防外源性凝血的组合物E(收率1.4％)。
实施例F-3预防外源性凝血的组合物的制备3将干燥羊栖菜粉碎成40目或以下，向100g该粉末中加入3L 50％的乙醇水溶液，在室温下放置3天，提取。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。减压浓缩滤液，然后冷冻干燥，得到21.1g本发明的预防外源性凝血的组合物F(收率21.1％)。
试验例F-2抗外源性凝血活性的确认2对于试验例F-1得到的预防外源性凝血的组合物A、实施例F-2得到的预防外源性凝血的组合物B、C、D、E和实施例F-3得到的预防外源性凝血的组合物F，以固体成分浓度0.2mg/mL的浓度测定PT。带入实施例F-1的类肝素活性值(U/mg)的计算式，求出各预防外源性凝血的组合物的类肝素活性值和PT比。对于实施例F-2中80％乙醇的上清组分也同样，调节试样，求出类肝素活性值和PT比。结果如表22所示。


表22表明实施例F-2中得到的乙醇沉淀成分显示高的类肝素活性，可知优异的抗外源性凝固效果包含在乙醇沉淀部分中。
实施例F’-1预防血栓的组合物的制备1将干燥羊栖菜粉碎成40目或以下，向100g该粉末中加入3L蒸馏水，在100℃提取3小时。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。减压浓缩滤液，然后冷冻干燥，得到23.8g本发明的预防血栓的组合物A。收率为23.8％。
试验例F’-1预防血栓的效果的确认利用从人血液中分离的贫血小板血浆(PPP)，用血凝分析仪测定APTT，评价本发明的预防血栓的组合物A的预防血栓的效果。
向反应管中加入10μl将本发明的预防血栓的组合物A的浓度调节至以固体成分浓度计为0.075、0.15、0.3和0.5mg/mL的试样和40μlPPP，在37℃反应1分钟。然后加入50μl APTT试剂(国际试药公司制造)，再在37℃反应2分钟，之后，加入50μl 25mM的氯化钙，测定血浆凝固所需的时间(秒)，以此作为APTT。结果如下表23所示。
此时，使用调节至0.05、0.1、0.2和0.3U/mL的肝素作为对照试样，用相同方法测定APTT。由该肝素的浓度和肝素与APTT的关系求出类肝素活性值(U/mg)的计算式，带入该计算式，求出各试样浓度下相对于肝素(1U/mL)的类肝素活性值。结果如下表24所示。
类肝素活性值(U/mg)＝(0.1648×Log(试样的APTT))/试样浓度(mg/mL)[表23]


表24的结果表明本发明的预防血栓的组合物A随着预防血栓的组合物浓度的增加，APTT也增加，换算成可用作抗血液凝固剂的肝素得到的类肝素活性值平均为0.36U/mg，显示高的抗凝血效果。
实施例F’-2预防血栓的组合物的制备2将干燥羊栖菜粉碎成40目或以下，向200g该粉末中加入6L蒸馏水，在100℃提取3小时。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。向残余物中加入6L蒸馏水，再在相同条件下重复提取一次，将各提取液合并，减压浓缩，制成400mL。向该浓缩液中加入乙醇，制成500mL(乙醇终浓度为20％)，然后在室温下静置24小时，使不溶性成分沉淀。通过离心分离(8500rpm、10分钟)沉淀物，向该沉淀物中加入1L蒸馏水，再溶解，过滤除去不溶性成分。减压浓缩该滤液，冷冻干燥，得到16.4g本发明的预防血栓的组合物B。向同样得到的浓缩液中加入乙醇，使乙醇终浓度为60％、80％时的不溶性成分沉淀，进行同样的操作，分别得到本发明的预防血栓的组合物C 21.4g和D 25.2g。还向乙醇终浓度为60％的上清中加入乙醇，使乙醇的终浓度为80％，产生沉淀，进行同样的操作，得到2.8g本发明的预防血栓的组合物E。
实施例F’-3预防血栓的组合物的制备3将干燥羊栖菜粉碎成40目或以下，向100g该粉末中加入3L 50％的乙醇水溶液，在室温下放置3天，提取。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。减压浓缩滤液，然后冷冻干燥，得到21.1g本发明的预防血栓的组合物F。收率21.1％。
试验例F’-2预防血栓的效果的确认对于实施例F’-1得到的预防血栓的组合物A、实施例F’-2得到的预防血栓的组合物B、D、E和实施例F’-3得到的预防血栓的组合物F，以固体成分浓度0.2mg/mL的浓度、与试验例F’-1同样地测定APTT。带入试验例F’-1的类肝素活性值(U/mg)的计算式，求出各预防血栓的组合物的类肝素活性值。对于实施例F’-2中80％乙醇提取的上清组分也同样，调节试样，求出类肝素活性值。结果如表25所示。


表25表明实施例F’-2中得到的乙醇沉淀成分显示高的类肝素活性值，可知优异的抗凝血效果包含在水提取物的乙醇沉淀部分中。
实施例F”-1用于预防血栓的组合物的制备1将干燥羊栖菜粉碎成40目或以下，向100g该粉末中加入3L蒸馏水，再加入0.1g蛋白酶，在55℃提取3小时。然后在90℃使酶失活30分钟。离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将滤液喷雾干燥，得到29.4g本发明的用于预防血栓的组合物A。收率为29.4％。
试验例F”-1预防血栓的效果的确认利用从人血液中分离的贫血小板血浆(PPP)，用血凝分析仪(シスメツクス公司制造)测定APTT，评价本发明的用于预防血栓的组合物A的预防血栓的效果。
向反应管中加入10μl将本发明的用于预防血栓的组合物A的浓度调节至以固体成分浓度计为0.075、0.15、0.3和0.5mg/mL的试样和40μl PPP，在37℃反应1分钟。然后加入50μl APTT试剂(国际试药公司制造)，再在37℃反应2分钟，之后，加入50μl 25mM的氯化钙，测定血浆凝固所需的时间(秒)，以此作为APTT。结果如下表26所示。
此时，使用调节至0.05、0.1、0.2和0.3U/mL的肝素作为对照试样，用相同方法测定APTT。由该肝素的浓度和肝素与APTT的关系求出类肝素活性值(U/mg)的计算式，带入该计算式，求出各试样浓度下相对于肝素(1U/mL)的类肝素活性值。结果如下表27所示。
类肝素活性值(U/mg)＝(0.1648×Ln(试样的APTT)-0.5487)/试样浓度(mg/mL)[表26]


表27的结果表明本发明的用于预防血栓的组合物A随着用于预防血栓的组合物浓度的增加，APTT也增加，换算成可用作抗血液凝固剂的肝素得到的类肝素活性值平均为0.52U/mg，显示高的抗凝血效果。
实施例F”-2预防血栓的组合物的制备2将干燥羊栖菜粉碎成40目或以下，向100g该粉末中加入3L蒸馏水，再加入0.1g蛋白酶，在55℃提取3小时。然后在90℃使酶失活30分钟。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，减压浓缩滤液，制成200mL。向该浓缩液中加入乙醇，制成250mL(乙醇终浓度为20％)，然后在室温下静置24小时，使不溶性成分沉淀。通过离心分离(8500rpm、10分钟)沉淀物，向该沉淀物中加入1L蒸馏水，再溶解，过滤除去不溶性成分。减压浓缩该滤液，冷冻干燥，得到24.5g本发明的用于预防血栓的组合物B。向同样得到的浓缩液中加入乙醇，使乙醇终浓度为60％时的不溶性成分沉淀，进行同样的操作，分别得到21.4g本发明的用于预防血栓的组合物C。
比较例F”-1比较组合物的制备将干燥羊栖菜粉碎成40目或以下，向100g该粉末中加入3L蒸馏水，在100℃提取3小时。然后离心分离(8500rpm、10分钟)，过滤其上清，将提取物和残余物分离。减压浓缩滤液，然后冷冻干燥，得到23.8g比较组合物。
试验例F”-2预防血栓的效果的确认对于实施例F”-1得到的用于预防血栓的组合物A、实施例F”-2得到的用于预防血栓的组合物B、C和比较例F”-1得到的比较组合物，以固体成分浓度0.2mg/mL的浓度、与试验例F”-1同样地测定APTT。带入试验例F”-1的类肝素活性值(U/mg)的计算式，求出各用于预防血栓的组合物的类肝素活性值。结果如表28所示。


表28表明对水提取羊栖菜进行酶处理，再进行醇分离处理，显示更高的类肝素活性值。
实施例G-1抗血栓剂的制备1将10g市场销售的ι-角叉菜聚糖(サンカラNo.208；太阳化学株式会社制造)溶解于1L的80℃热水中，然后过滤，减压浓缩，冷冻干燥，得到本发明的抗血栓剂A。
同样地，使用κ-角叉菜聚糖(サンカラNo.1572；太阳化学株式会社制造)、λ-角叉菜聚糖(サンカラNo.1057；太阳化学株式会社制造)，得到本发明的抗血栓剂B、C。
试验例G-1抗血栓效果的确认利用从人血液中分离的贫血小板血浆(PPP)，用血凝分析仪(シスメツクス公司制造)测定本发明的抗血栓剂的抗凝血活性。
向反应管中加入10μl试样、25μl APTT试剂(国际试药公司制造)，25μl 10％脑磷脂，在37℃反应3分钟，然后加入50μl PPP，反应2分钟。最后，加入50μl 25mmol的氯化钙，使其凝固，测定血浆凝固所需的时间(秒)，以此作为APTT。
此时，向对照中加入水，用同样的方法测定APTT。通过以下算式，由测定的试样的APTT计算相对于对照的抗凝血活性(％)。
抗凝血活性(％)＝((试样的APTT-对照的APTT)/对照的APTT)×100为确认本发明的抗血栓剂的浓度与抗凝血活性的关系，使用固体成分浓度为0(对照)、1、3、5mg/mL的本发明的抗血栓剂，测定其活性。结果如下表29所示。


上表29的结果表明本发明的抗血栓剂显示高的抗凝血活性。还表明随着提取物浓度的增加，抗凝血活性也成比例增加。
产业实用性本发明提供含有具血栓形成抑制作用的规定的植物成分的用于抑制血栓形成的组合物。本发明的用于抑制血栓形成的组合物例如可用于饮料食品、准药、药物、饲料。
权利要求
1.抗血栓组合物，其特征在于含有选自印度醋栗的果实、果汁以及它们的提取物的至少一种。
2.抑制血纤维蛋白形成的组合物，其特征在于含有选自印度醋栗的果实、果汁以及它们的提取物的至少一种。
3.抗血小板凝集组合物，其特征在于含有选自印度醋栗的果实、果汁以及它们的提取物的至少一种。
4.抑制血小板凝集的组合物，其特征在于含有选自印度醋栗的果实、果汁以及它们的提取物的至少一种。
5.用于抗血栓的组合物，其特征在于含有茶的提取物。
6.用于抗血小板凝集的组合物，其特征在于含有茶的提取物。
7.抗血液凝固组合物，其特征在于含有选自木槿的果实、果汁、叶以及它们的提取物的至少一种。
8.预防血小板凝集的组合物，其特征在于含有选自木槿的果实、果汁、叶以及它们的提取物的至少一种。
9.用于预防血小板凝集的组合物，其特征在于含有选自木槿的果实、果汁、叶以及它们的提取物的至少一种。
10.抑制血小板凝集性血栓的组合物，其特征在于含有选自苍耳的果实、果汁、种子以及它们的提取物的至少一种。
11.用于抑制血小板凝集性血栓的组合物，其特征在于含有选自苍耳的果实、果汁、种子以及它们的提取物的至少一种。
12.血栓形成抑制剂，其特征在于含有匙羹藤、其提取物或它们的混合物。
13.预防外源性凝血的组合物，其特征在于含有羊栖菜、其提取物或它们的混合物。
14.预防血栓的组合物，其特征在于含有羊栖菜、其提取物或它们的混合物。
15.用于预防血栓的组合物，其特征在于含有羊栖菜、其提取物或它们的混合物的酶处理物。
16.抗血栓剂，其特征在于含有角叉菜聚糖。
全文摘要
本发明提供可用于饮料食品、准药、药物、饲料的，含有来自印度醋栗、茶、木槿、苍耳、匙羹藤、羊栖菜、角叉菜聚糖的规定植物成份而成的用于抑制血栓形成的组合物。
文档编号A61P7/00GK1913909SQ200480041388
公开日2007年2月14日 申请日期2004年11月30日 优先权日2003年12月4日
发明者坂口腾, 杉野豪俊, 大久保勉, 伊藤俊宏, 纪平智彦, 尹先柱, T·P·拉奥, H·赫拉赫拉, L·R·祖尼贾 申请人:太阳化学株式会社