专利名称：改进的免疫疗法的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫治疗领域，特别涉及增强抗肿瘤免疫反应。
背景技术：
治疗肿瘤的一种方法是在肿瘤细胞内引入基因，该基因编码的酶能将相对低毒性的前体药物转化为有效的细胞毒药物。机体对这一前体药物全身给药是耐受的，因为它只在肿瘤区域才会被细胞表达的前体药物转化酶转化为有毒的衍生物。这一方法称为基因导向的酶前体药物疗法(GDEPT)，或者通过重组病毒载体而递送基因的病毒导向的前体药物(prodrug)疗法(VDEPT)(McNeish等，1997)。
用在此种途径的前体药物和前体药物转化酶的例子包括更昔洛韦(ganciclovir)和HSV胸苷激酶、5-氟胞嘧啶和胞嘧啶脱氨酶、环磷酰胺或对乙酰氨基酚和细胞色素P450，和与本发明特别相关的氮丙啶基前体药物CB1954(5-(氮丙啶-1-基)-2，4-二硝基苯)及硝基还原酶(Knox等1998)。在观察到Walker大鼠癌细胞系对CB1954特别敏感之后，这表明这是由于表达大鼠硝基还原酶DT硫辛酰胺脱氢酶。然而，由于CB1954是人型的该酶较差的底物，人肿瘤细胞对CB1954敏感度要差很多。GDEPT被设想作为一种引入合适的硝基还原酶的途径，优选对CB1954具有更高活性的酶，用来致敏靶细胞。由NFSB基因(又称作NFNB，NFSI或DPRA)编码的大肠杆菌硝基还原酶(EC1.6.99.7，又称作对氧气不敏感的NAD(P)H硝基还原酶或二羟基蝶啶还原酶，通常简称NTR)，被广泛用作此目的(Grove等综述，1999)。NFSB编码的硝基还原酶(NTR)是同型二聚体，能结合两个黄素单核苷酸(FMN)辅因子分子。利用NADH或NADPH作为电子供体，结合的FMN作为还原的中间体，NTR还原CB1954的两个硝基中的任意一个，生成高毒性的4-羟胺衍生物或相对无毒性的2-羟胺。在细胞内部，(5-(氮丙啶-1-基)-4-羟氨基-2-硝基苯甲酰胺)极可能通过进一步的有毒代谢物，变得非常具有基因毒性(Knox等，1991)。其导致的损害的确切本质还不清楚，但与其他因素引起的损害不相同。出现特别高频率的链间交联，而该损害很难修复，致使CB1954成为异常有效的抗肿瘤剂(Friedlos等，1992)。这一系统在许多模式系统中已显示出有效产生有用的抗肿瘤反应，包括在裸鼠身上人异种移植的肿瘤(Djeha等，2000)。
也就是说，已经有将酶-前体药物策略与免疫疗法相结合来增强肿瘤杀伤效果的尝试。合理的是希望在被细胞毒性因子杀伤的细胞中生成针对肿瘤特异性抗原的抗肿瘤免疫反应，及希望肿瘤位置的残余细胞和肿瘤转移中的细胞能(主要)被细胞毒性T细胞反应杀伤。为促进刺激这一反应，基因疗法中已尝试使用一些免疫刺激的分子与GDEPT/VDEPT结合。其中较好的候选物是GM-CSF，其已经与胸苷激酶(Jones等)和胞嘧啶脱氨酶一起使用(Cao等)。其他尝试与上述一种或两种酶共同使用的候选物包括IL-2，II-6，B7-1(Felzman等)，IFN-γ(Santodonato等)和MCP-1(Sakai等)然而总体来看，试验的结果不一，没有产生对治疗方案可靠的改进。对于肿瘤的免疫治疗还有很多地方需要改进。
在细胞应激反应中，一亚组基因被诱导表达产生应激反应蛋白。这些蛋白有着不同的功能，包括细胞内的信使和转录因子，如NF-κB和高泳动性组B1(HMGBl，Bustin，2002)和细胞因子如IL-1β，IL-1α，IL-6，IL-8，TNF-α，GM-CSF，IL-12和IL-15。其中最为重要的一类称作热休克蛋白。
热休克蛋白是细胞内广泛存在的蛋白，在进化过程中保持高度保守性，已知与基本的细胞内过程如蛋白折叠，解折叠和蛋白的降解相关，是多个蛋白亚单位复合体的装配。在细胞应激条件下(热，毒素，饥饿，组织缺氧)其表达水平急剧上调，并且在修复和减轻细胞应激期间导致的蛋白损伤中起作用(Parsell和Lindquist综述，1993)。热休克蛋白的表达受一些结合到热休克蛋白启动子元件的上游因子控制。这些上游因子包括HSF-1(热休克蛋白-1，Baler等，1993)，HSF-2(Mathew等，2001)和HSF-3(Nakai和Morimoto等，1993)和干扰素反应因子，包括IRF-1和2(Taniguchi等，2001，Mamane等，1999)。
最近，已知它们在衍生自细胞内蛋白的肽的加工和呈递，及将这些肽运送给抗原呈递细胞起着一定的作用。具体而言，热休克蛋白Hsp70，Hsp90和钙网膜蛋白能以极高的亲和力结合自身肽段，通过裂解细胞将其从细胞中释放后运送给表达Hsp受体CD91的抗原呈递细胞(Basu等，2001)。裂解之前的细胞应激提高了热休克蛋白的含量，因而增强这种作用。有人认为，刺激针对细胞内抗原的免疫反应与细胞坏死而不是细胞调亡或程序性细胞死亡有关，而这至少部分地受抗原递呈细胞含量的控制(Matzinger，1994)。当特异性运用于抗肿瘤反应时，非调亡(即坏死)的肿瘤细胞的死亡诱导更高水平的Hsp70，并与免疫原性增强、炎性细胞内容物释放，前炎性Th1型细胞因子的分泌增加和巨噬细胞的激活相关(Gough等，2001)。另一方面，调亡性细胞死亡，因细胞内的大分子在接触到细胞外环境之前已经被降解了，而Hsp70，Hsp90和钙网膜蛋白没有大量释放(Basu等，2000)，因此一般不能引发炎性反应和免疫应答。坏死的，而不是调亡的细胞裂解物能使树突状细胞成熟，其是一种在免疫应答的起始阶段用于激活幼稚T细胞的关键的抗原递呈细胞(Galucci等，1999；Sauter等，2000)。Hsp70本身被认为是树突状细胞的成熟因子(Kuppner等，2001；Gastpar等，欧洲专利申请EP1209226)。此外，调亡细胞可以直接传递抗炎性和免疫抑制信号给抗原递呈细胞，例如通过磷脂酰丝氨酸受体(Fadok等，2000)。
发明概述发明人发现运用硝基还原酶/CB1954酶/前体药物系统，除了杀伤靶标肿瘤细胞外，还杀伤与释放自裂解细胞的活化CB1954有毒产物接触的周围细胞，能对后来进行的同型肿瘤细胞的攻击产生显著的防护效果。由于先前的工作认为这种杀伤是通过调亡机制进行的(Djeha等，2000)，而调亡性细胞死亡被认为只能产生相对弱的免疫应答，上述发现是没预料到的。为进一步增强抗肿瘤效果，构建了含有编码能表达硝基还原酶和Hsp70的多核苷酸的腺病毒基因治疗载体。其合理之处在于肿瘤细胞能成为该载体的靶标，再被其感染，并通过施用CB1954导致死亡，这促进由肿瘤细胞死亡引发的抗肿瘤免疫应答，该免疫应答因Hsp70的过量表达而增强。而这又反过来导致细胞内Hsp70结合的肽段被有效传递到表达CD91的抗原递呈细胞。上述递呈的肽段含有肿瘤特异的“非自身”的表位，是在肿瘤细胞内由于体细胞突变形成的，因此这些肽段的递呈在主要为I型MHC分子的情况下，导致CD8+细胞毒性T细胞抗肿瘤免疫反应的启动。而另有一部分Hsp运送的肽段进入II型MHC呈递途径，导致CD4+T辅助细胞应答的增强。细胞应答的这两个方面都对抗肿瘤免疫非常重要。
这种方法成功产生抗肿瘤免疫应答的原因是否是在至少一部分细胞中GDEPT-介导的杀伤是坏死性的；如果主要的杀伤机制是调亡性的，为何有明显的继发性细胞坏死发生；调亡性细胞死亡的抗炎性和非免疫原性性质能否在一定程度上被热休克因子的过量表达所克服，这些问题都尚不清楚。然而，发明人证实在小鼠肿瘤模型中用运送NTR基因的载体注射原发性肿瘤以及随后全身给药CB1954不仅杀伤肿瘤，而且能在一定程度上防止对同类肿瘤细胞的攻击。发明人还进一步表明这种保护效应因方便在同一基因治疗载体中同时给药指导表达Hsp70的基因而显著增强。
本发明不限于硝基还原酶作为前体药物转化酶的应用，也不限于依赖前体药物转化的细胞杀伤的方法。原则上，任何一种细胞杀伤的方法，包括编码能进行细胞杀伤的分子的多核苷酸，都可以与任何具有热休克蛋白样功能的分子联用，作为内源性的佐剂加强抗肿瘤应答。能被编码并应用到这一途径的毒素有篦麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素和肉毒(杆)菌毒素。能作为适合的前体药物转化酶的另一种选择是细胞色素P450/对乙酰氨基酚酶/前体药物组合。已知这一系统可用作杀伤肿瘤细胞的手段(国际专利申请WO 00/40272)，并且有证据表明，由于对乙酰氨基酚激活产生毒性的N-乙酰苯并醌亚胺(NABQI)，导致细胞杀伤是调亡性的(Bae等，2001；Boulares等，2002)。然而，申请人发现细胞色素P450和hsp70的共同表达在治疗量的对乙酰氨基酚存在的条件下，导致抗肿瘤应答比单独应用细胞色素P450时显著提高。
事实上，上述公开的运送提供表达热休克蛋白的载体的方法显然可以用来增强针对由于不同原因被杀死的细胞的免疫应答，如肿瘤细胞，但不限于此。热休克蛋白的DNA运送作为辅助的免疫治疗结合化学治疗或放射治疗可能是有益的。
适合用作免疫佐剂的分子为Hsp70，Hsp90，Hsp110，钙网膜蛋白，gp96，grp170，Hsp27，Hsc70，分枝杆菌Hsp65，肺炎军团杆菌(Legionella pneumophila)Hsp60，大肠杆菌(Escherichia coli)GroEL和GroES。
此外，从在此公开的数据一目了然，基于GDEPT方法导致坏死性细胞死亡(如NTR/CB1954组合)的应用，即使没有由结合的Hsp转基因提供的上调Hsp表达水平的额外有益作用，仍然是有显著的免疫原性。
这个载体可以是能将DNA转移到细胞内的任何载体，优选的载体为整合载体或游离型载体。
优选的整合载体包括重组的逆转录病毒载体。重组的逆转录病毒载体包括逆转录病毒基因组的至少一部分能感染靶细胞的DNA。术语“感染”用以说明病毒将遗传物质转移到它的宿主或靶细胞内的过程。优选地，构建本发明的载体所用的逆转录病毒是复制缺陷型的，能消除病毒复制对靶细胞的影响。在这些情形下，复制缺陷型的病毒基因组可被辅助病毒以常规的技术进行包装。通常任何满足上述感染力和功能基因转移要求的逆转录病毒都可以用在本发明的实践中。
合适的逆转录病毒载体包括业内人上知晓的pLJ，pZip，pWe，pEM，但不限于此。对复制缺陷型的逆转录病毒合适的包装病毒系统包括，例如ψCrip，ψCre，ψ2，和ψAm。特别适合的逆转录病毒载体是慢病毒载体，尤其是HIV，SIV和FIV。
本发明中其他有用的载体包括腺病毒、腺相关病、SV40病毒、牛痘病毒、HSV和痘病毒载体。优选的载体是腺病毒载体。腺病毒载体为业内人士所知并已用于向众多细胞类型转移基因，包括呼吸道上皮、骨骼肌、肝、脑和皮肤(Hitt等，1997；Anderson，1998)和以及向肿瘤细胞转移基因(Moutain，2000)。
另一种优选的载体是腺相关病毒(AAV)载体。AAV载体为业内人士所知并已用于基因治疗中稳定转导人T淋巴细胞，成纤维细胞、鼻息肉、骨骼肌、脑、类红细胞和造血干细胞(Philip等，1994；Russell等，1994；Flotte等，1993；Walsh等，1994；Miller等，1994；Emerson，1996)。国际专利申请WO 91/18088描述了具体的基于AAV的载体。
优选的游离型载体包括暂时不复制的游离载体和具有病毒来源的复制功能的自身复制型游离载体，所述病毒包括EBV，人乳多空病毒(BK)和BPV-1。
这样的整合型和游离型载体对业内人士是熟知的，并在业内熟知的文献中有完整的描述。具体而言，合适的游离型载体的描述见于WO98/07876。
哺乳动物人工染色体也可在本发明中用作载体。哺乳动物人工染色体的使用有关的讨论参见Calos(1996)。
在优选的实施方案中，本发明的载体是质粒。该质粒可以是不能复制和不能整合的质粒。
此处使用的术语“质粒”意指任何编码可表达的基因的核酸，包括线状或环状的核酸及双链或单链的核酸。核酸可以是DNA或RNA，并可以包括修饰过的核苷酸或核糖核苷酸，以及可以是通过甲基化或包含保护基团或加帽或加尾等途径而经化学修饰过的。
不能复制和不能整合的质粒是一种核酸，当其转染宿主细胞后不能复制，也不能特异性的整合到宿主的基因组中(即，不能以高频率整合，且不能整合在特定位点)。
复制型质粒的鉴定利用标准分析，包括Ustav等(1991)的标准复制检测方法。
本发明还提供转染有本发明的载体的宿主细胞。该宿主细胞可以是哺乳类细胞。优选的是啮齿动物或哺乳动物细胞。
很多已知的技术可以用在本发明作为运送所述的载体至细胞中，包括使用核酸缩合剂，电穿孔，配合使用石棉、凝聚胺(polybrene)、DEAE纤维素、右旋糖苷、脂质体、阳离子脂质体、脂聚胺、聚鸟氨酸、颗粒轰击和直接微注射(Kucherlapati和Skoultchi综述，1984；Keown等1990)。
本发明的载体可以通过病毒或非病毒的转移方式被非特异性或特异性(即转移到指定的宿主细胞部分)转移到宿主细胞。优选的源自病毒的转移方法包括使用产生病毒粒子的包装细胞系作为本发明载体的转染受体，该受体中病毒包装信号已被改造，所述的病毒如腺病毒，疱疹病毒和乳多空病毒。优选的源自非病毒的基因转移机制也可用于本发明中并包括直接的裸核酸注射，核酸缩合肽和非肽、阳离子脂质体和在脂质体中进行封装。
载体直接转移到组织中已有描述，也获得一些短期的基因表达。载体直接转移到肌肉(Wolff等，1990)，甲状腺(Sikes等，1994)，黑色素瘤(Vile等，1993)，皮肤(Hengge等1995)，肝(Hickman等，1994)，和暴露在呼吸道上皮后(Meyer等，1995)是现有技术清晰描述的。
来自于病毒外膜蛋白的氨基酸序列的不同的肽段被用于基因转移中与聚赖氨酸DNA复合物共同施用(Plank等，1994，Trubetskoy等，1992；WO91/17773；WO92/19287和Mack等，1994)，表明聚赖氨酸偶联物与阳离子脂类的共缩合能导致基因转移效率的提高。国际专利申请WO95/02698公开了使用病毒组分以试图提高阳离子脂类基因转移效率。
本发明中有效的核酸缩合剂包括精胺、精胺衍生物、组蛋白、阳离子肽、阳离子非肽如聚乙烯亚胺(PEI)和聚赖氨酸。“精胺衍生物”是指精胺的类似物和衍生物，以及包括国际专利中请WO93/18759中列出的化合物(公布于1993年9月30日)。
二硫键被用来连接转移介质的肽组分(Cotton等，1992)，参见Trubetskoy等(同上)。
转移DNA结构到细胞的转移介质是业内所知的，包括对细胞表面受体特异的DNA/聚阳离子复合物，描述见于，如Wu和Wu(1988)，Wilson等(1992)和美国专利No.5,166,320。
根据本发明的载体的转移通过使用核酸缩合肽而实现。核酸缩合肽描述见于国际专利申请WO 96/41606，其对缩合载体和将载体转移到细胞特别有效。官能团可以结合到本发明所述的用于载体转移的肽上，如WO96/41606中所述。这些官能团包括靶向到特定细胞类型的配体，如单克隆抗体，胰岛素、转铁蛋白、唾液酸糖蛋白或糖。上述配体可以根据细胞类型的限制，以特异或非特异的方式靶向到细胞。
官能团还可以包括脂类，如棕榈酰脂、油脂或硬脂酰脂；和中性亲水的聚合物如聚乙二醇(PEG)，或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；致溶血的肽，如流感病毒的HA肽；或重组酶或整合酶。官能团还可以包括细胞内运输蛋白(trafficking protein)，如核定位序列(NLS)，内涵体逃逸信号，如膜破坏蛋白，或指引蛋白直接到细胞质的蛋白。
因此，本发明提供含有编码毒素或前体药物转化酶的多核苷酸序列，和编码应激反应蛋白或应激反应蛋白表达诱导因子的的多核苷酸序列产品。所述的应激反应蛋白包括如NF-κB、B1组高泳动性类蛋白(HBGB-1)、细胞因子如IL-1β，IL-1α，IL-6，IL-8，TNF-α，GM-CSF，IL-12和IL-15；和热休克蛋白如Hsp70，Hsp90，Hsp110，钙网膜蛋白，gp96，grp170，Hsp27，Hsc70，分枝杆菌Hsp65，肺炎军团杆菌Hsp60，大肠杆菌GroEL和GroES；应激蛋白表达诱导因子包括HSF-1、HSF-2、HSF-3、IRF-1和IRF-2。
在一个优选的实施方案中，优选的毒素或前体药物转化酶能坏死性杀死细胞。术语“坏死性”和“坏死性细胞死亡”包括所有形式的非程序性或调亡的细胞死亡。
在另一个优选的实施方案中，上述产品用于增强免疫应答，特别是抗肿瘤的免疫应答。
在另外的实施方案中，编码毒素或前体药物转化酶的多核苷酸序列，和编码应激反应蛋白或应激反应蛋白表达诱导因子的多核苷酸序列都是单个多核苷酸分子的组分。在另一个实施方案中，上述序列位于不同的多核苷酸序列中，可以同时或连续地给药。
优选地，毒素或前体药物转化酶是能够活化前体药物CB1954的硝基还原酶，或者是细胞色素P450酶，优选源自哺乳动物的，更优选来自人的，最优选为人的CYP1A2或者是人的CYP2E1或CYP3A4。
在另一个优选的实施方案中，编码的酶是啮齿动物细胞色素P450，优选小鼠的。最优选的，是小鼠CYP1A2、CYP2E1或CYP3A4。
优选地，多核苷酸编码的应激反应蛋白是热休克蛋白。更优选，热休克蛋白选自Hsp70，Hsp90，Hsp110，钙网膜蛋白，gp96，grp170，Hsp27，Hsc70，分枝杆菌Hsp65，肺炎军团杆菌Hsp60，大肠杆菌GroEL和GroES，最优选的是Hsp70。或者，多核苷酸编码应激蛋白表达诱导因子，其能诱导热休克蛋白的表达。优选地，其选自热休克因子-1(HSF-1)，热休克因子-21(HSF-2)，热休克因子-3(HSF-3)，干扰素反应因子-1(IRF-1)，或干扰素反应因子-2(IRF-2)。
在第二方面，本发明提供含有上述产品的DNA疫苗。“DNA疫苗”是指能引发或增强治疗性免疫反应的物质，其包括一个或多个编码并能表达蛋白或肽段具有免疫原性或佐剂性质的多核苷酸。
第三方面，DNA疫苗包括编码用以增强抗肿瘤免疫应答的毒素或前体药物转化酶的多核苷酸。优选地，毒素或前体药物转化酶为能活化前体药物CB1954的硝基还原酶。或者，毒素或前体药物转化酶是细胞色素P450。优选地，该细胞色素P450选自人CYP1A2、人CYP2E1，人CYP3A4，啮齿动物CYP1A2，啮齿动物CYP2E1，和啮齿动物CYP3A4。
优选地，所述毒素或前体药物转化酶能诱导坏死性细胞死亡。
本发明的第四方面在于提供含有编码能活化前体药物CB1954的硝基还原酶的多核苷酸，和编码免疫刺激分子的多核苷酸的组合物，用于增强抗肿瘤免疫应答。术语“免疫刺激”包括能作为免疫抑制因子或效应的抑制剂的因子，如IL-10和TGF-β。
优选地，免疫刺激分子选自GM-CSF，IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，IL-12，IL-18，B7-2，TNFα，γ-IFN，MCP-1，MIP-2RANTES，TGF-β，CD154(CD40配体)，CD134配体(OX40L)，I型MHC，II型MHC，CD135配体(Flt3L)，TNF相关调亡诱导受体(TRAIL，Apo-2配体)。
本发明的具体实施方案为编码下列用于增强免疫应答的物质的载体a)毒素或前体药物转化酶，和b)应激反应蛋白优选地，免疫应答为抗肿瘤免疫应答。
还优选地，应激反应蛋白是热休克蛋白。更优选地，热休克蛋白选自Hsp70，Hsp90，Hsp110，钙网膜蛋白，gp96，grp170，Hsp27，Hsc70，分枝杆菌Hsp65，肺炎军团杆菌Hsp60，大肠杆菌GroEL和GroES。最优选的是Hsp70。
优选地，毒素或前体药物转化酶为能活化前体药物CB1954的硝基还原酶。最优选，载体为CTL102/mCMV-mHSP70，如
图1所示。
或者，可以是细胞色素P450酶，优选为源自哺乳动物，更优选源自人，最优选为人的CYP1A2。或者为人CYP2E1或人CYP3A4。
在另一优选的实施方案中，编码的酶为啮齿动物细胞P450，优选来自小鼠，最优选的为小鼠CYP1A2，CYP2E1或CYP3A4。
进一步优选，任何上述的载体具有一种或两种下列多核苷酸序列其一方面编码毒素或前体药物转化酶，另一方面编码应激反应蛋白或应激反应蛋白表达诱导因子，并可操作连接至一个或多个提供肿瘤选择性表达的启动子。
这里使用的术语“可操作连接”，是指将欲表达的基因通过顺式连接受启动子控制。
优选的肿瘤选择性启动子包括TRP-1，HER2，HER3，ERBB2，ERBB3，CEA，MUC-1，α胎蛋白，前列腺特异性抗原(PSA)，绒毛蛋白，胰淀粉酶，酪氨酸酶相关肽，肿瘤排斥抗原前体和T细胞因子(TCF)反应性启动子。优选地，所述启动子包括一个或多个TCF反应性元件。
TCFs是一个转录因子家族，属于高泳动性组(HMG)的DNA结合蛋自(Love等，Nature，376，791-795，1995)。该家族包括TCF-1，TCF-3和TCF-4，它们在van der Wetering等(EMBOJ.，10，123-132，1991)，EP-A-0939122和Korinek等(Science，275，1784-1787，1997)中有描述。TCF-4显示参与Wnt/Wingless信号传导相关的肿瘤发生。TCF和LEF-1(淋巴增强因子-1)被认为通过与β-连环蛋白相互作用介导针对Wnt信号的核反应。Wnt信号传导和其他增加β-连环蛋白稳定性的细胞事件据信通过与β-连环蛋白相关的LEF-1和TCF蛋白能导致基因的转录激活。在没有Wnt信号传导的情况下，LEF-1/TCF蛋白抑制与Groucho和CBP(CREB结合蛋白)相关的转录。
在没有Wnt信号传导的情况下，β-连环蛋白被发现存在于两个不同的多蛋白复合物中。一个复合物定位在细胞质膜上，将钙粘着蛋白(钙依赖的吸附分子)与肌动蛋白细胞骨架交联，而另一个复合物(包括结肠腺瘤性息肉蛋白(APC)，虫漆脂，糖原合成酶激酶3β(GSK3β))靶向β-连环蛋白使其降解。Wnt信号传导拮抗APC-虫漆脂-GSK3β复合物，造成细胞质内游离β-连环蛋白水平的升高。游离胞质β-连环蛋白能重定位到细胞核，在那里结合LEF-1/TCF因子并激活Wnt靶基因。Wnt和其他信号对LEF-1/TCF转录因子的调控讨论见于Eastman等(Current Opin.Cell Biology，11，233-240，1999)。
TCFs已知可以识别并结合TCF结合元件，该结合元件具有核苷酸序列CTTTGNN，其中N表示A或T(van der Wetering等，同上)。
TCF反应性元件已显示能提供可操作连接的基因在肿瘤中的高选择性表达，尤其是在结肠和肝脏的肿瘤中(WO01/64379)。
优选地，载体是病毒载体，更优选地，是腺病毒载体。特别优选的实施方案是编码和允许表达能活化前体药物CB1954的硝基还原酶和(b)hsp70，用以增强抗肿瘤免疫应答。最优选是CTL102/mCMV-mHSP70。
或者，病毒载体是逆转录病毒载体，更优选为慢病毒载体。
另一个实施方案是含有上述任意载体的宿主细胞。
本发明的另一方面是含有上述相关产品或组合物、载体或宿主细胞的疫苗。
还提供上述相关产品或组合物、载体或宿主细胞用作药剂或疫苗。
本发明的另一方面是药物组合物，其含有上述的任意产品或相关的组合物，DNA疫苗，载体或宿主细胞和可药用的稀释剂，缓冲液，佐剂或赋形剂。
同样提供的上述任意产品，相关的组合物，DNA疫苗，载体或宿主细胞在制备用于治疗癌症的药剂或用于治疗癌症的疫苗中的应用。
本发明提供增强免疫应答的方法，包括给药治疗量的含有编码毒素或前体药物转化酶的多核苷酸和编码热休克蛋白或热休克蛋白表达诱导因子的多核苷酸的产品。优选地，免疫应答是抗肿瘤免疫应答。
还提供治疗患有某种癌症的病人的方法，包括给药治疗量的含有编码毒素或前体药物转化酶的多核苷酸和编码热休克蛋白或热休克蛋白表达诱导因子的多核苷酸的产品。
在一个优选的实施方案中，该方法包括给药治疗量的含有编码能够活化前体药物CB1954的硝基还原酶的多核苷酸和编码热休克蛋白的多核苷酸的产品，经一段时间上述产品进入肿瘤细胞，编码的硝基还原酶和热休克蛋白被表达，然后给药治疗量的CB1954。
或者，该方法包括给药治疗量的含有编码细胞色素P450的多核苷酸和编码热休克蛋白的多核苷酸的产品，经一段时间上述产品进入肿瘤细胞，编码的细胞色素P450和热休克蛋白被表达，然后给药治疗量的前体药物。优选的前体药物是对乙酰氨基酚。
上述方法中优选的热休克蛋白是Hsp70。
本发明的另一方面提供了治疗患某种癌症的病人的方法，包括给药治疗量的含有编码热休克蛋白的多核苷酸的产品，和治疗量的抗肿瘤细胞毒性药物，以诱导治疗性的抗肿瘤免疫应答。
在优选的实施方案中，抗肿瘤细胞毒性药物能够诱导肿瘤细胞的坏死性死亡。
在本发明的最后一方面，提供引发抗肿瘤免疫应答的方法，包括给药治疗量的含有编码能够活化前体药物CB1954的硝基还原酶的多核苷酸的产品，经一段时间上述物质进入肿瘤细胞，编码的硝基还原酶被表达，然后给药治疗量的CB1954。
本发明的该产品、DNA疫苗，载体或宿主细胞或药物组合物可以通过全身，肌内、皮下、皮内、静脉内、气溶胶、口服(液体或固体形式)、局部、眼部、栓剂、腹膜内和/或胸内和局部的直接注射等途径而被施用。
该疗法的确切剂量当然需要由临床医生根据病人的具体情况来决定，而这反过来，又受控于治疗性基因表达的蛋白具体性质和将接受治疗的靶组织的类型。
剂量还依赖于疾病指征和药物给药的途径。
根据本发明，为实现有效治疗的目的，核酸构建体或载体的转移量优选为在大约50ng-1000μg载体DNA/每公斤体重的范围，更优选的在大约1-100μg载体DNA/公斤的范围。
尽管根据本发明优选在哺乳动物给药核酸构建体，载体或宿主细胞，使其在体内被细胞吸收；但离体方法也可以应用，其中从动物取出的细胞被核酸构建体或载体转导，然后回输到动物体内。
附图简述图1
腺病毒血清型5(Ad5)E1的重组腺病毒的结构。所有的病毒都删除了所示的E1和E3病毒区域。E1删除包括Ad5病毒基因组的359-3524位核苷酸，而E3删除了28,592-30,470位核苷酸。HCMV人CMV(巨细胞病毒)；IE(立即早期)增强子/启动子；NTR大肠杆菌硝基还原酶基因；IVSII人β珠蛋白内含子II序列；mCMV小鼠巨细胞病毒IE增强子/启动子；mHSP70小鼠热休克蛋白70；SV40SV40晚期poly(A)信号；mGM-CSF小鼠粒细胞-集落刺激因子。
图2.
受腺病毒载体感染的细胞裂解物中NTR，mHSP70和mGM-CSF的Western印迹分析。
(A)以感染复数(MOI)增高的病毒Ad.mCMV-mHSP70(泳道3-5)，或CTL102/mCMV-mHSP70(泳道8-10)感染CMT93细胞(不表达内源HSP70)。CTL102感染的细胞提取物用作NTR表达的阳性对照。Ad.CMV-LacZ感染的细胞的提取物(泳道2)用作阴性对照。
(B)以Ad.mCMV-mGM-CSF(泳道2)或Ad.CMV-LacZ(泳道1，阴性对照)感染Hela细胞。
在感染后24小时制备全细胞提取物。用50μg蛋白裂解物进行变性SDS-PAGE，下游的处理于材料和方法中描述。Biorad分子量标准用来确定表达的蛋白是否具有期望的大小。
图3.
免疫接种方案图4.
A.用5.0×103和5.0×104Ad.hCMV-NTR-转导(CTL102)的4T1细胞单次免疫接种和体内CB1954处理，小鼠产生对5.0×103亲本4T1细胞攻击的保护。对小鼠的攻击发生在免疫接种后21天(空心棒)或80天(实心棒)。
B.用5.0×103或5.0×104个CTL102-转导的4T1细胞单剂量免疫接种和体内CB1954处理之后21天，小鼠不产生对5.0×104个EJ6细胞攻击的保护，EJ6细胞是无关的肿瘤细胞系。
棒显示强制处死时，有保护作用的受攻击的个体肿瘤大小与对照组幼稚小鼠平均肿瘤大小的百分比。
图5.
A.在分别用a)5.0×104Ad.hCMV-NTR-转导的(CTL102)4T1细胞及CB1954处理，(b)5.0×104Ad.hCMV-NTR/mCMV-mHSP70-转导的4T1细胞及CB1954处理，(C)5.0×105CTL102-转导的4T1细胞及CB 1954处理和(d)5.0×105个Ad.hCMV-NTR/mCMV-mHSP70-转导的4T1细胞及CB1954处理的免疫接种的单个BALB/c小鼠接受肿瘤细胞攻击30天后的肿瘤大小。免疫接种后21天，所有的小鼠用5.0×103个亲本4T1细胞攻击，及一组幼稚小鼠(e)。
B.图显示处理组的平均肿瘤大小。
C.用5.0×105个CTL102-转导的4T1细胞及CB1954处理，5.0×105Ad.mCMV-mHSP70-转导的4T1细胞及CB1954处理，和5.0×105个Ad.hCMV-NTR/mCMV-mHSP70-转导的4T1细胞及CB1954处理而免疫接种的小鼠存活率。免疫接种后21天，所有的小鼠用5.0×103个亲本4T1细胞攻击，及一组幼稚小鼠。
图6.
A在分别用(a)5.0×105个Ad.hCMV-NTR-转导的(CTL102)4T1细胞及CB1954处理，(b)5.0×105个CTL102+Ad.mCMV-mHSP70-转导的4T1细胞及CB1954处理，(c)5.0×105Ad.mCMV-mGM-CSF转导的4T1细胞及CB1954处理以及(d)5.0×105个CTL102+Ad.mCMV-mGM-CSF转导的4T1细胞及CB1954处理而免疫接种的单个BALB/c小鼠在接受肿瘤细胞攻击30天后的肿瘤大小。免疫接种后21天，所有的小鼠用5.0×103个亲本4T1细胞攻击，及一组幼稚小鼠(e)。
B图显示处理组的平均肿瘤大小。
发明详述以下列实施例来详细描述本发明。这些实施例用作举例说明，而不是对本发明的限制。
实施例实施例1材料和方法细胞培养4T1，小鼠乳癌细胞，获自ATCC(CRL-2539)。EJ-6-2-Bam-6a获自ATCC(CRL-1888)，并通过用人EJ膀胱癌细胞DNA转染NIH/3T3而产生。PER.C6细胞(lit)获自IntroGene(Leiden，荷兰)。911细胞由L.Young教授提供(CRC癌症研究所，伯明翰大学，英国)，于含10％FCS，10mM MgCl2和抗生素的DMEM培养液中维持。4T1和EJ-6-2-Bam-6a采用提供者建议的方式培养。
质粒构建pTX0374通过克隆含有连接到大肠杆菌ntr基因(NTR从基因组DNA扩增到的大肠杆菌B/r硝基还原酶基因)的人CMV启动子的1.6kbBglII-BamHI片段到pSW107而构成。pRAJ 43BP4是含有小鼠GM-CSF cDNA的pUC19质粒，由L.Young教授惠赠(CRC癌症研究所，伯明翰大学，英国)。CET902是含有小鼠CMV IE增强子/启动子和SV40晚期poly(A)信号的pUC19质粒。
CET902/mCMV-mHSP70含有应激诱导的小鼠HSP70蛋白的表达盒，以如下方式构建。首先将小鼠全长(1.4.kb)CMV启动子克隆到源自pUC19的载体。然后SV40晚期poly(A)信号被克隆到启动子的下游。最后，编码小鼠HSP70的cDNA通过Smal位点被克隆到启动子和poly(A)信号之间。含有小鼠HSP70的cDNA的质粒由R.Vile博士惠赠(分子医学项目，Mayo Clinic，200第一大街SW，罗切斯特，明尼苏达，美国)，切成NheI/BamHI片段并以T4DNA聚合酶平末端处理。
CET902/mCMV-mGM-CSF得自于用EcoR I and Bam HI消化处理pRAJ 43 BP4释放出465bp的片段。该片段是平末端，连接到Smal处理的CET902。
pPS1128由P.Searle博士惠赠(CRC癌症研究所，伯明翰大学，英国)。pPS1128含有腺病毒序列从左侧反向末端重复(ITR)到359位核苷酸和从3525到10,589位核苷酸，因此是E1-缺失的载体。pPSl128的构建方法是将连接到240bp含poly(A)添加物和人补体C2基因的转录终止信号的Hinc II至BamHI片段上的人β珠蛋白基因的917bp片段(2号外显子Bam HI位点至3号外显子Eco R1位点)，克隆到pBluescript质粒(Stratagene)中。该质粒构建分两个阶段。首先，pPS971质粒(Weedon等，Int.J.Cancer，待出版)的左侧EcoR I位点被转化为Swal位点以生成pPS115。然后pPS115的长为350bp Spe 1-Afl II片段被下面两条寡核苷酸退火形成的接头所代替5′-CTAGTATCGATTGTTAATTAAGGGCGTGGCC-3′和5′-TTAAGGCCACGCCCTTAATTAACAATCGATA-3’。
pPS1022的构建是将pPS972左侧的EcoRI位点转化为SwaI位点而实现。
pTX0375，用于生成CTL102的转移载体，其构建方法为将横跨整个表达盒(hCMV-NTR-IVSII-p(A))的SpeI片段从pTX0374克隆到SpeI消化的pPS1128质粒，并鉴定含有从左向右方向的表达盒的克隆。pPS 1128/mCMV-mHSP70和pTX0375/mCMV-mHSP70的构建方法为将mCMV-mHSP70-SV40p(A)表达盒从CET902/mHSP70分别转移到平末端化的pPS1128或转移到平末端化的pTX0375的Pacl位点。mCMV-mHSP70-SV40p(A)表达盒通过用Xmn I，Asc I和BstZ17I消化CET902/mHSP70质粒以及用T4DNA聚合酶平末端化而制备。因此最后的表达盒只含有大约500bp小鼠CMV启动子，这一片段提供了它绝大多数的活性。pPS118/mCMV-mGM-CSF的构建方法是将从CET902/mCMV-mGM-CSF制备(经BstZ17I和Ascl消化并平末端化)的完整表达盒(1.3kb)克隆到pPS1128。
腺病毒“骨架”载体pPS1160的构建方法是用Pac I线性化处理pPS 1128，与含有Xbal位点的适合Pac I的接头(寡核苷酸15′-TACATCTAGATAAT-3’；寡核苷酸25′-TTATCTAGATGTA-3′)连接，接着用Xba I消化释放约为7kb的含有3524-10589位Ad5序列的Xba I片段。然后将其克隆进Xba I线性化的pPS1022(Peter Searle博士)，这是一种源自pUC18的质粒，含Ad5序列的10,589位至右侧反向末端重复(ITR)但缺失28,592-30,470位核苷酸序列(E3区域)。
腺病毒载体构建重组病毒CTL102(Ad.hCMV-NTR)，CTL102/mCMV-mHSP70，Ad.mCMV-mHSP70和Ad.mCMV-mGM-CSF在Per.C6细胞中通过同源重组而构建。这些细胞分别以pTX0375，pTX0375/mCMV-mHSP70，pPS 1128/mCMV-HSP70或pPS 1128/mCMV-mGM-CSF与pPS 1160的等摩尔混合物共转染到90％汇合的PER.C6细胞。重组病毒在大约7天后经感染培养基(DMEM，1％FCS，2mM MgCl2)3次反复冻融而收获。通过重复的感染/收获循环，病毒大量扩增然后经标准的CsCl密度离心纯化，对过量的保存缓冲液(10mM Tris pH7.4，140mM NaCl，5mM KCl，0.6mM Na2HPO4，0.9mM CaCl2，0.5mM MgCl2和5％蔗糖)透析，最后在液氮中快速冷冻，并保存于-80℃。病毒粒子含量通过BCA蛋白分析试剂(Perbio Science UK，LTD，Tattenhall，Cheshire，UK)测定。空斑形成单位(p.f.u.)滴度通过在911细胞上的空斑试验来测定。
4T1体外感染4T1细胞在加湿的CO2培养箱中以1×107/ml的细胞密度以给定的每细胞p.f.u.(感染复数，MOI)于感染培养基(常规培养基，但只含1％FCS)进行感染。在感染过程中每30分钟轻柔晃动细胞。然后收集细胞(300×g，5分钟)，洗涤之后重悬于PBS。免疫接种实验中感染复数为200到300，并使用病毒混合物，载体的最终剂量保持恒定以避免剂量依赖的细胞病变效应。
Western印迹分析在感染培养基中于37℃，5％CO2的条件下通过孵育2小时用给定的感染复数感染3×105个HeLa细胞。然后细胞用完全培养基(10％FCS)培养24小时。接着用PBS洗涤细胞，每6孔加入200μl RIPA缓冲液(10mM Tris pH8.0，150mM NaCl，1.0％NP40，0.1％SDS，0.5％脱氧胆酸钠加上完整的蛋白酶抑制剂混合物，Roche)制备全细胞裂解物。将细胞在在室温孵育10分钟，然后于4℃以13,000RPM离心。裂解物上清液转移到新管中，用Biorad DC蛋白分析试剂盒(Hercules，CA，USA)测定蛋白浓度。取每个裂解样本30μg采用High Rainbow蛋白质分子量标准(Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ，USA)通过11％SDS-PAGE进行测定。然后将蛋白转移到硝酸纤维素膜(GelmanSciences，Ann Arbor，MI，USA)，以TBS(10mM Tris pH7.5，150mMNaCl)/0.1％Tween20/5％奶粉在室温下封闭1小时。以如下方式用封闭缓冲液稀释第一抗体羊抗-NTR(多克隆抗体，Dyfed，UK)，1∶2000，小鼠抗-HSP70(SPA-810，Stressgen Biotechnologies，Victoria BC，Canada)，1∶1000和山羊抗GM-CSF(SantaCruz，CA，USA；sc-1322)，1∶1000。用第一抗体在室温下孵育膜1小时，然后充分洗涤，并于室温下以如下第二抗体的TBS/0.1％Tween20/0.5％奶粉孵育30分钟驴抗绵羊-HRP(1∶7,500；Sigma)，抗小鼠-HRP(1∶10,000；SIGMA A-9917)和抗山羊-HRP(Sigma，A-5420)。经充分洗涤，用Pierce“超信号West Pico化学发光底物”(Perbio Science UK Ltd.，Tattenhall，UK)进行增强的化学发光，然后以Alpha Innotech Imager Model 2.3.1分析。
小鼠雌性BALB/c小鼠(H-2d，6-8周龄)获自Harlan(Oxion，UK)，维持在控制温度、有光周期的房间中，随意获取食物和水。小鼠可以在进行任何处理之前休息一周。管理和实验程序完全遵守英国内政部规章。
鼠肿瘤模型4T1是高度攻击性和转移性的来自乳腺癌的成熟细胞系，其能在BALB/cfC3H小鼠中自发的产生(Dexter等，1978)。表达H-2dI类但不表达II类分子的4T1细胞系是非免疫原性的肿瘤模型，不能在体内或体外刺激产生同系的抗肿瘤反应。在BALB/c小鼠中最少100％肿瘤诱导剂量是5×102个细胞。当皮下注射到能主要自发转移到肺的BALB/c小鼠体内时，4T1细胞产生攻击性的实体瘤，而原发肿瘤在原位生长。成纤维细胞系EJ-6-2-Bam-6a(Shih等，1981)被用作对照肿瘤。
免疫接种程序指定数量的腺病毒转导的4T1细胞皮下注射到每只幼稚小鼠的体右侧，总量为100μl(第0天)。不同的实验组用单个或不同组合的含硝基还原酶和/或共刺激因子的腺病毒转导的细胞进行注射。经过一段时间体内转基因的表达，第二天表达达到最大，在小鼠肿瘤周围注射总体积为500μl的400μM CB1954溶液。除另有说明，在第21天，对所有的小鼠在身体对侧第二次注射5.0×103亲本4T1细胞。该剂量比幼稚小鼠的最小致死剂量高10倍。一组幼稚小鼠也同时注射了上述细胞。免疫接种后80天进行攻击显示诱导长期抗肿瘤免疫反应。所有组的小鼠在任一次实验中都在同一天用同样制备的细胞进行攻击。定期对动物进行触诊以检查肿瘤的出现，其后每周2-3次以游标卡尺测量肿瘤的两个垂直方向的大小。肿瘤大小表示成个体肿瘤的两个直径的乘积。出于人道主义的考虑，当小鼠显示垂死症状，肿瘤变得过分坏死或肿瘤大小超过160mm2时，将其从组中剔除。
结果
CTL102/CB1954对4T1的杀伤能诱导对4T1细胞攻击显著和持久的保护为证明原位的NTR/CB1954肿瘤细胞杀伤对特异的抗肿瘤免疫反应的产生有一定作用，进行免疫接种实验。在最优化的试验下建立最适的杀伤条件，其中细胞接种的利量范围是(5.0×102到5.0×106NTR-表达的4T1细胞)，随后在体内用从100到400μM逐步增加的CB1954剂量进行实验(数据未显示)，免疫接种无瘤小鼠。在分别以5.0×103或5.0×104个NTR-表达的4T1细胞免疫接种的两组小鼠中，将未接受首次接种的肿瘤细胞的小鼠用5.0×103个未修饰的4T1细胞在细胞接种21天后在身体对侧进行攻击。同样在免疫接种小鼠80天后对其进行攻击实验，以评估长期抗肿瘤免疫反应的诱导。所有幼稚小鼠至第10天产生进行性发展的肿瘤，并在攻击后第25天达到强制处死的程度。在接种有NTR/CB1954杀伤的细胞的小鼠中观察到免疫剂量依赖的排斥攻击物的反应，该反应与攻击的次数无关(图4A)。用5.0×103个细胞低剂量免疫接种比之前未接种过的小鼠赋予低的保护水平，而高剂量(5.0×104)免疫显著增强4T1细胞的免疫接种原性，并保护大多数小鼠免受攻击。
为评估NTR/CB1954杀伤疫苗保护作用的特异性，对免疫接种有5.0×103或5.0×104个表达NTR的4T1细胞的小鼠以另一同系的肿瘤EJ6进行攻击，EJ6是小鼠纤维肉瘤。以4T1细胞免疫接种的小鼠不能保护所有小鼠免遭EJ6攻击(图4B)。
通过表达小鼠HSP70共刺激分子增强NTR/CB1954杀伤的抗肿瘤免疫为测定免疫接种模型中NTR/CB1954杀伤的效果能否因表达共刺激分子HSP70而提高，用转导有携带NTR基因的单重组病毒或携带NTR及HSP70基因双重组病毒的4T1细胞对小鼠进行单次免疫。在第2天在动物的肿瘤周围注射CB1954，然后在对侧用5.0×103个未修饰的4T1细胞进行攻击(参见免疫程序)。免疫接种过程使用两种不同的剂量，低剂量5.0×104，高剂量5.0×105。所有的动物在细胞接种后21天以5.0×103个未修饰的4T1细胞进行攻击，随后观测肿瘤出现，生长，和存活率。这些结果表明NTR/CB1954对表达HSP70的细胞杀伤比单独以NTR/CB 1954杀死的细胞接种的小鼠更能有效引发免疫应答(图5A)。高的接种细胞数量看起来可以更好的保护小鼠免受其后4T1细胞的攻击。因此，接种有表达NTR-HSP70的细胞的动物表现出显著的存活率(图5C)。与之对照，接受表达NTR细胞的动物只表现出适中的存活优势，有一只无瘤小鼠存活时间超过3个月。只用表达HSP70的细胞接种和以CB1954处理不能保护任何小鼠在接种位置免于肿瘤的产生，该处产生进行性生长的肿瘤，约30天肿瘤大小达到可强制处死的程度，小鼠必须于细胞接种后21天的免疫时间之后不久被处死。
通过表达mGM-CSF共刺激分子增强NTR/CB1954杀伤的抗肿瘤免疫为评估GM-CSF的表达在免疫激活NTR/CB1954杀伤中的效果，4T1细胞用携带NTR和携带GM-CSF的腺病毒共同转导，注射到小鼠体内(5.0×105)，并在体内以CB1954处理(参见免疫程序)。尽管GM-CSF单独使用对攻击具有显著排斥效果，并且甚至优于用NTR/CB1954杀伤细胞免疫接种的效果，但是在肿瘤环境中，在NTR/CB1954杀伤的同时存在GM-CSF会导致对攻击更佳的保护，其中57％的小鼠在攻击后30天排斥攻击物(图5A)。所有之前未免疫接种的小鼠在接受肿瘤攻击后因为荷瘤在一个月之内不得不处死。
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权利要求
1.一种产品，含有编码毒素或前体药物转化酶的多核苷酸序列和编码应激反应蛋白或应激反应蛋白表达诱导因子的多核苷酸序列。
2.权利要求1的产品，用于增强免疫应答。
3.权利要求1或2的产品，其中增强的免疫应答是抗肿瘤反应。
4.权利要求1-3任一项的产品，其中编码能够诱导坏死性细胞死亡的毒素或前体药物转化酶的多核苷酸序列，和编码应激反应蛋白或应激反应蛋白表达诱导因子的的多核苷酸序列，都是单个多核苷酸分子的成分。
5.权利要求1-4任一项的产品，其中毒素或前体药物转化酶是能够活化前体药物CB1954的硝基还原酶。
6.权利要求1-4任一项的产品，其中毒素或前体药物转化酶是细胞色素P450。
7.权利要求5的产品，其中细胞色素P450选自人CYP1A2，人CYP2E1，人CYP3A4，啮齿动物CYP1A2，啮齿动物CYP2E1和啮齿动物CYP3A4。
8.利要求1-7任一项的产品，其中编码或诱导的应激反应蛋白是热休克蛋白。
9.权利要求8的产品，其中热休克蛋白选自Hsp70，Hsp90，Hsp110，钙网膜蛋白，gp96，grp170，Hsp27，Hsc70，分枝杆菌Hsp65，肺炎军团杆菌(Legionella pneumophila)Hsp60，大肠杆菌(Escherichiacoli)GroEL和GroES。
10.权利要求9的产品，其中热休克蛋白是Hsp70。
11.DNA疫苗，含有权利要求1-10任一项的产品。
12.DNA疫苗，含有编码用以增强抗肿瘤免疫应答的毒素或前体药物转化酶的多核苷酸。
13.权利要求12的DNA疫苗，其中毒素或前体药物转化酶是能够活化前体药物CB1954的硝基还原酶。
14.权利要求13的DNA疫苗，其中毒素或前体药物转化酶是细胞色素P450。
15.权利要求14的DNA疫苗，其中细胞色素P450选自人CYP1A2，人CYP2E1，人CYP3A4，啮齿动物CYP1A2，啮齿动物CYP2E1和啮齿动物CYP3A4。
16.含有编码能够活化前体药物CB1954的硝基还原酶的多核苷酸和编码免疫刺激分子的多核苷酸的产品，用于增强抗肿瘤免疫应答。
17.含有编码细胞色素P450的多核苷酸和编码免疫刺激分子的多核苷酸的产品，用于增强抗肿瘤免疫应答。
18.权利要求16或17的产品，其中免疫刺激分子选自GM-CSF，IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，IL-12，IL-18，B7-2，TNFα，γ-IFN，MCP-1，MIP-2，RANTES，TGF-β，CD154，CD134配体，I型MHC，II型MHC，CD135配体，和TRAIL。
19.编码并表达下述用于增强免疫反应的物质的载体a)毒素或前体药物转化酶和b)应激反应蛋白。
20.权利要求19的载体，其中免疫反应是抗肿瘤反应。
21.权利要求19或20的载体，其中应激反应蛋白是热休克蛋白。
22.权利要求21的载体，其中热休克蛋白选自Hsp70，Hsp90，Hsp110，钙网膜蛋白，gp96，grp170，Hsp27，Hsc70，分枝杆菌Hsp65，肺炎军团杆菌Hsp60，大肠杆菌GroEL和GroES。
23.权利要求22的载体，其中热休克蛋白是hsp70。
24.权利要求19-23任一项的载体，其中毒素或前体药物转化酶是能够活化前体药物CB1954的硝基还原酶。
25.权利要求19-23任一项的载体，其中毒素或前体药物转化酶是细胞色素P450。
26.权利要求25的载体，其中细胞色素P450选自人CYP1A2，人CYP2E1，人CYP3A4，啮齿动物CYP1A2，啮齿动物CYP2E1和啮齿动物CYP3A4。
27.权利要求19-26任一项的载体，其中一方面是编码毒素或前体药物转化酶的多核苷酸序列，另一方面是编码应激反应蛋白或应激反应蛋白表达诱导因子的多核苷酸序列，在上述两种多核苷酸序列中有一种或两种可操作连接到一个或多个提供肿瘤选择性表达的启动子。
28.权利要求27的载体，其中启动子包括一个或多个TCF反应性元件。
29.权利要求19-29任一项的载体，其中载体是病毒载体。
30.权利要求29的载体，其中载体是腺病毒载体。
31.权利要求29的载体，其中载体是逆转录病毒载体。
32.权利要求31的载体，其中载体是慢病毒载体。
33.编码和表达下列用于增强抗肿瘤免疫反应的物质的腺病毒载体a)能够活化前体药物CB1954的硝基还原酶，和b)hsp70。
34.含有权利要求19-33任一项的载体的宿主细胞。
35.一种疫苗，含有权利要求1-10或16-18任一项的产品，权利要求19-33任一项的载体，或权利要求34的宿主细胞。
36.权利要求1-10或16-18任一项的产品，权利要求10-15任一项的DNA疫苗，权利要求19-33任一项的载体，或权利要求34的宿主细胞，用作药物。
37.权利要求1-10或16-18任一项的产品，权利要求19-33任一项的载体，或权利要求34的宿主细胞，用作疫苗。
38.一种药物组合物，含有权利要求1-10或16-18任一项的产品，权利要求10-15任一项的DNA疫苗，权利要求19-33任一项的载体，或权利要求34的宿主细胞，以及可药用的稀释剂、缓冲液、佐剂或赋形剂。
39.权利要求1-10或16-18任一项的产品，权利要求10-15任一项的DNA疫苗，权利要求19-33任一项的载体，或权利要求34的宿主细胞在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
40.权利要求1-10或16-18任一项的产品，权利要求10-15任一项的DNA疫苗，权利要求19-33任一项的载体，或权利要求23的宿主细胞在制备用于治疗癌症的疫苗中的应用。
41.一种增强免疫反应的方法，包括给药治疗量的含有编码毒素或前体药物转化酶的多核苷酸和编码热休克蛋白或热休克蛋白表达诱导因子的多核苷酸的产品。
42.权利要求41的方法，其中免疫反应是抗肿瘤免疫反应。
43.一种治疗患某种形式癌症的病人的方法，包括给药治疗量的含有编码毒素或前体药物转化酶的多核苷酸和编码热休克蛋白或热休克蛋白表达诱导因子的多核苷酸的产品。
44.权利要求41-43任一项的方法，包括a)给药治疗量的含有编码能够活化前体药物CB1954的硝基还原酶的多核苷酸和编码热休克蛋白的多核苷酸的产品，b)一段时间后，上述产品进入肿瘤细胞，以及编码的硝基还原酶和热休克蛋白被表达，和c)给药治疗量的CB1954。
45.权利要求40-42任一项的方法，包括a)给药治疗量的含有编码细胞色素P450的多核苷酸和编码热休克蛋白的多核苷酸的产品，b)经过一段时间，上述产品进入肿瘤细胞，以及编码的细胞色素P450和热休克蛋白被表达，和c)给药治疗量的前体药物。
46.权利要求43的方法，其中前体药物是对乙酰氨基酚。
47.权利要求40-44任一项的方法，其中热休克蛋白是Hsp70。
48.一种治疗患某种形式癌症的病人的方法，包括给药治疗量的含有编码热休克蛋白的多核苷酸的产品，和治疗量的抗癌细胞毒性药物，以诱导治疗性抗肿瘤免疫反应。
49.一种引发抗肿瘤免疫反应的方法，包括a)给药治疗量的含有编码能够活化前体药物CB1954的硝基还原酶的多核苷酸的产品，b)一段时间后，上述产品进入肿瘤细胞，以及编码的硝基还原酶被表达，和c)给药治疗量的CB1954。
全文摘要
本发明提供了一种改进的诱导针对靶细胞的免疫反应的方法。运用既表达毒素蛋白或前体药物转化酶来杀伤靶细胞型又表达应激反应蛋白(特别是热休克蛋白)的基因疗法，增强随后产生的针对这些细胞的免疫反应。这个方法特别适用于诱导针对癌细胞的免疫反应。本发明还提供此方法中使用的多核苷酸、产品和载体。
文档编号C12N15/861GK1705741SQ200380101398
公开日2005年12月7日 申请日期2003年10月10日 优先权日2002年10月14日
发明者卡伊·斯特凡·利平斯基, 哈基姆·德杰哈 申请人:Ml 实验室公开有限公司