用于治疗血栓形成的抗凝血剂的制作方法

专利名称：用于治疗血栓形成的抗凝血剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及与人凝血因子或辅助因子结合的单克隆抗体(mAb)，以及它们作为血栓形成的自限制抑制剂的用途。
背景技术：
在正常情况下，对做血管衬里的血管内皮细胞小的或较大的损伤，将通过通常称为凝血“级联”的一系列事件触发止血反应。该级联在可溶性纤维蛋白原转化为不溶性血纤维蛋白中达到高潮，血纤维蛋白与血小板一起形成阻止血液成分外渗的局部凝块或血栓。然后可能发生伤口愈合，接着凝块溶解并恢复血管完整和流动。
发生在损伤和凝块形成之间的事件为仔细地调节并连接的一系列反应。简短地说，无活性酶原形式的多种血浆凝血蛋白和辅助因子在血液中循环。活性酶复合物在伤口位置装配并且被有次序地激活为丝氨酸蛋白酶，每个逐次的丝氨酸蛋白酶催化其后的酶原使蛋白酶活化。这种酶促级联导致每个步骤放大随后步骤的作用。关于凝血级联的综述参见“血栓形成和出血”的第一章，J.Loscalzo and A.Schafer,eds.,Blackwell Scientific Publications,Oxford.英国(1994)。
尽管有效的凝血限制了伤口位置血液的损失，但在静脉和动脉中不适当地形成血栓是伤残和死亡的一个常见的原因。异常的凝血活性可能是病理学或治疗的结果和/或原因，这些病理学或治疗诸如心肌梗塞、不稳定心绞痛、心房纤维性颤动、中风、肾损伤、经皮经管腔冠状血管成形术、播散性血管内凝血、脓毒症、肺栓塞和深静脉血栓形成。在人工器官、吻合(shunt)和如人工心脏瓣膜的假体(prosthese)的外表面形成凝块也是成问题的。
现在用于这些病理学和其他血栓和栓塞疾病治疗的许可的抗凝血剂包括硫酸杂多糖肝素和低分子量(LMW)肝素。非肠道给予这些药剂，它们能通过激活凝血酶抑制剂抗凝血酶Ⅲ并失活所有的凝血因子，引起快速和完全的凝血抑制。
然而，肝素和LMW肝素由于它们的效力而有缺陷。由于简单的运动应力并伴随有与物理物体接触或在外科部位不能控制的出血是主要的并发症，并且在1-7％接受连续输注的病人和8-14％给予间歇药丸剂量的病人中观察到不能控制的出血。为减少这种危险，连续取样以能够连续监测活体外的凝血时间，这实质上造成治疗成本和病人的不便。
此外，不将病人置于在出血危险下而达到需要效力水平的治疗靶范围是窄的。治疗的范围是大约1μg肝素/ml至不到3μg肝素/ml血浆，这导致活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)的分析时间为大约35至100秒。将肝素浓度增至3μg/ml超出了该靶范围，而在大于4μg/ml的浓度下，不能检测到凝血活性。因此，必须十分小心地保持病人的血浆浓度在治疗范围内。
另一个有较慢和较长持续作用的许可抗凝血剂是华法令，一种香豆素衍生物。华法令通过与凝血酶原及其它维生素K依赖性凝血因子的维生素K依赖性翻译后修饰竞争而起作用。
对于华法令和肝素以及LMW肝素，可见到抗凝血的一般作用形式，其中在仅比治疗范围高一点的浓度下使血液变得不可凝。显然，需要在控制血栓形成和栓塞疾病而不引起不能控制的出血或其可能性的抗凝血剂。
发明概述因此，本发明的一个方面是在动物中抑制血栓形成的方法，包括给予有效剂量的具有自限制中和活性的抗凝血因子单克隆抗体。
本发明的另一方面是具有对凝血因子自限制中和活性的抗凝血因子单克隆抗体。
本发明的另一方面是具有SB 249413、SB 249415、SB 249416、SB 249417、SB 257731、SB 257732、9E4(2)F4或11G4(1)B9的鉴别特征的单克隆抗体。
本发明的另一方面是具有9E4(2)F4或11G4(1)B9鉴别特征的杂交瘤细胞系。
本发明的另一方面是通过缺失本发明的单克隆抗体的Fc区域产生的中和Fab片段或其F(ab’)2片段。
本发明的另一方面是通过链改组(shuffling)产生的中和Fab片段或其F(ab’)2片段，由此在鼠轻链丝状噬菌体Fab呈现文库中表达本发明的单克隆抗体的Fd重链。
本发明的另一方面是通过链改组产生的中和Fab片段或其F(ab’)2片段，由此在鼠重链丝状噬菌体Fab呈现文库中表达本发明的单克隆抗体的轻链。
本发明的另一方面是具有选自SEQ ID NO:8、9和10的氨基酸序列的免疫球蛋白重链互补决定区。
本发明的另一方面是具有选自SEQ ID NO:12、13和14的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链互补决定区。
本发明的另一方面是包含一条重链和一条轻链的改变抗体，其中所述重链和轻链的框架区得自至少一个选定抗体，并且每个所述链的互补决定区的氨基酸序列得自对该凝血因子具有自限制中和活性的抗凝血因子单克隆抗体。
本发明的另一方面是包含一条重链和一条轻链的嵌合体抗体，所述抗体的特征在于以自限制方式抑制特性(intrinsic)或共同途径凝血因子的功能，其中抑制血栓形成并且产生凝血的限制调节，其中所述重链和轻链的恒定区得自至少一个选定抗体，并且每个所述链的可变区的氨基酸序列得自对该凝血因子具有自限制中和活性的抗凝血因子单克隆抗体。
本发明的又一方面是包含本发明人化抗体或嵌合体抗体和药学上可接受的载体的药用组合物。
附图简述

图1是证明用鼠抗因子ⅨmAb BC1和BC2测定正常人血浆效价的实验结果的图示。
图2是证明用鼠抗因子ⅨmAb 9E4(2)F4和11G4(1)B9测定正常人血浆效价的实验结果的图示。
图3是证明用鼠抗因子ⅩmAb HFXHC和HFXLC和鼠抗因子ⅪmAb HFXI测定正常人血浆效价的实验结果的图示。
图4是在大鼠颈动脉血栓形成模型中，证明肝素、乙酰水杨酸和鼠因子ⅨmAb对60分钟时活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)的作用的实验结果直方图。
图5是在大鼠颈动脉血栓形成模型中，证明肝素、乙酰水杨酸和鼠因子ⅨmAb对60分钟时凝血酶原时间的作用的实验结果直方图。
图6是在大鼠颈动脉血栓形成模型中，证明肝素、乙酰水杨酸和鼠因子ⅨmAb对颈动脉流动闭塞的作用的实验结果直方图。
图7是在大鼠颈动脉血栓形成模型中，证明肝素、乙酰水杨酸和鼠因子ⅨmAb对血栓重量的作用的实验结果直方图。
图8是在大鼠颈动脉血栓形成模型中，证明肝素、鼠因子ⅨmabBC2、嵌合因子Ⅸmab和多种人化因子Ⅸmab对60分钟时aPTT时间的作用的实验结果的直方图。
图9是在一个大鼠颈动脉血栓形成模型中，通过血栓重量证明肝素、鼠因子Ⅸmab BC2、嵌合因子Ⅸmab和多种人化因子Ⅸmab的作用的实验结果的直方图。
本发明的详细描述本发明提供以抗凝血因子为目标的各种各样的抗体、改变抗体及其片段，其特征在于自限制中和活性。该凝血因子优选来自特性途径或共同途径。该抗凝血因子抗体最优选是抗因子Ⅸ、抗因子Ⅸa、抗因子Ⅹ、抗因子Ⅹa、抗因子Ⅺ、抗因子Ⅺa、抗因子Ⅷ、抗因子Ⅷa、抗因子Ⅴ、抗因子Ⅴa、抗因子Ⅶ、抗因子Ⅶa或抗凝血酶。特别推荐的是抗因子Ⅸ抗体。典型的抗凝血因子抗体分别是导向人因子Ⅸ的人化单克隆抗体SB 249413、SB 249215、SB 249416、SB249417、SB 257731和SB 257732、导向人因子Ⅸ的嵌合单克隆抗体chαFIX、导向人因子Ⅸ和/或因子Ⅸa的鼠单克隆抗体BC1、BC2、9E4(2)F4和11G(1)B9或导向人因子Ⅹ和Ⅺ的鼠单克隆抗体HFXLC和HFXI。特别推荐的是抗人因子Ⅸ的单克隆抗体SB249417。
本发明的抗体可通过常规的杂交瘤技术、噬菌体呈现组合文库、免疫球蛋白链改组和产生新型自限制中和抗体的人化技术制备。也包括了具有自限制中和活性的完全人mAb。这些产物在与下列疾病有关的血栓形成和栓塞疾病的治疗组合物和药用组合物中有用心肌梗塞、不稳定心绞痛、心房纤维性颤动、中风、肾损伤、肺栓塞、深静脉血栓形成、经皮经管腔冠状血管成形术、脓毒症、人造器官、吻合或假体。
本文所用的术语“自限制中和活性”指与人凝血因子结合并以使得产生有限凝血调节的方式抑制血栓形成的抗体的活性，人凝血因子最好是来自特性途径和共同途径，包括因子Ⅸ/Ⅸa、Ⅹ/Ⅹa、Ⅺ/Ⅺa、Ⅷ/Ⅷa和Ⅴ/Ⅴa、Ⅶ/Ⅶa以及凝血酶原。“有限的凝血调节”定义为通过延长活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)测定的凝结时间的增加，这里在aPTT达到最大值时，尽管增加单克隆抗体的浓度，血浆仍保持可凝结。这种有限的凝血调节与在增加浓度的肝素存在下使血浆变得不凝并显示出无限的aPTT相反。本发明方法的最大aPTT值优选在肝素治疗范围内。最大aPTT最优选在大约35秒至大约100秒的范围内，这相当于正常对照aPTT值的大约1.5至大约3.5倍。在本发明的一个实施方案中，延长aPTT而没有显著延长凝血酶原时间(PT)。
“改变抗体”指由改变的免疫球蛋白编码区编码的蛋白，它可以通过在一个选定宿主细胞中表达而获得。这类改变抗体是工程抗体(如嵌合抗体或人化抗体)或缺少全部或部分免疫球蛋白恒定区的抗体片段，如FV、Fab、Fab或F(ab’)2等。
“改变的免疫球蛋白编码区”指编码本发明的改变抗体的核酸序列。当该改变抗体是CDR-移殖抗体或人化抗体时，将编码来自非人免疫球蛋白的互补决定区(CDR)的序列插入包含人可变框架序列的第一免疫球蛋白部分。可选择地将该第一免疫球蛋白部分操作性地与第二免疫球蛋白部分连接。
“第一免疫球蛋白部分”指编码一个人框架或人免疫球蛋白可变区的一段核酸序列，在该人框架或人免疫球蛋白可变区中，天然的(或天然产生的)CDR-编码区被一个供体抗体的CDR-编码区取代。该人可变区可以是一条免疫球蛋白重链、一条轻链(或两条链)、一个类似物或其功能片段。这类位于抗体(免疫球蛋白)可变区内的CDR区可用本领域已知方法确定。例如Kabat等(“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，第四版，U.S.Department of Health and HumanServices,National Institutes of Health(1987))公开了定位CDR的规则。另外，已知计算机程序可用于鉴别CDR区/结构。
“第二免疫球蛋白部分”指编码一个蛋白或肽的另一核酸序列，它在框架中或借助一个任选的常规接头序列融合(即操作性地连接)第一免疫球蛋白部分。它最好是一个免疫球蛋白基因。该第二免疫球蛋白部分可以包括编码同样的(即同源的，第一和第二改变抗体是得自同一来源)或一个另外的(即异源的)目的抗体的整个恒定区的核酸序列。它可以是一条免疫球蛋白重链或轻链(或两条链都作为单个多肽的部分)。该第二免疫球蛋白部分不限于一个特定的免疫球蛋白类或同种型。另外，该第二免疫球蛋白部分可以包含一个免疫球蛋白恒定区的部分，如在Fab、或F(ab)2发现的部分(即适当的人恒定区或框架区的一个独立部分)。这种第二免疫球蛋白部分也可以包含编码暴露在宿主细胞外表面上的完整膜蛋白的序列(例如作为噬菌体呈现文库的部分)或编码用于分析或诊断检测的蛋白，如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶等。
术语Fv、Fc、Fd、Fab、Fab’或F(ab’)2是以它们的标准含义使用。参见例如Harlow等(“Antibodies A Laboratory Manual”，冷泉港实验室，(1988))的描述。
本文使用的“工程抗体”描述一种类型的改变抗体，即全长合成抗体(如与抗体片段相对的嵌合抗体或人化抗体)，其中选定受体抗体的轻链和/或重链可变域的一部分被来自一个或多个具有对选定抗原决定簇专一性的供体抗体的类似部分取代。例如，这类分子可以包括特征为与未修饰轻链(或嵌合轻链)有关的人化重链抗体，或反之亦然。工程抗体的特征也可以在于编码受体抗体轻链和/或重链可变域框架区的核酸序列的改变，以保留供体抗体结合专一性。这些抗体可以包含来自有具有本文所述供体抗体CDR的受体抗体的一个或多个CDR(最好是全部)的取代。
“嵌合抗体”指一种类型的工程抗体，它含有一个从与得自受体抗体的轻链和重链恒定区相关的供体抗体获得的天然产生的可变区(轻链和重链)。
“人化抗体”指一种类型的工程抗体，它具有得自非人供体免疫球蛋白的CDR，该分子其余的免疫球蛋白来源部分得自一种或多种人免疫球蛋白。另外，可以改变框架支持残基以保持结合亲和力。参见例如Queen等，Proc.Natl Acad Sci USA,86,10029-10032(1989),Hodgson等，Bio/technology,9,421(1991)。
术语“供体抗体”指一种单克隆抗体或重组抗体，它将其可变区、CDR或其它功能片段或其类似物的核苷酸序列贡献给第一免疫球蛋白部分，以便提供改变的免疫球蛋白编码区和产生的具有该供体抗体抗原专一性和中和活性特征的表达的改变抗体。适于在本发明使用的一个供体抗体是称为BC2的鼠自限制中和单克隆抗体。其它合适的供体抗体包括称为BC1、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC和HFXI的鼠自限制中和单克隆抗体。
术语“受体抗体”指与该供体抗体异源的单克隆抗体或重组抗体，它把编码重链和/或轻链框架区和/或其重链和/或轻链恒定区的核酸序列的全部或一部分贡献给第一免疫球蛋白部分。人抗体最好是该受体抗体。
“CDR”定义为抗体互补决定区的氨基酸序列，它是免疫球蛋白重链和轻链的超变区。参见例如Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第四版，U.S.Department of Health and HumanService,NationalInstitute of Health(1987)。免疫球蛋白的可变部分中有三条重链和三条轻链CDR或CDR区。因此，如果合适，本文用的“CDR”指全部三条重链CDR或全部三条轻链CDR或全部重链和全部轻链的CDR。
CDR提供抗体与抗原或抗原决定簇结合的大多数接触残基。在本发明中的目的CDR是从供体抗体可变重链和轻链序列获得的，并且包括天然产生的CDR类似物，该类似物也共享或保留持与从中获得它们的供体抗体同样的抗原结合专一性和/或中和能力。
“共享抗原结合专一性或中和能力”意味着例如，虽然mAb BC2的特征可能在于某种水平的自限制中和活性，而由适当结构环境中的BC2的核酸序列编码的CDR可能有较低的或较高的活性。预期在这种环境中BC2的CDR将仍然识别与BC2相同的抗原决定簇。
“功能片段”是一部分重链或轻链可变序列(如免疫球蛋白可变区的氨基或羧基末端的较短的缺失)，它保留与从中获得片段的抗体相同的抗原结合专一性和/或中和能力。
“类似物”是由至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，其中所述修饰可以是化学的或置换或几个(即不超过10个)氨基酸的重排，修饰允许该氨基酸序列保留未修饰序列的生物学特征，如抗原专一性和高亲和力。典型的类似物包括沉默突变，它可通过替代构建物以在CDR-编码区内部或周围产生某些核酸内切酶限制位点。
类似物也可能呈现为等位基因变异。“等位基因变异或修饰”是在编码本发明的氨基酸序列或肽序列的核酸序列中的改变。这类变异和修饰可能归结于在遗传密码中的简并性或可能有意设计以提供需要的特征。这些变异或修饰可能导致或不导致在任何编码的氨基酸序列中的改变。
术语“效应剂”指通过常规方法可以与改变抗体和/或该供体抗体的天然或合成的轻链或重链或该供体抗体的其它片段结合的非蛋白载体分子。这类非蛋白载体可以包括用于诊断领域的常规载体(如聚苯乙烯或其它塑料珠)、如用在BIAcore(Pharmacia)系统中的多糖或用于医学领域并对人类和动物的给予是安全的其它非蛋白物质。其它效应剂可以包括螯合重金属原子或放射性同位素的大环。这类效应剂也可以用于增加该改变抗体的半衰期，例如聚乙二醇。
对于用于构建本发明的抗体、改变抗体和片段，可以使用诸如牛、羊、猴子、鸡、啮齿动物(如小鼠和大鼠)之类的非人类物种，以根据呈现的人凝血因子产生需要的免疫球蛋白，人凝血因子最好是因子Ⅸ/Ⅸa、Ⅹ/Ⅹa、Ⅺ/Ⅺa、Ⅷ/Ⅷa、Ⅴ/Ⅴa、Ⅶ/Ⅶa或凝血酶或其肽抗原决定簇。可以使用常规杂交瘤技术以为各个凝血因子提供一个分泌非人mAb的杂交瘤细胞系。然后按实施例部分描述的，用包被到96孔板上的因子Ⅸ/Ⅸa、Ⅹ/Ⅹa、Ⅺ/Ⅺa、Ⅷ/Ⅷa、Ⅴ/Ⅴa、Ⅶ/Ⅶa或凝血酶，或者用结合到包被链亲和素的平板的生物素标记的因子Ⅸ/Ⅸa、Ⅹ/Ⅹa、Ⅺ/Ⅺa、Ⅷ/Ⅷa、Ⅴ/Ⅴa、Ⅶ/Ⅶa或凝血酶，筛选这种杂交瘤的结合。另一方面，用本领域技术人员已知的技术可以产生全长的人mAb并将其用于本发明。
本发明的一个典型的自限制中和mAb是mAb BC2，一个可以用来研制嵌合分子或人化分子的鼠抗体。该BC2 mAb的特征在于对于凝结时间的自限制抑制活性。正如aPTT分析测定的，BC2 mAb对凝结时间的影响显示出大约100秒的最大值。该BC2 mAb也结合因子Ⅸa，抑制因子Ⅸ向Ⅸa转化以及抑制因子Ⅸa的活性。二价金属辅助因子为活性所需要，mAb表现出与Mn2+相比更优选Ca2+。在aPTT分析中观察到的IC50将近50nM。该BC2 mAb显示出与大鼠的种交叉反应性并且属于同种型IgG2a。
其它想要的供体抗体是鼠的mAb、BC1、9E4(2)F4和11G4(1)B9。这些mAb的特征在于对凝结时间的自限制抑制活性。正如aPTT分析测定的，这些mAb对凝结时间的影响显示出的最大值对9E4(2)F4大约为90至100秒，而对11G4(1)B9大约为80秒。该BC1 mAb也结合因子Ⅸa，抑制因子Ⅸa活性，但不抑制因子Ⅸ向Ⅸa转化。其活性不需要金属辅助因子。在aPTT分析中观察到BC1的IC50接近35nM。该BC1 mAb属于同种型IgG1。
而另一想要的其特征在于对凝结时间的自限制抑制活性的供体抗体是鼠mAb HFXLC。正如aPTT分析测定的，HFXLC mAb对凝结时间的影响显示出大约50秒至60秒的最大值。该HFXLC mAb结合因子Ⅹ轻链，并且抑制因子Ⅹ/Ⅹa活性。在aPTT分析中观察到IC50接近20nM。
而另一想要的其特征在于对凝结时间的自限制抑制活性的供体抗体是鼠mAb HFXI。正如aPTT分析测定的，该HFXI mAb对凝结时间的影响显示出大约100秒的最大值。该HFXImAb结合因子Ⅺ并且抑制因子Ⅺ/Ⅺa活性。在aPTT分析中观察到IC50接近30nM。
尽管不打算结合与作用机制有关的任何特定理论，但这些mAb似乎是通过非竞争性或变构机制调节凝血，从而获得仅仅部分的抑制。
本发明不限于BC1、BC2、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC、HFXI或它们的超变(即CDR)序列的使用。特征为自限制中和活性的任何其它合适的高亲和性抗体和对应的CDR都可以替代它们。在以下描述作为BC1、BC2、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC或HFXI的供体抗体的鉴别仅仅为了说明和简单地描述。
本发明也包括得自导向合适的人凝血因子或辅助因子的mAb的Fab片段或F(ab’)2片段。这些片段可用作具有抗凝血因子的自限制中和活性药剂，它们最好是抗因子Ⅸ/Ⅸa、Ⅹ/Ⅹa、Ⅺ/Ⅺa、Ⅷ/Ⅷa、Ⅴ/Ⅴa、Ⅶ/Ⅶa或凝血酶。一个Fab片段包含全部轻链和重链的氨基末端部分。一个F(ab’)2片段是由两个Fab片段通过二硫键结合形成的片段。mAb BC1、BC2、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC和HFXI以及其它相似的高亲和性抗体，提供可通过常规方法(如用合适的蛋白水解酶、木瓜蛋白酶和/或胃蛋白酶切割mAb、或用重组方法)获得的Fab片段和F(ab’)2片段的来源。这些Fab和F(ab’)2片段本身可用作治疗剂、预防剂和诊断剂，以及用作包括用于形成本文所述重组抗体或人化抗体的可变区和CDR序列在内的序列供体。
Fab和F(ab’)2片段可通过一个联合噬菌体文库构建(参见例如Winter等，Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994))或通过免疫球蛋白链改组构建(参见例如Marks等，Bio/Technology,10:779-783(1992))(这两篇论文通过引用全部结合到本文中)，其中允许来自选定抗体(如BC2)的Fd或VH免疫球蛋白与一个轻链免疫球蛋白的所有组成部分、VL(或VK)结合以形成新的Fab。相反，可以让来自选定抗体的轻链免疫球蛋白与一个重链免疫球蛋白的所有组成部分、VH(或Fd)结合，形成新的Fab。可通过让mAb BC2的Fd与一个轻链免疫球蛋白的所有组成部分结合获得自限制中和因子ⅨFab。因此，可用来自链改组技术的独特的序列(核苷酸和氨基酸)回收中和Fab。
上面描述的mAb BC2或其它抗体可以提供序列，如可变重链和/或轻链肽序列、框架序列、CDR序列、功能片段和其类似物、以及编码它们的核酸序列，用于设计和获得特征为该供体抗体的抗原结合专一性的各种改抗体。
编码可变轻链和重链肽列的本发明的核酸序列或其片段也可用于在编码CDR或框架区的核酸序列中诱变导入特定变化，以及用于将产生的修饰或融合核酸序列加入质粒中以进行表达。例如，框架区和CDR编码区的核苷酸序列中的沉默置换可用于产生便于诱变的CDR和/或框架区插入的限制性内切酶位点。这些CDR编码区可以用于本发明人化抗体的构建。
SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中列出了BC2重链可变区的核酸和氨基酸序列。SEQ ID NO:8、9和10中列出了该区的CDR序列。
SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:11中列出了BC2轻链可变区的核酸和氨基酸序列。SEQ ID NO:12、13和14中列出了该区的CDR序列。
考虑到遗传密码的简并性，可以构建编码本发明的可变重链和轻链氨基酸序列和CDR序列和功能片段以及享有该供体抗体的抗原专一性的类似物的各种编码序列。编码可变链肽序列或CDR的本发明分离的核酸序列或其片段当与一个第二免疫球蛋白部分操作性地结合时，可用来产生改变抗体，例如本发明的嵌合抗体或人化抗体或其它工程抗体。
应当注意，除了编码本文所述的改变抗体部分和抗体的分离的核酸序列，本发明还包括其它这类核酸序列，例如与天然的CDR编码序列互补的序列或与CDR-编码区周围修饰的人框架区互补的序列。有用的DNA序列包括那些在严格杂交条件下与所述DNA序列杂交的序列。见，T.Maniatis等，分子克隆(实验室手册)，冷泉港实验室(1982),第387-389页。一个这种严格杂交条件的例子是在4×SSC、65℃杂交，接着在0.1×SSC、65℃洗涤一小时。或者，典型的严格杂交条件是42℃下的50％甲酰胺、4×SSC。最好是，这些杂交DNA序列的长度至少为大约18个核苷酸，即大约一个CDR的大小。
改变的免疫球蛋白分子可编码改变抗体，它包括工程抗体，诸如嵌合抗体和人化抗体。一个需要的改变免疫球蛋白的编码区含有插入诸如人框架或人免疫球蛋白可变区之类的第一免疫球蛋白部分中、编码具有因子Ⅸ/Ⅸa、Ⅹ/Ⅹa、Ⅺ/Ⅺa、Ⅷ/Ⅷa、Ⅴ/Ⅴa、Ⅶ/Ⅶa或凝血酶抗体(最好是诸如本发明提供的高亲和性抗体)的抗原专一性的肽的CDR编码区。
最好是，该第一免疫球蛋白部分是操作性地与一个第二免疫球蛋白部分连接。以上定义了第二免疫球蛋白部分，它可以包括编码目的第二抗体区(例如Fc区)的序列。第二免疫球蛋白部分也可以包括在框架中或通过接头序列与该轻链或重链恒定区融合的另一免疫球蛋白的编码序列。可以设计导向凝血因子功能片段或其类似物的工程抗体，以引起增强与同一抗体的结合。
该第二免疫球蛋白部分也可以与以上定义的效应剂(包括非蛋白载体分子)结合，可通过常规方法操作性地将效应剂与该第二免疫球蛋白部分连接。
在该第二免疫球蛋白部分(如抗体序列)与该效应剂之间的融合或连接可通过任何合适的方法进行，如通过常规共价键或离子键、蛋白融合、或异种-双功能的交叉-接头，如碳二亚胺、戊二醛等。这类技术是本领域已知的并在常规化学和生物化学书中都有描述。
另外，也可以将在该第二免疫球蛋白部分和该效应剂之间简单地提供需要量空间的常规接头序列构建成改变的免疫球蛋白编码区。这类接头的设计对那些本领域技术人员是公知的。
此外，可以通过那些本领域技术人员公知的技术修饰本发明分子的信号序列以增强表达。
一个优选的改变抗体含有具有mAb BC2的抗原专一性的可变重链和/或轻链肽或蛋白序列(如VH和VL链)。本发明再一想要的改变抗体的特征在于该氨基酸序列包含至少一个、最好是全部鼠抗体分子BC2的重链和/或轻链的可变区的CDR或一个功能片段或其类似物，其余序列得自人类来源。
在另一个实施方案中，本发明的改变抗体可以已与另外的药剂连接。例如，可用重组DNA技术产生本发明的改变抗体，其中完整抗体分子的Fc片段或CH2 CH3域已被一个酶分子或其它可检测的分子(即一个多肽效应分子或报道分子)取代。
该第二免疫球蛋白部分也可以操作性地与非免疫球蛋白肽、蛋白或其片段连接，这些肽和蛋白及其片段对具有对凝血因子、最好是因子Ⅸ/Ⅸa、Ⅹ/Ⅹa、Ⅺ/Ⅺa、Ⅷ/Ⅷa、Ⅴ/Ⅴa、Ⅶ/Ⅶa或凝血酶的抗原专一性的含CDR序列是异源的。产生的蛋白表达时可以显示出抗原专一性和非免疫球蛋白的特性。那个融合部分的特性可以是例如功能特性(诸如另一结合域或受体域)或治疗特性(如果该融合部分本身是治疗蛋白)或另外的抗原特性。
本发明的另一想要的蛋白可以包含一个完整的抗体分子，它具有全长的重链和轻链或任何其独立的片段(诸如Fab或F(ab’)2片段)、一个重链二聚物或任何其基本重组片段(诸如Fv或单链抗体(SCA))或任何其它与选定供体mAb(如mAb BC1、BC2、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC或HFX)有相同专一性的分子。这种蛋白可以以改变抗体的形式使用或可以以其非融合形式使用。
每当从不同于该供体抗体的抗体(如任何同种型或任何类的免疫球蛋白框架的类或恒定区)得到该第二免疫球蛋白部分时，总是产生工程抗体。工程抗体可以包含一种来源(如该受体抗体)的免疫球蛋白(Ig)恒定区和可变框架区和一个或多个(最好是全部)来自该供体抗体的CDR，该供体抗体例如为本文描述的抗因子Ⅸ/Ⅸa、Ⅹ/Ⅹa、Ⅺ/Ⅺa、Ⅷ/Ⅷa、Ⅴ/Ⅴa、Ⅶ/Ⅶa或凝血酶的抗体。另外，为了保留供体抗体的抗原结合专一性，可以在核酸或氨基酸水平产进行该受体mAb轻链和/或重链可变域框架区或该供体CDR区的改变(如缺失、置换或加入)。
将这类工程抗体设计成使用凝血因子mAb的一个(或两个)可变重链和/或轻链(可选地如所述方法修饰)和一个或多个的重链或轻链CDR。本发明的工程抗体显示出自限制中和活性。
这类工程抗体可以包括含有选定人免疫球蛋白或亚型的框架区的人化抗体或含有与该凝血因子抗体功能片段融合的人重链和轻链恒定区的嵌合抗体。一种合适的人(或其它动物)受体抗体可以是选自常规数据库(如KABAT数据库、Los Alamos数据库和瑞士蛋白质数据库)的受体抗体，通过与该供体抗体的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性选定抗体。特征在于与该供体抗体的框架区同源(在氨基酸基础上)的人抗体可能适合于提供用于插入该供体CDR的一个重链可变框架区。可以以类似的方法选择能贡献出轻链可变框架区的适合的受体抗体。应当注意，该受体抗体的重链和轻链不需要起源于同一受体抗体。
最好是，异源框架和恒定区选自人免疫球蛋白的类和同种型，例如IgG(亚型1-4)、IgM、IgA和IgE。然而，该受体抗体不需要仅仅包含人免疫球蛋白序列。例如可以构建一个基因，其中编码部分人免疫球蛋白链的DNA序列与编码非免疫球蛋白氨基酸序列(诸如多肽效应物分子或报道分子)的DNA序列融合。
一种特别优选的人化抗体含有插入一个选定人抗体序列的框架区的BC2的CDR。对于中和人化抗体，将一个、两个或最好是三个因子Ⅸ抗体重链和/或轻链可变区的CDR插入该选定人抗体序列的框架区。
最好是，在人化抗体中，通过一个或多个CDR取代，加工人重链和轻链中的可变结构域。可能使用所有六个CDR、或不到六个CDR的各种组合。最好取代所有六个CDR。可以仅在人重链中取代CDR，用作人受体抗体未修饰的轻链。另一方面，一个相容的轻链可以通过依靠常规抗体数据库从另外的人抗体选择。其余的工程抗体可以得自任何合适的受体人免疫球蛋白。
因此该工程人化抗体优选具有天然人抗体或其片段的结构，并且具有用于有效治疗用途(如治疗人的血栓形成和栓塞疾病)所需性质的组合。
最优选的是，所述人化抗体具有SEQ ID NO:31、52或89中提出的重链氨基酸序列。也最优选人化抗体具有SEQ ID NO:44、57、62、74、78或99中提出的轻链氨基酸序列。特别优选的是人化抗体SB 249413，其重链具有SEQ ID NO:31中提出的氨基酸序列，而轻链具有如SEQ ID NO:44中列出的氨基酸序列。也特别优选人化抗体SB 249415，其重链具有SEQ ID NO:52中提出的氨基酸序列，而轻链具有如SEQ ID NO:57中提出的氨基酸序列。也特别推荐的是人化抗体SB 249416，其重链具有SEQ ID NO:52中提出的氨基酸序列，而轻链具有SEQ ID NO:62中提出的氨基酸序列。还特别推荐的是人化抗体SB 249417，其重链具有SEQ ID NO:52中提出的氨基酸序列，而轻链具有SEQ ID NO:74中提出的氨基酸序列。还特别推荐的是人化抗体SB 257731，其重链具有SEQ ID NO:52中提出的氨基酸序列，而轻链具有SEQ ID NO:78中提出的氨基酸序列。还特别推荐的是人化抗体SB 257732，其重链具有SEQ ID NO:89中提出的氨基酸序列，而轻链具有SEQ ID NO:99中提出的氨基酸序列。
那些本领域技术人员会理解，可以通过在可变结构域氨基酸中进行改变而进一步修饰工程抗体，不需要影响该供体抗体(即类似物)的专一性和高亲和性。可以预料，或者在可变结构域框架中，或着在CDR中或着在二者中，用其它氨基酸置换重链和轻链的氨基酸。这些置换物可通过该供体抗体或来自一个特定亚组的共有序列供给。
另外，可改变该恒定区以增强或减小本发明分子的选择性性质，例如二聚作用、与Fc受体的结合、或结合并激活补体的能力(参见例如Angal等，Mol.Immunol,30,105-108(1993),Xu等，J.Biol.Chem,269,3469-3474(1994),Winter等，EP 307434-B)。
为嵌合抗体的改变抗体与以上描述的人化抗体不同，它提供与人免疫球蛋白两条链的恒定区结合的整个非人供体抗体重链和轻链可变区，包括框架区。可以预料，保留对应于本发明人化抗体的另一非人序列的嵌合抗体在人中可以引起显著的免疫应答。
这类抗体可用于以下讨论的血栓形成和栓塞疾病的预防和治疗中。
最好是，通过以下方法，在改变抗体的构建中利用可变轻链和/或重链序列和mAb BC2的CDR或其它合适的供体mAb，如BC1、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC、HFXI和它们的编码核酸序列，最好是本发明的人化抗体。相同或相似的技术也可以用于产生本发明的其它实施方案。
以常规方法克隆产生选定供体mAb(如鼠抗体BC2)的杂交瘤，并且通过本领域技术人员已知的技术(如在Sambrook等，“分子克隆实验室手册”(1989)第二版，冷泉港实验室中描述的技术)获得它的重链和轻链可变区的DNA。用多核苷酸引物和逆转录酶获得这样的BC2可变的重链和轻链区，它至少含有所述CDR-编码区和那些为了保留该供体mAb结合专一性所需的受体mAb轻链和/或重链可变结构域框架区的BC2可变的重链和轻链区，以及其余的得自人免疫球蛋白抗体链的免疫球蛋白来源部分。用一个已知的数据库并通过与其它抗体比较鉴别CDR-编码区。
然后可制备鼠/人嵌合抗体并分析其结合能力。这样一种嵌合抗体含有整个非人供体抗体的VH区和VL区，两条链都与人Ig恒定区结合。
用计算机数据库如KABAT鉴别来自人抗体的重链可变区的同源框架区，并且选择具有与BC2同源性的人抗体作为该受体抗体。用在框架区中任选的核苷酸置换以插入限制性位点，设计人抗体框架中含有BC2 CDR编码区的合成重链可变区的序列。然后用合成的长寡聚体合成该设计的序列。或者，通过重叠寡核苷酸合成该设计的序列，通过多聚酶链反应(PCR)进行扩增，并纠正错误。可用同样的方法设计合适的轻链可变框架区。
可从嵌合抗体获得人化抗体，或最好是通过恰当地在选定重链和轻链框架中插入来自重链和轻链的供体mAb CDR-编码区来合成制备人化抗体。或者，可用标准诱变技术制备本发明的人化抗体。因此，产生的人化抗体含有人框架区和供体mAb CDR编码区。可以有框架残基的随后操作。可在诸如COS、CHO或骨髓瘤细胞的重组宿主细胞中表达得到的人化抗体。用这种技术在其它合适的因子Ⅸ专一性或其它凝血因子专一性的自限制的、中和、高亲和性、非人抗体上制备其它人化抗体。
通过将这些改变抗体的编码序列与常规调节控制序列操作性地结合，产生常规表达载体或重组质粒，该常规调节控制序列能在宿主细胞中控制复制和表达和/或从宿主细胞中分泌。调节序列包括启动子序列(如CMV启动子)和信号序列，后者可得自其它已知的抗体。同样地，可产生一个第二表达载体，它具有编码互补抗体轻链或重链的DNA序列。最好是，除了编码序列和可选择的标记方面外，该第二表达载体与第一表达载体是等同的，以便尽可能地保证功能性地表达每个多肽链。或者，该改变抗体的重链和轻链密码序列可能存在于单个载体上。
通过常规的技术，用第一和第二载体共转染选定宿主细胞(或简单地用单个载体转染)，以产生本发明转染的宿主细胞，该转染的宿主细胞既含重组或合成的轻链又含重链。然后通过常规的技术培养转染的细胞，以产生本发明的工程抗体。通过适合的分析，如ELISA或RIA，从培养物筛选包括该重组重链和/或轻链的联合的人化抗体。可用同样的常规技术构建本发明其它改变抗体和分子。
在本发明方法和本发明组合物的构建中使用的用于克隆和亚克隆步骤的适合载体可由本领域技术人员选择。例如，可使用诸如Amersham或Parmacia的供应商处可商购的pUC系列的克隆载体，诸如pUC19。另外，能够容易地复制的、具有丰富的克隆位点和选择性基因(如抗生素抗性)并且容易操作的任何载体都可用于克隆。因此，克隆载体的选择不是在本发明中的个限制因素。
同样，本领域技术人员可以从任何常规载体中选择用来表达根据本发明的工程抗体的载体。所述载体也含有在选定宿主细胞中指导异源DNA序列复制和表达的选定调节序列(诸如CMV启动子)。这些载体含有编码该工程抗体或改变免疫球蛋白编码区编码的上述DNA序列。另外，所述载体可以加入通过为易于操作而插入所需限制性位点进行修饰的选定免疫球蛋白序列。
所述表达载体的特征也可以在于适于异源序列扩增表达的基因，例如哺乳类二氢叶酸还原酶基因(DHFR)。其它优选的载体序列包括poly A信号序列(诸如来自牛生长激素(BGH)的)和β球蛋白启动子序列(βglopro)。这里用的表达载体可以通过本领域技术人员公知的技术合成。
这类载体的成分，如复制子、选择基因、增强子、启动子、信号序列等等可以从商品化或天然来源中获得，或通过用于在选定宿主中指导重组DNA产物表达和/或分泌的已知方法来合成。为此，也可以选择适用于哺乳动物、细菌、昆虫、酵母和真菌表达的其它表达载体，这些载体的许多类型是本领域已知的。
本发明也包括含所述工程抗体或其改变的免疫球蛋白分子编码序列的重组质粒转染的细胞系。用于所述克隆和这些克隆载体的其它操纵的宿主细胞也是常规的。然而，最好是将大肠杆菌的不同菌株用于在本发明改变抗体构造中的克隆载体的复制和其它步骤。
适合于本发明的工程抗体或改变抗体表达的宿主细胞或细胞系优选诸如CHO、COS、成纤维细胞(如3T3)和骨髓细胞的哺乳动物细胞，最优选CHO或骨髓细胞。可以用人细胞，由此可用人糖基化形式修饰该分子。或者，可使用其它真核生物细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞的选择和用于转化、培养、扩增、筛选和生产产物以及纯化的方法在本领域是公知的，见上文，Sambrook等。
细菌细胞证明可用作适于本发明重组Fab表达的宿主细胞(参见例如Pluckthun,A,Immunol.Rev.,130,151-188(1992))。然而，由于在细菌细胞中表达的蛋白倾向于伸展或不当折叠形式或非糖基化形式，因此在细菌细胞中产生的任何重组Fab将不得不对抗原结合能力的保持进行筛选。如果细菌细胞表达的分子以正确的折叠形式产生，则该细菌细胞将是需要的宿主。例如，众所周知用于表达的大肠杆菌的各种菌株在生物技术领域作为宿主细胞。也可用枯草杆菌、链霉菌、其它杆菌等的各种菌株。
如果需要，那些本领域技术人员已知的酵母菌株细胞以及昆虫细胞(如果蝇和鳞翅目)和病毒表达系统也可作为宿主细胞应用。参见例如Miller等，Genetic Engineering,8,277-298,Plenum Press(1986)和其中引用的参考文献。
可以构建本发明载体的一般方法、产生本发明宿主细胞需要的转染方法和从这种宿主细胞产生本发明改变抗体必需的培养方法都是常规技术。同样，本发明的改变抗体一旦产生，则可以根据本领域的标准方法，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等，从细胞培养物中进行纯化。这类技术是本领域的技术并且不限制本发明。
可以利用诸如在美国专利4,873,316号中描述的表达人化抗体的再一方法在转基因动物中进行表达。这涉及用动物的酪蛋白启动子的表达系统，当该表达系统通过转基因进入哺乳动物时，它允许雌性在它的奶中产生需要的重组蛋白。
该工程抗体一旦通过需要的方法表达，那么通过用一种适合的分析检测其体外活性。目前，用常规的ELISA分析形式评定该工程抗体与因子Ⅸ或与其它适合的凝血因子的定性和定量结合。另外，也可用其它体外分析在随后进行的人类临床研究之前检验中和效力，这些临床研究忽略通常清除机制，评价该工程抗体在身体中的持续性。
描述从BC2制备人化抗体的方法后，本领域技术人员也可从本文描述的其它供体抗体、可变区序列和CDR肽构建人化抗体。用以该工程抗体的受体潜在识别为“自身的”的可变区框架可产生工程抗体。可实现对该可变区框架的较小的修饰以引起在抗原结合中大的增加，而对受体的免疫原性没有明显的增加。这类工程抗体可以有效地治疗人类由凝血因子介导的疾病。这类抗体也可以用于这类疾病的诊断。
本发明也涉及在动物特别是在人类中抑制血栓形成的方法，它包含给予有效剂量的具有自限制中和活性的抗凝血因子单克隆抗体。优选凝血因子来自特性或共同凝血途径。最优选该抗凝血因子单克隆抗体是抗因子Ⅸ、抗因子Ⅸa、抗因子Ⅹ、抗因子Ⅹa、抗因子Ⅺ、抗因子Ⅺa、抗因子Ⅷ、抗因子Ⅷa、抗因子Ⅴ、抗因子Ⅴa、抗因子Ⅶ、抗因子Ⅶa或抗凝血酶。该mAb可以包括本文描述的一种或多种工程抗体或改变抗体或其片段。
另一方面，乙酰水杨酸可与抗凝血因子单克隆抗体结合给予。在某些情况下，混合疗法降低抗凝血因子单克隆抗体的治疗有效剂量。
通过与相应的凝血因子结合以及随后凝血级联的自限制抑制，产生由本发明分子的使用诱导的治疗应答。因此，本发明的分子当在适于治疗用途的制剂中时，对于对异常凝结活性敏感或经受异常凝结活性的人是非常需要的，异常的凝结活性与心肌梗塞形成、不稳定心绞痛、心房纤维性颤动、中风、肾损伤、肺栓塞、深静脉血栓形成和人造器官以及假体移植物有关，但不限于上述。
本发明改变抗体、抗体和其片段也可和其它抗体一起使用，特别是与本发明抗体导向的引起该病的其它标志物(抗原决定簇)反应的人mAb。
本发明的治疗剂对异常凝结疾病的治疗相信需要1天至3周或根据需要进行。这代表超过目前所用的抗凝血药肝素和华法令的一个相当大的进步。治疗的剂量和持续时间涉及本发明分子在人类循环中的相对持续时间，并可由本领域技术人员根据待治疗的疾病和病人的一般健康状况调节。
本发明治疗剂的用药模式可以是输送该药剂到宿主的任何合适途径。本发明的改变抗体、抗体、工程抗体和它们的片段以及药用组合物对于非肠道的途径给药(即皮下、肌内、静脉内或鼻内用药)特别有用。
可以将本发明的治疗剂制备为药用组合物，它含有药学上可接受的载体中的有效量的本发明工程(如人化)抗体作为活性成分。另一方面，本发明的药用组合物也可含乙酰水杨酸。在本发明的预防剂中，最好是含该工程抗体、最好是在生理pH下缓冲的易于注射的形式的水性悬液或溶液。用于非肠道途径给药的组合物通常将包括本发明工程抗体的溶液或溶于药学上可接受的载体(最好是水性载体)的其混合剂。可使用各种水性载体，例如0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。这些溶液是无菌的并通常是无特殊物质的。可通过常规的众所周知的灭菌技术(如过滤)灭菌这些溶液。所述组合物可以含有接近生理条件(如pH调节和缓冲剂等)所需的药学上可接受的辅助物质。在这种药用制剂中本发明抗体浓度的变化范围可以很宽，即从不到大约0.5％(重量)(通常为大约1％或至少为大约1％)至高至15％或20％(重量)，并且根据选定给药的特定模式，主要根据流体体积、粘度等进行选择。
因此，用于肌肉注射的本发明药用组合物可以制备为含1ml无菌缓冲水和在大约1ng至大约100mg(例如大约50ng至大约30mg，或更优选是大约5mg至大约25mg)的一种本发明工程抗体。同样，用于静脉内输注的本发明药用组合物可制备为含大约250ml的无菌Ringer溶液和大约1mg至大约30mg(最好是5mg至大约25mg)的本发明工程抗体。制备非肠道途径给药的组合物的实际方法对那些本领域技术人员是已知的或是显而易见，并且在例如“Remington’s PharnaceuticalScience”，第15版，Mack Publishing Compang,Easton,Pensylvania中有更详细的描述。
本发明的治疗剂当在药学制剂中时，最好以单位剂量形式存在。那些本领域技术人员可容易地确定合适的治疗有效剂量。为了有效地治疗人或动物的血栓形成或栓塞疾病，应以非肠道途径，最好是静脉注射或肌内注射，给予每kg体重大约0.1mg至大约20mg剂量的本发明蛋白或抗体。如果需要，可在血栓形成反应期间由内科医师适当地选择合适的时间间隔重复这种剂量。
可冻干本文描述的抗体、改变抗体或其片段，以用于贮存，并在使用前在合适的载体中重建。已表明该技术对常规的免疫球蛋白是有效的并且可使用公知的技术冻干和重建。
现在参考以下特定的非限制性实施例描述本发明。
实施例1抗因子Ⅸ单克隆抗体的制备和筛选雌性Balb/c小鼠注射按Jenny,R.等(Prep.Biochem.16,227-245(1986))的描述纯化的人因子Ⅸ。通常，每只小鼠接受溶于0.15ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)并与0.15ml完全弗氏佐剂混合的100μg蛋白的起始注射。在2-3月的时间内大约每两周给予0.15ml PBS与0.15ml不完全弗氏佐剂中的50μg蛋白的加强免疫接种。在最后一次加强后，在脾/骨髓瘤细胞融合前三天，小鼠接受含50μg因子Ⅸ的PBS。从免疫的小鼠中分离脾细胞并按Oi,V.T.等(“Selected Methods in CellularImmunology”Mishell,B.B.和Shigii,S.M.,eds.,Freeman Press,SanFrancisco)所述，用聚乙二醇将其与NS-1骨髓瘤细胞(Kohler,G.等，Eur.J.Immunol.6,292-295(1976))融合。融合后，在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中重新悬浮细胞，并且这些等份置于含0.5ml腹腔灌洗细胞条件培养基的四个24孔板的每个孔中。第二天，每个孔接受在含10％胎牛血清的1640培养基中的1.0ml 2×10-4M次黄嘌呤、8×10-7M氨基蝶呤和3.2×10-5M胸苷。每3-4天通过除去一半的培养基并用新鲜的含1×10-4M次黄嘌呤和1.6×10-5M胸苷的培养基取代来饲养所述细胞。
将近两周后，从每个孔取出1.0ml杂交瘤培养基，并用Jenny,R.J.等(Meth.Enzymol.222,400-416(1993))描述的ELISA分析检测抗因子Ⅸ抗体。简短地说，将因子Ⅸ固定在96孔微量滴定板的塑料孔上。然后在孔中温育杂交瘤上清液或纯化的抗体稀释液。洗涤所述孔并用结合在辣根过氧化物酶和生色底物邻联二茴香胺的羊抗鼠免疫球蛋白第二抗体检测抗体-抗原复合物的存在。
通过限制稀释将含抗因子Ⅸ抗体的孔在96孔板中亚克隆并生长。通过以上描述的ELISA分析，对因子Ⅸ的抗体筛选来自克隆的杂交瘤细胞培养物的上清液，并且将来自阳性杂交瘤的细胞扩大培养、冰冻、在液氮中贮存，然后在小鼠中作为腹水肿瘤生长。
实施例2抗凝血因子抗体在凝血中的自限制作用在fibrometer(Becton-Dickinson Microbiology Systems,Cockeysville,Maryland)中，用Baxter参考方法LIB0293-J,3/93修订版(BaxterScientific,Edison,New Jersey)测定增加浓度的抗凝血因子抗体对人血浆的活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)的影响。
在实验开始前，在该fibrometer的加热室中放入含2-3ml的0.02MCaCl2的5ml试管。人血浆样品或者是新鲜取出的或者是保持在冰上或按Hemostasis参比血浆(American Diagnostics,Greenwich,Connecticut)的厂商建议重建的。
将来自猪肠粘膜的未分级分离肝素(Sigma Chemical,St.Louis,Missouri)、来自猪肠粘膜的低分子量肝素(Lovenox,enoxaparin sodium,Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals,Collegeville,Pennsylvania)或mAb抗凝血药制备为大约50μM的贮液，并直接连续地稀释到该测试血浆中。包括一个含血浆不含凝血剂的空白作为参比。
将两个fibroTubefibrometer杯分别注入100μl测试血浆或100μl具有抗凝血剂的测试血浆和125μl的肌动蛋白活化的cephaoplastin试剂(肌动蛋白试剂，来自鞣花酸中的兔脑脑磷脂，得自BaxterScientific)，于37℃放在fibrometer孔中。
一分钟后，将100μl肌动蛋白试剂转移到含血浆的杯中并用移液管将所述内容物混合几次。温育3分钟后，用自动移液器/定时-触发器(Becton-Dickinson)向血浆-肌动蛋白试剂混合物加入于37℃预温的100μl CaCl2。记录凝结时间，图1中的结果以随300μl总分析体积中抗凝血剂的终浓度变化的凝结时间表示。该分析中因子Ⅸ的标定浓度是30-40nM。
图1中显示的结果证明增加浓度的鼠抗因子Ⅸ mAb BC1和BC2对aPTT凝结时间的影响。通过延长aPTT，两种mAb都抑制凝结，并且两种mAb都达到对该aPTT的最终饱和作用。BC1和BC2的IC50值分别近似于～35nM和～50nM，但标明了在对两种抗体的最大应答的差异。饱和浓度的BC1将aPTT增加大约50％，增至～40秒。另一方面，BC2将该aPTT增加3.5倍，增至大约90秒。用肝素在抗凝血治疗中使用的治疗靶范围是突出的。结果表明将两个mAb归类在肝素治疗的aPTT范围。
mAb BC1和BC2的性质总结在表Ⅰ中。每个BC mAb都识别酶原、因子Ⅸ以及该活性蛋白酶、因子Ⅸa，但只有BC2能阻断酶原活化和蛋白酶活性。发现BC1和BC2与Cynomologous猴因子Ⅸ交叉反应。另外，BC2也与大鼠因子Ⅸ交叉反应。表Ⅰ.抗因子Ⅸ mAb的体外性质总结BC1 BC2结合因子Ⅸ是 是结合因子Ⅸa 是 是抑制Ⅸ向Ⅸa转化 否 是抑制Xase复合物中 是 是的Ⅸa活性辅助因子需求 否二价金属Ca2+＞Mn2+
150350IC50,nM ～35 ～50种交叉反应性 猴 大鼠，猴同种型 IgG1 IgG2图2显示的结果证明增加浓度的鼠抗因子Ⅸ mAb 9E4(2)F4和11G4(1)B9对aPTT凝结时间的影响。将用于分析的血浆稀释为正常浓度的一半，得到45秒的起始aPTT。通过延长aPTT，两种mAb都抑制凝结，并且都达到对aPTT的最终饱和作用。对于饱和浓度的9E4(2)F4和11G4(1)B9,9E4(2)F4将该aPTT增加到～90-100秒，而11G(1)B9将该aPPP至～80秒。结果表明两种mAb都在肝素治疗的aPTT范围的上限。
图3显示的结果证明增加浓度的鼠抗因子Ⅹ mAb HFXLC(抗轻链抗原决定簇)、HFXHC(抗重链决定簇)和抗因子Ⅺ mab HFXI对aPTT凝结时间的影响。这些mAb从酶研究实验室(South Bend,IN)获得。mAb HFXLC和HFXI通过延长该aPTT抑制凝结，并且两种mAb都达到对该aPTT的最终饱和作用。HFXLC的IC50值为～40nM；饱和浓度将该aPTT增加至～60秒。HFXI的IC50值为～20nM；饱和浓度将该aPTT增加至～100秒。结果表明HFXLC在肝素治疗的aPTT范围内，而HFXI落在肝素治疗范围的上限。mAbHFXHC对aPTT凝结时间无影响。
用因子Ⅷ的抗体、因子Ⅸa的辅助因子也观察到aPTT的自限制延长。例如，从Affinity Biologicals,Inc.购买的抗人因子Ⅷ抗体SAF8C-IG将该aPTT增加至大约65秒的最大值。用大约100nM抗体获得该aPTT的半最大值延长。
实施例3在大鼠血栓模型中鼠因子Ⅸ的效力为了评价在动脉血栓形成预防中抗因子Ⅸ抗体的效力，修改了Schumacher等(J.Cardio.Pharm.22,526-533(1993))报道的大鼠颈动脉血栓形成模型。该模型包括通过用于颈动脉表面的FeCl3溶液产生的氧基(oxygen radicals)对颈动脉内皮的部分损伤。
简短地说，用戊巴比妥钠麻醉大鼠，将颈静脉插管以进行静脉内注射，并且将左股骨动脉插管以监测血压和心率。用无菌技术通过颈部外科切口分离颈动脉，并安装用于血流量测定的磁性流动探针。一段时间的稳定后，建立以下变量的基准参数颈动脉血流量、动脉压、心率、激活部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)和凝血酶原时间(PT)。然后，将一张在50％FeCl3溶液中浸湿的预检测的Whatman滤纸放在颈动脉上15分钟，以将位于下面的内皮细胞完全损伤。去除FeCl3浸湿的纸后，在60分钟内继续完成实验。在实验的最后，从颈动脉取出颈动脉血栓并称重。
在颈动脉损伤开始以前15分钟给予所有药剂。检查以下的治疗并与因子Ⅸ mAb BC2比较。
1．肝素15、30、60或120U/kg大丸剂，接着在60分钟内分别进行0.5、1、2或4U/kg/分钟的灌注2．乙酰水杨酸(ASA，阿司匹林)5mg/kg大丸剂3．抗因子Ⅸ mAb BC2:1、3或6mg/kg大丸剂，接着在60分钟内分别进行0.3、1、或2μg/kg/分钟的灌注4．肝素30U/kg大丸剂+以5mg/kg的1U/kg/分钟+ASA5．抗因子Ⅸ mAb BC2:1mg/kg+以5mg/kg的0.3μg/kg/分钟+ASA图4和5通过显示肝素、ASA和因子Ⅸ mAb BC2对aPTT(图4)和PT(图5)的影响，证明抗凝血药/血栓形成制度的比较药理学。
用出血素质的关键指标aPTT作为用于该研究中的抗凝血药/血栓形成剂的抗出血倾向效力评价的初级判断标准。图4的结果证明由肝素引起的aPTT剂量依赖性延长，在两个较高剂量下凝结时间的最大延长超过该试验极限。单独ASA不显著增加aPTT，但与肝素结合时观察到明显的协同作用。因子Ⅸ mAb对aPTT具有中等影响，甚至在最高剂量下，凝结时间的增加也不超过临床使用的标准抗凝血药极限的3倍。最值得注意的是，与ASA结合的低剂量因子Ⅸ mAb BC2不改变该aPTT。
图5中数据表示在两个较高剂量下，并且通过ASA+肝素的结合，肝素也明显地延长PT，但任何剂量的单独因子Ⅸ mAb或与ASA联合的任何剂量延长不延长PT。
图6显示肝素、ASA和因子ⅨmAb对颈动脉阻塞的影响。结果表明所有载体处理动物的颈动脉对该损伤反应而阻塞。肝素剂量相关地抑制该颈动脉的阻塞。在最高剂量下，肝素完全阻止该颈动脉的阻塞；然而在该剂量下，可能没有触发凝血。单独的ASA对颈动脉阻塞只有较小的影响。与肝素结合的ASA也不能完全防止颈动脉阻塞。在两个较高剂量下，因子Ⅸ mAb完全阻止颈动脉阻塞，它没有延长临床所需靶以外的凝结。主要不能单独保证开放的较低剂量的因子ⅨmAb，证明了当与ASA结合给予时，完全抑制颈动脉阻塞。
图7显示肝素、ASA和因子ⅨmAb对血栓重量的影响。肝素剂量依赖性地减少颈动脉中的血栓块。然而，尽管凝血的完全阻止，仍然在颈动脉中发现某些残余的血栓。单独的或与肝素(30U/kg制度)结合的ASA对血栓重量只有部分影响。因子ⅨmAb剂量依赖性地减少血栓块并且高剂量实际上完全阻止了血栓形成。而且，低剂量的抗因子ⅨmAb和ASA的结合为完全阻止颈动脉阻塞而没有不利地影响凝血指标的一种制度，完全阻止血栓形成。
在大鼠颈动脉血栓形成模型中进行的研究清楚地证明，在一个高度形成血栓的动脉损伤模型中因子Ⅸ mAb在血栓形成的抑制方面的效力。最值得注意的是，在aPTT限定的所需治疗抗凝血药靶中证明了因子Ⅸ mAb的效力。此外，目前的标准抗凝药肝素仅仅在严重危害凝血至产生不可凝血液程度的剂量下才达到比得上因子Ⅸ mAb的效力。有趣的是，当ASA与抗因子ⅨmAb一起给予时，也证明了观察到的用ASA与肝素结合治疗获得的增强作用和协同作用。然而，不象导致增强抗血栓形成的和抗凝血作用的肝素和ASA的结合，因子ⅨmAb和ASA的结合导致抗血栓形成效力的增强，而在体外血液凝血参数上没有一致的作用。总之，该数据显示与肝素、ASA或肝素与ASA的组合相比，因子Ⅸ mAb优越的抗血栓形成能力。
实施例4大鼠血栓形成模型的扫描电子显微镜从假损伤(sham)、单独的氯化铁和氯化铁+6mg/kg因子Ⅸ抗体，3/组，在氯化铁使用15分钟后收集大鼠颈动脉的片段。用甲醛通过灌注固定所述动脉，并在损坏区的上下结扎。将固定的动脉脱水，在六甲基二甲硅氮烷中温育并在干燥器中干燥。将干的动脉纵向打开，置于扫描电子显微镜(SEM)短棒(stubs)上并用金喷涂。
假损伤动脉的SEM显示基本正常的内皮，由稀少分散的血小板。在内皮中有几处破坏，可能是手术期间机械损伤的结果，位于下面的基膜被血小板毡层覆盖。在假损伤大鼠中没有观察到血栓形成的证据。
用氯化铁处理的动脉的SEM显示占据大部分血管腔的大附壁血栓。所述血栓由聚集的血小板、红血细胞和无定形的丝状蛋白性材料组成。蛋白性材料和纤维蛋白一致。动脉的内皮大部分被大血栓遮敝。在可见处，用氯化铁处理区的上覆内皮被大量粘附的血小板和无定形蛋白性材料覆盖。
来自大鼠的用氯化铁处理、也用因子Ⅸ抗体处理的动脉的SEM显示所述血管腔基本上无血栓。用氯化铁处理区的上覆内皮显示大范围的损伤并且某些区域被粘附的血小板和血小板层聚集体覆盖，但几乎没有或没有蛋白性材料。
实施例5抗因子Ⅸ mAb BC2重链和轻链cDNA序列分析用TriReagent(Molecular Research Center,Inc.,Cincinnati,OH)根据厂商的实验方案纯化总RNA。RNA用异丙醇沉淀并溶于0.5％SDS并调节至0.5M NaCl。用Dynabeads Oligo(dT)25(Dynal A.S.,LakeSuccess,NY)根据厂商的实验方案分离Poly A+RNA。从所述小珠中洗脱出Poly A+RNA并将其重新悬浮在TE缓冲液中。用RT-PCR试剂盒依厂商的说明书(Boehringer Mannheim分类号1483-188)，以dT oligo作为引物逆转录12等份的100ng RNA。对于重链，用鼠IgG2a绞链引物(SEQ ID NO:1)和重链信号序列引物(SEQ ID NO:2)进行25个循环6个RNA/DNA杂合体的PCR扩增。同样，对于轻链，用一个鼠κ引物(SEQ ID NO:3)和简并轻链信号序列引物(SEQ ID NO:4)进行25个循环的6个RNA/DNA杂合体的PCR扩增。在PCR2000载体(TA克隆试剂盒，Invitrogen分类号K2000-1)中连接来自12个扩增的每个的PCR产物。随机挑选重组克隆的集落并用Bimboim和Doly(Nucl.AcidsRes.7,1513(1979))描述的碱抽提方法微量制备质粒DNA。分离的质粒DNA用EcoRⅠ消化并在0.8％琼脂糖凝胶上分析。用修改的Sanger方法对适当大小的双链cDNA插入物(即对于重链为～700bp，对于轻链为～700bp)测序。比较所有12个重链和轻链的序列，产生一个共有BC2重链可变区序列(SEQ ID NO:5)和共有BC2轻链可变区序列(SEQ ID NO:6)。
BC2重链可变区cDNA的序列分析显示一个编码121个氨基酸序列(SEQ ID NO:7)的363个核苷酸开放阅读框架。重链CDR1、2和3的序列分别列在SEQ ID NO:8、9和10中。
BC2轻链可变区cDNA的序列分析显示一个编码107个氨基酸序列(SEQ ID NO:11)的321个核苷酸开放阅读框架。轻链CDR1、2和3的序列分别列在SEQ ID NO:12、13和14。
实施例6人化抗体设计了六个称为SB 249413、SB 24941 5、SB 249416、SB249417、SB 257731和SB 257732的人化抗体以含有人抗体框架中的上述鼠CDR。SB 249413SB 249413含重链F9HZHC 1-0和轻链F9HZLC 1-0。用得自免疫球蛋白RF-TS3’CL(Capra,J.D.等，J.Clin.Invest.86,1320-1328(1990)在Kabat数据库中鉴定为Kabpro:Hhc10w)的重链的最初三个框架区和先前描述的BC2重链CDR，设计合成的可变区人化重链F9HZHC 1-0。没有制备可能影响CDR表现的框架氨基酸置换。产生四个重叠的合成的寡核苷酸(SEQ ID NO:15、16、17和18)，当退火和延伸时，它们编码代表通过并包括CDR3的氨基酸(SEQ ID NO:19和20)的重链可变区。然后用PCR引物(SEQ ID NO:21和22)扩增该合成基因并将其连接到PCR2000载体(TA克隆试剂盒，Invitrogen分类号K2000-01)中，并从SpeⅠ,KpnⅠ限制性消化物中分离。通过用两个引物(SEQ IDNO:26和27)通过PCR扩增编码人化的抗人呼吸道合胞病毒重链(SEQID NO:25)的构建物的合适区域，并用限制性内切酶EcoRⅠ和SpeⅠ消化，制备编码包括可变区前五个氨基酸的campath信号序列的第二DNA片段(SEQ ID NO:23和24)。将产生的两个片段连接到EcoRⅠ、KpnⅠ消化的pFHZHC2-6pCD哺乳动物细胞表达载体中，该载体包含剩余的人共有框架4和IgG1恒定区。该载体含一个在公开的国际专利申请WO94/05690号中描述的pFHZHC2-3pCD载体的单个氨基酸突变。通过用XbaⅠ和EcoR5消化pFHZHC2-3pCD并插入从两个合成的寡核苷酸(SEQ ID NO:28和29)产生的接头，将框架2最后的残基(残基49)从Ser突变为Ala。F9HZHC 1-0插入物的序列显示在SEQ IDNO:30和31。
用得自免疫球蛋白LS8’CL(Carmack等，J.Exp.Med.169,1631-1643(1989)，在Kabat数据库中鉴定为Kabpro:Hk1318)的人轻链的框架区和先前描述的BC2轻链CDR，设计合成的可变区人化轻链F9HZLC 1-0。没有制备可能影响CDR表现的框架氨基酸置换。产生两个重叠的合成寡核苷酸(SEQ ID NO:32和33)，当退火和延伸时，它们编码代表轻链可变区的氨基酸(SEQ ID NO:34和35)。然后用PCR引物(SEQ ID NO:36和37)扩增该合成基因，并将其连接到PCR2000载体(TA克隆试剂盒，Invitrogen，分类号为K2000-01)，并从ScaⅠ、SacⅡ限制性消化物中分离。通过用两个引物(SEQ ID NO:26和40)将编码人化抗人呼吸道合胞病毒重链(SEQ ID NO:25)的构建物的合适区进行PCR扩增，并用限制性内切酶EcoRⅠ和ScaⅠ消化，制备编码包括可变区的最初的两个氨基酸的campath信号序列的第二DNA片段(SEQ ID NO:38和39)。将产生的两个片段连接到EcoRⅠ、SacⅡ消化的pFHzLC1-2pCN哺乳动物细胞表达载体中，该载体包含剩余的人共有框架4和κ恒定区。该载体含一个在公开的国际专利申请WO94/05690号中描述的pFHZLC1-1pCN载体的单个氨基酸突变。通过用SmaⅠ和KpnⅠ消化pFHZLC1-pCN，并插入从两个合成寡核苷酸(SEQ ID NO:41和42)产生的接头，将一个框架2残基从Ser突变为Pro。F9HZLC 1-0插入物的序列显示在SEQ ID NO:43和44中。SB 249415SB 249415包含重链F9HZHC 1-1和轻链F9HZLC 1-1。这些重链和轻链构建物分别基于F9HZHC 1-0和F9HZLC 1-0。然而，它们具有能影响CDR表现的框架氨基酸置换。
F9HZHC 1-1具有可能影响CDR表现的三个框架氨基酸置换。产生两个重叠的合成寡核苷酸(SEQ ID NO:45和46)，当退火和延伸时，它们编码代表改变的重链可变区的改变部分(SEQ ID NO:47和48)。然后用PCR引物(SEQ ID NO:49和50)扩增该合成基因并将其连接到PCR2000载体(TA克隆试剂盒，Invitrogen，分类号为K2000-01)，并从EcoNⅠ、KpnⅠ限制性消化物中分离。将该片段连接到EcoNⅠ、KpnⅠ消化的F9HZHC 1-0(SEQ ID NO:30)载体中。F9HZHC 1-1插入物的序列显示在SEQ ID NO:51和52中。
F9HZLC 1-1具有可能影响CDR表现的四个框架氨基酸置换。产生两个合成寡核苷酸(SEQ ID NO:53和54)，当退火时，它们具有KpnⅠ和BamHⅠ粘端，并且编码代表该轻链可变区改变部分的氨基酸(SEQ IDNO:55)。F9HZLC 1-0(SEQ ID NO:43)用限制性内切酶KpnⅠ和BamHⅠ消化并将其与合成DNA连接。F9HZLC 1-1插入物的序列显示在SEQID NO:56和57中。SB 249416SB 249216含有重链F9HZHC 1-1(以上描述的)(SEQ ID NO:52)和轻链F9HZLC 1-2。轻链构建物基于F9HZLC 1-1，然而，它具有一个另外的能影响CDR表现的框架氨基酸置换。
产生两个合成的寡核苷酸(SEQ ID NO:58和59)，当退火时，它们具有BanHⅠ和XbaⅠ粘端，并且编码代表该轻链可变区改变部分的氨基酸(SEQ ID NO:60)。F9HZLC 1-1(SEQ ID NO:56)载体用限制性内切酶BamHⅠ和XbaⅠ消化并与合成DNA连接。F9HZLC 1-2插入物的序列显示在SEQ ID NO:61和62中。SB 249417SB 249217包含重链F9HZHC 1-1(以上描述的)(SEQ ID NO:52)和轻链F9HZLC 2-0。用得自免疫球蛋白REI(Palm and Hilschmann,Z.Physiol.Chem.354,1651-1654(1973)，在Kaba数据库中鉴定为Kabpro:HKL111)的人轻链的框架区和前面描述的BD2轻链CDR，设计F9HZLC 2-0合成可变区人化轻链。导入五个氨基酸共有人置换。制备六个可能影响CDR表现的框架氨基酸鼠置换。产生两个重叠的合成寡核苷酸(SEQ ID NO:63和64)，当退火和延伸时，它们编码代表该轻链可变区的氨基酸(SEQ ID NO:65和66)。然后用PCR引物(SEQ IDNO:67和68)扩增该合成基因，并将其连接到PCR2000载体(TA克隆试剂盒，Invitrogen，分类号为K2000-01)中，并从ScaⅠ、SacⅡ限制性消化物中分离。通过用两个引物(SEQ ID NO:26和69)将编码人化抗人呼吸道合胞病毒重链(SEQ ID NO:25)的构建物的合适区进行PCR扩增，并用限制性内切酶EcoRⅠ和ScaⅠ消化，制备编码包括该可变区前两个氨基酸的campath信号序列的第二DNA片段(SEQ ID NO:38)。通过将两个合成寡核苷酸(SEQ ID NO:71和72)退火，产生编码其余的人框架4(SEQ ID NO:70)并具有SacⅡ和NarⅠ粘端的第三DNA片段。F9HZLC 1-0(SEQ ID NO:43)用限制性内切酶EcoRⅠ和NarⅠ消化并连接到三个DNA片段。F9HZLC 2-0插入物的序列显示在SEQ ID NO:73和74中。SB 257731SB 257731含有重链F9HZHC 1-1(SEQ ID NO:52)和轻链F9HZLC1-3，后者为F9HZLC 1-2(SEQ ID NO:62)的单个氨基酸突变。用两个引物(SEQ ID NO:26和69)将F9HZLC 1-2 PCR扩增，并用限制性内切酶EcoRⅠ和ScaⅠ消化。分离94bp的片段(SEQ ID NO:75和76)。将该片段连接到EcoRⅠ、ScaⅠ消化的F9HZLC 1-2载体中，以产生轻链构建物F9HZLC 1-3。F9HZLC 1-3插入物的序列显示在SEQ ID NO:77和78中。SB 257732SB 257732含有合成可变区人化重链F9HZHC3-0和轻链F9HZLC3-0。产生四个重叠的合成寡核苷酸(SEQ ID NO:79、80、81和82)，当退火和延伸时，它们编码代表改变的重链可变区的氨基酸(SEQ IDNO:83和84)。然后用PCR引物(SEQ ID NO:85和86)扩增该合成基因，将其连接到PCR2000载体(TA克隆试剂盒，Invitrogen，分类号为K2000-01)中，并从StuⅠ、KpnⅠ限制性消化物中分离。将分离的片段连接到StuⅠ、KpnⅠ消化的F9HZHC 1-1(SEQ ID NO:52)载体中。然后将该载体用EcoRⅠ、SpeⅠ消化除去信号序列。用两个引物(SEQ ID NO:26和87)PCR扩增F9HZHC1-0，并用限制性内切酶EcoRⅠ和SpeⅠ消化，制备编码包括该可变区前五个氨基酸的campath信号序列的DNA片段。将产生的片段连接到该载体中。F9HZHC3-0插入物的序列显示在SEQ ID NO:88和89中。
产生四个重叠的合成寡核苷酸(SEQ ID NO:90、91、92和93)，当退火和延伸时，它们编码代表该轻链可变区的氨基酸(SEQ ID NO:94和95)。然后用PCR引物(SEQ ID NO:96和97)扩增该合成基因，并将其连接到PCR2000载体(TA克隆试剂盒，Invitrogen，分类号为K2000-01)中，并从ScaⅠ、NarⅠ限制性消化物中分离。将分离的片段连接到ScaⅠ、NarⅠ消化的F9HZLC1-3(SEQ ID NO:77)载体中。F9HZLC3-0插入物的序列显示在SEQ ID NO:98和99中。
在CHO细胞中表达所述人化抗因子ⅨmAb。在250ml一次性无菌锥形烧瓶(Coming)中的100ml含1×核苷酸和0.05％F68的无蛋白培养基中，在Innova 2100平板型摇床(plateform shaker)(New BrunswickScientific)上，以150rpm于37℃在5％CO2、95％空气潮湿的培养箱中让适于在无血清培养基中悬浮生长的DG-44细胞系生长。这些细胞每周以4×105细胞/ml传代两次。通过用NotⅠ消化将15μg的每种pCN-Lc-轻链和pCD-Hc-重链载体线性化，在无菌条件下共沉淀并重新悬浮在50μl的1×TE(10mM Tris、1mMEDTA,pH7.5)缓冲液中。采用Hensley等(J. Biol.Chem.269,23949-23958(1994))的技术，用Bio-Rad基因脉冲发生器(Bio-Rad Laboratories)将该DNA电穿孔到Acc-098细胞中。在12.5ml冰冷的PBSucrose(PBS、272mM蔗糖、7mM磷酸钠pH7.4、1mM MgCl2)中将1.2×107细胞洗涤一次，重新悬浮在0.8mlPBS中，将其加入50μl的DNA溶液并在冰上温育15分钟。在380 V和25微法拉向所述细胞输送脉冲，然后在冰上温育10分钟。在选择前，将细胞以5×105细胞/板接种到96孔培养板中的维持培养基中24小时。在维持培养基中以对400μg/ml G418(Geneticin,LifeTechnologies,Inc.)抗性选择细胞。分析前24小时，用150μl的维持培养基饲养细胞。
用电化学发光检测方法在Origen分析仪上分析来自单个集落的条件培养基，参见Yang等，Biotechnology 12,193-194(1994)。
从IGEN获得进行所述分析(分析缓冲液)和分析仪操作(细胞清洗剂)需要的所有溶液。用TAG-NHS-酯(IGEN,Inc.)以7∶1的TAG∶蛋白克分子比所述标记抗体(抗人IgG(g-链专一性)，Sigma Chemicals和对人IgG(H+L)的F(ab’)2片段，Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.)，而用生物素-LC-Sulfo-NHS-酯(IGEN,Inc.)以20∶1的生物素∶蛋白克分子比标记蛋白A(Sigma)，两个都根据IGEN的建议进行。从Dynal获得涂有链亲和素的磁性珠(M-280)。
用以下操作步骤进行免疫分析每个样品50μl的涂有链亲和素的珠粒(在具有1.25％吐温的PBS pH7.8中稀释的终浓度为600μg/ml)与50μl生物素-蛋白A(在具有1.25％吐温的PBS pH7.8中稀释的终浓度为1μg/ml)混合，并在室温下摇动温育15分钟，加入50μl的TAG抗体(在具有1.25％吐温的PBS pH7.8中稀释的终浓度为1.25μg/ml的对人IgG(H+L)的F(ab’)2片段与0.25μg/ml抗人IgG(g-链专一性)的混合物)，然后将该溶液加入50μl的条件培养基中并在室温下摇动温育1小时。向反应混合物加入200μl的分析缓冲液，并在Origen I分析仪上分析该样品以测定ECL。结果表明大约20-37％的所分析的集落分泌超过15ng/ml的抗体，抗体的平均表达大约为150ng/ml。
采用Procep A捕获步骤，接着通过离子交换层析以减少DNA负荷，从条件培养基中纯化人化抗因子Ⅸ mAb。用ProceptA吸附材料(Bioprocessing Ltd.,Durham,England)制备直径与重量之比为1∶1的柱子。在柱子上以大约150cm/hr加载澄清的条件培养基。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)、含1M NaCl的PBS以及最后用PBS连续地洗脱该柱。用0.1M乙酸洗脱回收结合的材料。将该洗出液调节至pH5.5并用水稀释(1∶4)。将稀释的溶液加载到一个S-Sepharose柱(2.5×13cm)上，柱子用20mM、pH5.5乙酸钠以80cm/小时预平衡。用乙酸盐缓冲液洗涤该柱直至获得稳定的基线，并且用20mM、pH7.4磷酸钠以25cm/hr洗脱该结合蛋白。用0.4微米膜过滤洗出材料并贮存于4℃。
实施例7鼠-人嵌合抗体用RT-PCR试剂盒依厂商的说明书(Boehringer Mannheim分类号1483-188)以dT oligo作为引物逆转录100ng的BC2 RNA，用合成ScaⅠ引物(SEQ ID NO:100)和NarⅠ引物(SEQ ID NO:101)进行PCR扩增，以产生有Sca1、Nar1末端的BC2轻链可变区(SEQ ID NO:102和103)。将该DNA连接到ScaⅠ、NarⅠ消化的F9HZHC1-3(SEQ ID 77)中，并用ScaⅠ、NarⅠ消化以产生鼠-人嵌合轻链F9CHLC(SEQ ID NO:104和105)。
用RT-PCR试剂盒依厂商的说明书(Boehringer Mannheim分类号1483-188)以dT oligo作为引物逆转录100ng的BC2 RNA，用合成SpeⅠ引物(SEQ ID NO:106)和NheⅠ引物(SEQ ID NO:107)进行PCR扩增，以产生有Spe1、Nhe1末端的BC2重链可变区(SEQ ID NO:108和109)。从RSVHZ19重链(SEQ ID NO:25)用EcoRⅠ引物(SEQ ID 26)和SpeⅠ引物(SEQ ID 87)PCR扩增campath信号序列。将这两个DNA片段连接到EcoRⅠ、NheⅠ消化的、在公开的国际专利申请WO95/07301号中描述的IL4CHHCpcd载体中，用BC2因子Ⅸ鼠可变区取代IL4可变区，以产生鼠-人嵌合的重链F9CHHC(SEQ ID NO:110和111)。
用以上描述的用于人化构建物的方法完成鼠-人嵌合抗体chαFIX的共转染和纯化。
实施例8人化因子Ⅸ mAb在大鼠血栓形式模型中的效力为了评价人化抗因子Ⅸ抗体在防止动脉血栓形成中的效力，使用在以上实施例3中描述的大鼠颈动脉血栓形成模型。建立颈动脉血流量、动脉压、心率、血管开放和激活部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)的基线参数。15分钟后，实施动脉损伤10分钟。在动脉损伤开始后60分钟测定所述参数。也从颈动脉中抽出颈动脉血栓并称重。
在颈动脉损伤开始前15分钟静脉内注射所有药剂。检测以下处理并与抗因子Ⅸ mAb BC2比较。
1．载体2．chαFIX:3mg/kg大丸剂3．SB 249413:3mg/kg大丸剂4．SB 249515:3mg/kg大丸剂
5．SB 249416:3mg/kg大丸剂6．SB 249417:3mg/kg大丸剂7．SB 257731:3mg/kg大丸剂8．肝素60单位/kg大丸剂+2单位/kg/分钟灌注aPTT用作用于该研究中的抗凝血/血栓剂的抗出血倾向评价的主要标准。图8的结果证明人化因子ⅨmAb SB 249413、SB 249415、SB 249416、SB 249417和SB 257731在在临床接受的范围内的3.0mg/kg下对aPTT有中等影响。
所述因子Ⅸ mAb对血栓块的影响显示在图9。结果表明所有的人化mAb对减少血栓块都具有等同的效应。
在大鼠颈动脉血栓形成模型中进行的研究清楚地证明所述人化因子Ⅸ mAb在防止高度形成血栓的动脉损伤模型中血栓形成的效力。最值得注意的是，证明所有的人化因子Ⅸ mAb的效力都在aPTT确定的想要的治疗抗凝血靶中。
实施例9抗体生物化学和生物物理学性质通过MALD-MS确定SB 249417的分子量为148,000Da。SB249417的分析超离心得到相同的值。在因子Ⅸ加Ca2+存在下，从BC2获得的抗体沉淀，248,000Da的质量相当于该mAb和两分子因子Ⅸ的组合质量。在存在或缺乏因子Ⅸ下没有观察到更高度有序的聚集体的证据。
通过BIAcore分析，用结合于固定蛋白A表面的抗体评价因子Ⅸ与SB 249417结合的动力学。以49nM使用重组人因子Ⅸ(rhFIX,Genetics Institute)，并且在5nM Ca2+存在下进行测定。该相互作用的特征在于快速结合(kass=2.0×105M-1s-1)和相对慢的解离速率(kdiss=4.1×10-4S-1)。计算的因子Ⅸ结合的Kd是1.9nM。
表1总结了SB 249417的生物物理性质。
表1SB 249417生物物理性质的总结同种型IgG1,κ通过SDS-PAGE的纯度＞95％(在还原条件下)分子量质谱 148,000Da分析型超离心 148,000Da因子Ⅸ结合的化学计量法等温滴定测热法1.5摩尔因子Ⅸ:1摩尔mAb因子Ⅸ结合亲和力等温滴定量热学Kd=4nM，于25℃下生物传感器Kd=2nM因子Ⅸ结合动力学生物传感器Kass=2.0×105M-1s-1Kdiss=4×10-4s-1表2总结了本发明mAb的因子Ⅸ结合性质。计算的解离常数在实验误差内基本上是相等的。
表2因子Ⅸ结合抗因子Ⅸ mAb的动力学mAb kass(M-1s-1) kdiss(s-1)calc.KD(nM)SB 249417 2.0×1054.1×10-41.9BC2 4.8×1059.1×10-41.9Chf9 2.4 ×1053.0×10-41.3SB 249413 6.5×1052.8×10-33.7-5.1SB 249415 7.5 ×1051.8×10-41.1-2.3SB 249416 5.2×1054.1×10-40.8SB 257731 9.2×1059.9×10-41.1SB 257732 1.1×1061.2×10-31.5在rhFIX和SB 249417、BC2以及其它人化构建物之间的相互作用在滴定微量量热学上有明显区别，滴定微量量热学测定溶液中来自结合内热的结合相互作用。将9个106μM FIX的注射液制成含2μMmAb SB 249417的量热计。在前4个注射液中以放热的热量检测结合。对最后5个注射液，用FIX饱和该mAb的结合位点，仅观察到混合的背景热。结果显示正如预期的，等量点发生在接近2 FIX每mAb的一克分子结合比。该数据的非线性最小平方分析得出该结合亲和力。
在34-44℃的温度范围内，在10mM HEPES、10mM CaCl2、150mM NaCl pH7.4中测定所述mAb的rhFIX亲和力。这些数据提供在37℃直接测定的亲和力以及在25℃由Van’t Hoff公式计算的亲和力。表3中的数据表明SB 249417、BC2和它的其它人化构建物的亲和力同样在误差范围内(2的一个因子)。
表3抗FIX mAb滴定微量量热学结果mAbKd.nM at 25℃Kd,nM at 37℃克分子结合率FIX/mAbBC2 10 20 1.4SB 612 1.9249413SB 371.7249415SB 412 1.5249417SB 4 91.8257732通过差示扫描量热法，mAb SB 249413、SB 249415、SB249417和SB 257732都表现出非常相似的热稳定性。它们伸展Tm范围为70-75℃，表明对热诱导变性的高稳定性。
实施例10因子Ⅸ的抗体介导的抑制机制构建一个嵌合构建物文库，它由剪接到同源蛋白因子Ⅶ的框架中因子Ⅸ的序列组成，并用于因子Ⅸ BC2 mAb抗原决定簇的图谱分析。参见Cheung等，Thromb.Res.80,419-427(1995)。用BiaCore 2000表面等离子体激元共振设备测定结合。用NHS/EDC反应直接使该BC2抗体与该芯片结合。在25mM MOPS pH7.4、0.15M NaCl、5mMCaCl2中，通过与200nM每种给定构建物以20μL/分钟接触2分钟测定结合。用无蛋白的同一缓冲液监测解离3分钟。在50mMEDTA存在下未检测到与野生型构建物的结合。该数据显示在表4。
表4因子Ⅸ构建物与BC2抗体结合的总结
这些数据表明含因子Ⅸ轻链和因子Ⅶ重链的构建物(Ⅸ LC/ⅧHC)、含因子Ⅸ gla和芳族塔结构域的构建物(Ⅸ-A/Ⅶ)、含因子Ⅶ gla域内的因子Ⅸ gla域的残基3-11的构建物(Ⅶ gla(Ⅸ3-11)/Ⅸ)；和含残基5的赖氨酸置换为丙氨酸的因子Ⅸ的构建物(Ⅸ K5A)都显示出与BC2结合。Ⅶ gla(Ⅸ 3-11)/Ⅸ构建物表现出等同于野生型因子Ⅸ(血浆Ⅸa和r-Ⅸ)的BC2结合。因此，该BC2抗体与包含在因子Ⅸ gla域的残基3-11内的一个抗原决定簇结合。
可以以其它特定形式实施本发明，而不违反本发明精神或基本特征，因此，应当以所附权利要求做参考以指明本发明的范围，而不是以前面的说明书做参考。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人Blackburn,MichaelChurch,WilliamGross,MitchellFeuerstein,GioraNichols,AndrewPadlan,EduardoPatel,ArunbhaiSylvester,Daniel(ⅱ)发明名称用于治疗血栓形成的抗凝血剂(ⅲ)序列数111(ⅳ)通信地址(A)收信人SmithKline Beecham Corporation(B)街道709 Swedeland Road(C)城市King of Prussia(D)州PA(E)国家美国(F)邮政编码19406(ⅴ)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM兼容(C)操作系统DOS
(D)软件FastSEQ版本1.5(ⅵ)当前申请数据(A)申请号(B)提交日期1997年1月16日(C)分类(ⅶ)在先申请数据(A)申请号60/029,119(B)提交日期1996年10月24日(ⅷ)代理律师/代理人资料(A)姓名Baumeister,Kirk(B)注册号33,833(C)参考/档案号P50438(ⅸ)电讯资料(A)电话610-270-5096(B)传真(C)电报(2)SEQ ID NO:1资料(ⅰ)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)前提无(ⅳ)反义无(ⅴ)片段类型(ⅵ)原始来源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:CATCCTAGAG TCACCGAGGA 20(2)SEQ ID NO:2资料(ⅰ)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)前提否(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型(ⅵ)原始来源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:AGCTGCCCAA AGTGCCCAAG C21(2)SEQ ID NO:3资料(ⅰ)序列特征(A)长度36碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)前提否(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型(ⅵ)原始来源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:CTAACACTCA TTCCTGTTGA AGCTCTTGAC AATGGG36(2)SEQ ID NO:4资料(ⅰ)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)前提否(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型(ⅵ)原始来源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:GATTTTCARG TGCAGATTTT C21(2)SEQ ID NO:5资料(ⅰ)序列特征(A)长度363碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)前提否(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型(ⅵ)原始来源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:CAGATCCAGT TGGTGCAGTC TGGACCTGAG CTGAAGAAGC CTGGAGAGAC AGTCAAGATC 60TCCTGCAAGG CTTCTGGGTA CACCTTCACA AACTATGGAA TGAACTGGGT GAAGCAGGCT 120CCAGGAAAGG GTTTAAAGTG GATGGGCTGG ATAAACACCA GAAATGGAAA GTCAACATAT 180GTTGATGACT TCAAGGGACG GTTTGCCTTC TCTTTGGAAA GCTCTGCCAG CACTGCCAAT 240TTGCAGATCG ACAACCTCAA AGATGAGGAC ACGGCTACAT ATTTCTGTAC AAGAGAAGGG 300AATATGGATG GTTACTTCCC TTTTACTTAC TGGGGCCAAG GGACTCTGGT CACTGTCTCT 360GCA 363(2)SEQ ID NO:6资料(ⅰ)序列特征(A)长度321碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)前提否(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型(ⅵ)原始来源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:CAAATTGTTC TCTCCCAGTC TCCAGCAATC CTGTCTGCAT CTCCAGGGGA GAAGGTCACA 60ATGACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTAAAT TACATGCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGA 120TCCTCCCCCA AACCCTGGAT TTATGCCACA TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGCTCGC 180TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCAGCAGAGT GGAGGCTGAA 240GATGCTGCCA CTTATTACTG CCAGCAGTGG AGTATTAACC CACGGACGTT CGGTGGAGGC 300ACCAAGCTGG AAATCAAACG G 321(2)SEQ ID NO:7资料(ⅰ)序列特征(A)长度121个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)前提否(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部(ⅵ)原始来源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe50 55 60Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn65 70 75 80Leu Gln Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115 120(2)SEQ ID NO:8资料(ⅰ)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)前提否(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部(ⅵ)原始来源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:Asn Tyr Gly Met Asn1 5(2)SEQ ID NO:9资料(ⅰ)序列特征(A)长度17个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)前提否(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部(ⅵ)原始来源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys1 5 10 15Gly(2)SEQ ID NO:10资料(ⅰ)序列特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)前提否(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部(ⅵ)原始来源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO:11资料(ⅰ)序列特征(A)长度107个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链
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(B)位置27…446(D)其它资料F9HZHC 3-0(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:88:GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe1 5TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG ATC CAA CTA GTG CAA 101Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln10 15 20 25TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC 149Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys30 35 40AAG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT GGA ATG AAC TGG GTG CGA 197Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg45 50 55CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC GAG TGG ATG GGA TGG ATA AAC ACC AGA 245Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg60 65 70AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GTC TTC 293Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe75 80 85TCT CTA GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTA CAG ATC AGC AGC CTA 341Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu90 95 100 105AAG GCT GAG GAC ACT GCA GTG TAT TTC TGT ACG AGA GAA GGG AAT ATG 389Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met110 115 120GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC CAG GGT ACC CTG GTC ACC 437Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr125 130 135GTC TCC TCT 446Val Ser Ser140(2)SEQ ID NO:89资料(ⅰ)序列特征(A)长度140个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅲ)前提否(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部(ⅵ)原始来源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:89:Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val65 70 75 80Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser85 90 95Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr115 120 125Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser130 135 140(2)SEQ ID NO:90资料(ⅰ)序列特征(A)长度90个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)前提否(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型(ⅵ)原始来源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:90:AGTACTGACA CAGTCTCCAT CCTCCCTGTC TGCATCTGTT GGGGACAGAG TCACCATCAC 60TTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT 90(2)SEQ ID NO:91资料(ⅰ)序列特征
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(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)前提否(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型(ⅵ)原始来源(ⅸ)特征(A)名称/关键词编码序列(B)位置2…328(D)其它资料(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:94:A GTA CTG ACA CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTT GGG GAC AGA 49Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg1 5 10 15GTC ACC ATC ACT TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG 97Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Mis Trp20 25 30TAC CAA CAG AAA CCT GGC AAA GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT GCC ACG145Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr35 40 45AGT AAC CTG GCT AGC GGC GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGA TCC GGG TCT193Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser50 55 60GGG ACA GAT TAC ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA CAA CCT GAA GAT TTT241Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe65 70 75 80GCG ACT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG TTC GGC 289Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly85 90 95GGA GGG ACC AAG CTG GAG ATC AAA CGA ACT GTG GCG GCG CC330Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105(2)SEQ ID NO:95资料(ⅰ)序列特征(A)长度109个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅲ)前提否(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部(ⅵ)原始来源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:95:Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg1 5 10 15Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp20 25 30Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr35 40 45Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser50 55 60Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe65 70 75 80Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly85 90 95Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105(2)SEQ ID NO:96资料(ⅰ)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)前提否(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型(ⅵ)原始来源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:96:CAAGTACTGA CACAGTCTCC ATCCTC 26(2)SEQ ID NO:97资料(ⅰ)序列特征(A)长度26个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)前提否(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型(ⅵ)原始来源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:97:AGGGCGCCGC CACAGTTCGT TTGATC 26(2)SEQ ID NO:98资料(ⅰ)序列特征(A)长度412个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)前提否(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型(ⅵ)原始来源(ⅸ)特征
(A)名称/关键词编码序列(B)位置27…412(D)其它资料F9HZLC 3-0(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:98:GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC53Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe1 5TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG ATA GTA CTG ACA CAG101Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln10 15 20 25TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTT GGG GAC AGA GTC ACC ATC ACT149Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr30 35 40TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG TAC CAA CAG AAA197Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys45 50 55CCT GGC AAA GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT GCC ACG AGT AAC CTG GCT245Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala60 65 70AGC GGC GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGA TCC GGG TCT GGG ACA GAT TAC293Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr75 80 85ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA CAA CCT GAA GAT TTT GCG ACT TAT TAC341Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr90 95 100 105TGT 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权利要求
1．在动物中抑制血栓形成的方法，包括给予有效剂量的具有自限制中和活性的抗凝血因子单克隆抗体。
2．权利要求1的方法，还包括结合所述抗凝血因子单克隆抗体给予乙酰水杨酸。
3．权利要求1或2的方法，其中所述凝血因子来自特性或共同凝血途径。
4．权利要求3的方法，其中所述抗凝血因子单克隆抗体是抗因子Ⅸ、抗因子Ⅸa、抗因子Ⅹ、抗因子Ⅹa、抗因子Ⅺ、抗因子Ⅺa、抗因子Ⅷ、抗因子Ⅷa、抗因子Ⅴ、抗因子Ⅴa、抗因子Ⅶ、抗因子Ⅶa或抗凝血酶。
5．权利要求3的方法，其中所述抗凝血因子单克隆抗体是抗因子Ⅸ。
6．权利要求5的方法，其中所述抗凝血因子Ⅸ单克隆抗体具有SB 249413、SB 249415、SB 249416、SB 249417、SB 257731和SB 257732的鉴别特征。
7．权利要求5的方法，其中所述抗凝血因子Ⅸ单克隆抗体具有SB 249417的鉴别特征。
8．权利要求1或2的方法，其中延长aPTT，而没有明显延长PT。
9．权利要求4的方法，其中aPTT为大约35秒至大约100秒。
10．权利要求1或2的方法，其中所述血栓形成与心肌梗塞、不稳定的心绞痛、心房纤维性颤动、中风、肾损伤、肺栓塞、深静脉血栓形成、经皮经管腔冠状血管成形术、播散性血管内凝血、脓毒症、人造器官、吻合(shunt)或假体有关。
11．对所述凝血因子具有自限制中和活性的抗凝血因子单克隆抗体。
12．权利要求11的单克隆抗体，其中所述凝血因子来自特性或共同凝血途径。
13．权利要求12的单克隆抗体，其中所述抗凝血因子单克隆抗体是抗因子Ⅸ、抗因子Ⅸa、抗因子Ⅹ、抗因子Ⅹa、抗因子Ⅺ、抗因子Ⅺa、抗因子Ⅷ、抗因子Ⅷa、抗因子Ⅴ、抗因子Ⅴa、抗因子Ⅶ、抗因子Ⅶa或凝血酶。
14．权利要求12的单克隆抗体，其中所述抗凝血因子单克隆抗体是抗因子Ⅸ。
15．具有SB 249413、SB 249415、SB 249416、SB 249417、SB 257731、SB 257732、9E4(2)F4或11G4(1)B9的鉴别特征的权利要求14的单克隆抗体。
16．具有SB 249417的鉴别特征的权利要求14的单克隆抗体。
17．具有细胞系9E4(2)F4或11G4(1)B9的鉴别特征的杂交瘤。
18．中和Fab片段或其F(ab’)2片段，它通过缺失权利要求11的单克隆抗体的Fc区产生。
19．中和Fab片段或其F(ab’)2片段，它通过链改组产生，由此在鼠轻链丝状噬菌体Fab呈现文库中表达权利要求11的单克隆抗体的Fd重链。
20．中和Fab片段或其F(ab’)2片段，它通过链改组产生，由此在鼠重链丝状噬菌体Fab呈现文库中表达权利要求11的单克隆抗体的轻链。
21．免疫球蛋白重链互补决定区，其氨基酸序列选自SEQ ID NO:8、9和10。
22．编码权利要求21的免疫球蛋白互补决定区的核酸分子。
23．免疫球蛋白轻链互补决定区，其氨基酸序列选自SEQ ID NO:12、13和14。
24．编码权利要求23的免疫球蛋白互补决定区的核酸分子。
25．包含一条重链和一条轻链的改变抗体，其中所述重链和轻链的框架区从至少一个选定抗体获得，并且每个所述链的互补决定区的氨基酸序列从权利要求11的单克隆抗体获得。
26．权利要求25的改变抗体，它是人化的。
27．权利要求26的人化抗体，其中所述重链具有在SEQ ID NO:31、52或89提出的氨基酸序列。
28．权利要求26的人化抗体，其中所述轻链具有在SEQ ID NO:44、57、62、74、78或99提出的氨基酸序列。
29．权利要求26的人化抗体，其中所述重链具有在SEQ ID NO:31提出的氨基酸序列，而所述轻链具有在SEQ ID NO:44提出的氨基酸序列。
30．权利要求26的人化抗体，其中所述重链具有在SEQ ID NO:52提出的氨基酸序列，并且所述轻链具有在SEQ ID NO:57提出的氨基酸序列。
31．权利要求26的人化抗体，其中所述重链具有在SEQ ID NO:52提出的氨基酸序列，并且所述轻链具有在SEQ ID NO:62提出的氨基酸序列。
32．权利要求26的人化抗体，其中所述重链具有在SEQ ID NO:52提出的氨基酸序列，并且所述轻链具有在SEQ ID NO:74提出的氨基酸序列。
33．权利要求26的人化抗体，其中所述重链具有在SEQ ID NO:52提出的氨基酸序列，并且所述轻链具有在SEQ ID NO:78提出的氨基酸序列。
34．权利要求26的人化抗体，其中所述重链具有在SEQ ID NO:89提出的氨基酸序列，并且所述轻链具有在SEQ ID NO:99提出的氨基酸序列。
35．包含一条重链和一条轻链的嵌合抗体，所述抗体的特征在于以自限制方式抑制特性或共同途径凝血因子的功能，其中抑制血栓形成并且产生凝血的有限调节，其中所述重链和轻链的恒定区从至少一个选定抗体获得，并且每个所述链可变区的氨基酸序列得自权利要求11的单克隆抗体。
36．按照权利要求35的抗体，其中所述恒定区选自人免疫球蛋白。
37．药用组合物，包含权利要求26或35的改变抗体和一种药学上可接受的载体。
38．权利要求37的药用组合物，还包含乙酰水杨酸。
全文摘要
公开了导向凝血因子的单克隆抗体和它们在抑制血栓形成中的用途。
文档编号C07K16/00GK1213312SQ97192981
公开日1999年4月7日 申请日期1997年1月17日 优先权日1996年1月17日
发明者M·N·布拉克布恩, W·R·丘奇, G·Z·费乌尔斯泰恩, M·S·格罗斯, A·J·尼科尔斯, E·A·帕德兰, A·H·帕特尔, D·R·西尔维斯特 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司, 佛蒙特大学及州立农业学院