用于mthfr基因芯片检测的特异性引物对和探针的制作方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，公开了用于检测MTHFR基因rs1801133677C/T的SNP位点的特异性寡核苷酸探针，以及检测上述SNP位点时，用于扩增含有检测目标位点的目标区域的特异性引物对。上述寡核苷酸探针能够特异地与MTHFR基因第677位不同基因型杂交。特异性引物对可扩增含有检测目标位点的目标区域。利用芯片杂交法，使探针与上述被扩增区域杂交，检测MTHFR基因型，为有血栓形成倾向的可疑患者的评价、同型半胱氨酸水平的提高和叶酸代谢的变化提供参考，为医生正确选择药物并合理调整药物剂量提供信息。
【专利说明】用于MTHFR基因芯片检测的特异性引物对和探针
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域和核酸检测领域，具体设计用于扩增MTHFR基因的特异性引物对和用于MTHFR基因芯片检测的特异性探针。
【背景技术】
[0002]脑血管疾病以其高发病率、高死亡率、高致残率严重危害着人类的健康，是目前人类最常见的死因之一。近年来，高同型半胱氨酸血症作为一种新的脑卒中危险因素逐渐引起人们的重视。目前研究已明确高同型半胱氨酸血症是脑卒中的独立危险因子，约有 20%~50%的脑卒中患者有不同程度的同型半胱氨酸血症。
[0003]亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate-reductase,MTHFR)是同型半胱氨酸(Hcy)在人体内代谢途径中的关键酶，其含量不足或活性下降将直接导致同型半胱氨酸在体内的蓄积，引起高同型半胱氨酸血症。研究表明，C677T多态性引起的高同型半胱氨酸血症可损伤内皮细胞和血管平滑肌细胞，诱导内皮细胞激活促凝因子，促进纤溶酶原激活物抑制剂的表达，从而促进血小板粘附聚集功能和组织因子活性，激活凝血酶V、 VD等，使机体处于高凝状态，从而促进血栓形成，引发多种疾病，如H型高血压，冠心病，2 型糖尿病急性脑梗死，高血脂，动脉粥样硬化以及提高众多癌症疾病发病机率，比如前列腺癌，结肠直肠癌和膀胱癌等。其中以高同型半胱氨酸血症引起的脑卒中以及新生儿缺陷最为严重。
[0004]MTHFR C677T在世界范围内具有相对较高的突变频率，在中国人群中该位点突变型频率高达17%-47%。在中国人群中，MTHFR677T基因型可能是静脉血栓的危险因素，MTHFR 基因677TT基因型通过提高血浆Hcy水平来增加患脑卒中的危险性，MTHFR C677T多态性与我国人群脑卒中的易感性密切相关。
[0005]此外，随着分子生物学技术的发展，在叶酸代谢中起关键作用的亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性被认为与多种出生缺陷疾病有关。MTHFR的缺陷将导致Hcy向蛋氨酸的转化发生障碍。叶酸在蛋氨酸的代谢中必不可少，它以5-甲基四氢叶酸形式起作用，叶酸水平不足，导致蛋氨酸合成障碍，血中Hcy堆积，在孕早期干扰神经管闭合。已有研究表明，MTHFR基因C677T多态性与神经管缺陷(NTD)的发生有关。另外有研究证实，由于叶酸代谢相关基因的缺陷致叶酸的代谢障碍引起DNA低甲基化导致染色体不分离，是唐氏综合征(DS)发生的危险因素。还有研究发现，携带677TT基因型且叶酸补`充剂或膳食叶酸摄入偏低的母亲，其生育唇腭裂婴儿的风险显著增高。目前测定MTHFR基因型的方法主要采用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)、手工或自动测序、序列特异性引物PCR等方法，操作繁琐，检测周期长，检测结果不易准确，难以满足临床检验的要求。
[0006]近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一便是基因芯片。 用基因芯片检测MTHFR基因亚型，发挥基因芯片检测操作简单、快捷、结果准确的特点，它是将能反映样本中大量基因信息的基因探针(寡核苷酸探针、cDNA克隆、PCR产物等)，有序固定在固相支持物(如醛基、氨基、巯基、羧基等活性基团修饰的载玻片或硅片、尼龙膜、硝酸纤维素膜)上形成阵列，通过与实际样本(或扩增产物)进行杂交反应，只需一次实验，就可高通量获得所有待检基因的信息。这种平行检测、高信息通量的特点使其在基因表达、基因多态性检测等方面的应用具有很强的先进性和明显的优势。对于指导临床个性化用药，具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种用于检测MTHFR基因SNP位点的特异性扩增弓丨物对和特异性寡核苷酸杂交探针。
[0008]这种用于检测MTHFR基因SNP位点的特异性寡核氨酸探针可用于检测MTHFR677C/T rsl801133 位点。
[0009]寡核氨酸探针序列如下，使用时可从下列序列中挑选一条:
[0010]所述的检测位点为677C时，特异性寡核苷酸探针序列为含有以下核苷酸序列之
[0011](I)SEQ ID N0.1:5，-TGCGGGAGCCGATTTCAT-3，；
[0012](2) SEQ ID N0.2:5’ -GTCTGCGGGAGCCGATTT-3’ ；
[0013](3) SEQ ID N0.3:5，-CGGGAGCCGATTTCATCAT-3，；
[0014]所述的检测位点为677T时，特异性寡核苷酸探针序列含有以下核苷酸序列之一:
[0015](4) SEQ ID N0.4:5，-GTCTGCGGGAGTCGATTTCA-3’ ；
[0016](5) SEQ ID N0.5:5’ -CTGCGGGAGTCGATTTCATC-3’ ；
[0017](6) SEQ ID N0.6:5’ -GTGTCTGCGGGAGTCGATTTC-3’。
[0018]优选的，所述的检测位点为677C时，特异性寡核苷酸探针为SEQ ID N0.1-3中的一个；所述的检测位点为667T时，特异性寡核苷酸探针为SEQ ID N0.4-6中的一个。
[0019]更优选的，所述的检测位点为677C时，特异性寡核苷酸探针为SEQ IDN0.1_3中的一个，并且其5’端还包含5’氨基修饰的聚脱氧胸苷酸；所述的检测位点为667T时，特异性寡核苷酸探针为SEQ ID N0.4-6中的一个，并且其5’端还包含5’氨基修饰的聚脱氧胸苷酸。聚脱氧胸苷酸长度为5~25。即上述特异性寡核苷酸探针的5’端还包含一段5~25聚的聚脱氧胸苷酸。
[0020]检测上述MTHFR基因SNP位点时，用于扩增MTHFR rsl801133677C/T位点所使用的特异性引物对含有以下核苷酸序列之一:
[0021](1)上游 SEQ ID N0.7:5’ -GTTGGAAGGTGCAAGATCAG-3，，
[0022]下游 SEQ ID N0.8:5，-CTCACGACTCAAGCGACTCA-3，，或，
[0023](2)上游 SEQ ID N0.9:5，-CCAGTCCCTGTGGTCTCTTC-3，，
[0024]下游 SEQ ID N0.10:5，-GAAAGGGTAGGTCCACTCC-3，，或，
[0025](3)上游 SEQ ID N0.11:5，-TCTCCTGACTGTCATCCCTATT-3，，
[0026]下游 SEQ ID N0.12:5’ - TCACAGACAACTCCCCAAAC-3，。
[0027]即引物对上游和下游序列含有SEQ ID N0.7和N0.8的核苷酸序列，或者含有SEQID N0.9和N0.10的核苷酸序列，或者含有SEQ ID N0.11和N0.12的核苷酸序列。
[0028]优选的，所述引物对的上游和下游序列为SEQ ID N0.7和N0.8的核苷酸序列，或者SEQ ID N0.9和N0.10的核苷酸序列，或者SEQ ID N0.11和N0.12的核苷酸序列。[0029]更优选的，上述特异性引物对核苷酸序列的5’端用生物素、地高辛、荧光素、荧光素衍生物、荧光分子、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶进行了修饰。
[0030]利用芯片杂交法，使探针与上述被扩增区域杂交的探针，其能够特异地与MTHFR基因第677位不同基因型杂交。
[0031]利用上述引物对及特异性寡核苷酸探针检测MTHFR基因rsl801133677C/TSNP位点的方法，步骤包括:
[0032](I)制备待测样品的基因组DNA ；
[0033](2)采用聚合酶链反应方法扩增MTHFR基因中包含rsl801133677C/T SNP位点的基因片段；用上述的引物对进行扩增，
[0034](3)将所得扩增产物与杂交缓冲液混合；
[0035](4)将上述混合液与MTHFR基因SNP检测芯片杂交；所述的MTHFR基因SNP检测芯片包括固相支持物和固定在所述固相支持物上的特异性寡核苷酸探针；
[0036](5)检测芯片的杂交信号。
[0037]步骤(5)中检测杂交信号的方法选自碱性磷酸酶催化的四氮唑蓝显色反应，辣根过氧化物酶催化的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺显色反应或者荧光检测。
[0038]上述寡核苷酸探针能够特异地与MTHFR基因第677位不同基因型杂交。特异性引物对可扩增含有检测目标位点的目标区域。利用芯片杂交法，使探针与上述被扩增区域杂交，检测MTHFR基因型。
`[0039]上述的特异性寡核苷酸探针用于制备MTHFR基因SNP检测芯片或试剂盒。
[0040]上述的引物对用于制备MTHFR基因SNP检测芯片或试剂盒。
[0041]上述MTHFR基因SNP检测芯片可用于检测677C/T位点的基因型。
[0042]上述基因芯片的制备可按照生物芯片的常规制造方法进行。例如，如果固相支持物采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后用点样仪将其点在修饰玻片或硅片，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到基因芯片。如果寡核苷酸探针不含氨基修饰，则其制备方法也可参照:王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；Derisi, JL等于1997年在《科学》278 (5338):680-686发表的“探讨基因组内基因表达的代谢和遗传控制”(Dersi，几，IyerVR, Brown P0.Exploring the metablic and genetic control of gene expression on agenomic scale.Science.1997; 278 (5338):680-686)及马立人等主编的生物芯片，化学工业出版社。)
[0043]制备用于PCR扩增的染色体DNA的方法很多，可以从全血中制备,也可以从组织中制备。具体方法可参阅文献(丁振诺主编《临床PCR基因诊断技术》，世界图书出版公司)。
[0044]用PCR方法扩增基因组DNA的特定片段的关键在于引物设计。
[0045]取适量扩增产物加入杂交缓冲液中与基因芯片杂交。与基因芯片杂交时，可以先将基因芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。
[0046]扩增产物与基因芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易较易确定有关缓冲液、探针和样品浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》J.萨姆布鲁克等主编的《分子克隆实验指南》，科学出版社。[0047]然后根据标记信号在基因芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。所述检测基因芯片杂交信号的方法是基于与抗生物素抗体或亲和素或链亲和素或抗地高辛抗体或抗荧光素抗体复合在一起的碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶催化的四氮唑蓝(NBT)和 5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺盐(BCIP)或四甲基联苯胺(TMB)的显色反应。具体方法可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》。若扩增产物用荧光基团标记，也可参照用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪SCanarray3000等)获取待测信息。
[0048]上述所制备的MTHFR基因SNP检测芯片具有良好的信噪比，所设计的探针有良好的特异性，能准确区分各类型的突变位点。全自动化杂交过程更加方便快捷并且避免了人为操作过程中存在的诸多不确定因素。本发明提供的探针、特异性引物对及其试剂盒，可用于检测MTHFR基因型，为有血栓形成倾向的可疑患者的评价、同型半胱氨酸水平的提高和叶酸代谢的变化提供参考，为医生正确选择药物并合理调整药物剂量提供信息，为提供针对性治疗提供了一种简便易行的解决方案。
【专利附图】
【附图说明】
[0049]图1实施例1本发明基因芯片上的一种点样列阵。
[0050]图2:实施例5中，用实施例1的芯片和探针检测MTHFR基因时所得结果的照片。 【具体实施方式】
[0051]以下实施例是对本发明的更详细说明，而不是对本发明范围的限定。
[0052]所用基因序列的来源为NCBI (美国国立生物技术信息中心):
[0053]MTHFR677C/T (rsl801133)
[0054]实施例1基因芯片的制备
[0055]醛基修饰的载玻片(产品编号:BSM03011，上海百傲科技有限公司)。人工合成(上海生工生物工程技术服务有限公司)以下探针，用水溶解为lOOpmol/ul浓 度的溶液，然后用2X点样buffer (产品编号:BST02010，上海百傲科技有限公司)等比混合。接着，用 Affymetrix公司的GSM417点样仪按说明书所述方法点制如图1的阵列。室温放置过夜。
[0056]各特异性探针序列如下:
[0057]检测位点677C的特异性寡核苷酸探针为，NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT TGCGGGAGCCGATTTCAT ;检测位点67H的特异性寡核苷酸探针为，NH2_TTTTTTTTTTTTTTTT GTCTGCGGGAGTCGATTTCA-3’。即上述各探针分别为序列表中SEQ ID N0.1和4，且5’端还包含一段5’氨基(-NH2)修饰的16聚Polyd T (多聚脱氧胸苷酸)。
[0058]如图1所示，在载玻片上点上质控点、677C探针(SEQ ID N0.1)、677T探针(SEQ ID N0.4 )、阴性对照探针和空白对照。其中0为质控探针，I为MTHFR基因677C探针，2为MTHFR 基因677T探针，3为MTHFR基因677位阴性对照探针，4为空白对照。
[0059]实施例2染色体DNA的制备
[0060]使用上海百傲科技有限公司血液DNA提取试剂盒按说明书操作如下:
[0061]吸附柱活化:
[0062]将吸附柱置于收集管中，加入500 ii L缓冲液BH1，静置2_3min，12，OOOrpm (9，500Xg)离心30s ;弃去收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，在吸附柱中加入500 μ L缓冲液ΒΗ2,12，OOOrpm (9，500 X g)离心30s,弃去收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中待用。
[0063]操作程序:
[0064](I)将20 μ L的蛋白酶K用移液器加入到1.5mL离心管底部。
[0065](2)将200 μ L的血液样品加入到离心管中。[0066](3)加入200 μ L缓冲液BL到离心管中，振荡混匀15s。
[0067](4)离心管 56°C保温 lOmin。
[0068](5)短暂离心将离心管盖的液滴离下。
[0069](6)加入200 μ L无水乙醇，振荡混匀15s。短暂离心将离心管盖的液滴离下。
[0070](7)取已活化的吸附柱套在2mL收集管中，将上述混合液小心加入吸附柱中，不要弄湿管口。盖上管盖，12，OOOrpm (9，500 X g)离心lmin，弃取装废液的收集管，将吸附柱插入新的收集管中。
[0071](8)小心打开吸附柱的管盖,加入500 μ L缓冲液BWl,不要弄湿管口。盖上管盖，12, OOOrpm (9，500Xg)离心lmin,倒掉废液,将吸附柱插入收集管中。
[0072](9)小心打开吸附柱的管盖,加入500 μ L缓冲液BW2,不要弄湿管口。盖上管盖，12, OOOrpm (9，500Xg)离心lmin,倒掉废液,将吸附柱插入收集管中。
[0073](10)将吸附柱插入收集管中。12，OOOrpm (9，500Xg)离心lmin。
[0074](11)将吸附柱插入干净的1.5mL无菌离心管，弃去装废液的收集管。小心打开吸附柱的管盖，加入60 μ L的洗脱液BE或去离子水。室温(15~25°C)放置5min，然后12, OOOrpm (9, 500)离心 lmin。
[0075](12)抽提好的DNA放置_20°C冰箱保存备用。
[0076]实施例3用本发明提供的引物通过PCR方法扩增MTHFR基因片段
[0077]委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物，引物信息如下。
[0078]上游SEQ ID N0.7:5’ -GTTGGAAGGTGCAAGATCAG-3，，
[0079]下游SEQ ID N0.8:5，-CTCACGACTCAAGCGACTCA-3，，
[0080]并且，引物的5’端用生物素进行修饰。
[0081]然后用水溶解并稀释至lOpmol/μΙ。将购置的Taq酶(TaKaRa)UOX缓冲液(TaKaRa)、dNTP (上海生工生物工程技术服务有限公司)、纯水以及实施例2获得的PCR扩增模板按以下配方配制PCR扩增体系:
[0082]表1
【权利要求】
1.一组用于检测MTHFR基因SNP位点的特异性寡核苷酸探针，其特征在于，所述特异性寡核苷酸探针用于检测MTHFR基因rsl801133677C/T的SNP位点；所述的检测位点为677C时，特异性寡核苷酸探针序列含有以下核苷酸序列之一:(1)SEQ ID N0.1:5’ -TGCGGGAGCCGATTTCAT-3’ ；(2)SEQ ID N0.2:5，-GTCTGCGGGAGCCGATTT-3，；(3)SEQ ID N0.3:5，-CGGGAGCCGATTTCATCAT-3，；所述的检测位点为677T时，特异性寡核苷酸探针序列含有以下核苷酸序列之一:(4)SEQ ID N0.4:5’ -GTCTGCGGGAGTCGATTTCA-3’(5)SEQ ID N0.5:5’ -CTGCGGGAGTCGATTTCATC-3’(6)SEQ ID N0.6:5’ -GTGTCTGCGGGAGTCGATTTC-3’。
2.权利要求1所述用于检测MTHFR基因SNP位点的特异性寡核苷酸探针，其特征在于， 所述的检测位点为677C时，特异性寡核苷酸探针序列为以下核苷酸序列之一:(1)SEQ ID N0.1:5’ -TGCGGGAGCCGATTTCAT-3’ ；(2)SEQ ID N0.2 :5’ -GTCTGCGGGAGCCGATTT-3’ ；(3)SEQ ID N0.3:5，-CGGGAGCCGATTTCATCAT-3，；所述的检测位点为677T时，特异性寡核苷酸探针序列为以下核苷酸序列之一:(4)SEQ ID N0.4:5’ -GTCTGCGGGAGTCGATTTCA-3’(5)SEQ ID N0.5:5’ -CTGCGGGAGTCGATTTCATC-3’(6)SEQ ID N0.6:5’ -GTGTCTGCGGGAGTCGATTTC-3’。
3.权利要求1所述用于检测MTHFR基因SNP位点的特异性寡核苷酸探针，其特征在于， 所述的检测位点为677C时，特异性寡核苷酸探针序列为以下核苷酸序列之一，并且其5’端还包含5’氨基修饰的聚脱氧胸苷酸，聚脱氧胸苷酸长度为5~25:(1)SEQ ID N0.1:5’ -TGCGGGAGCCGATTTCAT-3’ ；(2)SEQ ID N0.2:5’ -GTCTGCGGGAGCCGATTT-3’ ；(3)SEQ ID N0.3:5，-CGGGAGCCGATTTCATCAT-3，；所述的检测位点为677T时，特异性寡核苷酸探针序列为以下核苷酸序列之一，并且其 5’端还包含一段5’氨基修饰的16-25聚的聚脱氧胸苷酸:(4)SEQ ID N0.4:5’ -GTCTGCGGGAGTCGATTTCA-3’(5)SEQ ID N0.5:5’ -CTGCGGGAGTCGATTTCATC-3’(6)SEQ ID N0.6:5’ -GTGTCTGCGGGAGTCGATTTC-3’。
4.一组用于检测MTHFR基因SNP位点的引物对，其特征在于，所述引物对是用于扩增 MTHFR rsl801133677C/T的特异性引物对，含有以下核苷酸序列之一:(1)上游SEQ ID N0.7:5，-GTTGGAAGGTGCAAGATCAG-3，，下游 SEQ ID N0.8:5’ -CTCACGACTCAAGCGACTCA-3’，或，(2)上游SEQ ID N0.9:5，-CCAGTCCCTGTGGTCTCTTC-3，，下游 SEQ ID N0.10:5，-GAAAGGGTAGGTCCACTCC-3’，或，(3)上游SEQ ID N0.11:5，-TCTCCTGACTGTCATCCCTATT-3，，下游 SEQ ID N0.12:5，- TCACAGACAACTCCCCAAAC-3，。
5.权利要求4所述用于检测MTHFR基因SNP位点的引物对，其特征在于，所述引物对序列选自以下核苷酸序列之一:
(1)上游SEQ ID N0.7:5，-GTTGGAAGGTGCAAGATCAG-3，，
下游 SEQ ID N0.8:5’ -CTCACGACTCAAGCGACTCA-3’，或，
(2)上游SEQ ID N0.9:5，-CCAGTCCCTGTGGTCTCTTC-3，，
下游 SEQ ID N0.10:5’ -GAAAGGGTAGGTCCACTCC-3’，或，
(3)上游SEQ ID N0.11:5，-TCTCCTGACTGTCATCCCTATT-3，，
下游 SEQ ID N0.12:5，- TCACAGACAACTCCCCAAAC-3，。
6. 权利要求4或5所述用于检测MTHFR基因SNP位点的引物对，其特征在于，所述的SEQ ID N0.7~12的核苷酸序列5’端用生物素、地高辛、荧光素、荧光素衍生物、荧光分子、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶进行了修饰。
7.权利要求1~3任一项所述的特异性寡核苷酸探针用于制备MTHFR基因SNP检测芯片或试剂盒。
8.权利要求4~6任一项所述的引物对用于制备MTHFR基因SNP检测芯片或试剂盒。
【文档编号】C12N15/11GK103525924SQ201310461481
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】朱滨, 邢军芬, 孙悦, 张宇, 张佳琦, 张艳, 张莹 申请人:上海百傲科技股份有限公司