发展用于血栓形成倾向识别的方法(mert)的制作方法

专利名称：发展用于血栓形成倾向识别的方法(mert)的制作方法
技术领域：
本申请涉及预测个体的静脉血栓形成的遗传易感性的方法，以及可用于实施该公开方法的试剂盒。
背景技术：
仅在美国，静脉血栓形成每年侵害每1000个个体中的1人，并且是引起每年大约300,000例住院治疗和50,000例死亡的死亡率和发病率的一个主要原因(Rosendaal，Thromb.Haemost.781-6，1997；Nordstrom等.，J.Inter.Med.232155-60，1992；和Hansson等.，Arch.Intern.Med.1571665-70，1997)。
许多环境使个体预先倾向于静脉血栓形成。所述危险因素的实例包括妊娠、产后期、口服避孕药和/或激素替代治疗的使用、创伤、手术、骨折、延长的固定术、老龄、抗磷脂类抗体、以前的血栓形成史、脊髓增生病、恶性肿瘤和轻度-中度的高半胱氨酸血症(Abramson等.，Southern Med.J.941013-20，2001；以及Seligsohn和Lubetsky，N.Engl.J.Med.3441222-31，2001)。静脉血栓形成常常以深静脉血栓形成(DVT)形式存在于下肢，其常导致通常致死的肺栓塞。尤其不幸的是所述血栓栓塞现象常常发生在于生理学上已受损伤的患者体内。
除了后天的静脉血栓形成的危险因素，许多表面看来单基因的、常染色体显性的、可变外显的遗传突变或多态性引起增加静脉血栓形成的风险。所述突变或多态性的实例为编码促凝血蛋白质(凝血因子V、凝血酶原和纤维蛋白原)、天然的抗凝血剂蛋白质(蛋白质C、蛋白质S和抗凝血酶III)及其他血栓形成相关蛋白质(血管紧张素-I转化酶和亚甲基四氢叶酸还原酶)那些基因。因此，静脉血栓形成为复杂的遗传病症。导致凝血系统过分活跃的遗传缺陷存在于一大部分患有静脉血栓形成的患者中。60％以上的血栓形成倾向可归因于遗传组分(Souto等.，Am.J Hum.Genet.671452-9，2000)。
之前的报道描述了筛选与血栓形成有关的一或多种多态性，例如通过利用PCR(Harrington等.，Clin.Chem.Lab.Med.41496-500，2003)，或微量平板阵列对角线凝胶电泳(Bauer等.，Thromb.Haemost.84396-400，2000)。尽管已建议利用微阵列技术筛选尤其是参与静脉血栓形成的基因中的突变，这些微阵列由于其具有低预测值并且仅检测白种人(Caucasians)群体中普遍的突变而受到限制(例如参见Pecheniuk等.，Blood Coagul.Fibrinolysis 11683-700，2000；Pollak等.，Ital.Heart J.2568-72，2001；Evans和Lee-Tataseo，Clin.Chem.481406-11，2002；Schrijver等.，Am.J.Clira.Pathol.119490-6，2003；Erali等.，Clin.Chem.49732-9，2003)。其他人已指出微阵列技术用于筛选参与血栓形成的大量遗传突变和多态性之前需要经历进一步的发展(Grody，Annu.Rev.Med.，54473-90，2003)。
因此，目前存在对可准确预测个体发展静脉血栓形成风险的方法的需要，所述方法可用于筛选多种种族的人群。

发明内容
尽管静脉血栓形成为发达国家发病率和死亡率的一个主要原因，但是通过利用现行的抗凝血剂如未分馏的肝素、低分子量肝素、乙酰水杨酸和香豆灵/丙酮苄羟香豆素的预防性治疗是一种可避免的疾病。因此，评估个体血栓形成的风险从而开发分层方案用于个体风险-适应的预防而避免静脉血栓栓塞的发展是很有利的。对于该分层法，评估与止血的单一或组合危险因素有关的个体风险。
本发明人已鉴定了静脉血栓形成-有关分子中突变和多态性的组合，可以在若干种族人群中以高准确度预测个体发展静脉血栓形成的遗传易感性。在一个实例中，与静脉血栓形成统计上相关的分子中回复突变和多态性的组合可以在若干种族人群中以高准确度预测个体发展静脉血栓形成的总的遗传易感性。回复突变和多态性为在一个以上家族中存在，如至少两个遗传上显著差异的家族。例如，仅在一个家族中观察到的突变或多态性不是回复突变或多态性。
例如，利用公开的方法进行的关于至少十种静脉血栓形成相关遗传变异的并行检验所公开的统计分析表明静脉血栓形成的预测在白种人中准确度至少为99％，在亚洲人中至少为85％，在非洲人群中至少为88％。所公开的方法，在此称为发展用于血栓形成倾向识别的方法(MERT)，提供了快速且经济的测定法，可在与静脉血栓形成易感性统计上相关的分子中并行遗传检验，例如抗凝血酶III、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血酶原(凝血因子II)、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和血管紧张素1-转化酶(ACE)。
在一个实例中，所述方法包括确定受试者在静脉血栓形成-相关分子中是否具有一或多处突变、多态性或两者，所述分子包括、基本上由或由来自抗凝血酶III、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR和ACE的序列组成。在一个实例中，在其暴露于引起血栓形成的高风险环境之前或期间时筛选无症状的个体，所述环境如妊娠、产后期、口服避孕药或激素替代治疗的使用、先前的血栓形成史、延长的固定术、脊髓增生病、恶性肿瘤、外科手术、骨折、老龄、抗磷脂类抗体或其组合。
尽管已有用于筛选上至六种血栓形成倾向易感性单核苷酸多态性的现有检验，它们具有有限潜能以及1.7％的最大预测值。所述检验具有仅允许检测只在白种人群体中普遍存在的单核苷酸多态性(SNP)的筛选能力(Erali等.，Clin.Chem.495，2003；Evans等.，Clin.Chem481406-11，2002)。相比之下，本发明公开的方法和阵列例如通过筛选与静脉血栓形成统计上相关的那些基因中的突变和多态性(不仅用于SNP而且用于插入和缺失)而首次提供了高度准确的、总的静脉血栓形成遗传易感性预测。在具体的实例中，筛选与静脉血栓形成统计上相关的所有已知的回复突变和多态性，或所有所述已知的突变和多态性的亚型。在一些实例中，如果具有小于0.005的p值，突变或/和多态性与静脉血栓形成统计上相关。
在具体的实例中，该方法利用基因组DNA微阵列技术检测受试者对静脉血栓形成的总的遗传易感性，并且将微阵列数据与用于适合各种种族人群的VT小组相关易感性基因的组合似然比直接关联。
在一具体的实例中，该方法包括扩增获自受试者的核酸分子以获得扩增产物。扩增产物可包括、基本上由或由来自抗凝血酶III、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血酶原(凝血因子II)、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和血管紧张素I-转化酶(ACE)基因的序列组成。将得到的扩增产物与阵列接触或应用于阵列。阵列包括寡核苷酸探针，其能杂交至包含一或多处突变、一或多种多态性或其组合的抗凝血酶III、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR和ACE序列。具体的突变和多态性的实例在表1中提供。在一些实例中，阵列进一步包括能杂交至野生型抗凝血酶III、野生型蛋白质C、野生型蛋白质S、野生型纤维蛋白原、野生型凝血因子V、野生型凝血因子II、野生型MTHFR和野生型ACE的寡核苷酸。扩增产物与阵列温育足以使扩增产物和寡核苷酸探针之间杂交的时间段，由此形成扩增产物寡核苷酸探针复合物。随后分析扩增产物寡核苷酸探针复合物以确定扩增产物在抗凝血酶III、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR或ACE中是否包括一或多处突变、多态性或两者。
一或多处突变或一或多种多态性的存在表明受试者具有静脉血栓形成的遗传倾向性。在具体的实例中，一处以上突变或多态性的存在表明该受试者比仅具有一处突变或多态性的受试者处于静脉血栓形成的更大风险中。
所公开的方法可准确地评估发展静脉血栓形成的总的遗传风险并且因此例如通过在合适状况下开始合适的预防性治疗而实现避免静脉血栓形成。在此给出的结果表明，当用于检测静脉血栓形成或向其发展的倾向时，用于至少八种与静脉血栓形成相关分子的遗传检验组的并行使用使阳性预测值提高30倍以上。因此，公开了选择静脉血栓形成治疗的方法，其包括利用此处公开的方法检测受试者的至少一种VT-相关分子中的突变、多态性或其组合(如一或多处取代、缺失或插入)并且如果鉴定了所述突变或多态性，选择治疗法以避免静脉血栓形成、延缓静脉血栓形成的发病或将其后果降低到最低程度。
此外公开的为阵列，其能实现对静脉血栓形成遗传易感性，如总的静脉血栓形成遗传易感性的快速、经济的多个遗传检验。所述阵列包括寡核苷酸，其与抗凝血酶III、蛋白质C、蛋白质S、凝血因子V、凝血因子II、纤维蛋白原、MTHFR和ACE的野生型或突变序列或两者互补。还公开了包含用于检测受试者静脉血栓形成遗传倾向性的所述阵列的试剂盒。
所公开内容的上述及其他特征和优点根据下列几个实施方案的详细说明而将变得更加明显。
序列表附随序列表中的核酸序列表利用标准的核苷酸碱基字母缩写显示。仅显示每一核酸序列的一条链，但是可理解参照所显示的任一链也包扩其互补链。
ATIIISEQ ID NO1为可用于探测野生型抗凝血酶III序列2770位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO2为可用于探测抗凝血酶III中2770 insT的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO3为可用于探测野生型抗凝血酶III序列5311-5320位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO4为可用于探测抗凝血酶III 5311-5320 del6bp的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO5为可用于探测野生型抗凝血酶III序列5356-5364位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO6为可用于探测抗凝血酶III中5356-5364，delCTT的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO7为可用于探测野生型抗凝血酶III序列5381C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO8为可用于探测抗凝血酶III中5381C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO9为可用于探测野生型抗凝血酶III序列5390C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO10为可用于探测抗凝血酶III中5390C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO11为可用于探测野生型抗凝血酶III序列5493A位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO12为可用于探测抗凝血酶III中5493A/G替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO13为可用于探测野生型抗凝血酶III序列α(16)ArgCGT6490C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO14为可用于探测抗凝血酶III中6490C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO15为可用于探测野生型抗凝血酶III序列α(16)ArgCGT9788G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO16为可用于探测抗凝血酶III中9788G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO17为可用于探测野生型抗凝血酶III序列α(19)ArgAGG9819C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO18为可用于探测抗凝血酶III中9819C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO19为可用于探测野生型抗凝血酶III序列13342位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO20为可用于探测抗凝血酶III中13342 insA的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO21为可用于探测野生型抗凝血酶III序列13380T位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO22为可用于探测抗凝血酶III中13380T/C替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO23为可用于探测野生型抗凝血酶III序列β(14)ArgCGT6460A位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO24为可用于探测抗凝血酶III中6460A/G替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO25为可用于探测野生型抗凝血酶III序列β(68)Ala，GCT13262G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO26为可用于探测抗凝血酶III中13262G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO27为可用于探测野生型抗凝血酶III序列β(255)Arg，CGT13268G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO28为可用于探测抗凝血酶III中13268G/C替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO29为可用于探测野生型抗凝血酶III序列γ(275)Arg，CGT13268G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO30为可用于探测抗凝血酶III中13268G/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO31为可用于探测野生型抗凝血酶III序列γ(275)Arg，CG13295C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO32为可用于探测抗凝血酶III中13295C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO33为可用于探测野生型抗凝血酶III序列γ(292)Gly，GGC13296G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO34为可用于探测抗凝血酶III中13296G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO35为可用于探测野生型抗凝血酶III序列γ(308)Asn，AAT13299C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO36为可用于探测抗凝血酶III中13299C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO37为可用于探测野生型抗凝血酶III序列γ(318)Asp，GAC2484T位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO38为可用于探测抗凝血酶III中γ(318)Asp/GlyGAC/GGC2484T/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO39为可用于探测野生型抗凝血酶III序列Thr312，ACT2586C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO40为可用于探测抗凝血酶III中2586C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO41为可用于探测野生型抗凝血酶III序列2603C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO42为可用于探测抗凝血酶III中2603C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO43为可用于探测野生型抗凝血酶III序列2604G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO44为可用于探测抗凝血酶III中2604G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO45为可用于探测野生型抗凝血酶III序列2759C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO46为可用于探测抗凝血酶III中2759C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO47为可用于探测野生型抗凝血酶III序列5382G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO48为可用于探测抗凝血酶III中5382G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO49为可用于探测野生型抗凝血酶III序列13324C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO50为可用于探测抗凝血酶III中13324C/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO51为可用于探测野生型抗凝血酶III序列13328G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO52为可用于探测抗凝血酶III中13328G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO53为可用于探测野生型抗凝血酶III序列13333C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO54为可用于探测抗凝血酶III中13333C/G替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO55为可用于探测野生型抗凝血酶III序列13337C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO56为可用于探测抗凝血酶III中13337C/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO57为可用于探测野生型抗凝血酶III序列13338C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO58为可用于探测抗凝血酶III中13338C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO59为可用于探测野生型抗凝血酶III序列13392G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO60为可用于探测抗凝血酶III13392G/C替换的寡核苷酸序列。
蛋白质CSEQ ID NO61为可用于探测蛋白质C41G中野生型蛋白质C序列3363/3364位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO62为可用于探测蛋白质C中41G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO63为可用于探测野生型蛋白质C序列1357C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO64为可用于探测蛋白质C中1357C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO65为可用于探测野生型蛋白质C序列1381C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO66为可用于探测蛋白质C中1381C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO67为可用于探测野生型蛋白质C序列3103C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO68为可用于探测蛋白质C中3103C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO69为可用于探测野生型蛋白质C序列3169T位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO70为可用于探测蛋白质C中3169T/C替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO71为可用于探测野生型蛋白质C序列3217G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO72为可用于探测蛋白质C中3217G/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO73为可用于探测野生型蛋白质C序列3222G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO74为可用于探测蛋白质C中3222G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO75为可用于探测野生型蛋白质C序列3222G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO76为可用于探测蛋白质C中3222G/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO77为可用于探测野生型蛋白质C序列3359G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO78为可用于探测蛋白质C中3359G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO79为可用于探测野生型蛋白质C序列3360C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO80为可用于探测蛋白质C中3360C/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO81为可用于探测蛋白质C中野生型蛋白质C序列3363/3364位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO82为可用于探测蛋白质C中3363/4 insC的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO83为可用于探测野生型蛋白质C序列3438C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO84为可用于探测蛋白质C中3438C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO85为可用于探测野生型蛋白质C序列6128T位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO86为可用于探测蛋白质C中6128T/C替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO87为可用于探测野生型蛋白质C序列6152C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO88为可用于探测蛋白质C中6152C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO89为可用于探测野生型蛋白质C序列6182C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO90为可用于探测蛋白质C中6182C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO91为可用于探测野生型蛋白质C序列6216C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO92为可用于探测蛋白质C中6216C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO93为可用于探测野生型蛋白质C序列6245C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO94为可用于探测蛋白质C中6245C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO95为可用于探测野生型蛋白质C序列6246G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO96为可用于探测蛋白质C中6246G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO97为可用于探测野生型蛋白质C序列6265G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO98为可用于探测蛋白质C中6265G/C替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO99为可用于探测野生型蛋白质C序列6274C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO100为可用于探测蛋白质C中6274C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO101为可用于探测野生型蛋白质C序列7176G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO102为可用于探测蛋白质C中7176G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO103为可用于探测野生型蛋白质C序列7253C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO104为可用于探测蛋白质C中7253C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO105为可用于探测野生型蛋白质C序列8403C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO106为可用于探测蛋白质C中8403C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO107为可用于探测野生型蛋白质8481A位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO108为可用于探测蛋白质C中8481A/G替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO109为可用于探测野生型蛋白质C序列8485-7位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO110为可用于探测蛋白质C中8485/6 delAC或8486/7delCA的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO111为可用于探测野生型蛋白质C序列8551C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO112为可用于探测蛋白质C中8551C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO113为可用于探测野生型蛋白质C序列8559G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO114为可用于探测蛋白质C中8559G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO115为可用于探测野生型蛋白质C序列8571C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO116为可用于探测蛋白质C中8571C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO117为可用于探测野生型蛋白质C序列8572G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO118为可用于探测蛋白质C中8572G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO119为可用于探测野生型蛋白质C序列8589G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO120为可用于探测蛋白质C中8589G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO121为可用于探测野生型蛋白质C序列8604G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO122为可用于探测蛋白质C中8604G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO123为可用于探测野生型蛋白质C序列8608C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO124为可用于探测蛋白质C中8608C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO125为可用于探测野生型蛋白质C序列8631C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO126为可用于探测蛋白质C中8631C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO127为可用于探测野生型蛋白质C序列8678-80位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO128为可用于探测蛋白质C中8678-80 del3nt的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO129为可用于探测野生型蛋白质C序列8689T位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO130为可用于探测蛋白质C中8689T/C替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO131为可用于探测野生型蛋白质C序列8695C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO132为可用于探测蛋白质C中8695C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO133为可用于探测野生型蛋白质C序列84708763G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO134为可用于探测蛋白质C中8763G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO135为可用于探测野生型蛋白质C序列8857位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO136为可用于探测蛋白质C中8857 delG的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO137为可用于探测野生型蛋白质C序列8895A位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO138为可用于探测蛋白质C中8895A/C替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO139为可用于探测野生型蛋白质C序列8924C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO140为可用于探测蛋白质C中8924C/G替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO141为可用于探测野生型蛋白质C序列1387C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO142为可用于探测蛋白质C中1387C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO143为可用于探测野生型蛋白质C序列1388G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO144为可用于探测蛋白质C中1388G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO145为可用于探测野生型蛋白质C序列1432C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO146为可用于探测蛋白质C中1432C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO147为可用于探测野生型蛋白质C序列-34TG6218C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO148为可用于探测蛋白质C中-34，delG6218C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO149为可用于探测野生型蛋白质C序列-24GTG(其中24为密码子核苷酸位点)6219G的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO150为可用于探测蛋白质C中6219G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO151为可用于探测野生型蛋白质C序列7219C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO152为可用于探测蛋白质C中7219C/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO153为可用于探测野生型蛋白质C序列8470G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO154为可用于探测蛋白质C中8470G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO155为可用于探测野生型蛋白质C序列448744G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO156为可用于探测蛋白质C中8744G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO157为可用于探测野生型蛋白质C序列8769C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO158为可用于探测蛋白质C中8769C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO159为可用于探测野生型蛋白质C序列8790G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO160为可用于探测蛋白质C中8790G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO161为可用于探测野生型蛋白质C序列8886G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO162为可用于探测蛋白质C中8886G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO163为可用于探测野生型蛋白质C序列-1654C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO164为可用于探测蛋白质C中-1654C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO165为可用于探测野生型蛋白质C序列-1641A位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO166为可用于探测蛋白质C中-1641A/G替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO167为可用于探测野生型蛋白质C序列-1476A位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO168为可用于探测蛋白质C中-1476A/T替换的寡核苷酸序列。
蛋白质SSEQ ID NO169为可用于探测野生型蛋白质S序列-34，TGC位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO170为可用于探测蛋白质S中-34，delG的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO171为可用于探测野生型蛋白质S序列-24，GTG位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO172为可用于探测蛋白质S中-24，GTG/GAG替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO173为可用于探测野生型蛋白质S序列19，GAA位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO174为可用于探测蛋白质S中19，GAA/TAA替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO175为可用于探测野生型蛋白质S序列26，GAA位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO176为可用于探测蛋白质S中26，GAA/TAA替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO177为可用于探测野生型蛋白质S序列44位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO178为可用于探测蛋白质S中44，delCTTA的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO179为可用于探测野生型蛋白质S序列46，GTT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO180为可用于探测蛋白质S中46，GTT/CTT替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO181为可用于探测野生型蛋白质S序列内含子d，外显子4，+1位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO182为可用于探测蛋白质S中内含子d，G/A，外显子4，+1替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO183为可用于探测野生型蛋白质S序列155，AAG位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO184为可用于探测蛋白质S中155，AAG/GAG替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO185为可用于探测野生型蛋白质S序列217，AAT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO186为可用于探测蛋白质S中217，AAT/AGT替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO187为可用于探测野生型蛋白质S序列238，CAG位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO188为可用于探测蛋白质S中238，CAG/TAG替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO189为可用于探测野生型蛋白质S序列265位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO190为可用于探测蛋白质S中265，insT的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO191为可用于探测野生型蛋白质S序列293位，TCA的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO192为可用于探测蛋白质S中293，TCA/TGA替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO193为可用于探测野生型蛋白质S序列295，GGC位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO194为可用于探测蛋白质S中295，GGC/GTC替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO195为可用于探测野生型蛋白质S序列内含子j，外显子10，+5位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO196为可用于探测蛋白质S中内含子j，G/A，外显子10，+5替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO197为可用于探测野生型蛋白质S序列349，GAA位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO198为可用于探测蛋白质S中349，GAA/AAA替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO199为可用于探测野生型蛋白质S序列372位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO200为可用于探测蛋白质S中372，delCTTTTT，insAA的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO201为可用于探测野生型蛋白质S序列中内含子k，外显子12，-9位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO202为可用于探测野生型蛋白质S序列中内含子k，A/G，外显子12，-9替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO203为可用于探测野生型蛋白质S序列-25405，CTA位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO204为可用于探测蛋白质S中405，CTA/CCA替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO205为可用于探测野生型蛋白质S序列410，CGA位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO206为可用于探测蛋白质S中410，CGA/TGA替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO207为可用于探测野生型蛋白质S序列431位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO208为可用于探测蛋白质S中431，insA的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO209为可用于探测野生型蛋白质S序列465，TGG位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO210为可用于探测蛋白质S中465，TGG/TGA替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO211为可用于探测野生型蛋白质S序列474，CGT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO212为可用于探测蛋白质S中474，CGT/TGT替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO213为可用于探测野生型蛋白质S序列内含子b，外显子2，+5522位，CAG的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO214为可用于探测蛋白质S中522，CAG/TAG替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO215为可用于探测野生型蛋白质S序列534，CTG位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO216为可用于探测蛋白质S中534，CTG/CGG替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO217为可用于探测野生型蛋白质S序列中内含子k，外显子11，+54625，TGT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO218为可用于探测蛋白质S中625，TGT/CGT替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO219为可用于探测野生型蛋白质S序列-2，CGT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO220为可用于探测蛋白质S中-2，CGT/CTT替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO221为可用于探测野生型蛋白质S序列9，AAA位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO222为可用于探测蛋白质S中9，AAA/GAA替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO223为可用于探测野生型蛋白质S序列中内含子e，外显子5，+5位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO224为可用于探测蛋白质S中内含子e，G/A，外显子5，+5替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO225为可用于探测野生型蛋白质S序列外显子15，终止密码子-25后520nt位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO226为可用于探测蛋白质S中-25，insT的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO227为可用于探测野生型蛋白质S序列467，GTA位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO228为可用于探测蛋白质S中467，GTA/GGA替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO229为可用于探测野生型蛋白质S序列633位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO230为可用于探测蛋白质S中633，delAA的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO231为可用于探测野生型蛋白质S序列636，TAA位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO232为可用于探测蛋白质S中636，TAA/TAT替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO233为可用于探测野生型蛋白质S序列内含子k，外显子11+54位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO234为可用于探测蛋白质S中内含子k，C/T，外显子11+54替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO235为可用于探测野生型蛋白质S序列460，TCC位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO236为可用于探测蛋白质S中460，TCC/CCC替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO237为可用于探测野生型蛋白质S序列626，CCA位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO238为可用于探测蛋白质S中626，CCA/CCG替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO239为可用于探测野生型蛋白质S序列外显子15，终止密码子后520nt位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO240为可用于探测蛋白质S中外显子15，终止密码子后520ntC/A替换的寡核苷酸序列。
纤维蛋白原SEQ ID NO241为可用于探测野生型纤维蛋白原序列α(16)Arg，CGT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO242为可用于探测纤维蛋白原中α(16)Arg/CysCGT/TGT替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO243为可用于探测野生型纤维蛋白原序列α(16)Arg，CGT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO244为可用于探测纤维蛋白原中α(16)Arg/HisCGT/CAT替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO245为可用于探测野生型纤维蛋白原序列α(19)Arg，AGG位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO246为可用于探测纤维蛋白原中α(19)Arg/GlyAGG/GGG替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO247为可用于探测野生型纤维蛋白原序列α(461)Lys，AAA位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO248为可用于探测纤维蛋白原中α(461)Lys/终止子AAA/TAA替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO249为可用于探测野生型纤维蛋白原序列α(554)Arg，CGT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO250为可用于探测纤维蛋白原中α(554)Arg/CysCGT/TGT替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO251为可用于探测野生型纤维蛋白原序列β(14)Arg，CGT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO252为可用于探测纤维蛋白原中β(14)Arg/CysCGT/TGT替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO253为可用于探测野生型纤维蛋白原序列β(68)Ala，GCT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO254为可用于探测纤维蛋白原中β(68)Ala/ThrGCT/ACT替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO255为可用于探测野生型纤维蛋白原序列β(255)Arg，CGT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO256为可用于探测纤维蛋白原中β(255)Arg/CysCGT/TGT替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO257为可用于探测野生型纤维蛋白原序列γ(275)Arg，CGC位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO258为可用于探测纤维蛋白原中γ(275)Arg/CysCGC/TGC替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO259为可用于探测野生型纤维蛋白原序列γ(275)Arg，CGC位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO260为可用于探测纤维蛋白原中γ(275)Arg/HisCGC/CAC替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO261为可用于探测野生型纤维蛋白原序列γ(292)Gly，GGC位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO262为可用于探测纤维蛋白原中γ(292)Gly/ValGGC/GTC替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO263为可用于探测野生型纤维蛋白原序列γ(308)Asn，AAT的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO264为可用于探测纤维蛋白原中γ(308)Asn/LysAAT/AAG替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO265为可用于探测野生型纤维蛋白原序列γ(318)Asp，GAC位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO266为可用于探测纤维蛋白原中γ(318)Asp/GlyGAC/GGC替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO267为可用于探测野生型纤维蛋白原序列Thr312，ACT位的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO268为可用于探测纤维蛋白原中Thr312AlaACT/GCT替换的寡核苷酸序列。
凝血因子V
SEQ ID NO269为可用于探测野生型凝血因子V序列1691G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO270为可用于探测凝血因子V中1691G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO271为可用于探测野生型凝血因子V序列1628G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO272为可用于探测凝血因子V中1628G/A替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO273为可用于探测野生型凝血因子V序列4070A位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO274为可用于探测凝血因子V中5382G替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO275为可用于探测野生型凝血因子V序列1090A位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO276为可用于探测凝血因子V中1090A/G替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO277为可用于探测野生型凝血因子V序列1091G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO278为可用于探测凝血因子V中1091G/C替换的寡核苷酸序列。
凝血因子IISEQ ID NO279为可用于探测野生型凝血酶原序列20210G位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO280为可用于探测凝血酶原中20210G/A替换的寡核苷酸序列。
MTHFRSEQ ID NO281为可用于探测野生型MTHFR序列677C位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO282为可用于探测MTHFR中677C/T替换的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO283为可用于探测野生型MTHFR序列1298A位核苷酸的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO284为可用于探测MTHFR中1298A/C替换的寡核苷酸序列。
ACESEQ ID NO285为可用于探测内含子16中具有288bp插入的野生型ACE序列开始部分的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO286为可用于探测内含子16中具有288bp插入的野生型ACE序列中间部分的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO287为可用于探测内含子16中具有288bp缺失的突变型ACE序列的寡核苷酸序列。
几个实施方案的详细说明缩写和术语以下提供了下列术语和方法的注解以更好地描述本发明并且指导本领域普通技术人员实践本发明。例如，术语“包括核酸”包含单个或多个核酸并且认为相当于短语“包括至少一种核酸”。除非上下文另有明确规定，单数形式的“a”，“an”以及“the”是指一个或者一个以上。除非上下文另有明确规定，术语″或″指所述可选择要素的单个要素或两个或更多要素的组合。如此处所用的，“包括”指“包含”。因此，“包括A或B”指“包含A、B或A和B”而不排除另外的要素。例如，短语“突变或多态性”或“一或多处突变或多态性”指突变、多态性或其组合，其中“a”可指一种以上。
除非另外解释，此处所用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同的意思。虽然与此处所述的类似的或等同的方法和材料可用于实践或测试本发明，合适的方法和材料描述如下。材料、方法和实施例仅是解释性的而并不试图作为限制。
非洲人包含具有任何非洲黑色人种群血统的人的人种族类别。一些实例中，包括深色-皮肤的人，其为非洲的本地人或居民，以及非洲人血统的人，如美裔非洲人人，其中这种人还保留与非洲的本地人或居民显著的遗传相似性。在具体的实例中，非洲人为至少1/64非洲人。
扩增核酸分子为了增加核酸分子的拷贝数，如基因或基因片段，例如静脉血栓形成(VT)-相关的基因。得到的扩增产物称为扩增产物。
体外扩增的一个实例为聚合酶链式反应(PCR)，其中获自受试者的生物样品与寡核苷酸引物对在允许引物与样品中核酸分子杂交的条件下接触。引物在合适的条件下延伸，从模板分离，并且随后重新退火、延伸，以及分离以扩增核酸分子的拷贝数。体外扩增技术的其他实例包括定量实时PCR、链置换扩增(参见USPN 5,744,311)；无转录等温扩增(参见USPN 6,033,881)；修复链式反应扩增(参见WO90/01069)；连接酶链式反应扩增(参见EP-A-320 308)；缺口填充连接酶链式反应扩增(参见USPN5,427,930)；偶联的连接酶检测和PCR(参见US PN6,027,889)；以及NASBATMRNA无转录扩增(参见USPN6,025,134)。
血管紧张素I-转化酶(ACE)将血管紧张素I转化为血管收缩血管紧张素II，并且参与缓激肽降解的酶。包括任何ACE基因、cDNA、RNA或来自任何生物体的蛋白质，如人。实例包括以GenBank登录号BC048144公开的的序列(以及相应的基因组和蛋白质序列)。
人ACE的至少一种变异与静脉血栓形成有关由内含子16中288-bp片段的插入(ins)或缺失(del)组成的多态性。
抗凝血剂降低或预防异常血凝结的制剂。抗凝血剂可例如通过降低或终止血液凝固所需的蛋白质的产生而避免新凝块的形成，并且预防现有的凝块生长(扩大)。实例包括，但不限于，阿斯匹林、肝素和丙酮苄羟香豆素。
抗凝血酶III(AT III)蛋白质serpin(丝氨酸蛋白酶抑制剂)超家族的成员。AT III为主要的凝血抑制因子，并且具有对其他凝血因子如因子IXa、Xa、XIa和XIIa的抑制作用。此外，AT III加速因子VIIa-组织因子复合物的解离并且防止其重新结合。包括任何AT III基因、cDNA或RNA的产物或来自任何生物体，如人的AT III蛋白。实例包括以GenBank登录号NM_000488公开的的mRNA序列(以及相应的基因组和蛋白质序列)。编码人AT III的基因定位于染色体lq23-25，跨越13.4kb的DNA并且具有七个外显子。
杂合的AT III缺陷与提高的静脉血栓形成风险有关。AT III缺陷的分子基础为高度异种的。AT III缺陷分为I型(功能性和免疫性AT III的低血浆水平)和II型(血浆中的AT III变体)。II型进一步细分为RS(缺陷的反应位点)、HBS(缺陷的肝素-结合位点)和PE(多效的，即，对功能的多重效应)。
存在至少127种与AT III缺陷有关的不同缺陷对于I型AT III缺陷的92种突变(40种点突变、40种小的插入或缺失以及12种大的缺失)和对于II型AT III缺陷的35种突变(12种RS、12种HBS和11种PE突变，均为点突变)。I型突变中，已描述了多个无关的家族中至少11种不同的突变(7种点突变和4种缺失或插入)，并且剩下的突变为单个家族特有的，其使得它们成为个体突变。II型中，已描述了多个无关的家族中的35种突变的19种(七种RS、六种HBS和六种PE突变)并且已报道剩下的为个体突变。
与静脉血栓形成有关的典型的回复AT III基因突变在表1中显示。
阵列分子，如生物学大分子(如多肽或核酸)或生物样品(如组织切片)以可寻址的位置在基质上或基质中的排列。″微阵列″为小型化以便要求或通过显微镜观察辅助用于评估或分析的阵列。阵列有时称为DNA芯片或生物芯片。
分子的阵列(″特征″)使得一次对样品进行很大数量的分析成为可能。在某些实例阵列中，一或多种分子(如寡核苷酸探针)将多次(如两次)出现在阵列上，例如用以提供内对照。阵列上可寻址的位置的数目可以变化，例如从几个(如三个)至至少50个、至少100个、至少200个、至少250个、至少300个、至少500个、至少600个、至少1000个、至少10,000个或更多。在具体的实例中，阵列包括核酸分子，如至少15个核苷酸长度的寡核苷酸序列，如约15-40个核苷酸长度，如至少18个核苷酸长度、至少21个核苷酸长度，或甚至至少25个核苷酸长度。在一个实例中，分子包括通过其5′或3′-末端附着于阵列的寡核苷酸。
在具体的实例中，阵列包括SEQ ID NO1-287，或其亚型，如奇数编号的SEQ ID NO1-285和SEQ ID NO286(用以检测野生型VT-相关的序列)，或偶数编号的SEQ ID NO2-284和SEQ ID NO287(用以检测突变或多态性的VT-相关序列)，以及SEQ ID NO1-287中所示序列的至少20个，如SEQ ID NO1-287中所示序列的至少50个、至少75个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个或至少260个。
阵列内，每种排列的样品为可寻址的，以致能在该阵列的至少二维空间内可靠和一致地确定其位置。位于排列上的特征应用可呈现不同的形状。例如，阵列可以是规则的(如以均一的行和列排列的)或不规则的。因此，在有序的阵列中每一样品的位置在其应用于阵列时指定给样品，并且提供密钥以使得每一位置与合适的靶标或特征位点相关联。常常，有序阵列以对称的网格模式排列，但样品可以其他的模式排列(如以辐射状分布的线、螺旋线或有序的簇)。可寻址的阵列通常为计算机可读的，因为计算机可程序化以使得具有在该位点样品信息(如杂交或结合数据，包括例如信号强度)的阵列上特定的地址相关联。在一些计算机可读形式的实例中，阵列中的各个特征有规则地排列，例如以笛卡尔的网格型式，其可通过计算机与地址信息相关联。
此处还关注的为基于蛋白质的阵列，其中探针分子为或包括蛋白质，或其中靶分子为或包括蛋白质，并且阵列包括蛋白质/多肽结合之的核酸，或反之亦然。
亚洲人包含具有任何远东、东南亚、印度次大陆或太平洋岛屿原始人血统的人的人种族类别。该区域包括，例如中国、印度、日本、朝鲜、菲律宾群岛和萨摩亚。在具体的实例中，亚洲人包括亚洲血统的人，如美裔亚洲人人，其保留与亚洲的本地人或居民显著的遗传相似性。在具体的实例中，亚洲人为至少1/64亚洲人。
结合或稳定的结合两种物质或分子之间的结合，如一种核酸分子杂交至另一种(或本身)以及抗体与肽的结合。如果足够量的寡核苷酸分子形成碱基对或杂交至其靶核酸分子，则寡核苷酸分子结合或稳定结合至靶核酸分子以允许结合的检测。结合可通过本领域技术人员已知的任何方法检测，如通过靶标寡核苷酸复合物的物理或功能性质。例如，结合可通过确定结合在如基因的表达、DNA复制、转录、翻译等等的生物合成过程后是否具有可观察到的效果而从功能上检测。
检测核酸分子互补链结合的物理方法包括但不限于，如DNase I或化学足迹法、凝胶转移(shift)和亲和裂解测定法、Northern印迹法、斑点印迹和光吸收检测过程的方法。例如，一种方法包括观察在温度缓慢升高时含有寡核苷酸(或类似物)和靶核酸的溶液在220至300nm处光吸收的变化。如果寡核苷酸或类似物已结合其靶标，当寡核苷酸(或类似物)和靶标相互解离或解链时在特征温度处存在吸收的急剧提高。在另一个实例中，该方法包括检测信号，如在一条或两条互补链上存在的可检测标记。
寡聚物和其靶核酸间的结合经常通过温度(Tm)表征，在该温度50％的寡聚物从其靶标解链。更高的(Tm)指相对于具有较低(Tm)的复合物的更强或更稳定的复合物。
白种人传统地通过身体特征如非常轻微的至褐色的皮肤色素沉着和直的至波状的或卷发而区分的人种族类别，其包括具有任何欧洲、北非或中东的原始人血统的人。通俗地，在北美洲单词″白人″与″白种人″同义使用。所述人也保留与欧洲、北非或中东的本地人或居民显著的遗传相似性。在具体的实例中，白种人为至少1/64白种人。
cDNA(互补DNA)缺乏内部的、非-编码片段(内含子)和决定转录的调控序列的一段DNA。cDNA可通过从提取自细胞的信使RNA反转录而合成。
互补性和百分比互补性当链通过形成Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen碱基对而相互结合(杂交)时，具有互补核酸的分子形成稳定的双链体或三链体。当寡核苷酸分子在所需条件下保持可检测地结合至靶核酸序列时产生稳定的结合。
互补性为一条核酸链的碱基与第二条核酸链的碱基的碱基配对程度。互补性通过百分比方便地描述，即，形成两条链间或两条链的特定区域或结构域内形成碱基对的核苷酸比例。例如，如果15-核苷酸的寡核苷酸的10个核苷酸与DNA分子的靶区形成碱基对，则认为该寡核苷酸具有与靶DNA区域66.67％的互补性。
本说明书中，“足够的互补性”指寡核苷酸分子和靶核酸序列(如抗凝血酶III、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR和ACE)之间存在足够数目的碱基对以实现可检测结合。当通过形成的碱基对的百分比表示或测定时，满足该目的的百分比互补性可在少至约50％互补性至完全(100％)互补的范围内。通常，足够的互补性为至少约50％，例如至少约75％的互补性、至少约90％的互补性、至少约95％的互补性、至少约98％的互补性，或甚至至少约100％的互补性。
在确定结合条件中涉及定性和定量考虑的周密处理，其允许本领域技术人员设计用于所需条件下的合适的寡核苷酸，由Beltz等.Methods Enzymol 100266-285，1983，以及由Sambrook等.(ed.)，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.，vol.1-3，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989提供。
DNA(脱氧核糖核酸)包括大多数活的生物体的遗传物质的长链聚合物(一些病毒具有包括核糖核酸、RNA的基因)。DNA聚合物中的重复单元为四种不同的核苷酸，每种包括结合至脱氧核糖的四种碱基，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一种，磷酸基附着于脱氧核糖。核苷酸的三联体称为DNA分子中编码多肽中的氨基酸的密码子。术语密码子还用于DNA序列转录为的mRNA中三个核苷酸的对应(和互补)序列。
缺失一个或多个核苷酸从核酸序列的除去(或一个或多个氨基酸从蛋白质序列的除去)，所除去序列两边的区域连接在一起。
凝血因子V(FV)在凝血酶原通过因子Xa和α-凝血酶转化至凝血酶中可充当辅因子的蛋白质。包括任何FV基因、cDNA或RNA的产物或来自任何生物体，如人的FV蛋白。FV核酸序列的实例包括以GenBank登录号No.NM_000130公开的mRNA序列(以及相应的基因组和蛋白质序列)。
FV在血浆中作为330-kD单链糖蛋白循环。活化的FV(FVa)促凝血活性的下调通过活化的蛋白质C(APC)-介导的FVa在三个不同顺序切割位点的蛋白质水解而实现。凝血因子V首先在Arg 506裂解，随后在Arg 306裂解，并且最后在Arg 679裂解。Arg 506处肽键的裂解对于随后Arg 306和Arg 679处切割位点的最理想的暴露是必须的。肽键在Arg 306处的裂解是最初70％活性丧失的原因，并且随后在Arg679处的裂解造成残留活性的丧失。
人FV基因中至少五个单核苷酸取代与提高的血栓形成风险有关导致Arg506Gln多态性的1691G→A转变；导致R485K多态性的1628G→A转变；导致Arg306Thr突变的1091G→C转变；导致Arg306Gly突变的1090A→G转变以及导致His1299Arg多态性的4070A→G转变。
纤维蛋白原在血凝结中，如血纤蛋白凝结形成、凝血因子XIII-介导的血纤蛋白交联、无底物的凝血酶结合、血小板聚集以及纤维蛋白溶解中具有多重功能的血浆蛋白质。包括任何纤维蛋白原基因、cDNA、RNA的产物或来自任何生物体，如人的纤维蛋白原蛋白。纤维蛋白原核酸序列的实例包括分别以GenBank登录号No.NM_021871.1、BC007030和NM_021870公开的亚基(对应于α、β和γ)，以及相应的基因组和蛋白质序列。
人纤维蛋白酶原为340-kD的糖蛋白，由通过二硫键连接的两个相同的亚基组成。每一亚基包括三个多肽链(α、β和γ)，其由人染色体4长臂上三个独立的基因编码。血纤维蛋白原异常由纤维蛋白原分子中导致纤维蛋白原功能异常的各种结构异常引起。
至少25种单纤维蛋白原突变(22种单核苷酸取代，一种插入和两种缺失)与提高的血栓形成风险有关，并且包括Thr312Ala多态性。已在多个报道中描述了来自不同的无关家族的至少13种突变，并且剩下的突变已是单个家族特有的，其使得它们成为个体突变。
与静脉血栓形成有关的典型的回复血栓形成纤维蛋白原基因突变和一种共同的多态性在表1中显示。
遗传倾向性患上遗传疾病，如静脉血栓形成的易感性。然而，所述易感性可能或可能不导致该疾病实际上的发展。
杂交DNA、RNA的两条链的互补区域之间或DNA和RNA之间形成碱基对，由此形成双链体分子。产生特定严谨程度的杂交条件将根据杂交方法的性质和杂交核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(如Na+浓度)决定杂交的严谨度。关于获得特定严谨程度的杂交条件的计算论述在Sambrook等.，(1989)Molecular Cloning，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，NY(第9和11章)中。下列为杂交条件的典型组，并且不是限制性的非常高的严谨度(检测共有至少90％同一性的序列)杂交5×SSC，65℃16小时洗涤两次每次在室温下(RT)2×SSC中15分钟洗涤两次每次在65℃0.5×SSC中20分钟高严谨度(检测共有至少80％同一性的序列)杂交5-6×SSC，65-70℃16-20小时洗涤两次每次在RT下2×SSC中5-20分钟洗涤两次每次在55℃-70℃1×SSC中30分钟低严谨度(检测共有至少50％同一性的序列)杂交6×SSC，RT至55℃16-20小时洗涤至少两次每次在RT至55℃2-3×SSC中20-30分钟。
插入一个或多个核苷酸添加至核酸序列，或一个或多个氨基酸添加至蛋白质序列。
分离的“分离的”生物组分(如核酸分子、蛋白质或细胞器)已基本上与生物体细胞中(该组分天然存在于其中)的其他生物学组分分开或纯化，如其他的染色体和外染色体DNA以及RNA、蛋白质和细胞器。已″分离的″核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。该术语还包含通过在宿主细胞中的重组表达而制备的核酸分子和蛋白质以及化学合成的核酸分子和蛋白质。
标记物能例如通过ELISA、分光光度测定法、流细胞计数法或显微镜检查检测的试剂。例如，标记可附着于核酸分子，由此允许核酸分子的检测。标记的实例包括，但不限于放射性同位素、酶底物、辅因子、配体、化学发光试剂、荧光基团、半抗原、酶和其组合。用于标记的方法和选择适于不同目的的标记的指南例如在Sambrook等.(Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NewYork，1989)和Ausubel等.(In Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，1998)中论述。
亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)参与胞内高半胱氨酸代谢的再次甲基化途径的蛋白质。在由甲硫氨酸合酶催化的再次甲基化途径中，钴胺素作为辅因子而甲基由5-甲基-四氢叶酸供给，其源自5，10-亚甲基四氢叶酸通过MTHFR的还原。包括任何MTHFR基因、cDNA或RNA的产物，或来自任何生物体，如人的MTHFR蛋白质。实例包括以GenBank登录号No.NM_005957公开的mRNA序列(以及相应的基因组和蛋白质序列)。
人MTHFR基因位于染色体1p36.3，包括～17kb的DNA并且具有11个外显子。人MTHRF中至少两个多态性与静脉血栓形成有关677C→T多态性和1298A→C多态性。
突变作为遗传变异来源的核酸序列的任何改变。例如，突变可存在于基因或染色体内，包括染色体非编码区的特定的改变，例如基因调控区中或接近基因调控区的改变。突变的类型包括，但不限于碱基取代点突变(如转变或易位)、缺失和插入。错义突变为将不同的氨基酸导入所编码蛋白质的序列中的突变；无义突变为导入新的终止密码子的突变；并且沉默突变为导入常常在密码子第三个位点具有碱基改变的相同氨基酸的突变。在插入或缺失的情况下，突变可为读框内的(不改变全序列的读框)或为移框突变，其可以导致大量密码子的错译(并且常常导致所编码产物由于另一读框中终止密码子的存在而异常终止)。
核酸阵列核酸分子(如DNA或RNA)在基质上指定位置的排列，如cDNA阵列或寡核苷酸阵列中发现的排列。
核酸分子代表基因具有适合用作探针或其他指示分子的任何长度的任何核酸分子，例如DNA(内含子或外显子或两者)，cDNA或RNA，并且其为相应的基因提供信息。
核酸分子脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，包括不限于cDNA、mRNA、基因组DNA和合成的(如化学合成的)DNA。核酸分子可以为双-链或单链的。为单链时，核酸分子可以为有义链或反义链。此外，核酸分子可以为环状的或线性的。
所公开的包括分离的核酸分子，其包括指定长度的VT-相关的核苷酸序列。所述分子可以包括这些序列的至少10个、至少15个、至少20个、至少21个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个或至少50个连续的核苷酸或更多。
核苷酸包括但不限于，包括连接至糖的碱基的单体，如嘧啶、嘌呤或其合成的类似物，或连接至氨基酸的碱基，如在肽核酸(PNA)中。核苷酸为多核苷酸的一种单体。核苷酸序列指多核苷酸中碱基的序列。
寡核苷酸寡核苷酸为通过天然的磷酸二酯键连接的多个连接的核苷酸，在约6个和约300个核苷酸长度之间。寡核苷酸类似物指功能类似于寡核苷酸但具有非-天然存在部分的部分。例如，寡核苷酸类似物可以含有非-天然存在的部分，如改变的糖部分或糖内键，如硫代磷酯寡脱氧核苷酸。
特定的寡核苷酸和寡核苷酸类似物可以包括上至约200个核苷酸长度的线性序列，例如至少6个碱基的序列(如DNA或RNA)，例如至少8个、至少10个、至少15个、至少20个、至少21个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少100个或甚至至少200个碱基长，或从约6个至约50个碱基，例如约10-25个碱基，如12、15、20、21或25个碱基。
寡核苷酸探针核苷酸的短序列，如至少8个、至少10个、至少15个、至少20个、至少21个、至少25个或至少30个核苷酸长度，通过分子杂交用于检测互补序列的存在。在具体的实例中，寡核苷酸探针包括标记，其允许寡核苷酸探针靶序列杂交复合物的检测。
可操作性连接的当第一个核酸序列处于和第二个核酸序列的功能关系中时，第一个核酸序列与第二个核酸序列可操作性连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作性连接至编码序列。通常，可操作性连接的DNA序列为连续的并且，需要时将两个蛋白质-编码区连接在相同的阅读框中。
开放读框(ORF)无任何内部终止密码子的一系列编码氨基酸的核苷酸三联体(密码子)。这些序列通常可翻译为肽。
多态性由于突变，个体中基因序列可不同。这些不同的序列称为等位基因。存在于既定基因座的等位基因(染色体上基因的位置称为基因座)称为个体的基因型。一些基因座在个体中有很大的不同。如果基因座具有两个或更多等位基因，群体中每一个的频率超过1％，则该基因座称为多态的。多态的位点称为多态性。术语多态性还包括产生改变功能的基因产物的变异，即产生功能不等同基因产物的基因序列中的变体。该术语还包括不产生基因产物、产生无活性的基因产物或产生提高或降低活性或甚至无生物学作用的基因产物的变异。
多态性可例如指通过变异存在的核苷酸位点，通过由核苷酸变异造成的氨基酸序列的改变，或通过与该变异有关的核酸分子或蛋白质的一些其他特征的改变。
引物短的核酸分子，例如10-100个核苷酸长度的DNA寡核苷酸，如约15、20、21、25、30或50个核苷酸或更多的长度。引物可通过核酸杂交与互补的靶DNA链退火以在引物和靶DNA链间形成杂交物。引物对可用于核酸序列扩增，如通过本领域已知的PCR或其他的核酸扩增方法。
用于制备和使用核酸引物的方法例如在Sambrook等.(InMolecular CloningA Laboratory Manual，CSHL，New York，1989)，Ausubel等.(编)(In Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，1998)，以及Innis等.(PCR Protocols，A Guide toMethods and Applications，Academic Press，Inc.，San Diego，CA，1990)中描述。PCR引物对可源自已知序列，例如通过利用用于该目的的计算机程序如Primer(Version 0.5，1991，Whitehead Institute forBiomedical Research，Cambridge，MA)。本领域的普通技术人员将理解特定引物的特异性随着其长度而提高。因此，例如，包含VT-相关蛋白质编码核苷酸30个连续核苷酸的引物将以比仅15个核苷酸的相应引物更高的特异性退火至靶序列，如指定的VT-相关蛋白质的另一种同系物。因此，为了获得更好的特异性，可选择包含VT-相关蛋白质-编码核苷酸序列的至少20个、至少21个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个或更多连续核苷酸的引物。
蛋白质C(PC)在凝血酶结合至其内皮受体，凝血调节蛋白(thrombomodulin)后PC被活化。活化的PC通过裂解和灭活因子Va和VIIIa而抑制凝结形成。包括任何PC基因、cDNA或RNA的产物或来自任何生物体，如人的PC蛋白。实例包括以GenBank登录号No.BC034377.1公开的mRNA序列(以及相应的基因组和蛋白质序列)。
人PC基因定位于人染色体2q13-14；其跨越大约10kb并且含有九个外显子。PC基因中功能丧失的突变导致PC的缺陷，其为公认的VT的原因。PC缺陷分为I型(低的功能性和免疫学PC的血浆浓度)和II型(具有正常的抗原水平的低的功能蛋白的血浆水平)。
在与人中静脉血栓形成有关的至少161种不同的PC基因突变中，已描述了多个无关的家族中至少51种不同的突变(48种点突变，2种缺失和1种插入)，并且剩下的突变为单个家族特有的，其使得它们成为个体突变。至少四十种回复突变与I型PC缺陷有关并且已在患有II型PC缺陷的患者中发现11种突变。
位于PC基因5′非翻译区的三个多态位点(nt-1654C/T、-1641A/G和-1476A/T)也对血浆的PC水平起作用。携带CGT等位基因的受试者具有比具有另一种基因型的受试者更低的血浆PC水平并且该等位基因为静脉血栓形成的风险因素。
与静脉血栓形成有关的典型的回复PC基因突变和多态性在表1中显示。
蛋白质S(PS)用于活化的PC在因子Va和VIIIa蛋白水解失活中的非-酶促辅因子。包括任何PS基因、cDNA或RNA的产物或来自任何生物体，如人的PS蛋白。实例包括以GenBank登录号No.NM_000313.1公开的mRNA序列(以及相应的基因组和蛋白质序列)。
人DNA包含两种PS基因有活性的PROS1基因和假基因PRSO2，其定位于3p11.1-q11.2。PRSO1跨越80kb基因组DNA并且包含15个外显子和14个内含子。PRSO1中功能丧失的突变导致PS的缺陷。根据血浆测量识别三种PS缺陷I型通过低的总量以及无PS抗原水平表征，II型通过降低的活性以及正常的总量和无PS抗原水平表征，并且III型通过游离PS水平的选择性降低表征。
在与人中静脉血栓形成有关的至少131种不同的PS基因突变中，已描述了多个无关的家族中至少32种不同的突变(25种点突变，3种缺失，3种插入以及1种缺失和插入)，并且剩下的突变已是单个家族特有的，其使得它们成为个体突变。已报道二十五种回复突变与定量(I型和/或III型)PS缺陷有关，3种突变与定性(II型)PS缺陷有关，并且由于缺少一种血浆测定法或由于受试者正进行口服抗凝血疗法，在剩下的4种突变中不能确定PS缺陷的类型。PS基因中四种回复多态性与患有遗传PS缺陷家族中的缺陷表型共分离(cosegregate)。
与静脉血栓形成有关的典型的回复PS基因突变和多态性在表1中显示。
凝血酶原(凝血因子II，FII)丝氨酸蛋白酶凝血酶的前体，其为维生素K-依赖的糖蛋白。通过FXa活化(FVa和磷脂存在时)，FIIa呈现促凝血的、抗凝血的和抗纤维蛋白溶解的活性。包括任何FII基因、cDNA或RNA的产物或来自任何生物体，如人的FII蛋白。实例包括以GenBank登录号No.V00595.1公开的mRNA序列(以及相应的基因组和蛋白质序列)。
编码FII的人基因定位于染色体11，带11p11-q12上并且跨越21kb的DNA。FII基因组织在14个外显子中，通过13个内含子分开，具有5′和3′-非翻译(UT)区。
人FII基因中至少一种单核苷酸取代与提高的血栓形成风险有关核苷酸20210位G→A的多态性。
纯化的术语“纯化的”并不要求绝对的纯度；相反，其只是作为相对术语。因此，例如，纯化的蛋白质制备物为其中所指的蛋白质比其在细胞内的天然环境中更纯的蛋白质。例如，蛋白质的制备物为纯化的，使得该蛋白质代表该制备物至少50％的总蛋白质含量。同样，纯化的寡核苷酸制备物为其中寡核苷酸比在包含复杂的寡核苷酸混合物的环境中更纯的寡核苷酸。
重组体重组核酸分子为具有不是天然存在序列的序列或具有通过两种不同分离的序列片段的人工组合而制备的序列的核酸分子。该人工组合可通过化学合成或通过分离的核酸分子片段的人工操作实现，如通过遗传工程技术。
样品生物样本，如包含基因组DNA、RNA(包含mRNA)、蛋白质或其组合的那些。实例包含但不限于，外周血、尿、唾液、活体组织、外科样本、羊膜穿刺样品和尸检材料。
序列同一性/相似性两个或更多核酸序列或两个或更多氨基酸序列间的同一性/相似性根据序列间的同一性或相似性表示。序列同一性可根据同一性百分比衡量；百分比越高序列更同一。序列相似性可根据相似性百分比衡量(其考虑了保守的氨基酸取代)；百分比越高序列更相似。当利用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同系物或直向同源物拥有比较高的序列同一性/相似性程度。相比更远相关的物种(如人和线虫序列)，当直向同源蛋白质或cDNA源自更密切相关的物种(如人和小鼠序列)时该同源性更加显著。
用于比较的序列比对方法为本领域所熟知。以下描述了各种程序和比对算法Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2482，1981；Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48443，1970；Pearson & Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444，1988；Higgins & Sharp，Gene，73237-44，1988；Higgins & Sharp，CABIOS 5151-3，1989；Corpet等.，Nuc.Acids Res.1610881-90，1988；Huang等.Computer Appls.inthe Biosciences 8，155-65，1992；和Pearson等.，Meth.Mol.Bio.24307-31，1994。Altschul等.，J.Mol.Biol.215403-10，1990记载了序列比对方法和同源性计算的详尽介绍。
NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul等，J Mol.Biol.215403-10，1990)可由以下几个来源获得，包括国家生物信息中心(NCBI，National Library of Medicine，Building 38A，Room8N805，Bethesda，MD 20894)和Internet，并结合序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx一起使用。附加信息可在NCBI网点获得。
BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。为了比较两条核酸序列，选项可设置如下-i设为包含用以比较的第一个核酸序列的文件(如C\seq1.txt)；-j设为包含用以比较的第二个核酸序列的文件(如C\seq2.txt)；-p设为blastn；-o设为任何想要的文件名(如C\output.txt)；-q设为-1；-r设为2；并且所有其他选项保留为其缺省设置。例如，下列命令可用于产生包含两条序列间比较的输出文件C\B12seq-i c\seq1.txt-j c\seq2.txt-p blastn-o c\output.txt-q-1-r2。
为了比较两条氨基酸序列，B12seq选项可设置如下-i设为包含用以比较的第一个氨基酸序列的文件(如C\seq1.txt)；-j设为包含用以比较的第二个氨基酸序列的文件(如C\seq2.txt)；-p设为blastp；-o设为任何想要的文件名(如C\output.txt)；并且所有其他选项保留为其缺省设置。例如，下列命令可用于产生包含两条氨基酸序列间比较的输出文件C\B12seq-i c\seq1.txt-j c\seq2.txt-p blastp-o c\output.txt。如果两条比较的序列具有同源性，则指定的输出文件将以比对的序列呈现同源性的那些区域。如果两条比较的序列不具有同源性，则指定的输出文件不会呈现比对的序列。
一旦比对，通过计算存在于两者序列中相同的核苷酸或氨基酸残基的位点数目而确定匹配的数目。序列同一性百分比通过将匹配的数目除以所鉴定序列中所述的序列长度或关连的长度(如来自所鉴定序列中所述100个连续的核苷酸或氨基酸残基)，随后得到的值乘以100而确定。例如，当与具有1154个核苷酸的检验序列比对时具有1166个匹配，则核酸序列与该检验序列75％相同(即，1166÷1554*100＝75.0)。序列同一性的百分比值四舍五入至最接近的十分之一位数。例如，75.11、75.12、75.13和75.14下舍至75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19上舍至75.2。长度值始终为整数。在另一个实例中，包含与来自如下已确定序列的20个连续核苷酸比对的20-核苷酸区域的靶序列包含具有与已确定序列75％序列同一性的区域(即，15÷20*100＝75)。
1 20靶序列AGGTCGTGTACTGTCAGTCA| || ||| |||| |||| |已确定序列ACGTGGTGAACTGCCAGTGA为了比较超过约30个氨基酸的氨基酸序列，采用Blast 2序列功能，缺省BLOSUM62矩阵设置成缺省参数(缺口存在值11，每个残基缺口值1)。同系物通常通过拥有至少70％的序列同一性表征，其利用NCBI Basic Blast 2.0与数据库如nr或swissprot数据库进行有缺口的blastp而计数全长比对的氨基酸序列。用blastn程序搜索的查询序列用DUST过滤(Hancock和Armstrong，1994，Comput.Appl.Biosci.1067-70)。其他的程序使用SEG。此外，可进行人工比对。当通过该方法评估时具有甚至更大相似性的蛋白质将显示提高的同一性百分比，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。
当比对短肽(小于大约30个氨基酸)时，采用Blast 2序列功能，PAM30矩阵设置成缺省参数(开放缺口9，延伸缺口1罚分)，进行序列对比。当通过该方法评估时，具有与参考肽更高相似性的蛋白质将显示提高的同一性百分比，例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。当少于全序列被比较序列同一性时，在10-20个氨基酸的短窗口，同系物通常将具有至少75％的序列同一性，并且可具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性，取决于其与参考序列的同一性。用于确定在所述短窗口的序列同一性的方法在NCBI网点描述。
如上所述，两个核酸分子密切相关的一个指标为两个分子在严谨条件下相互杂交。然而由于遗传密码的简并性，不显示高同一性程度的核酸序列可能编码相同或类似的(保守的)氨基酸序列。可利用简并性产生核酸序列的改变以产生多个核酸分子，所有的编码基本上相同的蛋白质。所述同源核酸序列可例如，具有通过该方法确定的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。两条核酸序列基本上相同的另一种(并且未必累积的)指标为第一个核酸编码的多肽与第二个核酸编码多肽是有免疫交叉反应性的。
本领域技术人员将理解具体的序列同一性范围仅用于指导性的提供；有可能在所提供范围外可获得很明显的同系物。
单核苷酸多态性(SNP)群体的个体中DNA序列的单碱基(核苷酸)差异。SNP可以是作为原因的(实际上参与或作用于SNP相关的情况或性状)或相关的(与SNP相关的情况或性状有关而不是具有任何直接的参与或作用)。
受试者活的多细胞脊椎动物生物体，包括人和非-人哺乳动物(如兽医受试者)的种类。
靶序列位于基因组(如人基因组或任何哺乳动物基因组)特定区域的核苷酸序列，其对应于一或多种特定的遗传异常，如一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入、扩增或其组合。该靶例如可为编码序列；其还可以为对应于编码序列的非-编码链。靶序列的实例包括与静脉血栓形成有关的那些序列，如列于表1中的那些。
静脉血栓形成(VT)静脉内形成的血液凝块。在特定的实例中，VT与粘滞的血液流动有关(例如在延长的卧床休息、妊娠和外科手术期间出现的)或与血液的快速凝结有关。实例包括腿的深静脉或骨盆静脉中形成的深静脉血栓形成(DVT)。所述血栓有时迁移至肺并且形成导致心肺衰竭以及死亡的肺栓。
静脉血栓形成(VT)-相关的(或关联的)分子参与静脉血栓形成发展的分子。所述分子包括，例如核酸(如DNA、cDNA或mRNA)和蛋白质。VT-相关分子的特定实例包括列于表1中的那些，以及全长基因或cDNA的片段，其包括突变、多态性或两者，负责提高个体对VT的易感性，以及因此编码的蛋白质和蛋白质片段。
VT-相关分子可通过静脉血栓形成以许多不同的方式参与或作用，包括成为原因的(因为VT-相关分子的改变导致静脉血栓形成的发生或发展)或结果性的(因为静脉血栓形成的发生或发展引起或导致VT-相关分子的改变)。
野生型相比突变体形式，生物体自然群体中占优势的基因型。
参与静脉血栓形成的突变和多态性复杂的性状如静脉血栓形成可通过在候选的易感性基因中呈现不同突变、多态性之间的相互作用而了解。与每种遗传缺陷有关的风险在隔离时可能相对较低，但几个突变或多态性的同时存在可以显著提高疾病易感性。此外，环境因素可与一或多种遗传变异互相作用而进一步增加风险。静脉血栓形成表型的表现取决于来自几个基因座的基因产物和环境或后天影响的相互作用。因此，VT为复杂的遗传病症。
与发展VT的风险有关的基因中的几个突变和多态性(如一个或多个核苷酸的取代、插入、缺失或其组合)是已知的。然而，之前还没有鉴定出突变和多态性的组合(如在统计上与VT有关的基因中)，其允许在多个种族人群中准确预测受试者对VT的总遗传倾向性。
蛋白质C、蛋白质S和抗凝血酶III参与静脉血栓形成的几个基因，包括蛋白质C(PC)、蛋白质S(PS)和抗凝血酶III参与抗凝血途径。PC和PS缺陷导致活化的PC抗凝血系统的缺陷。
已报道了人中至少161种不同的有害PC基因突变(Reitsma等.，Thromb.Haemost.73876-89，1995)。在该161种不同的PC基因突变中，仅描述了多个无关的家族中51种不同的突变(48种点突变，2种缺失和1种插入)，并且剩下109种突变已是单个家族特有的，其使得它们成为个体突变。四十种回复突变与I型PC缺陷有关并且已在患有II型PC缺陷的患者中观察到11种突变。三个多态位点(nt-1654C/T、-1641A/G和-1476A/T)位于对血浆的PC水平起作用的该基因5′非翻译区。
PS缺陷具有至少131种不同突变的高度异种分子基础(Gandrille等.，Thromb.Haemost.84918，2000)。在所有的PS基因有害突变中，已描述了无关的家族中仅32种不同的突变(25种点突变，3种缺失，3种插入以及1种缺失和插入)，并且剩下的100种突变已是单个家族特有的，其使得它们成为个体突变。已报道二十五种回复突变与定量(I型和/或III型)PS缺陷有关，3种突变与定性(II型)PS缺陷有关。PS基因中四种回复多态性与患有遗传PS缺陷家族中的缺陷表型共分离(cosegregate)。
总人口中PC缺陷的发病率为大约1/300。PC和PS缺陷的携带者状态与大约10倍的提高的VT血栓形成风险有关。纯合的PC和PS缺陷通常与称为暴发性紫癜的严重的临床表型有关，其以出生后早期微循环中大范围的形成血栓为特征。
杂合的抗凝血酶III(AT III)缺陷与提高的VT风险有关。存在至少127种与AT III缺陷有关的不同缺陷(Lane等.，Thromb.Haemost.77197-211，1997)对于I型AT III缺陷的92种突变(40种点突变、40种小的插入或缺失以及12种大的缺失)和对于II型AT III缺陷的35种突变(12种RS、12种HBS和11种PE突变，均为点突变)。I型突变中，已描述了多个无关的家族中仅11种不同的突变(7种点突变和4种缺失或插入)，并且剩下的81种突变为单个家族特有的，其使得它们成为个体突变。II型中，已描述了多个无关的家族中的35种突变的19种(七种RS、六种HBS和六种PE突变)并且已报道剩下16种为个体突变。
总人口中AT III缺陷的发病率范围从0.2/1000至18/1000。在基于群体的对照研究中，报道了与AT III缺陷关联的五倍提高的VT风险。血栓形成患者中AT III缺陷的发病率范围从1％至8％。
凝血因子V、凝血酶原和纤维蛋白原参与静脉血栓形成的其他基因包括凝血因子V(FV)、凝血酶原(凝血因子II)和纤维蛋白原，其参与促凝血途径。突变FV的改变的活性为最常见的遗传血液凝固病症，其影响VT的发展(Nicolaes等.，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.22530-8，2002)。活化的FV(FVa)促凝血活性的下调通过活化的蛋白质C(APC)-介导的FVa在三个不同顺序切割位点的蛋白质水解而实现Arg 506、Arg 306和Arg 679(此处核苷酸或氨基酸的编号指人基因)。一个或多个这三个切割位点的缺陷可影响APC的失活过程，即使前凝结活性维持正常。
人FV基因中至少五种回复单核苷酸取代与提高的血栓形成风险有关。90％的病例中，对APC的抗性应归于导致Arg506由Gln替换(R506Q)的单核苷酸取代(FV Leiden；1691G→A)。白种人群体中其发病率为大约5％并且在VT患者中高达20％至40％。然而，其他人种中仅报道了极个别的FV Leiden病例，并且在东南亚和非洲没有发现，所以人们相信FV Leiden突变是对白种人特异的(Takamiya等.，Thromb.Haemost.74996，1995；Fujimura等.，Thromb.Haemost.741381-2，1995；Chan等.，Thromb.Haemost.75522-3，1996)。
FV基因中另一种单核苷酸取代，R485K，与远东人群提高的血栓形成风险有关(Hiyoshi等.，Thromb.Haemost.80705-6，1998；Le等.，Clin.Genet.57296-303，2000)。R485K多态性为核苷酸1628位出现的G→A的转变并且导致Arg 485的密码子AGA由推定为Lys残基的AAA密码子的替换。尽管白种人中K485等位基因的频率较低而在亚洲人和非洲人中较高，该多态性证实与远东和白种人群提高的血栓形成风险相关(Faisel等.，Eur.J.Hum.Genet.12187-91，2004)。
三种其他的单核苷酸取代与不同人群提高的血栓形成风险有关。人FV基因的外显子7中两种突变影响Arg306APC切割位点。这两种突变也具有异种的种族分布。FV Cambridge突变为核苷酸1091位G→C的转变以及推定氨基酸306位精氨酸由苏氨酸的替换(Arg306Thr)。仅在白种人群体中描述了该突变(Francoetal.，Thromb.Haemost.81312-3，1999)。第二种突变，FV Hong Kong，为核苷酸1090位A→G的转变以及Arg306至Gly的改变。虽然该突变最初在中国人群中描述，其在白种人中具有0.4％的发病率(Franco等.，Thromb.Haemost.81312-3，1999)。
称为R2等位基因的人FV基因外显子13中的另一种单核苷酸取代为核苷酸4070位A→G的转变，其在1299位由Arg替换His(H1299R)。R2等位基因的发病率在VT患者中明显高于健康对照，各自的值分别为18.5％和11.4％(Alhenc-Gelas等.，Thromb.Haemost.81193-7，1999)。美国白种人中该多态性具有11.9％的发病率，美裔非洲人人中为5.6％，亚洲人或太平洋岛民中为13.4％以及拉丁美洲人中为11.3％(Benson等.，Thromb.Haemost.861188-92，2001)。
凝血酶原(凝血因子II，FII)基因中至少一种单核苷酸取代与提高的血栓形成风险有关。凝血酶原基因3′-UT区20210位核苷酸G→A的多态性为第二个最参见的静脉血栓形成遗传风险因素(Poort等.，Blood 883698-703，1996)。FII G20210A与血凝血酶原过多和二至五倍提高的VT风险有关。其在健康受试者中发现1％-3％的患者以及在白种人群体中发现6％-18％的VT患者(Rosendaal等.，Thromb.Haemost.79706-8，1998)，但其在美裔非洲人和来自巴西的美国印地安人中相当罕见(Dilley等.Blood 90652a，1997；Arruda等.，Thromb.Haemost.781430-3，1997)。该突变在西非人、亚马逊河区的印第安人、澳大拉西亚人、拉丁美洲人、日本人或中国人受试者中没有发现(Ferraresi等.，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.172418-22，1997；Rahimy等.，Thromb.Haemost.79444-5，1998；Isshiki等.，Blood Coagul.Fibrinol.9105-6，1998；Miyata等.，Blood Coagul.Fibrinol.9451-2，1998，Rees等.Br.J Haematol.105564-566，1999)。
至少25种血栓形成纤维蛋白原突变(22种单核苷酸取代，1种插入和2种缺失)与VT有关(De Stefano等.，Br.J.Haematol.106564-8，1999)。至少13种突变来自不同的无关家族；剩下的突变是单一家族特有的，使得其成为个体突变。总人口中遗传血纤维蛋白原异常的发病率还未知；然而，具有静脉血栓形成病史的患者中的发病率为0.8％(Carter等.，Blood 961177-9，2000)。导致纤维蛋白原Aα链羧基端内312位密码子苏氨酸由丙氨酸取代的常见的多态性(Thr312Ala多态性)通过影响凝块稳定性以及使凝块在静脉血管树中倾向于栓塞而与静脉血栓栓塞有关(Carter等.，Blood 961177-9，2000；Standeven等.，Circulation 1072326-30，2003；Hayes，Arch.Pathol.Lab.Med.1261387-90，2002)。该多态性在51％的肺栓塞患者中以及在40％的健康受试者中观察到。已发现白种人和亚洲人中Thr312Ala多态性的遗传型分布无差异并且该多态性与两种群体中提高的纤维蛋白原水平有关(Liu等.，J.Med.Genet.3831-5，2001；Kain等.，Am.J.Epidemiol.156174-9，2002)。
血管紧张素I-转化酶和亚甲基四氢叶酸还原酶参与静脉血栓形成的另外的基因包括但不限于，血管紧张素I-转化酶(ACE)和亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)。
肾素血管紧张素系统通过不同的机理影响止血。人ACE基因的内含子16中，已知由288-bp片段的插入或缺失组成的多态性(Rigat等.，Nuc.Acids Res.201433，1992)。白种人和美裔非洲人的ACE DD基因型与循环酶的提高的水平以及3至10倍提高的静脉血栓栓塞风险有关。还在日本人群体中报道了ACE DD基因型。
轻微的-至-中等的高半胱氨酸血症(总高半胱氨酸在15和100μmol/之间的禁食水平(fasting)水平)为确定的VT风险因素并且与2至4倍提高的血栓形成风险有关。虽然其可由一些后天的原因，包括维生素B12、维生素B6和叶酸营养缺陷、老年、慢性肾衰竭以及抗-福利奇(folic)药物的使用而引起，亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因中两种常见的多态性与轻微的-至中等的高半胱氨酸血症有关(Cattaneo，Thromb.Haemost.81165-76，1999；Franco和Reitsma，Hum.Genet.109369-84，2001)。
MTHFR 677C→T多态性位于人外显子4的叶酸结合位点，将丙氨酸转变为缬氨酸。在其杂合状态，C677T多态性与MTHFR的热不稳定性有关，导致酶活性60-70％的降低以及轻微的至中等的高半胱氨酸血症(Franco和Reitsma，Hum.Genet.109369-84，2001；Frosst等.，Nat.Genet.10111-3，1995)。人MTHFR中C677T多态性在全世界具有较高的频率，TT基因型以总人口的约5％至17％存在，不同的种族人群中具有很不均匀的分布，欧洲发病率最高而非洲发病率最低(Frosst等.，Nat.Genet.10111-3，1995；Schneider等.，Am.J.Hum.Genet.621258-60，1998；De Franchis等.，Am.J.Hum.Genet.59262-4，1996；Ma等.，Circulation 942410-6，1996；Deloughery等.，Circulation943074-8，1996；Arruda V等.，Thromb.Haemost.77818-21，1997)。纯合的MTHRF C677T多态性为白种人静脉血栓形成患者中11％-27％发病率的独立的静脉血栓形成风险因素，而不与亚洲人和非洲人中的VT有关(Arruda等.，Thromb.Haemost.77818-21，1997；Margaglione等.，Thromb.Haemost.79907-11，1998；Salomon等.，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.19511-8，1999)。
另一种MTHFR多态性，1298A→C在人外显子7的推定调控结构域中，并且谷氨酰胺转变为丙氨酸。单独地，该多态性似乎不和高半胱氨酸血症有关，但与MTHFR 677C→T组合的杂合性导致降低的酶活性以及提高的高半胱氨酸水平(Weisberg等.，Mol.Genet.Metab.68511-2，1999)。
确定静脉血栓形成的遗传倾向性此处提供的为确定受试者，如另外的健康受试者或疑似或处于发展血栓的风险中的受试者是否对发展静脉血栓形成(VT)易感的方法。该方法包括检测受试者至少一种VT-相关分子的异常(如突变或多态性)，如编码凝血-相关蛋白质的核酸分子。具体包含的实施方案包括诊断或预后方法，其中检测个体细胞中VT-相关核酸分子的一或多处突变或多态性。在具体的实施方案中，VT-相关分子(如核酸序列)的亚型，或所有已知的VT-相关分子中检测到异常，其选择性地检测受试者对发展VT的遗传倾向性。
在具体的实例中，分子亚型包含与静脉血栓形成事件有关的一组10种VT-相关易感性等位基因，其中该10种VT-相关易感性等位基因在至少95％的白种人受试者中存在，其处于静脉血栓形成的风险之中(或其已经历过静脉血栓形成)。在具体的实例中，10种VT-相关易感性等位基因在至少98％的白种人中存在，如至少99％，并且在至少82％的亚洲人和非洲人人群中存在，如在至少85％的非洲人中，其已经发展或处于发展VT的风险中。
仍在其他的实例中，所筛选的VT-相关易感性等位基因数目为至少10种，例如至少15种、至少20种、至少50种、至少100种、至少143种、至少200种、至少287种或甚至至少500种等位基因。在其他的实例中，该方法用于筛选不超过600种、不超过500种、不超过400、不超过287种、不超过200种、不超过143种、不超过100种、不超过50种或不超过10种VT-相关易感性等位基因。具体的VT-相关易感性等位基因的实例在表1中显示。
如此处所用的，术语“VT-相关分子”包含VT-相关核酸分子(如DNA、RNA或cDNA)和VT-相关蛋白质。该术语不限于列于表1中的那些分子(以及相当于所列那些的分子)，而且包括受静脉血栓形成影响或在静脉血栓形成期间受影响的其他核酸分子和蛋白质(如对水平、活性、定位的影响)，其包括此处所列的所有这样的分子。
VT-相关基因的实例包括抗凝血酶III、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血酶原(凝血因子II)、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和血管紧张素-I转化酶(ACE)。在某些实例中，异常在至少一种VT-相关核酸中检测到，例如在至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少10种、至少15种或更多种的VT-相关核酸分子中。在具体的实例中，某些所述的方法采用筛选不超过100种、不超过50种、不超过40种、不超过30种、不超过20种或不超过15种的VT-相关基因。
所公开的方法(MERT)提供了用于在一种测定法中筛选总的遗传静脉血栓形成易感性的快速、直接、准确和可负担的多重遗传筛选方法，其对鉴定无症状携带者具有高的预测能力。其允许在高风险处境期间可能需要预防性抗凝血疗法的受试者的早期识别，所述处境如妊娠、产后期、口服避孕药或激素替代治疗的使用、创伤、外科手术、骨折、长时间的固定术、长的空中旅程(如4小时以上的)、老年、抗磷脂类抗体、以前的血栓形成病史、脊髓增生病、恶性肿瘤或其组合。所公开的测定法可通过处于遗传风险的个体的早期鉴定而用于降低静脉血栓形成的每年发生率。通过在发展病征之前检测个体，可制定有效的预防措施，如早期的凝血预防或甚至如避免口服避孕药或激素替代治疗使用的决定。
如上所述，不同的种族人群中遗传静脉血栓形成的原因不同。尽管FV Leiden和凝血酶原G0210A多态性为白种人中静脉血栓形成最普遍的风险因素，亚洲人和非洲人患者呈现无或很罕见FV Leiden或凝血酶原G20210A多态性。所公开的方法和阵列设计成不仅能在白种人中而且能在各种种族人群中确定遗传的静脉血栓形成倾向风险。在一个具体的实例中，该方法在不同的种族人群中具有高的预测能力(如对白种人的至少98％、对亚洲人的至少84％和对非洲人的至少87％)。在其他的实例中，该方法检测VT-相关分子(如核酸序列)中的异常，其中该异常在已患有VT的至少99％的白种人中，至少85％的亚洲人中和至少88％的非洲人中发现。因此，所公开方法和阵列在各种种族人群中的适用性使其成为强有力的手段。
在具体的实例中，所公开的方法和阵列相比现用的基于血浆的血栓形成倾向筛选平板低成本，其包括基于抗原性和活性的蛋白质C和S、AT III抗原和活性，血纤维蛋白原异常的凝血酶时间和蛇毒凝血酶时间的测定，纤维蛋白原水平的定量测定和基于PCR的FV Leiden、凝血酶原20210A和MTHFR多态性的直接的突变分析。
例如，因为所公开的方法在一种测定法而不是在两种依次的检验中检测I和II型缺陷，并且检测不同的AT III II型缺陷，其由于许多用于临床实践的自动的功能性肝素辅因子测定分析器的长孵育时间而可能不幸遗漏，以及通过避免高比率的假阳性，所公开方法提供了相比AT III缺陷测定法的优点。
在其他的实例中，因为在一个实施方案中所公开的方法可在一种测定法而不是三种依次的检验中检测I和II型缺陷，并且克服了由于低的正常水平和轻微的PC缺陷之间显著重叠的存在而从无症状的PC缺陷个体区分健康受试者的困难，通过避免由于作为年龄函数的PC浓度的提高为大约每十年4％而造成的PC缺陷个体的低估，以及通过避免高比率的假阳性，所公开的方法提供了相比PC缺陷测定法的优点，包括功能性PC水平的凝固测定法，免疫PC测定法和PC活性的显色测定法。
在其他的实例中，因为在一个实施方案中所公开的方法可在一种测定法而不是四种依次的表型测定法中检测定量的和功能性的缺陷，并且克服了由血浆中存在两种PS的分子形式(游离的PS和C4b-BP/PS复合物)而变复杂的用免疫学测定法诊断PS缺陷的困难，克服了由于对照和PS缺陷个体，特别是患有III型PS缺陷的个体之间重叠值的存在而从无症状的PS缺陷个体区分健康受试者的困难，以及通过避免高比率的假阳性，所公开的方法提供了相比PS缺陷测定法的优点，包括功能性PS水平的凝固测定法，PS免疫测定法和用于总的和游离的PS测量的酶联免疫吸附测定法。
在其他的实例中，所公开的方法提供了相比用于血纤维蛋白原异常的测定法的优点，其包括最重要的凝血酶时间和蛇毒凝血酶时间的检验，因为所公开的方法避免了高比率的假阳性。
临床样本用于和所公开的方法一起使用以确定受试者VT遗传倾向性的合适的样本包括任何常规的临床样品，例如血液或血液-组分(如血清)。用于所述样品采集的技术为本领域所熟知(例如参见Schluger等.，J.Exp.Med.1761327-33，1992，用于血清样品的收集)。血清或其他血液组分可以常规方式制备。例如，约200μl血清可用于在扩增反应中使用的DNA的提取。
一旦获得样品，样品可直接使用、浓缩(例如通过离心或过滤)、纯化或其组合，并且进行扩增反应。例如，快速的DNA制备可利用市场上可买到的试剂盒进行(如InstaGene Matrix，BioRad，Hercules，CA；NucliSens分离试剂盒，Organon Teknika，Netherlands)。在一个实例中，该DNA制备方法产生接近并且可经核酸扩增的核苷酸制备物。
核酸分子的扩增从受试者获得核酸样品以获得扩增产物，包括来自AT III、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血酶原(凝血因子II)、MTHFR的序列，并且可从检测前的临床样品扩增ACE。在一个实例中，扩增DNA序列。在另一个实例中，扩增RNA序列。
可利用任何核酸扩增方法。在一个具体的、非-限制性的实例中，利用聚合酶链式反应(PCR)扩增与静脉血栓形成有关的核酸序列。其他典型的方法包括，但不限于，RT-PCR和转录-介导的扩增(TMA)。
来自受试者的所要扩增的靶序列包括AT III、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、ACE和MTHFR。在具体的实例中，所要扩增的VT-有关靶序列基本上由，或仅由AT III、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR和ACE组成。
扩增反应中可使用一对引物。可例如用可检测的放射性标记、荧光基团或生物素分子标记一个或两个引物。引物对包括上游引物(其结合对于下游引物的5′)和下游引物(其结合对于上游引物的3′)。用于扩增反应的引物对为允许参与静脉血栓形成的核酸扩增的选择性引物。可选择引物以扩增列于表1中，或由列于表1中的那些代表的核酸分子。
另外的引物对可包含在扩增反应中作为内部对照。例如，这些引物可用于扩增″管家″核酸分子，并且用于提供合适扩增的确认。在另一个实例中，可构建包含引物杂交位置的靶核酸分子并且包括在扩增反应器中。本领域技术人员将能很容易地鉴定用作内部对照引物的引物对。
用于检测核酸和蛋白质序列的阵列在具体的实例中，用于检测至少一种VT-相关基因异常的方法利用此处公开的阵列。所述阵列可包括核酸分子。在一个实例中，该阵列包括可杂交至野生型、突变体或多态VT基因序列，如AT III、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血酶原(凝血因子II)、MTHFR和ACE的核酸寡核苷酸探针。在具体的实例中，阵列包括可识别列于表1中的143VT-有关回复突变和多态性的寡核苷酸，如以偶数编号SEQ ID NO2-284和SEQ ID NO287显示的寡核苷酸探针。在其他的实例中，阵列包括可识别突变体和野生型凝血因子V、凝血酶原(凝血因子II)、AT III、PC、PS、纤维蛋白原、MTHFR和ACE序列，如SEQ ID NO1-287的寡核苷酸探针。某些所述阵列(以及此处所述的方法)可包括未列于表1中的VT-相关分子，以及其他的序列，如识别一或多个管家基因的一或多种探针。
利用特异的寡核苷酸探针，阵列可用于检测参与静脉血栓形成的所扩增序列的存在，如抗凝血酶III、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血酶原(凝血因子II)、MTHFR和ACE序列。此处称为“VT检测阵列”的阵列用于确定受试者发展静脉血栓形成的遗传易感性。在一个实例中，一组寡核苷酸探针附着于固相支持物表面用于VT-有关序列的检测，如获自受试者的那些扩增的核酸序列。另外，如果内部对照核酸序列在扩增反应中扩增(参见上面)，寡核苷酸探针可包括检测这种扩增的核酸分子的存在。
结合至阵列的寡核苷酸探针可特异性地结合扩增反应中所扩增的序列(如在高严谨度条件下)。因此，该方法使用的序列为识别VT-相关序列，如抗凝血酶III、PC、PS、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血酶原(凝血因子II)、MTHFR和ACE基因序列的寡核苷酸探针。所述序列可通过检查不同物种的序列，以及选择特异性退火至特定的野生型或突变体序列(如列于表1中的那些或由列于表1中的那些代表的)而不是其它序列的引物而确定。本领域技术人员能够鉴定其他的VT-有关寡核苷酸分子，其可附着于固相支持物表面而用于其他所扩增的VT-有关核酸序列的检测。
根据本发明的方法和装置利用这样的事实，即在合适的条件下寡核苷酸与具有互补碱基序列的核酸分子形成碱基配对的双链体。双链体的稳定性取决于许多因素，包括寡核苷酸的长度、碱基组成和在其中完成杂交的溶液的组成。碱基组成对双链体稳定性的影响可通过在特定的溶液中，例如在高浓度的叔或季铵类存在时进行杂交而降低。
双链体的热稳定性还取决于序列之间的序列相似性程度。通过在接近期望在靶序列和结合至阵列的寡核苷酸之间形成的双链体类型的预期Tm的温度进行杂交，可显著降低错配双链体形成的比率。
可选择用于阵列的每种寡核苷酸序列的长度以优化靶VT-有关核酸序列的结合。特定筛选条件下用于特定VT-有关核酸序列的最佳长度可凭经验确定。因此，可优化阵列包含的寡核苷酸序列组的每一单独元素的长度而用于筛选。在一个实例中，寡核苷酸探针从约20个至约35个核苷酸的长度或约25个至约40个核苷酸的长度。
形成阵列的寡核苷酸探针序列可直接连接至支持物，例如通过探针的5′-或3′-端。在一个实例中，寡核苷酸通过5′端结合至固相支持物。然而，本领域技术人员可确定是否寡核苷酸的3′端或5′端的使用适合于键合至固相支持物。通常，3′端和5′端区域中寡核苷酸探针的内部互补性决定结合至支持物。或者，寡核苷酸探针可通过非-VT-有关序列，如用作固相支持物间隔物或接头的寡核苷酸或其他分子而附着于支持物。
在另一个实例中，阵列包括蛋白质序列，其包括至少一种VT-相关蛋白质如一种由列于表1的核酸分子(或包括一种所列序列或其片段的基因、cDNA或其他多核苷酸分子)编码的，或所述蛋白质的片段，或所述蛋白质或蛋白质片段的特异性抗体。所述阵列还可以包含列于表1中的核酸(或相应分子)的任何特定亚型。形成阵列的蛋白质或抗体可直接连接至支持物。或者，蛋白质或抗体可通过固相支持物的间隔物或接头附着于支持物。
可利用例如VT蛋白质-特异结合试剂检测VT-相关蛋白质的异常，其在有些情况下经可检测地标记。因此某些实例中，检测异常包括将来自受试者的样品与VT蛋白质-特异结合试剂接触；以及检测结合试剂是否由样品结合并且由此测定样品中存在的VT-相关蛋白质的水平，其中相对来自不倾向于发展VT的受试者的类似样品中测定的VT-相关蛋白质水平，或来自不具有发展VT的倾向的受试者的类似样品中标准的VT-相关蛋白质水平，样品中VT-相关蛋白质水平的差异为该VT-相关分子的异常。
在具体的实例中，微阵列材料由玻璃(二氧化硅)形成。用于固相支持物的合适的二氧化硅类型包括，但不限于铝硅酸盐、硼硅酸盐、二氧化硅、碱石灰、锌二氧化钛和熔凝硅石(例如参见Schena，Micraoarray Analysis.John Wiley & Sons，Inc，Hoboken，New Jersey，2003)。核酸附着至玻璃表面可通过本领域已知的方法实现，例如通过形成自有机聚合物的表面处理。具体的实例包括，但不限于聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚异丁烯、聚丁二烯、聚异戊二烯、聚乙烯吡咯烷、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚氟乙烯-丙烯、聚乙烯乙烯醇、聚甲基戊烯、聚氯三氟乙烯、聚砜、羟基化双轴向聚丙烯、活泼的双轴向聚丙烯、硫醇化双轴向聚丙烯、乙烯丙烯酸、乙烯甲基丙烯酸和其共聚物的混合物(参见美国专利号No.5,985,567，此处通过引用而引入)、提供化学活性胺或醛基的有机硅烷化合物、微阵列的环氧或聚赖氨酸处理。固相支持物表面的另一个实例为聚丙烯。
通常，可用于形成固相支持物表面的材料合适的特征包括经受表面活化后，使得在活化时支持物表面能共价附着生物分子如寡核苷酸；生物分子“原位”合成的顺应能力；为化学惰性的，使得在支持物上未由寡核苷酸占据的区域不会经受非特异性的结合，或当非特异性结合存在时，所述材料可很容易从该表面除去而不除去寡核苷酸。
在一个实例中，表面处理为含有胺的硅烷衍生物。核酸附着至胺表面通过DNA主链上带负电荷的磷酸基和带正电荷的氨基间的相互作用产生(Schena，Micraoarray Analysis.John Wiley & Sons，Inc，Hoboken，New Jersey，2003，此处通过引用引入)。在另一个实例中，反应性的醛基用作表面处理。附着至醛表面通过5′-胺基或氨基接头添加至目的DNA而实现。当胺接头上的非键电子对用作攻击醛基阳性的碳原子(Id.)的亲核试剂时产生结合。
根据本发明可采用多种阵列形式。一个实例包括寡核苷酸带的线性阵列，本领域中泛指量尺(dipstick)。另一种合适的形式包括独立单元的平面模式(如64乘64阵列的4096正方形)。如本领域技术人员所理解的，包括但不限于槽(矩形的)和环状阵列的其他阵列形式同样适用(参见美国专利号No.5,981,185，此处通过引用引入)。在一个实例中，阵列在聚合物介质上形成，其为纤维、薄膜或胶片。有机聚合物介质的实例为具有相当于约1mil.(0.001英寸)至约20mil.厚度的聚丙烯片层，虽然薄膜的该厚度不是临界的并且可在相当宽的范围内变化。此时特别公开用于阵列制备的为双轴向聚丙烯(BOPP)薄膜；除了其耐用性外，BOPP薄膜呈现低本底的荧光。在具体的实例中，阵列为固相的、基于等位基因特异的寡核苷酸(ASO)的核酸阵列。
本发明的阵列形式可包括于各种不同类型的形式中。“形式”包括固相支持物可附着的任何形式，如微量滴定板、试管、无机片层、量尺等等。例如，当固相支持物为聚丙烯纤维时，一或多种聚丙烯纤维可附着至塑料量尺类型的装置；聚丙烯薄膜可附着至载玻片。具体的形式本身是不重要的。所必需的为固相支持物可附着至此而不影响固相支持物或其上吸收的任何生物聚合物的功能性能，以及形式(如量尺或载玻片)对装置导入其中的任何材料(如临床样品和杂交溶液)是稳定的。
本发明的阵列可通过各种方法制备。在一个实例中，寡核苷酸或蛋白质序列分别合成并且随后附着于固相支持物(参见美国专利号No.6,013,789，此处通过引用引入)。在另一个实例中，序列直接合成在支持物上以提供所想要的阵列(参见美国专利号No.5,554,501，此处通过引用引入)。用于将寡核苷酸和蛋白质共价偶联至固相支持物以及用于将寡核苷酸或蛋白质直接合成在支持物上的合适的方法为本领域的工作人员所知；合适方法的概要可在Matson等.，Anal.Biochem.217306-10，1994中找到。在一个实例中，寡核苷酸利用常规的用于将寡核苷酸制备于固相支持物上的化学技术合成在支持物上(如参见PCT申请WO85/01051和WO89/10977，或美国专利5,554,501，此处通过引用引入)。
合适的阵列可利用自动化方法通过以预定模式设定四种碱基的前体而在阵列的单元中合成寡核苷酸而产生。简要地，采用多-通道自动的化学输送系统在穿过基底的平行排(以编号对应输送系统中的通道编号)产生寡核苷酸探针群。随着在第一个方向寡核苷酸合成的完成，基底可随后旋转90°以允许在第二(2°)组的排内进行合成，其现在垂直于第一组。该方法产生多通道的阵列，其交叉产生多个独立单元。
在具体的实例中，阵列上的寡核苷酸探针包括一或多种标记物，其允许寡核苷酸探针靶序列杂交复合物的检测。
核酸和蛋白质的检测获自受试者的核酸和蛋白质可包含与静脉血栓形成有关的一或多个基因中(如列于表1中的那些)一或多处插入、缺失、取代或其组合。可检测所述突变或多态性(或两者)以确定受试者是否具有发展静脉血栓形成的遗传素因。可利用检测核酸分子或蛋白质的任何方法，如物理的或功能性的测定法。
用于标记核酸分子和蛋白质，而使得其可检测的方法是众所周知的。所述标记物的实例包括非-放射性标记和放射性标记。非-放射性标记包括，但不限于酶、化学发光化合物、荧光化合物(如FITC、Cy3和Cy5)、金属络合物、半抗原、酶、比色试剂、染料或其组合。放射性标记包括，但不限于125I和35S。例如，本领域已知的放射性和荧光标记方法，以及其他的方法适合与本发明一起使用。在一个实例中，标记用于扩增受试者核酸的引物(如用生物素、放射性标记或荧光基团)。在另一个实例中，扩增的核酸样品为末端-标记的来形成经标记的扩增材料。例如，扩增的核酸分子可通过将标记的核苷酸包含入扩增反应中而标记。在具体的实例中，标记获自受试者的蛋白质并且随后例如通过将其施加到阵列而进行分析。
与静脉血栓形成有关的扩增的核酸分子在合适的杂交条件下施加至VT检测阵列以形成杂交复合物。在具体的实例中，扩增的核酸分子含有标记物。在一个实例中，预处理的有机化合物溶液，即包含有机化合物或热水的溶液可在杂交之前施加(参见美国专利号5,985,567，此处通过引用引入)。
用于给定的阵列和靶材料组合的杂交条件可以接近所期望双链体Tm的经验方式常规优化，由此最大化该方法的区别能力。结合存在于其中的阵列，如单元中位置的识别允许存在于所扩增材料中的与静脉血栓形成有关序列的快速和准确的鉴定(见下文)。
选择杂交条件以允许匹配和错配寡核苷酸间的区别。可选择杂交条件对应于已知适合用于杂交筛选的标准方法中的条件并且随后优化而与本发明的阵列一起使用。例如，将对该阵列用于其他靶标的用途而调整适于一种类型靶标杂交的条件。尤其，控制温度以基本上消除除了完全互补的VT-有关突变体序列的野生型外序列间双链体的形成。可采用各种已知的杂交溶剂，该选择取决于对本领域技术人员已知的考虑(参见美国专利5,981,185，此处通过引用引入)。
一旦所扩增的与静脉血栓形成有关的核酸分子与VT检测阵列中存在的寡核苷酸杂交，可例如通过检测复合物而分析杂交复合物的存在。
之前已描述了在寡核苷酸探针阵列中检测杂交复合物(参见美国专利5,985,567，此处通过引用引入)。在一个实例中，检测包括检测寡核苷酸、所扩增的序列或两者上存在的一或多种标记物。在具体的实例中，显影包括应用缓冲液。在一个实施方案中，缓冲液为柠檬酸钠盐、磷酸钠盐、氯化四甲铵、乙二胺四乙酸中的柠檬酸钠盐、十二烷基磺酸钠中的柠檬酸钠盐、乙二胺四乙酸中的磷酸钠盐、十二烷基磺酸钠中的磷酸钠盐、乙二胺四乙酸中的氯化四甲铵、十二烷基磺酸钠中的氯化四甲铵或其组合。然而，也可利用其他合适的缓冲溶液。
检测可进一步包括用偶联溶液处理杂交的复合物以影响杂交的复合物与检测标记物的结合或偶联，以及用检测试剂处理该偶联的、杂交的复合物。在一个实例中，偶联溶液包括链亲和素碱性磷酸酶、亲和素碱性磷酸酶或辣根过氧化酶。偶联溶液特定的、非-限制性的实例包括链亲和素碱性磷酸酶、亲和素碱性磷酸酶或辣根过氧化酶。偶联的、杂交的复合物可用检测试剂处理。在一个实例中，检测试剂包括酶标记的荧光试剂或测热试剂。在一个特定的非-限制性的实例中，检测试剂为来自Molecular Probes，Inc.(Eugene，OR)的酶-标记的荧光试剂(ELF)。杂交的复合物可随后置于检测装置，如紫外线(UV)透照器(由UVP，Inc.of Upland，CA制造)上。显示信号并且可用记录装置记录提高的信号强度，如电荷耦合装置(CCD)照相机(由Photometrics，Inc.of Tucson，AZ制造)。在具体的实例中，当利用放射性标记时不进行这些步骤。
在具体的实例中，该方法进一步包括定量，例如通过确定杂交的量。
试剂盒本发明提供可用于确定受试者，如另外健康的人受试者是否具有静脉血栓形成遗传倾向性。所述试剂盒允许确定受试者是否在与静脉血栓形成有关的序列中(包括列于表1的那些)具有一或多处遗传突变或多态性。
所公开的试剂盒包括结合分子，如选择性杂交至VT-相关分子(如突变体或野生型核酸分子)的寡核苷酸探针，其为试剂盒的靶标。在一个实例中，试剂盒包括以SEQ NO1-287或其亚组，如偶数编号的SEQ ID NO2-284和SEQ ID NO287或奇数编号的SEQ ID NO1-285和SEQ ID NO286所示的寡核苷酸探针。在另一个实例中，试剂盒包括以SEQ ID NO1287所示的至少20种探针，如SEQ ID NO1-287中所示的至少50种、至少75种、至少100种、至少125种、至少150种、至少175种、至少200种、至少225种或至少250种探针。当然也可利用以SEQ ID NO1-287所示的全长探针的片段，如包括任何SEQ ID NO1-287的至少15个连续核苷酸的片段，如任何SEQ ID NO1-287的至少16个连续核苷酸、至少17个连续核苷酸、至少18个连续核苷酸、至少19个连续核苷酸、如至少20个连续核苷酸、如至少21个连续核苷酸、如至少22个连续核苷酸、如至少23个连续核苷酸或如至少24个连续核苷酸。
在具体的实例中，试剂盒包括能结合野生型VT-相关蛋白质或突变的或多态的蛋白质的抗体。所述抗体具有区分野生型和突变体或多态的VT-相关蛋白质的能力。
试剂盒可进一步包括一或多种缓冲溶液、用于显影目的信号的偶联溶液或用于检测目的信号的检测试剂，每种在分开的包装，如容器中。在另一个实例中，试剂盒包括用作阳性对照的和VT检测阵列杂交的多个VT-相关靶核酸序列。靶核酸序列可包括寡核苷酸如DNA、RNA和肽-核酸，或可包括PCR片段。
静脉血栓形成的预防治疗本发明还提供了避免或降低确定为遗传倾向于发展静脉血栓形成的受试者中静脉血栓形成发病率的方法。例如，如果利用上述的筛选方法检测到受试者中至少一种VT-相关分子的突变或多态性，则选择治疗以避免或降低静脉血栓形成的发病率或延缓静脉血栓形成的发病。受试者随后可根据该选择而治疗，例如通过一或多种抗凝血试剂的给药。在一些实例中，根据一或多种VT-相关分子受试者的分布分析，所选择的治疗对于该受试者是特异性的或经调整的。
本发明进一步通过下列非-限制性的实施例举例说明。
实施例1
与静脉血栓形成有关的突变和多态性表1描述了用于设计阵列的VT-相关核酸和蛋白质序列，该阵列允许筛选八个不同基因中目前所有已知的143种静脉血栓形成相关的回复突变和多态性。然而，本领域技术人员将理解还可利用目前未鉴定的另外的回复VT-相关突变和多态性。针对突变/多态性的每个潜在位点，设计两种寡核苷酸探针(参见实施例3)。
表1与静脉血栓形成有关的突变和多态性。


*虽然本领域技术人员可确定其他生物体对应的核苷酸或氨基酸，核苷酸或氨基酸编号指人序列。
实施例2静脉血栓形成预测的统计分析该实施例表明通过在鉴定处于发展VT很高风险的个体中同时评估143种等位基因，MERT提供了高数值的临床有效性，即使每种等位基因对风险的贡献较小并且不足以引起VT。
为了在统计学上证明该公开的方法可预测健康受试者发展静脉血栓形成的概率，利用下列方法。如下所述的结果表明静脉血栓形成的疾病预测通过同时考虑多个素因性的遗传因素而得到很大提高。为了证明多发性静脉血栓形成(VT)相关易感性基因缺陷的并行筛选如何提高发展静脉血栓形成的预测，通过逻辑回归计算每种VT相关易感性基因检验的概率比并且随后VT相关易感性基因检验组的组合概率比(LR)仅作为假定每个检验独立的个体检验的概率比(LR)乘积而计算。
为了计算，选择在对照受试者和未经过选择的VT患者中均具有确定的发病率的八个VT相关基因中的10个VT相关易感性等位基因。
利用在之前报道的与VT相关遗传易感性有关的不同种族人群中进行的病例-对照研究的数据，相关等位基因频率源自AT III、蛋白质C和蛋白质S缺陷、纤维蛋白原Thr312Ala、FV Leiden(G1691A)、FV G1628A、FV A4070G(R2等位基因)、凝血酶原G20210A、MTHFRC677G和ACE DD变体(Seligsohn and Lubetsky，N.Engl.J.Med.3441222-31，2001；Heijboer等.N.Engl.J.Med.3231512-6，1990；Pabinger等.，Blood.Coagul.Fibrinolysis 3547-53，1992；Melissari等.，Blood.Coagul.Fibrinolysis 3749-58，1992；Bombeli等.Am.J.Hematol.70126-32，2002；Salomon等.，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.19511-8，1999；Harper等.，Br.J.Haemotol.77360-364，1991；Tait等.Br.J.Haematol.87106-12，1994；Arruda等.，Thromb.Haemost.77818-21，1997；Junker等.，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.192568-72，1999；Heller等.，Circulation.1081362-7，2003；Jerrard-Dunne等.Stroke.341821-7，2003；Patel等.Thromb.Haemost.90835-8，2003；Shen等.Thromb.Res.99447-52，2000；Sakata等.J.Tlaromb.Hemost.2528-30，2004；Lee等.Ann.Aead.Med.Singapore.31761-4，2002；Liu等.Thromb.Haemost.71416-9，1994；Suehisa等.Blood.Coagul.Fibrinolysis.1295-9，2001；Chen等.Ann.Hematol.82114-7，2003；Ho等.Am.J.Hematol.6374-8，2000；Miletich等.，N.Engl.J.Med.317991-6，1987；Horellou等.，BMJ 289；1285-1287，1984；Gladson等.，Thromb.Haemost.5918-22，1988；Tait等.，Thromb.Haemost.7387-93，1995；Dykes等.，Br.J.Haematol.113636-41；2001；Carter等.，Blood.961177-9，2000；Liu Y等.，J.Med.Genet.3831.5，2001；De Stefano等.Semin.Thromb.Hemost.24367-79，1998；Benson等.Thromb.Haemost.861188-92，2001；Ehrenforth等.Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.19276-80，1999；Leroyer等.Thromb.Haemost.8049-51，1998；Brown等.Br.J.Haematol.98907-9，1997；Arruda等.Thromb.Haemost.781430-3，1997；de Moerloose等.，Thromb.Haemost.80239-41，1998；Dowling等.J.Thromb.Hemost.180-7，2003；Rees等.Br.J.Haematol.105564-6，1999；Helley等.Hum.Genet.100245-8，1997；Le等.Clin.Genet.57296-303，2000；Lu等.，Thromb.Res 1077-12，2002；Dilley等.，Am.J.Epidemiol.14730-5，1998；Faisel等.，Eur.J.Hum.Genet.12187-91，2004；Dogulu等.，Thromb.Res.111389-95，2003；Hiyoshi等.Thromb.Haemost.80705-6，1998；Watanabe等.Thromb.Haemost.861594-5，2001；Alhenc-Gelas等.Thromb.Haemost.81193-97，1999；Poort等.Blood 883698-703，1996；Hillarp等.Thromb.Haemost.78990-2，1997；Ferraresi等.Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.172418-22，1997；Corral等.Br.J.Haematol.99304-307，1997；Hainaut等.Acta Clin Belg 53344-348，1998；Cumming等.Br.J.Haematol.98353-355，1997；Souto等.Thromb.Haemost.80366-9，1998；Eichinger等.Thromb.Haemost.8114-7，1999；Tosetto等.Thromb.Haemost.821395-98，1999；Ridker等.Circulation.99999-1004，1999；Margaglione等.，Thromb.Haemost.79907-11，1998；Dilley等.，J.Lab.Clin.Med 132452-5，1998；Howard等.Blood 911092，1998；Zheng等.，Br.J.Haematol.109870-4，2000；Lin等.，Thromb.Res.9789-94，2000；Fatini等.，Eur.J.Clin.Invest.33642-7，2003；and Hooper等.，Am.J.Hemato.701-8，2002)(表2)。
表2对照受试者和未经过选择的VT患者中遗传血栓形成倾向的频率

I白种人受试者II亚洲人受试者III来自非洲、北美洲、亚洲、澳大拉西亚、拉丁美洲和中东以及因纽特人受试者的非-欧洲受试者。
IV非洲受试者V来自北美洲、拉丁美洲、亚洲和太平洋岛屿的非-欧洲受试者。
VI美裔非洲人受试者通过逻辑回归进行LR的计算。通过将从之前报道的不同种族人群中有关VT遗传易感性病例对照研究取回的数据处理为风险机会比率的有效评估，每一等位基因的LR的阳性检验通过如之前所述获得的结果取幂而计算(Albert，Clin.Chem..281113-9，1982；McCullagh和Nelder，Chapman and Hall，London，1989；Yang等.，Am.J.Hum.Genet.，72636-49，2003)。
测定具有每一遗传检验(亦称每一遗传检验的阳性预测值)等位基因-阳性检验结果的个体的静脉血栓形成的后验概率(发展静脉血栓形成的概率)。
每一静脉血栓形成相关易感性基因检验的所计算的概率比和阳性预测值在表3中表示。
表3.对于健康受试者中发展VT的用MERT的单个易感性基因和多个遗传筛选的概率比和阳性预测值

自种人群；亚洲人群；*非洲人群随后，假定八个不同基因中每一种遗传缺陷的作用是独立的并且所有的相互作用是单纯相乘的，则十个VT相关遗传易感性检验组的LR作为个体检验结果概率比的乘积而计算。
如表3中所示，尽管每种遗传检验提供了关于发展静脉血栓形成概率的有限的预测信息(每一单独检验的疾病的后验概率范围为从0.12％至2.5％)，当利用本发明公开的方法对白种人群体未经过选择的患者评估时，存在的静脉血栓形成后验概率提高至99.7％，亚洲人提高至85.1％，以及非洲人提高至88.7％，提高了＞30倍。
实施例3用于检测静脉血栓形成易感性的阵列对突变/多态性的每个潜在位点(表1)，设计两种寡核苷酸探针(SEQ ID NO1-287)。第一种与野生型序列互补(SEQ ID NO1-285的奇数编号和SEQ ID NO286)并且第二种与突变序列互补(SEQ IDNO2-284的偶数编号和SEQ ID NO287)。例如，SEQ ID NO1与野生型AT III序列互补，并且SEQ ID NO2与突变体AT III序列互补，其可用于检测核苷酸2770位“T”插入的存在。所公开的寡核苷酸探针可进一步包括一或多种可检测的标记物，以允许探针和靶序列间杂交信号的检测。
杂交信号“损失”和“获得”的编译将揭示个体关于143种已知的VT-相关回复缺陷的遗传状态。
实施例4基于核酸的分析此处提供的VT-相关核酸分子可用于由于VT-相关核酸分子相比野生型核酸分子的多态性/突变而造成的静脉血栓形成倾向的遗传检验方法中。对于所述方法，分析受试者生物样品在VT-相关核酸分子(如列于表1中的那些)中的多态性或突变(或两者)。合适的生物样品包括含有获自受试者细胞的基因组DNA或RNA(包括mRNA)的样品，如存在于外周血、尿、唾液、活检组织、外科样本、羊膜穿刺样品和尸检材料中的那些。
一或多种VT-相关核酸分子(如列于表1中的那些)中具有多态性/突变的生物样品的检测可通过下列方法完成，如利用等位基因特异的寡核苷酸的杂交(ASO)(Wallace等.，CSHL Syrup.Quant.Biol.51257-61，1986)、直接的DNA测序(Church和Gilbert，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 811991-1995，1988)、限制性内切酶的利用(Flavell等.，Cell 1525，1978；Geever等.，1981)、在含有变性试剂的凝胶中电泳迁移率基础上的差别(Myers和Maniatis，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51275-84，1986)、RNase保护(Myers等.，Science 2301242，1985)、化学裂解(Cotton等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 854397-401，1985)和连接酶-介导的检测方法(Landegren等.，Science 2411077，1988)。
野生型或突变VT-相关序列的特异性寡核苷酸可利用市售获得的的机器化学合成。可随后标记这些寡核苷酸，例如用放射性同位素(如32p)或用非放射性的标记物如生物素(Ward和Langer等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 786633-6657，1981)或荧光基团，并且杂交至通过点-印迹或电泳后从凝胶转移而固定在薄膜或其他固相支持物上的个体DNA样品。这些特异的序列例如通过放射自显影法或荧光(Landegren等.，Science 242229-237，1989)或比色反应(Gebeyehu等.，NucleicAcids Res.154513-4534，1987)显影。利用野生型等位基因特异的ASO，无杂交将表明基因特定区域中的突变或多态性。相比之下，如果突变体等位基因特异的ASO杂交至临床样品则将表明由ASO限定的区域中突变或多态性的存在。
实施例5基于蛋白质的分析该实施例描述了可用于检测VT-相关蛋白量的缺陷，或检测氨基酸序列本身的改变的方法。VT相关蛋白质的序列可用于静脉血栓形成倾向遗传检验的方法中，由于VT-相关蛋白质相比野生型蛋白质的多态性或突变(或两者)造成。对于所述方法，测定受试者生物样品在VT-相关蛋白质中的多态性或突变(如列于表1中的那些)。合适的生物样品包括含有获自受试者细胞的蛋白质的样品，如存在于外周血、尿、唾液、活检组织、外科样本、羊膜穿刺样品和尸检材料中的那些。
受试者中一或多种VT-相关蛋白质的量的降低表明受试者具有提高的发展VT的易感性。同样，相比野生型蛋白质，VT-相关蛋白质中一或多处突变或多态性的存在表明受试者具有提高的发展VT的易感性。
相比正常受试者中(如不倾向于发展VT的受试者)所表示的，降低的VT-相关蛋白质水平的测定为VT-相关核酸突变或多态性的存在通过以上所列方法直接测定的可选择的或辅助的方法。特定VT-相关蛋白质的特异性抗体的可获得性将促进VT-相关蛋白质通过本领域所熟知的大量免疫测定方法中的一种检测和细胞定量，如Harlow和Lane(Antibodies，A Laboratory Manual，CSHL，New York，1988)中介绍的。构建所述抗体的方法为本领域已知的。
相比野生型VT-相关蛋白质，VT-相关蛋白质中一或多处突变或多态性存在的测定为VT-相关核酸突变或多态性的存在通过以上所列方法直接测定的另一种可选择的或辅助的方法。可利用本领域已知的方法制备能区分突变体或多态的蛋白质和野生型蛋白质的抗体。
任何标准的免疫测定法形式(如ELISA、蛋白质印迹或RIA测定法)可用于测定VT-相关多肽或蛋白质的水平，以及检测VT-相关蛋白质中的突变或多态性。相比野生型(正常的)VT-相关蛋白质的水平，VT-相关多肽水平的降低为发展VT倾向的指示。同样，一或多处突变体或多态的VT-相关蛋白质的存在为发展VT倾向的指示。免疫组织化学技术也可用于VT-相关多肽或蛋白质的检测和定量。例如，可从受试者获得组织样品，并且利用合适的VT-相关蛋白质特异结合试剂以及任何标准的检测系统(如包括偶联至辣根过氧化酶的二抗的那些)对野生型或多态的或突变体VT-相关蛋白质的存在而染色切片。关于所述技术的常规指导可参见Bancroft和Stevens(Theory and Practice ofHistological Techniques，Churchill Livingstone，1982)以及Ausubel等.(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NewYork，1998)。
为了定量VT-相关蛋白质，可利用包括细胞蛋白质的受试者的生物样品。VT相关蛋白质的定量可通过免疫测定法以及将所述量与来自不具有发展VT的遗传倾向的受试者细胞中测定的蛋白质水平作比较而实现。相比正常人细胞中测定的相同VT-相关蛋白质的量，受试者细胞中一或多种VT-相关蛋白质的量的显著降低通常为约30％或更大的差异。一或多种VT-相关蛋白质的显著低表达可以为发展VT的遗传倾向性的指示。
实施例6试剂盒提供试剂盒以确定受试者是否具有VT-相关核酸序列的一或多种多态性或突变(如含有VT检测阵列的试剂盒)。还提供包含检测阵列上的寡核苷酸和来自受试者的所扩增的VT相关核酸间形成的杂交复合物所需试剂的试剂盒。这些试剂盒每种可含有说明书，例如提供相比已确定值(如实验测定的)的标定曲线或图表的说明书。
在一个实例中，试剂盒包含能扩增VT-相关核酸分子，如列于表1中的那些分子的引物。在具体的实例中，引物悬浮在水溶液中或作为冷冻干燥的或冻干的粉剂而提供。其中提供引物的容器可以是任何常规容器，其能保持所提供的形式，例如，微量管、安瓿瓶或瓶子。在一些应用中，在独立的、通常一次性的管或对等的容器中以预定的单次用量提供引物对。
试剂盒中提供的每种引物的量可以是任何量，例如取决于产品针对的市场。例如，如果试剂盒适于研究或临床使用，所提供的每种寡核苷酸引物的量可能为足以启动几个体外扩增反应的量。本领域普通技术人员已知适于在单个扩增反应中使用的寡核苷酸引物量。常规指导可例如在Innis等.(PCR Protocols，A Guide to Methods andApplications，Academic Press，Inc.，San Diego，CA，1990)，Sambrook等.(In Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York，1989)和Ausubel等.(In Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York，1998)中找到。
在具体的实例中，试剂盒包含具有识别野生型、突变体或多态的VT-相关序列(如列于表1中的那些)的寡核苷酸的阵列。该阵列可包含例如用作阴性或阳性对照的其他寡核苷酸。识别野生型和突变体序列的寡核苷酸可在相同的阵列上或不同的阵列上。特定的阵列在实施例3中公开。例如，试剂盒可包含SEQ ID NO1-287中所示的寡核苷酸，或其亚型，如SEQ ID NO1-287中所示寡核苷酸的至少10种，例如SEQ ID NO 1-287中所示寡核苷酸的至少20种、至少50种、至少100种、至少143种或甚至至少250种。在特定的实例中，阵列包含奇数编号的SEQ ID NO1-285(即SEQ ID NO1、3、5、7等等)以及在一些实例中还包含SEQ ID NO286，或偶数编号的SEQ ID NO2-284(即SEQ ID NO2、4、6、8等等)以及在一些实例中还包含SEQ ID NO287。然而，两种所述阵列可包含在单个试剂盒中。
在一些实例中，试剂盒进一步包含进行杂交和检测反应所需的试剂，例如包括合适的缓冲液。还可包含书面说明书。
还提供用于检测VT-相关蛋白质表达的试剂盒，例如由列于表1中的核酸分子所编码蛋白质的低表达。所述试剂盒包含一或多种野生型或突变体AT III、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V(FV)、凝血酶原(凝血因子II)、MTHFR和ACE蛋白(全长的、片段或融合蛋白)或特异结合试剂(如多克隆或单克隆抗体或抗体片段)，并且可包含至少一种对照。VT-相关蛋白质特异结合试剂和对照可包含在单独的容器中。该试剂盒还可包含用于检测VT-相关蛋白质试剂复合物的工具，例如该试剂经可检测地标记。如果可检测的试剂未标记，其可由二抗或蛋白A检测，例如其中的任何一个还可在一或多种分开的容器中在一些试剂盒中提供。所述技术是众所周知的。
一些试剂盒中的另外组分包括进行测定法的说明书。说明书允许检验者确定VT-相关的表达水平相比对照样品是否降低了。反应容器和辅助试剂如生色团、缓冲液、酶等等也可包含在试剂盒中。
鉴于本发明的原理可应用许多可能的实施方案，应该认识到举例说明的实施方案仅是本发明优选的实例而不应该视为对本发明范围的限制。相反，本发明范围应由下列权利要求限定。我们因此要求本发明所有落入这些权利要求的范围和精神内的权利。
序列表<110>美国政府健康及人类服务部(The Government of the United States of Americaas Represent by the Secretary of the Department of Health and Human Services)<120>发展用于血栓形成倾向识别的方法(MERT)(Method evolved for recognition of thrombophilia(MERT))<130>SCT063374-66<150>60/537,463<151>2004-01-15<160>287<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>25<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
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<223>oligonucleotide probe<400>287gcctatacag tcacttttat gtggt2权利要求
1.检测受试者静脉血栓形成(VT)遗传倾向性的方法，包括确定受试者在至少八个VT-相关分子中是否具有一或多处突变或多态性，其中该至少八个静脉血栓形成分子包括抗凝血酶III(AT III)、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V(FV)、凝血酶原(凝血因子II)、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和血管紧张素1-转化酶(ACE)，并且其中一或多处突变或多态性的存在表明受试者具有静脉血栓形成的遗传倾向性。
2.权利要求1的方法，其中一或多处突变或多态性包括列于表1中的一或多处突变或多态性。
3.权利要求1的方法，其中该方法包括确定受试者在列于表1中的突变或多态性的至少10种中是否具有一或多处突变或多态性。
4.权利要求1的方法，其中该方法包括确定受试者在列于表1中的突变或多态性的至少50种中是否具有一或多处突变或多态性。
5.权利要求1的方法，其中该方法包括确定受试者在列于表1中的突变或多态性的至少143种中是否具有一或多处突变或多态性。
6.权利要求1的方法，其中该方法包括确定受试者在列于表1中的突变或多态性的不超过10种中是否具有一或多处突变或多态性。
7.权利要求2的方法，其中一或多处突变或多态性包括AT III缺陷、PC缺陷、PS缺陷、纤维蛋白原Thr312Ala多态性、FV Leiden(G1691A)多态性、FV G1628多态性、FV A4070G多态性、凝血酶原G20210A多态性、MTHFR C677T和ACE内含子16，288bp插入/缺失多态性。
8.权利要求1的方法，其中该方法提供了白种人中至少98％、亚洲人中至少85％以及非洲人中至少87％发展VT的可能性。
9.权利要求1的方法，其中该方法包括确定受试者是否在至少八种VT-相关分子中具有一或多处突变或多态性。
10.权利要求1的方法，其中该至少八种VT-相关分子包括核酸分子。
11.权利要求10的方法，其中该核酸分子扩增自受试者，由此产生扩增产物，并且其中该扩增产物与检测一或多处突变或多态性的寡核苷酸探针杂交。
12.权利要求11的方法，其中杂交寡核苷酸包括将扩增产物与寡核苷酸探针温育足以允许扩增产物和寡核苷酸探针之间杂交的时间，由此形成扩增产物寡核苷酸探针复合物；以及分析扩增产物寡核苷酸探针复合物确定扩增产物是否在VT-相关核酸中包括一或多处突变或多态性，其中一或多处突变或多态性的存在表明受试者具有VT遗传倾向性。
13.权利要求12的方法，其中分析扩增产物寡核苷酸探针复合物包括确定核酸杂交物的量，以及其中相比杂交至相应的野生型序列的量，杂交至一或多处突变序列的量更大表明受试者具有VT遗传倾向性。
14.权利要求12的方法，其中分析扩增产物寡核苷酸探针复合物包括检测复合物以及对其进行定量。
15.权利要求11的方法，其中寡核苷酸探针存在于阵列基底上。
16.权利要求15的方法，其中所述阵列进一步包括与野生型VT-相关核酸分子互补的寡核苷酸探针。
17.权利要求16的方法，其中野生型VT-相关核酸分子包括与野生型AT III、野生型蛋白质C、野生型蛋白质S、野生型纤维蛋白原、野生型凝血因子V、野生型凝血因子II、野生型MTHFR和野生型ACE核酸序列互补的寡核苷酸探针。
18.权利要求1的方法，其中所述至少八种VT-相关分子由来自AT III、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR和ACE的序列组成。
19.权利要求1的方法，其中该受试者在可能处于发展静脉血栓形成风险的组中。
20.权利要求19的方法，其中该受试者已怀孕、在产后期、正使用口服避孕药或激素替代治疗、已有先前的血栓形成病史、已有或将经受长时间的固定术、患有骨髓增生性疾病、患有恶性肿瘤、已有或将进行手术、具有骨折、在老年期、具有抗磷脂类抗体或其组合。
21.权利要求11的方法，其中获自受试者的核酸分子获自血清。
22.检测受试者VT遗传倾向性的方法，包括将扩增产物施加至阵列，其中阵列包括与突变的AT III、突变的蛋白质C、突变的蛋白质S、突变的纤维蛋白原、突变的凝血因子V、突变的凝血因子II、突变的MTHFR和突变的ACE序列互补的寡核苷酸探针，并且其中扩增产物包括获自受试者的AT III、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR和ACE的核酸序列；将扩增产物与阵列温育足以允许扩增产物和寡核苷酸探针之间杂交的时间，由此形成扩增产物寡核苷酸探针复合物；以及分析该扩增产物寡核苷酸探针复合物以确定扩增产物是否在ATIII、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR或ACE序列中包括一或多处突变或多态性，其中一或多处突变或多态性的存在表明受试者具有VT遗传倾向性。
23.选择静脉血栓形成(VT)治疗的方法，包括利用权利要求1的方法检测受试者的至少一种VT-相关分子中的突变或多态性；以及如果鉴定到所述突变或多态性，则选择治疗以避免或缓解VT，或延缓VT的发病。
24.权利要求23的方法，进一步包括给受试者施用所选择的治疗。
25.权利要求24的方法，其中所选择的治疗包括用抗凝血剂治疗受试者。
26.阵列，包括与野生型基因序列、突变基因序列或两者互补的寡核苷酸探针，其中基因序列包括来自AT III、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR和ACE基因的编码或非编码序列。
27.权利要求26的阵列，其中突变基因序列包括列于表1中的十或更多处突变或多态性。
28.权利要求27的阵列，其中突变基因序列基本上由列于表1中的突变或多态性组成。
29.检测受试者静脉血栓形成(VT)遗传倾向性的方法，包括将扩增产物施加至权利要求13的阵列，其中扩增产物包括获自受试者的扩增的核酸，其中核酸包括来自AT III、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR和ACE的编码或非编码序列，将扩增产物与阵列温育足以允许扩增产物和寡核苷酸探针之间杂交的时间，由此形成扩增产物寡核苷酸探针复合物；以及分析该扩增产物寡核苷酸探针复合物以确定扩增产物是否在ATIII、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR或ACE基因中包括一或多处突变或多态性，其中一或多处突变或多态性的存在表明受试者具有VT遗传倾向性。
30.用于检测受试者静脉血栓形成(VT)遗传倾向性的试剂盒，包括固相核酸阵列，包括以预定的模式化学连接至固体聚合支持物表面的多个寡核苷酸探针，其中该寡核苷酸探针能在严谨条件下与在ATIII、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR和ACE基因中具有VT-相关突变或多态性的一或多种核酸分子杂交。
31.权利要求30的试剂盒，其中该寡核苷酸包括SEQ ID NO1-287。
32.权利要求30的试剂盒，进一步包括分开包装、用于扩增获自受试者的核酸分子以获得扩增产物的引物，其中扩增产物包括来自ATIII、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血因子II、MTHFR和ACE基因的序列。
33.权利要求30的试剂盒，进一步包括分开包装的扩增酶。
34.权利要求30的试剂盒，进一步包括分开包装的缓冲溶液。
35.权利要求30的试剂盒，其中阵列进一步包括能在严谨条件与野生型AT III、野生型蛋白质C、野生型蛋白质S、野生型纤维蛋白原、野生型凝血因子V、野生型凝血因子II、野生型MTHFR和野生型ACE杂交的寡核苷酸。
全文摘要
本发明公开了用于在各种种族人群中预测个体发展静脉血栓形成的遗传风险的方法，以及可用于实施该方法的阵列和试剂盒。该方法包括在至少八种静脉血栓形成－相关分子中筛选突变、多态性或两者，所述分子如与静脉血栓形成有关的抗凝血酶III、蛋白质C、蛋白质S、纤维蛋白原、凝血因子V、凝血酶原(凝血因子II)、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和血管紧张素I－转化酶(ACE)分子。
文档编号C12Q1/68GK1930306SQ200580008290
公开日2007年3月14日 申请日期2005年1月14日 优先权日2004年1月15日
发明者希格迪姆·F·多乌卢, 欧文·M·伦纳特, 陈伟仪 申请人:美国政府健康及人类服务部