一种猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪圆环病毒2型环介导等温扩增（LAMP）检测方法，包括以下步骤：1）首先设计并合成特异性引物；2）从细胞提取病毒DNA模板；3）目的片段的获得：分别配制LAMP和PCR反应体系，按照LAMP和PCR反应程序进行反应得到目的片段；4）定性LAMP和PCR检测。本发明的检测方法简单、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好，并且检测的检测极限极低，灵敏度高，可准确定性检测出猪圆环病毒2型，达到预防和控制猪圆环病毒2型流行的作用。
【专利说明】—种猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属分子生物学领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法。
【背景技术】 [0002]目前，常用于病毒检测的方法有酶联免疫吸附反应(ELISA)、定性PCR技术和实时荧光定量PCR技术。ELISA灵敏度较高，但检测结果可能包括假阳性。定性PCR技术成本低、易于操作，但灵敏度比较低，且由于其扩增产物需通过凝胶电泳分析一次，极易产生污染。实时荧光定量PCR技术虽有高灵敏度、高特异性等特点，但该实验对检测人员要求较高且需要昂贵的Real-time PCR系统设备。环介导等温扩增技术简单、快速、灵敏度高、特性性强、重复性好等特点而被广泛应用。
[0003]环介导等温扩增(LAMP)技术针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件(65°C左右)保温约60min,即可完成核酸扩增反应，扩增出LAMP特征性梯状条带。还可通过设计两条环引物可使反应速度提升 1/2-1/3。
[0004]环介导等温扩增技术主要有如下几种检测方法:
[0005]I)扩增得出的产物经琼脂糖凝胶电泳来检验分析，扩增出的LAMP特征性条带，分析是否含有所需的片段。
[0006]2)扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀透过肉眼进行判断或者对其浊度进行检测。
[0007]3)扩增结果可用结合双链DNA的荧光染料SYBR Green I染色。在紫外灯或日光下通过肉限进行判定，如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持SYBR GreenI的橙色不变。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题是提供一种猪圆环病毒2型环介导等温扩增(LAMP)检测方法，通过Primer Explorer V3设计的三对特异性引物可以对特定片段在等温条件下进行快速、准确的扩增，同时又保证了实验的特异性。
[0009]本发明首先通过DNAstar分析，在猪圆环病毒2型基因组内寻找保守序列，在获得的保守区域设计特异性引物，然后通过扩增获得大量的目的片段。对目的片段进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。扩增结果也可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀透过肉眼进行判断或者对其浊度进行检测。
[0010]本发明所述猪圆环病毒2型LAMP检测方法，包括如下步骤:
[0011]I)特异性引物的设计和合成
[0012]本发明首先设计并合成了六个特异性引物:正向内部引物(FIP)、反向内部引物(BIP)、正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向环形引物(LF)和反向环形引物(LB)，并由上海生物工程有限公司合成。
[0013]所述六个特异性引物的序列分别如SEQ ID NoUSEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ IDNo4、SEQ ID No5、SEQ ID No6 所示，具体如下:
[0014]FIP:5/ -CAGGAATACAATATCCGTGTAACCATTTTGGTTAAGTGGGGGGTCTT-3'
[0015]BIP:5/ -GAGGCCTACGTGGTCTACATTTTTCAAACAACAAAAGAAATCAGCTATG-3'
[0016]F3:5/ -CACTTCGTAATGGTTTTTATTATTTA-3'
[0017]B3:5/ -TCCACTATTGATTACTTCCAAC-3'
[0018]LF: 5' -AACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATC-3'
[0019]LB: 5' -TTTCCAGCAGTTTGTAGTCTCAGC-3'
[0020]2)从培养的细胞中提取病毒DNA模板
[0021]按照Blood Viral DNA/RNA kit(B10MIGA Inc, San Diego, CA)的说明书来提取培养的细胞中的病毒DNA或RNA，分别提取猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒I型(PCV1)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)的DNA，再提取猪流行性腹泻病毒(PED)、猪传染性胃肠炎(TGE)、猪轮状病毒(RV)、猪蓝耳病毒(PRRS)的RNA，提取的RNA经ReverseTranscriptase M-MLV(RNase H-) (Takara Corp.，Japan)逆转录作用分别得到各自病毒的cDNA，将得到的DNA和cDNA保存在_70°C冰箱。
[0022] 3)目的片段获得
[0023]配制LAMP 反应体系:在 0.25ml eppendorf 管中加入 IOXThermopolReaction Buffer3.5 μ L,甜菜碱 1.5 μ L，六个特异性引物(FIP、BIP、F3、B3、LF、LB)各I μ L,基因组DNA5 μ L,去离子水补加至总体积25 μ L ；LAMP反应程序为:94°C 5min, 59°C 40min, 80°C IOmin0
[0024]配制PCR 反应体系:在 0.25ml eppendorf 管中加入 10Xbuffer2.5 μ Μ,dNTPs0.75 μ Μ,正向外引物、反向外引物(F3、B3)各0.5 μ M，2.5U DNA聚合酶，模版DNAlyL，去离子水补加至总体积25yL;PCR检测的反应程序为:95°C 5min，95°C 30S，55°C 30S,72°C 30S, 72°C 5min, 35 个循环。
[0025]待LAMP和PCR反应结束，0.25ml eppendorf管中就含有大量目的片段。
[0026]4 )定性LAMP和PCR检测
[0027]分别进行PCR和LAMP定性检测，并对每组设置阳性对照和空白对照。
[0028]将上述LAMP和PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳分析，扩增出与PCV2相应的约200bp大小的特异片段即为阳性，没有扩增出该特异性片段即为阴性。
[0029]本发明所述的猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法简单、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好。另外，本发明设计了不同的特异性引物，使实时环介导等温扩增(LAMP)检测的定量极限和检测极限极低，大大提高了 LAMP检测方法的灵敏度。
[0030]本发明的猪圆环病毒2型LAMP检测方法可以制备成试剂盒。使用该试剂盒，就能简单地进行猪圆环病毒2型的快速检测和定量检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为本发明LAMP法检测PCV2温度条件优化结果，M:DL2000 ;1_4泳道:反应温度55，57，59和61°C，所有产物都通过有Goldview染色的2%的琼脂糖凝胶电泳分析；[0032]图2为本发明PCV2的LAMP检测的特异性，M，DL2000 ;泳道I，PCVl ;泳道2，PCVl ；泳道3，PPV ;泳道4，PRV ;泳道5，PEDV ;泳道6，TEGV ;泳道7，RV ;泳道8，PRRSV ;泳道9，PCV2 ；N,阴性对照，所有产物经由Goldbiew染色的2%的琼脂糖凝胶电泳分析；
[0033]图3为本发明PCV2的LAMP扩增产物Hae III酶切特异性鉴定结果，M，DL500 ;泳道1，PCV2LAMP扩增产物；泳道2，PCV2扩增产物Hae III酶切鉴定，所有产物经由Goldbiew染色的2%的琼脂糖凝胶电泳分析；
[0034]图4为本发明PCV2常规定性PCR检测法灵敏度检测结果，M，DL2000 ;N。阴性对照;泳道1-8，分别为梯度稀释的PCV2DNA进行常规PCR反应IO8, IO7, IO6, IO5, IO4, IO3,100，和10拷贝，所有产物经由Goldbiew染色的2%的琼脂糖凝胶电泳分析；
[0035]图5为本发明PCV2LAMP定性检测法灵敏度检测结果，M，DL2000 ；N,阴性对照；泳道1-8，分别为梯度稀释的PCV2DNA进行LAMP反应IO8, IO7, IO6, IO5, IO4, IO3,100，和10拷贝，所有产物经由Goldbiew染色的2%的琼脂糖凝胶电泳分析。
【具体实施方式】
[0036]以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。
[0037]实验试剂和材料
[0038]猪圆环病毒2型PCV2、猪流行性腹泻PED、猪细小病毒PPV、伪狂犬病毒PRV、猪传染性胃肠炎TGE、猪轮状病毒RV、猪蓝耳病PRRS和猪圆环病毒I型PCVl均由上海市农业科学院畜牧兽医研究所提供，Bst DNA聚合酶,大片段(New England Biolabs, Beverly, US),其余试剂均购于 TaKaRa Biotechnology C0., Ltd.。
[0039]Blood Viral DNA/RNA kit(B10MIGA Inc, San Diego, CA)，ABI PRISM3730GeneticAnalyzer 型测序仪(Applied Biosystems Division of Perkin-Elmer Corp.), AppliedBioystem2720thermal cycler(Applied Biosystem.，US)。
[0040]实施例1
[0041]I)设计并合成特异性引物
[0042]用网上在线的LAMP引物设计软件Primer Exploer V3设计PCV2的三对引物(FIP、BIP、F3、B3、LF、LB)，按照Primer Exploer V3Manual上面的步骤来对PCV2的全序列进行引物设计，首先上载PCV2全序列、引物设计、展示引物设计结果、选择合适的引物，保存最适的引物信息，将保存的引物信息上载到Primer Exploer V3软件中进行设计环形引物(LF、LB)。在设计引物过程中要注意Tm值的设置、引物端头的稳定性、GC含量、二级结构以及引物的长度。设计好的引物由上海生物工程有限公司合成。
[0043]2)目的片段的获得
[0044]在猪圆环病毒2型检测研究中，以基因组DNA为模板进行LAMP和PCR扩增。LAMP反应体系为 25 μ L: 10 X Thermopol Reaction Buffer3.5 μ L，甜菜碱 1.5 μ L，三对引物(FIP、BIP、F3、B3、LF、LB)各I μ L，基因组DNA5 μ L，去离子水补加至总体积25 μ L ;所述LAMP反应程序为:94°C 5min, 59°C 40min, 80°C IOmin0
[0045]PCR反应体系为25yL:2XPCR Mixl2.5 μ L，正向外引物、反向外引物(F3、B3)各I μ L,基因组DNA2y L,去离子水补加至总体积25 μ L。PCR反应程序为:94°C 5min,94°C lmin,52°C lmin,72°C lmin,72°C 10min，35 循环。[0046]扩增出的LAMP特征性条带，分析是否含有所需的片段。
[0047]3 )定性LAMP和PCR检测
[0048]将上述LAMP和PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳分析，分析表明:扩增出了与PCV2相应的约200bp大小的特异片段即为阳性，没有扩增出该特异性片段即为阴性。
[0049]4) LAMP温度优化
[0050]为了使LAMP反应达到最佳水平，对LAMP反应进行温度优化，确定最佳反应温度，设置温度梯度从55°C到60°C，59°C时条带最亮、最清晰。最终确定最佳温度为59°C (参见图1)。
[0051]5)特异性检测
[0052]以 IO5 拷贝 / 微升的 PCV2DNA，PED，TGE，RV, PRRS 的 cDNA 和 PCV2，PCVl, PPV，PRV的DNA为模板做特异性检测，结果显示，实验过程中非猪圆环病毒2型DNA模板的反应，经琼脂糖凝胶电泳分析，没有相应条带出现(参见图2)，之后扩增产物经过HaeIII酶切鉴定(参见图3)并由上海生物工程有限公司进行测序鉴定，本发明设计的特异性引物具有很好的特异性。
[0053]6) LAMP 检测限
[0054]以101。，IO9, IO8, IO7, IO6, IO5, IO4, IO3, IO2, IO1 拷贝 /微升的PCV2DNA 为模板做LAMP反应，PCR反应体系和PCR反应程序同上。结果表明，建立的LAMP方法的定量极限为IO2拷贝/微升(参见图4)，检测极限为10拷贝/微升(参见图5)。
[0055]7)临床样品检测
[0056]从采集的血清样品中随机`抽取110个血清样品作为临床样品，这些血清样品直接用作为DNA模板来进行LAMP反应，根据相关文献，LAMP反应耐受性很强，可以省掉提取DNA等繁琐步骤，直接对病毒进行检测。经LAMP反应检测，110个血清样品中的95个血清样品呈现PCV2阳性。
[0057]以建立的LAMP体系作临床样品检测，结果显示，86.3%的样品为猪圆环病毒2型阳性，定性PCR检测PCV2阳性检出率微64%。因此LAMP体系PCV2阳性检出率比定性PCR检测的检出率提高了 22%。
[0058]以上实验结果表明，本发明所述的猪圆环病毒2型环介导等温扩增(LAMP)检测方法简单、快速、准确、特异性强、重复性好，并且检测的定量极限和检测极限极低，可准确定量检测出猪圆环病毒2型，起到预防和控制猪圆环病毒2型的流行。
[0059]最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
【权利要求】
1.一种猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法，包括如下步骤: 1)首先设计与合成六个特异性引物:正向内部引物FIP、反向内部引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环形引物LF和反向环形引物和LB，其核苷酸序列分别如SEQ IDNol-SEQ ID No6所示，具体如下:
FIP:5/ -CAGGAATACAATATCCGTGTAACCATTTTGGTTAAGTGGGGGGTCTT-3'
BIP:5/ -GAGGCCTACGTGGTCTACATTTTTCAAACAACAAAAGAAATCAGCTATG-3'
F3:5/ -CACTTCGTAATGGTTTTTATTATTTA-3'
B3:5/ -TCCACTATTGATTACTTCCAAC-3'
LF:5/ -AACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATC-3'
LB:5/ -TTTCCAGCAGTTTGTAGTCTCAGC-3' 2)从培养的细胞中提取病毒DNA模板； 3)目的片段的获得:配制LAMP和PCR反应体系，按照LAMP和PCR反应程序进行扩增反应得到目的片段； 4)定性LAMP检测和定性PCR检测:将上述LAMP和PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳分析，扩增出与PCV2相应的约200bp大小的特异片段即为阳性，没有扩增出该特异性片段即为阴性。
2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法，其特征在于，步骤3)中所述LAMP反应体系为:所述LAMP反应体系为:10XThermopol ReactionBuffer3.5μ L，六个特异性引物(FIP、BIP、F3、B3、LF、LB)各 I μ L，基因组 DNA5 μ L，去离子水补加至总体积25 μ L ;所述LAMP反应程序为:94°C 5min,59°C 40min,80°C IOmin0
3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法，其特征在于，步骤3)中所述PCR反应体系为:10Xbuffer2.5μΜ, dNTPs0.75 μ M，正向外引物F3、反向外引物B3各0.5 μ M，2.5U DNA聚合酶，模版DNAl μ L，去离子水补加至总体积25 μ L ;所述PCR反应程序为:95°C 5min,95°C 30S，55°C 30S，72°C 30S，72°C 5min，35 个循环。
4.权利要求1所述的猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法在制备环介导等温扩增试剂盒中的应用。
5.权利要求1所述的猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法在快速、灵敏和定性检测猪圆环病毒2型中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103725795SQ201310461343
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】赵凯, 倪建平, 李春华, 施伟, 赵本进, 赵笑, 何锡忠, 任方方, 张春玲, 吴洋洋, 蒋凤英, 胡瑞丽, 张俊平 申请人:上海佳牧生物制品有限公司, 上海市农业科学院