专利名称：具有抗血栓形成活性的低聚糖混合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有抗血栓形成活性的低聚糖混合物，尤其涉及由硫酸皮肤素衍生得来的低聚糖类物质。
背景技术：
硫酸皮肤素是具有抗血栓形成活性的线型多糖，其由交替的葡糖醛酸或艾杜糖醛酸残基和N-乙酰基半乳糖胺残基组成，这些残基被不同程度地硫酸化。其抑制凝血酶活性的机理依赖于既结合肝素辅因子II(HCII，一种丝氨酸蛋白酶抑制剂)又结合凝血酶(因子IIa)本身的硫酸皮肤素。
过去对硫酸皮肤素及其降解产物已经有了很多研究，这些研究主要针对于具有有关活性的特异性片断的鉴定和分离。例如生物化学杂志(J.Biological Chemistry)第261卷，1986年7月第8854-58页记载了含有12-14个结合于HCII上的糖残基的片断，该文还记载了没有这种结合能力的二糖、四糖和六糖片断。生物化学杂志(J.BiologicalChemistry)第265卷，1990年10月第18263-71页也记载了对HCII具有高亲和能力的六糖。在WO91/15217中记载了结合HCII的含5-6个糖残基的低聚糖及其有关物质。血栓形成研究(Thrombosis Research)，66，1992年第527-33页指出分子量范围是4-9KDa的低聚糖可以达到生物活性、清除、消失半衰期和生物利用度等因素的最佳平衡。WO93/05074记载了具有抗血栓形成活性的含11-13个糖残基的低聚糖，WO93/05075记载了含7-12个糖残基的低聚糖。血液(Blood)第81卷，1993年4月，1771-77页得出结论具有完全催化活性的最小片断为十六糖。
在早一些的研究中，这些所研究的片断的制备方法通常包括起始物质硫酸皮肤素的降解和用亲和色谱对这些片断的分离。
目前正在研究的一种天然低分子量硫酸皮肤素(Desmin)的特征在于硫酸根对羧酸根的比例为1.06(血栓形成研究(Thrombosis Research)，第83卷，第1期，103-109页)。
从上可以明白许多低聚糖片断可以从硫酸皮肤素中得到，这些低聚糖性质和其活性之间的关系是复杂的，至今也没有完全弄明白。
发明的公开我们已经发现一些片断的抗血栓形成活性可以达到令人满意的程度，所述的片断是从具有较低电荷密度的物质中分离得到并含有基于特异性二糖残基的低聚糖混合物。
本发明的低聚糖与现有技术不同，因为它们带有更多的负电荷。与以前应用的以及现有技术中记载的特异性片断的分离方法相比，本发明低聚糖的制备方法更具有商业竞争力，因为它们可以更廉价地制备出来。这些硫酸皮肤素片断对HCII的亲和力比天然硫酸皮肤素出奇地高，因此可用来增强基于硫酸皮肤素药物的抗血栓形成效能。
因此，本发明提供一种含有不同数目硫酸化二糖重复单元的线型低聚糖混合物，所述二糖重复单元由L-艾杜糖醛酸(IdoA)和N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)衍生得到，该线型低聚糖混合物具有下列性质(a)该混合物的90％或以上的分子量范围是1600-20000，(b)硫含量为6.0-8.0％重量，(c)硫酸根/羧酸根比为1.2-1.6，(d)二硫酸化二糖含量为单硫酸化二糖含量的20-60％重量，和(e)抗凝血酶活性为20-60IU/mg。
该混合物从硫酸皮肤素制备得到，因此可能含有少量由D-葡糖醛酸衍生的残基，尽管它优选没有或基本上没有这样的残基。还可能存在少量非Gal-NAc的己糖胺的残基，例如N-乙酰基-D-葡糖胺(Glu-NAc)的残基，尽管优选Gal-NAc是唯一存在的己糖胺。
太多数情况下，该Gal-NAc残基在4-位硫酸化；在某些情况下，IdoA残基在2-位硫酸化。在某些情况下，还可以见到在Gal-NAc的6-位发生硫酸化。因此，硫酸根羧基和二硫酸化单硫酸化二糖的比以及硫含量均可以变化，这主要取决于IdoA残基的硫酸化程度。
式1表示通常存在于本发明低聚糖中重复的硫酸化L-艾杜糖醛酸和N-乙酰基-D-半乳糖胺单元的序列。
其中R为H或SO3-，和对于90％或更多的物质，n的范围为3-37；对于分子分布的峰值点，n为10-15。
在这些残基中，IdoA的1-位与Gal-NAc的3-位相连；Gal-NAc的1-位与IdoA的4-位相连。当用下面描述的方法制备时，一部分末端Gal-NAc残基在1-位具有2，3，4-三羟基丁酸残基(HO-CH2-CH(O-)-CH(OH)COO-)。抗衡离子是单价或二价阳离子，主要为钠离子，但也可能为其它离子如钙离子。本发明的实施方案低聚糖的特性可通过下列方法测定(1)按照Dedem & Nielsen，Pharmeuropa(欧洲药物)第3卷第3期，202-218(1991)的方法用凝胶渗透色谱测定分子量，(2)按照Ph.Eur.V.3.5.3的方法测定硫含量，(3)按照Ph.Eur.第828页的方法测定硫酸根/羧基的比(4)按照Linhardt等，分析生物化学(Anal.Biochem.)181期第288-296页(1989)记载的方法，测定二硫酸化/单硫酸化双糖的含量，(5)用第4次国际肝素标准(International Heparin Standard)(代号.82/502)作为标准，在无血浆系统中用显色分析(Diagnostica Stago法国)测定HCII介导的抗凝血酶活性。
混合物的硫含量通常在6.0-8.0％重量范围内，优选6.5-8.0％范围。硫酸根/羧基比的通常范围是1.2-1.6，优选1.3-1.6。二硫酸化二糖的含量通常为单硫酸化二糖含量的20-60％重量，优选30-60％重量。本发明低聚糖的HCII介导的抗凝血酶活性的通常范围是20-60IU/mg，优选30-60IU/mg。
本发明的低聚糖混合物可以这样制备硫酸皮肤素通过高碘酸盐氧化反应解聚，然后经氢硼化物还原反应，再酸水解，然后通过离子交换分级分离。
用作起始物质的硫酸皮肤素可以从动物肠例如猪粘膜或牛气管中得到，它们具有下列特性比旋光度(4％的水溶液) -50°至-70°硫 5.3-6.3％(w/w)硫酸根/羧酸根比1.0-1.3HCII介导的抗凝血酶活性 2-10IU/mg解聚步骤包括的主要化学反应如下列反应方案所示，主要按照碳水化合物研究(Carbohydrate Research)36期，339-348页(1974)描述的路线进行。
硫酸皮肤素的解聚反应
第一步，用高碘酸盐处理硫酸皮肤素(1)导致非硫酸化IdoA残基的选择性氧化反应，产生开环二元醛(2)。后者经还原后得到二元醇(3)，该二元醇通过酸水解裂解得到两个Gal-NAc封端的片断，其中一个带有2，3，4-三羟基丁酸末端基团。这种裂解反应可以在硫酸皮肤素链上的许多部位发生，因此得到不同链长度的片断的混合物。然后这些片断经离子交换分级分离可以得到所选择的片断。
进行起始的氧化步骤可以应用高碘酸或其盐，例如钠盐，在温度为0-30℃、pH范围为5-8的含水介质中进行。进行还原步骤时可以应用氢硼化物例如氢硼化钾或者应用优选的氢硼化钠，在温度为0-30℃、pH为6-9的含水介质中进行。进行酸水解反应时优选应用无机酸例如盐酸或硫酸，可以选择任何合适的温度例如20-60℃。
该混合物的离子交换分级分离通常将较低硫酸化的片断与相对高度硫酸化的片断分离，其中相对高度硫酸化的片断特征为(a)该混合物的90％或以上的分子量范围是1600-20000，(b)硫含量为6.0-8.0％重量，(c)硫酸根/羧酸根比为1.2-1.6，(d)二硫酸化二糖含量为单硫酸化二糖含量的20-60％重量，和(e)抗凝血酶活性为20-60IU/mg。
可应用离子交换树脂通过分步洗脱法进行分级分离，其中的离子交换树脂例如有Amberlite IRA 404，Amberlite IRA 900，Amberlite IRA 904，Amberlite IRA 958，Amberlite IRA 67，Amberlite IRA 68，LewatitS5428A，Lewatit S6328A，Lewatit S6328，Lewatit MP 500WS，Dowex 11，Dowex Monosphere 550A，Dowex MSA1或任何其它阴离子交换剂。
离子交换步骤可以这样进行，将起始物质的溶液与该树脂结合，然后根据洗脱溶液的离子强度从树脂上洗脱出不同活性的馏分。低硫酸化低分子量产品通常先洗脱出来，将其弃掉，通过进一步洗脱可以得到所需要的高度硫酸化的低分子量物质。
本发明的低聚糖混合物可以作为抗血栓形成试剂以任何合适的方式制备成人药或兽药。这些药物组合物通常包括一种或多种可接受的载体，并可以是适合例如非经肠、口服或局部用药的形式。
该混合物可以制备成注射用的人药或兽药，并可以是单位剂量形式例如安瓿剂。注射用组合物可以是分散在油载体或含水载体中的混悬剂、溶液或乳剂，并可含有配制助剂例如悬浮剂、稳定剂、增溶剂和/或分散剂。
该组合物还可以制成口服制剂形式例如溶液、糖浆或混悬剂或制成在使用前与水或其它合适载体混合的干粉；还可以应用固体组合物例如片剂、胶囊、锭剂、丸剂、大丸剂、粉剂、糊剂、粒剂、弹剂(bullets)或预混合制剂。
该组合物还能以局部给药的剂型用于人药和兽药，例如软膏、乳膏、洗剂、香波、粉剂、喷雾剂、浸泡剂(dips)或气雾剂。
本发明的混合物可以与其它药物活性成分联合给药。
对于用于人药和兽药的本发明混合物，其每日总剂量范围是1-100mg/kg体重，优选3-30mg/kg体重，这些总剂量可以分次给药，例如1-4次/天。
本发明的制剂可以用于治疗各种血栓形成疾病例如深静脉血栓形成(DVT)和中风以及在一般外科手术如髋骨置换(hip replacement)和膝部手术中用于预防血栓形成并发症。
下面通过实施例来阐明本发明实施例1把300g从猪肠粘膜中分离得到的硫酸皮肤素钠溶于3升1％(w/v)氯化钠溶液中，在搅拌下慢慢地把17.4g NaIO4加入到上述溶液中。在黑暗中搅拌该溶液过夜。然后小心地把6g NaBH4加入到该溶液中。在室温下3小时后用盐酸调整pH值至2.0，然后在60℃下搅拌该溶液3小时。再用氢氧化钠调整pH值至5.5，过滤该溶液，用1.7倍体积的无水乙醇沉淀。得到的产品具有下列特性
比旋光度(4％的水溶液)-55°硫 6.3％(w/w)硫酸根/羧酸根比 未检测(nd)HCII介导的抗凝血酶活性 7.5IU/mg将4.0g上述分离得到的低分子量硫酸皮肤素溶于200ml 0.5M氯化钠溶液中，然后把200g Amberlite IRA 904离子交换材料加入到该溶液中。在60℃下搅拌1小时后，测定pH值和氯化钠的浓度，把pH调整到5.8-6.0，并把氯化钠的浓度调整到0.5(0.48-0.52)M。在60℃下搅拌该溶液过夜。排干离子交换材料，弃掉溶液。在60℃和pH5.8-6.0下，该离子交换材料用200ml 1.2M氯化钠溶液搅拌过夜洗脱两次，洗脱出低硫酸化低分子量硫酸皮肤素。小心地排干离子交换材料后，在60℃和pH5.8-6.0下，该离子交换材料用200ml 1.6M氯化钠溶液搅拌过夜洗脱两次，洗脱出高硫酸化低分子量硫酸皮肤素。过滤合并的洗脱液，用1.7倍体积的无水乙醇沉淀。再进行一次沉淀从而从该沉淀物中除去盐，最后得到0.7g高度硫酸化的低分子量硫酸皮肤素，其具有下列特性峰值分子量(Mp) 6926Da，硫 6.9％(w/w)，硫酸根/羧酸根比未检测二硫酸化二糖含量 未检测HCII介导的抗凝血酶活性 36.6IU/mg在兔颈静脉血栓模型(用5mg/kg的凝血酶原激酶处理的雄性和雌性Mol.Russian兔(体重2-2.5kg))中，上面得到的物质显示ED50值为0.753mg/kg。实施例2
把4.0g按照实施例1的方法制备的低分子量硫酸皮肤素按照实施例1的方法与Amberlite IRA 904结合，在60℃和pH5.8-6.0下，用1.0M氯化钠溶液搅拌过夜洗脱两次，以洗脱出低硫酸化的低分子量硫酸皮肤素。再按照实施例1的方法洗脱出随后分离的高度硫酸化的低分子量硫酸皮肤素，其显示下列特性峰值分子量(Mp) 7170Da，硫 7.0％(w/w)，硫酸根/羧酸根比未检测二硫酸化二糖含量 未检测HCII介导的抗凝血酶活性 30.9IU/mg实施例313.0kg从猪小肠粘膜中分离的硫酸皮肤素钠溶于130L去离子水中，再把617gNaIO4在搅拌下缓缓加入到该反应器中。该溶液在暗处搅拌过夜。小心地往该溶液中加入260g NaBH4。室温三小时后，用盐酸调整pH至2.0，在60℃下搅拌该溶液6小时。然后用氢氧化钠调整pH值至5.7，用1.7倍体积的无水乙醇使该溶液沉淀。得到12.2kg产品，具有下列特性比旋光度 -53.5°硫5.7％(w/w)硫酸根/羧酸根比 1.3HCII介导的抗凝血酶活性6.1 IU/mg将上面分离的低分子量硫酸皮肤素溶于122升0.5M的氯化钠溶液中，再往该溶液中加入4.9kg Amberlite IRA 68离子交换材料。该溶液在60℃搅拌过夜，排干离子交换材料，弃掉溶液，然后在60℃和pH6.0下，用80升2.0M氯化钠溶液过夜洗脱两次。合并的洗脱液用1.5倍体积的无水乙醇沉淀两次，用6.0μm过滤，从水溶液中喷雾干燥。得到713g高度硫酸化的低分子量硫酸皮肤素(LMWDS)，其显示下列特性峰值分子量 5000Da，硫 7.3％(w/w)，硫酸根/羧酸根比1.4二硫酸化二糖含量 39％HCII介导的抗凝血酶活性 44.5 IU/mg在兔颈静脉血栓模型(用5mg/kg的凝血酶原激酶处理的雄性和雌性Mol.Russian兔(体重2-2.5kg))中，皮下注射3小时后，该LMWDS显示ED50值为3.4mg/kg。
在类似的颈静脉血栓模型中，在15只兔的动物组中以三种剂量静脉注射，然后立即研究LMWDS的效果。得到下列结果剂量(mg/kg)不显示血栓形成的动物百分比1 123 6710 80
权利要求
1.含有不同数目硫酸化二糖重复单元的线型低聚糖的混合物，所述二糖重复单元由L-艾杜糖醛酸(IdoA)和N-乙酰-D-半乳糖胺(Gal-NAc)衍生得到，该线型低聚糖混合物具有下列性质(a)该混合物的90％或以上的分子量范围是1600-20000，(b)硫含量为6.0-8.0％重量，(c)硫酸根/羧酸根比为1.2-1.6，(d)二硫酸化二糖含量为单硫酸化二糖含量的20-60％重量，和(e)抗凝血酶活性为20-60IU/mg。
2.如权利要求1所述的混合物，其中的低聚糖具有式1的结构
其中R为H或SO3-，和对于90％或更多的物质，n的范围为3-37；对于分子分布的峰值点，n为10-15。
3.根据权利要求1或2的混合物，其硫含量为6.5-8.0％重量，硫酸根/羧酸根比为1.3-1.6，二硫酸化二糖的含量为30-60％和抗凝血酶活性为30-60IU/mg。
4.含有上面任意一项权利要求中的混合物和一种或多种载体的药物组合物。
5.权利要求1所述混合物的制备方法，包括通过高碘酸盐氧化使硫酸皮肤素解聚，然后用氢硼化物还原和酸水解，再用离子交换分级分离所述混合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中开始的氧化步骤是用高碘酸或其盐在0-30℃和pH5-8的含水介质中进行的，还原步骤是用氢硼化物在0-30℃和pH6-9的含水介质中进行的，酸水解步骤是用无机酸在20-60℃下进行的。
7.根据权利要求5所述的方法，其中分级分离是用阴离子交换树脂通过分步洗脱进行的。
全文摘要
含有不同数目硫酸化二糖重复单元的线型低聚糖的混合物,所述二糖重复单元由L－艾杜糖醛酸(IdoA)和N－乙酰－D－半乳糖胺(Gal－NAc)衍生得到,该线型低聚糖混合物具有下列性质:(a)该混合物的90%或以上的分子量范围是1600—20000,(b)硫含量为6.0—8.0%重量,(c)硫酸根/羧酸根比为1.2—1.6,(d)二硫酸化二糖含量为单硫酸化二糖含量的20—60%重量,和(e)抗凝血酶活性为20—60IU/mg。该混合物可用作抗血栓形成试剂,制备过程为:用高碘酸盐氧化硫酸皮肤素使其解聚,再用氢硼化物还原,然后酸水解,然后离子交换分级分离。
文档编号A61P7/00GK1259143SQ98805797
公开日2000年7月5日 申请日期1998年5月15日 优先权日1997年6月3日
发明者M·伦德奎斯特, K·B·约翰森 申请人:里奥药物制品有限公司