专利名称：P2y12受体的h2单元型与增加的血栓形成和外周动脉疾病的危险相关的制作方法
技术领域：
本发明涉及与血小板凝集(platelet aggregation)和血栓形成的危险相关的P2Y12受体的多态性的鉴定。
ADP(腺苷5′-二磷酸)是止血和血栓形成的最重要的介体之一(Storey等，2000)。ADP在血小板上的作用是通过被称为P2Y1和P2Y12的两种P2Y受体介导的。大量的证据表明，P2Y12受体在止血血栓的形成和动脉血栓形成的发生方面起着关键作用(Mills等，1996；Cattaneo等，1999)。P2Y12在动脉血栓形成中的关键作用得到噻吩并吡啶类抗血栓形成药物，如靶向P2Y12受体(Hollopeter等，2001；Quinn等，1999)的氯吡格雷和噻氯匹定，对诸如中风，心肌梗塞和周围性血管疾病的多种血栓形成疾病的有益作用的证实(Quinn等，1999；和参见CAPRIESteering Committee.Lancet.1996；3481329-1339)。ADP信号传导涉及由Gq-结合的P2Y1受体介导的Ca++的瞬时升高(Jin等，1998a)，和由Gj-结合的P2Y12受体介导的腺苷酸环化酶的抑制(Hollopeter等，2001；Foster等，2001)。由ADP同时活化Gq和Gj途径是正常凝聚所必须的(Jin等，1998b；Hechler等，1998a)。通过P2Y1活化Gq途径导致了血小板形状的改变，和血小板凝集的可快速逆转波(Jin等，1998a；Hechler等，1998a)，而通过P2Y12活化Gi途径引起了缓慢发展和持久的血小板凝集(Hechler等，1998b)。P2Y12的作用并不局限于抑制腺苷酸环化酶，以及细胞内cAMP含量的随后降低。实际上，业已证实P2Y12受体能通过磷酸肌醇3-(PI3-)激酶途径(Kauffenstein等，2001)和/或另一种未鉴定的G蛋白(Daniel等，1999)激活糖蛋白(GP)IIbIIIa整联蛋白。因此，P2Y12表现出在接触ADP时出现的血小板凝集的不可逆转波方面具有重要作用。
最近，由两个研究小组鉴定了编码342个氨基酸的受体的P2Y12基因(Hollopeter等，2001；Foster等，2001；Zhang等，2001)。业已描述了上四位患者，在接触ADP之后，他们的血小板发生了很少或没有可逆的凝集，并且表现出降低前列腺素E1(PGE1)-刺激的血小板的正常腺苷酸环化酶抑制作用(Nurden等，1995；Cattaneo等，1992)。在一位患者中，这种表型与P2Y12基因异常相关(Hollopeter等，2001)。
业已报导了产生不可逆转的凝集所需要的ADP的浓度在个体之间具有很大变化(Feng等，1999)。
由于遗传因素在血小板凝集方面具有重要作用(O′Donnell等，2001)，本发明人研究了P2Y12基因上的序列变异，这些变异可能解释血小板凝集对ADP的反应的个体间差异。
本发明人在P2Y12受体基因上鉴定了三个单核苷酸多态性(SNP)和核苷酸插入，它们确定了被称为H1和H2的两种单元型。H2单元型与响应ADP的较高的最大血小板凝集相关。
与提高的ADP诱导的血小板凝集强烈相关的P2Y12受体单元型的鉴定具有重要的临床意义，特别是在筛查具有血栓形成，特别是动脉血栓形成(atherothrombosis)的危险，和对噻吩并吡啶类药治疗欠佳反应的对象方面具有重要作用。
考虑到高危外周动脉疾病(PAD)患者中P2Y12受体的特异性，和H 2等位基因在血小板凝集中的功能的增加，本发明人在病例-对照研究中进一步研究了P2Y12基因H2单元型与PAD的关系。
他们发现了P2Y12H2单元型与PAD的强烈相关。
根据以上结果，本发明提供了用于区分P2Y12受体中的H1和H2单元型的方法，后者与出现血栓形成的较高的危险和/或对噻吩并吡啶类药治疗较低的敏感性相关。
因此，该方法可用于测定在对象体内出现血栓形成，特别是动脉血栓形成的危险。
该方法还可用于测定对象对噻吩并吡啶类药治疗的敏感性。
P2Y12受体如上文所述，业已克隆了人P2Y12受体。另外，已表征了其他物种中的变体。
在本发明中，术语“P2Y12受体”表示任何物种，特别是人类的P2Y12受体，不过，还表示如果需要的话，可以使用本发明的方法的其他哺乳动物或脊椎动物的P2Y12受体。因此，术语“对象”表示任何人类患者或任何哺乳动物或脊椎动物。
人P2Y12cDNA序列可以从Genbank获得(登记号AF313449和AY136754)。
本发明人分析了健康人群中的P2Y12基因，并且发现它包括由位于ATG密码子的上游、长度大约为1700bp的一个内含子分开的至少二个外显子。外显子2编码完整的342个氨基酸的蛋白。因为具有6个核苷酸(nt)的重复序列(表1)，无法确定外显子1的确切的3′末端和外显子2的5′起始位点。
表1描述外显子1的确切的3′末端和外显子2的5′起始位点的可能的核苷酸序列模式。内含子序列用小写字母表示。在重复序列下面划线。本发明人随意选择模式1进行核苷酸编号。
表1表示三种可能的序列模式，模式3是最可能的。不过，本发明人在开始他们的研究工作时随意选择了模式1，对研究的多态性进行编号。因此，对下面的多态性进行编号时，遵循模式1。
根据模式1，序列SEQ ID No 1代表内含子的5′序列，而序列SEQID No 2代表外显子2的5′序列，根据本发明，它们是P2Y12基因中的感兴趣的部分。这两种序列都显示下面定义的H2单元型。起始密码子ATG的A核苷酸是SEQ ID No 2上的17号核苷酸。
H1/H2单元型本发明人业已对P2Y12基因进行了测序，并且发现三种感兴趣的单核苷酸多态性(SNPS)和单核苷酸插入多态性(表2)。在本发明中，这些多态性有时又被称作″感兴趣的多态性位置″。
表2在所述研究群体中检测的多态性的描述。所述H1/H2单元型是由i-C139T，i-T744C(也被错误地称为i-T745C)，i-ins801A(也被错误地称为i-ins802A)和G52T多态性确定的。
两种变异位于5′内含子(在本文中被缩写为″i″)起始位点后139个核苷酸和744个核苷酸，所述变异分别由C至T(i-C139T)和T至C(i-T744C)的转换构成。另一种多态性由位于内含子的801号位置上的单核苷酸插入(A)(i-ins801A)构成。另外两种多态性出现在外显子2上，并且分别由位于ATG密码子的第一个核苷酸后17个核苷酸和35个核苷酸的C至T转换(C34T)和G至T颠换(G52T)构成；它们都不改变编码的氨基酸(分别为Asn6和Gly12)。C34T多态性与对ADP响应的最大凝集没有关系。
由于在100位白色人种的健康志愿者群体中i-C139T，i-T744C，i-ins801A和G52T多态性是完全连锁不平衡的，本发明人将主要等位基因的单元型命名为″H1″(139号位置上的C，744号位置上的T，和i-ins801A在所述内含子上的缺乏，以及外显子2的52号位置上的G)，并且将次要等位基因的单元型命名为″H2″(139号位置上的T，744号位置上的C，i-ins801A在所述内含子上的存在，和外显子2的52号位置上的T)。单元型H1和H2的相应的等位基因频率为86％和14％。所有多态性的等位基因频率符合哈迪-温伯格平衡。
与H2等位基因的非携带者(H1/H1)相比，H2等位基因的携带者(H1/H2或H2/H2)在体外具有更强的ADP-刺激的血小板凝集，细胞内cAMP水平的调节不同。
具有H2单元型的P2Y12受体基因的分离的核酸同样是本发明的一部分。
因此，本发明的一个主题是编码P2Y12受体的分离的核酸，所述核酸包括P2Y12基因序列，它同时具有T在所述内含子的139号位置上的存在，C在所述内含子的744号位置上的存在，A在所述内含子的801号位置上的插入，和T在外显子2的52号位置上的存在。
所述核酸优选包括SEQ ID No 1和/或SEQ ID No 2。
血栓形成危险本发明提供了一种用于测定在对象体内患血栓形成的危险的体外方法，该方法包括鉴定P2Y12受体在内含子(SEQ ID No 1)的139，744，和801号位置，和在外显子2(SEQ ID No 2)的52号位置上的多态性，其中，T在所述内含子的139号位置上的存在，C在所述内含子的744号位置上的存在，A在所述内含子的801号位置上的插入，和T在外显子2的52号位置上的存在的同时出现，被命名为H2单元型，并且指示了与对照对象相比，患血栓形成的更高危险，其中所述对照对象即在所述任何等位基因上都没有H2单元型的对象(即H1/H1对象)。
患血栓形成的更高的危险是指，与非携带者相比，在H2等位基因携带者中的明显更大的危险。
这种相对危险性通常是通过病例-对照研究并且使用比数比(oddsratio，OR)评估的。1.1的OR相当于患病的危险提高了10％，而2的OR相当于危险增加了100％。
患血栓形成的危险与血小板凝集的诱导相关。
血小板对于动脉血栓形成来说是特别重要的，并且还通过与功能紊乱的内皮细胞的黏附和生长因子和细胞因子的释放参与动脉粥样硬化损伤的开始和发展。动脉粥样硬化疾病的最重要的血管靶标包括脑动脉床、冠状动脉床和下肢动脉床。
在本发明中，术语″血栓形成″表示在血管中或在心脏管腔中血液凝块的形成。
在优选实施方案中，包括动脉血栓形成。
术语″动脉血栓形成″，″动脉粥样硬化″和″动脉的血栓形成″是同义词。
动脉血栓形成是很多血栓形成疾病，如中风，心肌梗塞和外周动脉疾病(PAD)的主要现象。
动脉血栓形成和动脉粥样硬化疾病的同时出现在外周动脉疾病(PAD)中是特别重要的。实际上，PAD与冠状动脉和脑血管的动脉硬化症事件的高危险相关，并且流行病学研究业已证实了75％的PAD患者死于血管疾病(Ouriel等，2001)。
因此，在对象体内鉴定P2Y12受体的H2单元型进一步指示了患这种血栓形成疾病，特别是PAD的较高危险。
在本发明的含义内，上文所定义的″血栓形成″包括其他血栓形成状态，如静脉血栓形成和静脉血栓栓塞病，以及血栓性微血管病或血管内弥散性血凝固。
对噻吩并吡啶类药治疗的敏感性本发明还提供了一种用于测定对象对噻吩并吡啶类药治疗的敏感性的体外方法，该方法包括鉴定P2Y12受体在内含子(SEQ ID No 1)的139，744，和801号位置，和在外显子2(SEQ ID No 2)的52号位置上的多态性，其中，T在所述内含子的139号位置上的存在，C在所述内含子的744号位置上的存在，A在所述内含子的801号位置上的插入，和T在外显子的52号位置上的存在的同时出现，被命名为H2单元型，并且，当存在于至少一个等位基因上时，指示与对照对象相比，所述对象对噻吩并吡啶类药治疗具有较低的敏感性，其中所述对照对象即没有H2等位基因的对象(即H1/H1对象)。
在本发明中，″噻吩并吡啶类药治疗″表示目前所采用的抗血栓形成治疗，它包括施用诸如氯吡格雷或噻氯匹定等噻吩并吡啶类药物，或能阻断ADP和P2Y12之间的相互作用的任何其他制剂。
″对象对噻吩并吡啶类药治疗的敏感性″表示进行这种治疗的对象的反应的多样性。对所述治疗较低的敏感性相当于较差的反应，因此是不理想的。
为了在早期阶段帮助医生设计最适用于所述对象的治疗方案，确定对象对噻吩并吡啶类药治疗的敏感性是特别有价值的。
H2等位基因之存在的鉴定上述方法，即用于测定血栓形成风险的方法和测定对噻吩并吡啶类药治疗的敏感性的方法，包括鉴定P2Y12受体基因的H1/H2单元型。
所述鉴定可以通过本领域技术人员所熟知的任何技术进行。
在实施本发明的方法时，可以通过从所述个体内获得DNA，并且确定感兴趣的P2Y12受体基因的多态性位置上的序列，来确定个体的有关H1/H2单元型的多态性形式。
所述DNA可以从任何细胞来源获得。临床应用中可以使用的细胞来源的非限定性例子包括血细胞，口腔细胞，子宫颈阴道细胞，来自尿道的上皮细胞，胎儿细胞，毛发，或通过活组织检查获得的存在于组织中的任何细胞。细胞还可以从体液中获得，体液包括，但不局限于血液，唾液，汗液，尿液，脑脊髓液，粪便，在感染或发炎部位的组织分泌液。DNA可以利用本领域标准的多种方法中的任意一种从所述细胞来源或体液中提取。应当理解的是，用于提取DNA的特定方法取决于所述来源的性质。在另一种实施方案中，分析是在不提取DNA的情况下进行的，例如，对全血进行(Mercier等，1990)。
对H1/H2单元型的多态性位置上的DNA序列的确定，是通过本领域已知的任何方法实现的。用于基因型分析的多种方法是现有的(Antonarakis等，1989；Cooper等，1991；Grompe，1993)。所述方法包括，但不局限于直接测序，限制片段长度多态性(RFLP)分析，与标记特异性寡核苷酸杂交，等位基因特异性PCR，使用诱变引物的PCR，连接酶-PCR，HOT裂解，变性梯度凝胶电泳(DGGE)，温度变性梯度凝胶电泳(TGGE)，单链构象多态性(SSCP)和变性高效液相层析(Kuklin等，1997)。直接测序可以通过任何方法进行，包括，但不局限于使用Maxam-Gi1bert方法的化学测序；使用Sanger方法的酶促测序；质谱分析测序；使用芯片型技术的测序(例如，参见Little等，1996)；和实时定量PCR。优选的是，首先使用特定的扩增引物，通过凝集酶链反应(PCR)对来自对象的DNA进行扩增。不过，还可以采用若干种其他方法，可以不依赖于PCR对DNA进行研究，如寡核苷酸连接测定(OLI)，滚环扩增(RCA)或InvaderTM测定。
在本发明的具体实施方案中，提供了用于鉴定对象体内与血栓形成相关或与对噻吩并吡啶类药治疗较低的敏感性相关的P2Y12受体的单元型的至少一种多态性的体外方法，该方法包括在P2Y12受体基因的至少一个区域上分析生物学样品的基因组DNA，所述区域位于内含子(SEQ IDNo 1)的139，744，和801号位置和外显子2(SEQ ID No 2)的52号位置周围；其中，T在所述内含子的139号位置上的存在，C在所述内含子的744号位置上的存在，A在所述内含子的801号位置上的插入，和T在外显子2的52号位置上的存在的同时出现，被命名为H2单元型，并且，当存在于至少一个等位基因上时，指示与对照对象相比，具有患血栓形成的较高危险或对噻吩并吡啶类药治疗具有较低敏感性。
所述分析优选可以包括扩增所述基因组DNA的所述区域的步骤(例如，通过PCR扩增)。
在一个具体实施方案中，所述分析是对分离的(即提取的)基因组DNA进行的。
用于鉴定P2Y12受体多态性的优选技术包括测序。
试剂盒根据本发明的一个方面，H1/H2单元型是通过让所述对象的DNA与任选地标记过的核酸探针接触检测的。
还可将引物用于扩增包括感兴趣的多态性位置的P2Y12基因的部分或对它进行测序。
所述探针或引物是能够与包括所述感兴趣的多态性位置的P2Y12基因序列的部分特异性杂交的核酸。这意味着，它们是能够与所提及核酸序列在高严格条件下杂交(Sambrook等，1989)的序列。所述条件是根据解链温度Tm和高离子强度确定的。优选的是，最理想的序列是能够在(Tm-5℃)至(Tm-30℃)的温度范围，更优选(Tm-5℃)至(Tm-10℃)温度范围内杂交的序列。6×SSC的离子强度是更优选的。例如，高严格性杂交条件相当于最高Tm，例如，50％甲酰胺，5×或6×SCC。SCC是0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠。杂交要求两种核酸包括互补序列，不过，根据杂交的严格性，碱基之间的错配是可能的。用于杂交核酸的合适的严格性取决于核酸的长度和互补程度，本领域众所周知的变量。两种核酸序列之间相似或同源程度越高，具有所述序列的核酸杂交体的Tm值越高。核酸杂交的相对稳定性(相对于较高的Tm)按以下顺序减弱RNA:RNA，DNA:RNA，DNA:DNA。对于长度超过100个核苷酸的杂交来说，业已推导出了用于计算Tm的方程(参见Sambrook等，同上，9.50-9.51)。对于较短核酸，即寡核苷酸的杂交来说，错配的位置变得更为重要，并且寡核苷酸的长度决定它的特异性(参见Sambrook等，同上，11.7-11.8)。可杂交核酸的最低长度至少为大约10个核苷酸；优选至少大约15个核苷酸；更优选所述长度至少为大约20个核苷酸。
优选的探针或引物在下面的
或实施例中披露。
当所述引物是诱变引物时，用于确定所述杂交条件的上述规则需要调整。诱变引物的序列可能实际上相对野生型序列是部分改变了的，以便在扩增特定等位基因时导入限制位点。另外，所述诱变引物的长度常常为30-40个核苷酸。
本发明还提供了适用于确定P2Y12受体的H1/H2单元型的至少一种多态性的试剂盒。
所述试剂盒可以包括以下部分(i)……of DNA，并且可以预先标记。或者，所述探针可以是未标记过的，并且用于标记的成分可以包含在所述试剂盒的独立容器中；和(ii)杂交试剂所述试剂盒还可以包括特定杂交方法所需要的其他适当包装的试剂和材料，如果适合的话包括固相基质，和标准物。
在另一种实施方案中，所述试剂盒可以包括(i)序列确定或扩增引物测序引物可以是预先标记的或可以包括亲和纯化或连接部分；和(ii)序列确定或扩增试剂所述试剂盒还可以包括特定测序扩增方法所需要的其他适当包装的试剂和材料。在一种优选实施方案中，所述试剂盒包括一组测序或扩增引物，它们的序列相应于靠近至少一个所述多态性位置的序列，以及用于检测每一种多态性序列的存在的工具。
在一个具体实施方案中，提供了一种试剂盒，它包含对扩增包括内含子(SEQ ID No 1)的139，744和801号位置和/或外显子2(SEQ IDNo 2)的52号位置中的至少一个的全部或部分P2Y12基因特异的核苷酸引物对。
下面的附图和实施例举例说明了本发明，而不限定它的范围。
图1是表示在P2Y12基因中所述引物和多态性的位置的示意图。
用引物E和J获得了大约3100bp的PCR产物。然后，用以下引物进行序列分析B5’TCATGCCAGACTAGACCGAA3’(SEQ ID N°3)，C5’ATCGATCGCTACCAGAAGACCACC3’(SEQ ID N°4)，E5’GGCTGCAATAACTACTACTT3’(SEQ ID N°5)，F5’AATTCCTTTCTGTCCTTAATT3’(SEQ ID N°6)，G5’TAAATAGGTGAGGAGATGCTG3’(SEQ ID N°7)，H5’TGCATTTCTTGTTGGTTACCT3’(SEQ ID N°8)，J5’GTCGTTTGTTTTGCTGCTAATA3’(SEQ ID N°9)，K5’CATTGAGAATTTCAGCTCCC3’(SEQ ID N°1O)，L5’ATACTAACTACTACAATGAAGAT3’(SEQ ID N°11)和M5’CCTTACACCCTGAGCCAAAC3’(SEQ ID N°12).
ATG和TAA分别是起始和终止密码子。i-C139T，i-T744C，i-ins801A，C34T和G52T是存在于所述研究群体中的多态性。
图2是显示在98位健康志愿者中对ADP的最大血小板凝集反应的图。在3分钟的孵育时间之后，用2μM ADP刺激血小板(250×109/L，存在于柠檬酸化的PRP中)。在第一次观察和第二次观察(一周之后)时记录的凝集之间的和谐系数(concordance coefficient)为77％(P＜0.001)。
图3是显示P2Y12单元型响应2μM ADP的最大凝集的图。将每一位志愿者在第一次观察和第二次观察时记录的最大凝集值的平均值用于分析。不具有H2等位基因的对象(H1/H1，n＝74)的中间值为34.7％，而携带一个H2等位基因(H1/H2，n＝21)的对象的中间值为67.9％，而携带两个H2等位基因的三个对象(H2/H2)的中间值为82.4％(P＝0.0071)。
图4是显示在H2单元型的携带者和非携带者中ADP对伊洛前列素诱导的cAMP形成的抑制作用的图。在37℃下孵育1分钟之后，将伊洛前列素(20μg/μL最终浓度)添加到柠檬酸化的PRP中。1分钟之后添加盐水(对照)或1、2或5μM的ADP。3分钟之后终止反应，并且使用商业化测定试剂盒测定cAMP浓度。三角形和圆分别表示H2单元型的携带者和非携带者。平均值±SEM。
实施例实施例1P2Y12基因序列变异的鉴定方法对象招募年龄在18-35岁之间的98位不相关的健康的白色人种男性志愿者，并且在Clinical Investigation Center of Hpital Européen Georges Pompidou进行研究。这些志愿者是不吸烟者，没有明显的个人和家族性医学病史，并且在采集血液之前至少10天没有进行过任何药物治疗。在被招募进来之前，进行了身体检查和常规实验室测定，包括白血细胞，红血细胞和血小板计数，平均血小板体积，凝血酶原时间(PT)，活化的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)，血浆血纤蛋白原和C-反应性蛋白测定。对在第0天(观察1)和第7天(观察2)从所有志愿者体内获得的血液进行凝集测定。从20位志愿者的小组中获得第三种血液样品进行血小板cAMP测定，并且比较在柠檬酸化的和水蛭素抗凝的富含血小板的血浆(PRP)中的最大凝集。所有志愿者都提供了他们的书面知情同意，并且这项研究方案得到了地方道德协会的同意。
样品制备在过夜禁食之后，使用19号针头，在上午8点到10点之间将静脉血液采集到装有0.105M柠檬酸钠(1体积/9体积)(BD VacutainerR，Becton Dickinson，Le Pont de Claix，法国)或50μg/mL lepirudine(Refludan，Hoechst，Paris，法国)的试管中，并且不使用止血带。将前2ml血液扔掉。通过在室温下以1000rpm的速度离心10分钟获得富含血小板的血浆(PRP)。
将通过以4000rpm的速度进一步离心15分钟获得的自身的缺少血小板的血浆用于把PRP的血小板数量调整到250×109/L。
血小板凝集研究在血液采集之后2小时之内进行凝集研究。在37℃下，通过采用光度测定方法在四通道凝集检测仪(RegulestAmneville，France)上测定凝集。在37℃下将PRP的280-μL等份样品培养3分钟，然后以1100rpm的速度搅拌2分钟，然后添加20μL的盐水或ADP(Sigma-Aldrich，St Quentin Fallavier，France)，ADP浓度为1，2或5μM(最终浓度)。记录血小板凝集反应5分钟时间。
cAMP测定在20位挑选的对象中测定血小板cAMP含量，这包括将270μL的PRP与10μL稳定的前列环素类似物伊洛前列素溶液一起孵育(20g/L，最终浓度)(Ilom édine，Schering-PLough)1分钟，边进行搅拌，然后添加20μL的盐水或ADP(1，2或5μM)。3分钟之后，通过添力20μL的12％三氯乙酸终止该反应。然后提取cAMP，并且按照生产商的说明用酶免疫测定(EIA)(Amersham，Pharmacia Biotech，Orsay，France)进行测定，而不了解所述对象的P2Y12基因型。
基因分型研究按照生产商的说明，通过使用Qiamp Maxi Kit(Qiagen，Courtaboeuf，France)从外周血单个核细胞中分离基因组DNA。
P2Y12受体。本发明人利用了Hollopeter等，(2001)报导的cDNA序列，该序列可以通过GenBank登录号AF313449获得。假设P2Y12基因组构与七种其他跨膜结构域受体基因的组构相同，其中这些基因大部分包括由一个内含子隔开的两个外显子，本发明人用被称为E和J的两种寡核苷酸作正义和反义引物进行了初步扩增实验；它们位于所述报导过的cDNA的5′和3′末端(图1)。然后用Pre-Sequencing Kit(AmershamPharmacia Biotech)纯化所述扩增产物。
纯化之后，使用引物E，B和J进行循环测序反应。随后用若干种其他引物(G，H，K和L)(图1)进行的测序，使得我们能够测定所述扩增产物的核苷酸序列。用ABI Prism 3700(Applera)进行序列分析。
对群体中的40位对象进行筛选，足以鉴定频率为5％或以上的多态性，置信区间(CI)为95％。因此，通过用引物K对外显子1的58个核苷酸进行测序，用引物E和G对它的3′侧翼区的947个核苷酸进行测序，用L，C和M对外显子2的1274个核苷酸进行测序，并且用引物H对它的5′侧翼区的570个核苷酸进行测序，筛选了第一个系列的48位连续健康志愿者的P2Y12基因多态性。
所述引物如图1所示。然后通过使用靶向所述鉴定的多态性的引物在另外50位对象中对P2Y12基因进行测序。
在不了解血小板凝集结果的情况下分析PCR和测序结果。在模棱两可的情况下重复基因分型。对所有98位对象进行了成功的基因分型。
血小板RNA提取和逆转录通过以4000rpm的速度离心15分钟，使4ml的PRP(109血小板)沉淀，按照生产商的说明，使用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取RNA。用10单位的RNasinTM核糖核苷酸酶抑制剂(Promega，Charbonnières，France)，100单位的Superscript II RnaseH-逆转录酶(Invitrogen)和1.5mM随机六核苷酸(Amersham Pharmacia biotech)进行逆转录。cDNA在-20℃下保存。
统计分析结果表示为平均值±SEM，偏斜变量(skewed variables)除外，后者被表示为中间值。用和谐检验(concordance test)比较在第一次观察和第二次观察获得的每一个对象的值(Lin，1989)。利用x2测定比较观察到的等位基因和基因型频率和哈迪-温伯格平衡预测结果。采用非参数Kruskall-Wallis测定测试在基因型组之间的趋势。在校正其他变量之后测定了基因型和对ADP的最大血小板凝集反应之间的关系，这使用多变量对数回归模型，其中，最大凝集＜50％被编码为0，而最大凝集≥50％被编码为1。考虑突变等位基因纯合的对象数量少(＜7)，无论何种多态性，将这些对象与杂合的对象合并在一起进行回归分析。
用STATA 7.0软件包(Stata Corp，College Station，TX)进行统计检验，并且将P值＜0.05的差别视为统计学上显著的。
结果为了评估ADP-诱导的血小板凝集的可变性，本发明人测试了从98位健康志愿者中每一个的体内获得的间隔一周的两份样品。图2比较了在两次观察中在柠檬酸化的PRP中对2μM ADP的最大凝集反应。鉴定了至少两种表现型类型。
在47位对象中在两次观察时的最大凝集都低于50％(48.0％)。另外，在该小组中的43位对象(91.5％)具有与可逆的第一阶段吻合的凝集特征。相反，在29位对象中(29.6％)在两次观察中的最大凝集超过50％，这些对象中的28位(96.5％)具有ADP-诱导的凝集的不可逆转的第二阶段。由于在两次观察之间的最大凝集是稳定的(r2＝77％，P＜0.001)，我们将每个对象的平均值(以下称之为最大凝集)用于随后的分析。
两组不同表型的血小板凝集的存在，以及随时间发展的ADP反应的稳定性，暗示了ADP对血小板凝集之影响的可能的遗传控制作用。因此，本发明人在所述研究群体中分析了P2Y12基因，并且发现它包括由一个长度大约为1700bp的内含子隔开的至少两个外显子，内含子位于ATG密码子的上游(图1)。外显子2编码完整的342个氨基酸的蛋白。由于6个核苷酸(nt)的重复序列(表1)，不能确定外显子1的确切的3′末端和外显子2的5′起始位点。
本发明人发现了确定H1和H2单元型的三个SNPs和单核苷酸插入多态性(表2)。
H2单元型与对ADP反应的较高的最大凝集相关，在不携带H2等位基因的对象(H1/H1，n＝74)中的中值为34.7％，在携带一个H2等位基因的对象(H1/H2，n＝21)中为67.9％，而在携带两个H2等位基因的对象(H2/H 2)中为82.4％(图3，P＝0).0071)。多变量对数回归分析表明，该相关性的比数比(OR)(OR 3.3，95％C11.1-10.4)在对年龄，体重指数，血小板数，平均血小板体积，白细胞数，血纤蛋白原，PT，aPTT和PIA1/PIA2基因型进行校准之后没有明显改变。C34T多态性与响应ADP的最大凝集没有关系。
为了研究H2单元型和位于外显子1和2之间的内含子的可能的剪接变体的关系，本发明人对P2Y12cDNA进行了扩增和测序，所述cDNA是通过对来自具有H1/H1(n＝3)，H1/H2(n＝3)和H2/H2(n＝3)基因型的志愿者的血小板mRNA进行逆转录获得的。核苷酸测序没有发现变异，而无论单元型如何。另外，所述序列特征与H1/H2对象中的两个等位基因的扩增一致，表明了这两种mRNA变体都是转录的(数据未显示)。
为了进一步研究H2单元型和ADP-刺激的血小板凝集之间的关系，本发明人随机挑选H2单元型的10个携带者和10个非携带者。由于ADP-诱导的血小板凝集被认为是依赖于细胞外Ca++浓度的(Packam等，1987)，他们在含有低Ca++浓度(柠檬酸-抗凝PRP)的培养基和在含有生理学Ca++浓度(水蛭素-抗凝PRP)的培养基中测定了对2μM ADP的最大凝集。对于柠檬酸化的血液来说，H2等位基因的携带者和非携带者分别具有71.5％±5.2％和50.7％±7.2％的最大凝集(P＝0.023)。类似的，在水蛭素-抗凝固血液中，H2等位基因的携带者和非携带者分别具有53.8％±3.9％和42.8％±3.4％的最大凝集(P＝0.034)。
为了确定H2单元型和腺苷酸环化酶的P2Y12调控之间可能的联系，本发明人测定了ADP在来自相同的20位对象的血小板中抑制伊洛前列素刺激的cAMP积累的能力。ADP以浓度依赖性方式在来自非携带者的血小板中抑制cAMP形成，在1，2和5μM ADP的浓度下的抑制率分别为13％，31％和37％(图4)，与之对照的是在H2单元型携带者中的抑制率分别为31％，39％和50％(P＝0.028)。
讨论本发明人在P2Y12受体基因中鉴定了三种单核苷酸多态性(SNP)和核苷酸插入，由此确定了被称为H1和H2的两种单元型。H2单元型与对ADP反应的增加的最大血小板凝集相关。这至少部分与通过ADP调控cAMP抑制作用的机制的差异相关。
业已证实，在大群体研究中，ADP-诱导的血小板反应表现出在产生＞50％凝集的二相性反应需要的ADP浓度方面具有显著的可变性(Feng等，1999)。在本研究中，在98位健康志愿者中ADP-诱导的凝集在间隔一周的两次测定之间是稳定的，即在更新大部分血小板之后。以上结果指示了ADP-诱导的血小板凝集的遗传学控制。
为了进一步研究H2单元型的携带者和非携带者对ADP的凝集反应之间的差异，本发明人检查了伊洛前列素-刺激的血小板的腺苷酸环化酶抑制。如图4所示，发现了H2单元型和由ADP导致的细胞内cAMP浓度降低之间的相关性。
用诸如噻吩并吡啶类药噻氯匹定和氯吡格雷等特异性P2Y12受体抑制剂获得的数据，证实了P2Y12是负责腺苷酸环化酶抑制和随后的细胞内cAMP减少的仅有的已知血小板ADP受体(Geiger等，1999)。另外，选择性的P2Y1受体拮抗剂对ADP-诱导的腺苷酸环化酶抑制不起作用(Jin等，1998a)。因此，在ADP刺激之后，H2单元型的携带者和非携带者之间的血小板cAMP浓度的差别，是对在这两组对象中观察到的最大ADP-诱导的凝集的差别的似乎合理的解释，不过，我们不能排除腺苷酸环化酶独立型机制的作用(Kauffenstein等，2001)。
业已用洗涤过的血小板表征了Ca++浓度对ADP-诱导的凝集的影响(Packam等，1987)。在将水蛭素用作抗凝血剂时，血液Ca++浓度为大约1.1mM，并且与柠檬酸化的PRP相比，ADP诱导更少的颗粒内容物释放(Mustard等，1975)。不过，尽管在我们的研究中，水蛭素抗凝PRP中的最大凝集较低，但H2等位基因保持与凝集反应相关。
H2单元型增强针对ADP反应的血小板凝集的分子机制尚有待确立。由于在本研究群体中筛查了P2Y12基因的完整的编码序列，可以排除影响蛋白结构的氨基酸取代。另外，对两种单元型进行的cDNA分析，在外显子1-外显子2结合部分发现了正常序列，排除了剪接片体。因此，血小板上受体数量的增加最有可能解释H2单元型和对ADP的血小板反应性之间的关系。业已披露了其他基因上的能增强转录效率和蛋白合成数量的内含子和外显子增强子区上的多态性(Scohy等，2000；Watakabe等，1993)。
实施例2H2单元型与下肢外周动脉疾病(PAD)的相关方法从巴黎地区招募了年龄小于70岁的连续的白种人男性PAD患者。PAD患者被定义为具有下肢症状性动脉粥样硬化疾病，踝/臂收缩压比＜0.90，或具有以前有手术或血管内血管再生的、有症状的下肢动脉粥样硬化疾病的病史。在先前所述对照组的703位白种人男性中随机选择年龄匹配的没有动脉疾病病史的对照对象，所述对照组是为了研究血管疾病中的遗传学危险因素而设计的(Arnaud等，2000)。所需对象数量的计算，是基于实施例1中所述P2Y12H2单元型的等位基因频率，并且进行测定，以便检测2或2以上的比数比。当α＝0.05和β＝0.20时，需要对150个病例和300个对照进行研究。在两年时间内，包括185个病例，和与331个对照匹配。每一个病例与两个对照匹配，其中的38个病例除外，这些病例各自与一个对照匹配。
病例和对照对象提供了书面知会同意，并且研究方案得到了Paris-Cochin道德协会的批准。
P2Y12基因的H2等位基因的测定是通过如实施例1所披露的凝集酶链反应和序列分析完成的。
结果和讨论表3归纳了病例和对照的特征(表3)。
表3对象特征。数值是以每一组的平均值±SD或百分比的形式提供的。LDL和HDL，低和高密度脂蛋白；BMI，体重指数。
两组的吸烟状态，高血压和糖尿病的发病率显著不同。在这两组中高胆固醇血症是类似的。
病例更经常用降脂药物处理，并且具有较低的总胆固醇值和LDL胆固醇值。大部分PAD患者患有间歇性跛行，并且在31％的患者中目前存在冠状动脉或缺血性脑血管疾病。在PAD患者中，30％的对象具有至少一个H2等位基因，而在对照组中的比例为21％(p＝0.03)。在表4中提供了对数回归结果。
表4.在病例和对照中P2Y12H1/H2单元型的基因型频率，具有PAD的单变量和多变量OR。将H1/H2和H2/H2组合合并在一起，进行OR计算。多变量分析的OR对在“方法”中定义的高血压，高胆固醇血症，糖尿病和烟草使用进行校准。
H2等位基因与PAD相关，在单变量分析中，OR＝1.6。在对包括高血压，高胆固醇血症，糖尿病和吸烟状态在内的常见的心血管危险因素进行校正后，所述相关得到加强，OR＝2.2(p＝0.004)。
这是表明功能性P2Y12基因多态性和动脉粥样硬化疾病之间相关的第一项研究。P2Y12是在PAD患者体内导致血栓形成并发症的一系列事件中的重要步骤。
H2单元型和PAD的相关突出了血小板在动脉粥样硬化形成中的作用。
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序列表<110>INSERM et al.
<12D>P2Y12受体的H2单元型与增加的血栓形成和外周动脉疾病的危险相关<130>BET 03P0927<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>947<212>DNA<213>智人<400>1aggtaatgtt atttctacaa gtacttgaca aatatatgta tttacactct gatatgtgtg 60tacatttttt ccaagtttct cttaaaattg taaaccttaa taactatcaa tgcaagcatg 120tatttggaat aaaaattata attaaaatag aagtctaatt agtgatgtca gagacaattg 180ttaattagcc tctttattaa gaaaaattat acaaagcata gaaataaaat ataaatggtc 240ttagttactt tgcctcaagt ataaaatgag atttaaatac agataaaggg agctgaaatt 300ctcaatgtca agaatacttg ttaaatatct tacagactac acaaaatgta tattcactaa 360gtcgaatttc caaaacggtc agggatgaac taagaccaca cagcagtagc aggaaaggtt 420aaaatcagtg atcttgtatt ggaaaacatt aggttttgtt tagcattatt ttaaagcgct 480aaataggtga ggagatgctg aaaattgaag ccatactgtg acaacatgat tcttaatcgt 540tttccttcca taattaagga cagaaaggaa ttccatggac attttgggga atttaagtgc 600tacattcatt tatctaaata tcttttacac gaaagttatt ttttaaaatt tgttatttgt 660actttcaata tatctctgat tattaagaat attttatata gaatcaattt cacttatctc 720tggtgaaata aaaagattac aaacgtcatt tcaaattccc aagatgtaga tgccatatag 780catattcaag tcacttgtta agttttcatt atagctgcct attgtggtaa taacctatat 840tttattttag ctaccattac acactccata aatctggaaa gtatgccctg ttttgaggaa 900tgccaactca tgaccatata tacacaggcc atttctgact cttattt 947<210>2<211>130<212>DNA<213>智人<400>2aggtaaccaa caagaaatgc aagccgtcga caatctcacc tctgcgcctg gtaacaccag 60
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权利要求
1.一种用于测定在对象体内患血栓形成危险的体外方法，该方法包括鉴定P2Y12受体在内含子(SEQ ID No 1)的139，744，和801号位置，和外显子2(SEQ ID No 2)的52号位置上的多态性，其中，T在所述内含子的139号位置上的存在，C在所述内含子的744号位置上的存在，A在所述内含子的801号位置上的插入，和T在外显子2的52号位置上的存在的同时出现，被命名为H2单元型，并且，当存在于至少一个等位基因上时，指示与没有任何H2等位基因的对照对象相比，出现血栓形成的危险较高。
2.如权利要求1的方法，其中，所述血栓形成是动脉血栓形成。
3.如权利要求2的方法，其中，H2单元型在至少一个等位基因上的存在进一步指示出现外周动脉疾病(PAD)的较高危险。
4.一种用于测定对象对噻吩并吡啶类药治疗的敏感性的体外方法，该方法包括鉴定P2Y12受体在内含子(SEQ ID No 1)的139，744，和801号位置，和外显子2(SEQ ID No 2)的52号位置上的多态性，其中，T在所述内含子的139号位置上的存在，C在所述内含子的744号位置上的存在，A在所述内含子的801号位置上的插入，和T在外显子2的52号位置上的存在的同时出现，被命名为H2单元型，并且，当存在于至少一个等位基因上时，指示与没有任何H2等位基因的对照对象相比，所述对象对噻吩并吡啶类药治疗具有较低的敏感性。
5.如权利要求4的方法，其中，所述噻吩并吡啶类药治疗是使用噻氯匹定或氯吡格雷治疗。
6.一种用于鉴定对象体内与血栓形成相关或与对噻吩并吡啶类药治疗较低的敏感性相关的P2Y12受体单元型的至少一种多态性的体外方法，该方法包括分析生物学样品的基因组DNA，以对P2Y12受体基因的至少一个区域进行分析，所述区域位于内含子(SEQ ID No 1)的139，744，和801号位置，和外显子2(SEQ ID No 2)的52号位置周围；其中，T在所述内含子的139号位置上的存在，C在所述内含子的744号位置上的存在，A在所述内含子的801号位置上的插入，和T在外显子2的52号位置上的存在的同时出现，被命名为H2单元型，并且，当存在于至少一个等位基因上时，指示与对照对象相比，具有患血栓形成的较高危险或对噻吩并吡啶类药治疗具有较低敏感性。
7.如权利要求6的方法，其中，所述分析是在从所述生物学样品中提取的基因组DNA上进行的。
8.如权利要求6或7中任意一项的方法，其中，所述分析包括扩增所述基因组DNA的所述区域的步骤。
9.如权利要求6-8中任意一项的方法，其中，所述P2Y12受体的多态性是通过测序鉴定的。
10.一种编码P2Y12受体的分离的核酸，所述核酸包括P2Y12基因序列，该序列中同时出现T在所述内含子的139号位置上的存在，C在所述内含子的744号位置上的存在，A在所述内含子的801号位置上的插入，和T在外显子2的52号位置上的存在。
11.一种适用于如权利要求1-6中任意一项的方法的试剂盒，该试剂盒包括特异用于扩增包括内含子(SEQ ID No 1)的139，744和801号位置和/或外显子2(SEQ ID No 2)的52号位置中的至少一个的P2Y12基因之全部或部分的核苷酸引物对。
全文摘要
本发明涉及一种用于测定在对象体内出现血栓形成的危险的体外方法，并且涉及一种用于测定对象对噻吩并吡啶类药治疗的敏感性的体外方法。这两种方法都涉及鉴定P2Y
文档编号C12Q1/68GK1705754SQ200380101367
公开日2005年12月7日 申请日期2003年10月14日 优先权日2002年10月15日
发明者M·艾阿驰, P·高瑟姆, P·方塔纳, S·甘德利勒, A·杜邦, J－L·伦尼 申请人:国家健康医学研究所, 公共救济事业局-巴黎医院, 雷内笛卡尔巴黎第五大学