脂环酸芽孢杆菌的多肽的制作方法

专利名称：脂环酸芽孢杆菌的多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及以保藏号DSM 15716保藏的细菌脂环酸芽孢杆菌的基因组包含的多核苷酸所编码的功能性和有效的多肽。本发明还涉及编码这些多肽或促进其表达的多核苷酸和这些多核苷酸的构建体以及制备多肽的方法。本发明还涉及包含该多肽和多核苷酸的组合物以及该多肽的用途。本发明还涉及以保藏号DSM 15716保藏的脂环酸芽孢杆菌属细菌。
背景技术：
一些来源于脂环酸芽孢杆菌属的酶是已知的，例如Matzke等；Genecloning，nucleotide sequence and biochemical properties of a cytoplasmiccyclomaltodextrinase(neopullulanase)from Alicyclobacillusacidocaldarius ATCC 2700；reclassification of a group of enzymes，提交(MAR-1999)给EMBL/GenBank/DDBJ数据库或Koivula等，Cloning andsequencing of a gene encoding acidophilic amylase from Bacillusacidocaldarius.J.Gen.Microbiol.1392399(1993)或Bartolucci等，Thioredoxin from Bacillus acidocaldariuscharacterization，high-levelexpression in Escherichia coli and molecular modeling，Biochem.J.328277(1997)或Tsuruoka等，Collagenolytic Serine-Carboxyl Proteinase fromAlicyclobacillus sendainensis Strain NTAP-1Purification，Characterization，Gene Cloning，and Heterologous Expression，递交(MAY-2002)给EMBL/GenBank/DDBJ数据库；Eckert K.& Schneider E.，A thermoacidophilic endoglucanase(ceIB)from Alicyclobacillusacidocaldarius displays high sequence similarity to arabinofuranosidasesbelonging to family 51 of glycosyl hydrolases；Eur.J.Biochem.，2703593-3602，2003所述。
寻找新酶时，还已知通过对可能的候选者进行特定的酶测定来筛选这类新酶。该方法受到酶可获得性的限制，而且不能鉴定活性尚不了解的功能性酶或多肽。
此外，全基因组测序是从给定的微生物获得所有基因信息的已知方法，例如Fleischmann等，Whole genome sequences and assembly ofHaemophilus influenzae Rd；Nature 269496-512；(1995)所述。
大部分工业用途的酶是微生物分泌至培养基中的酶。然而，只有小部分微生物的基因组编码分泌蛋白。例如仅有约4％的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)基因组或其最近亲属编码分泌蛋白(Van Dijl等Protein transportpathways in Bacillus subtilisa genome-based road map；《“Bacillussubtilis and its closest relatives”-From genes to cells》；337-355页；A.L.Sonenshein编；ASM Press 2002)。
基因组测序的一个缺点是所获得序列的绝大多数编码非分泌蛋白。
还已知的是信号捕获——使用与缺乏自身信号的额外的细胞报道基因所形成的融合物来鉴定含有编码信号肽的核苷酸的基因的方法(WO01/77315)。
发明概述本发明者发现了在低pH(约4-5)和高温(50-60℃)下生长的脂环酸芽孢杆菌菌株，即脂环酸芽孢杆菌DSM 15716。因为已知菌株和DSM15716菌株之间的系统发生距离是显著的，并且其生长条件与工业酶若干应用的条件类似，因此该菌株很有意义。
微生物基因组包含数千个不同基因，一些编码多肽，一些编码RNA。微生物基因组中仅有限数量的基因编码服务于微生物的外部目的并由微生物分泌至周围培养基中的功能性多肽。从这类多肽能够以可观数量在连续过程中产生而不破坏产生该多肽的细胞来看，这类多肽对工业是有意义的。
鉴定和提供由以保藏号DSM 15716保藏的脂环酸杆菌分泌的对脂环酸杆菌具有功能性目的的多肽是本发明的目的，因为这类多肽不仅可用于工业目的，而且可以以工业相关的方法和数量产生它们。
一方面本发明提供分离的成熟功能性多肽，其与可得自以保藏号DSM15716保藏的脂环酸芽孢杆菌属细菌的相应分泌多肽有至少90％的同一性并表现相同的功能。
另一方面本发明提供细菌谷氨酸肽酶(EC 3.4.23.19)。
另一方面本发明提供编码本发明多肽的多核苷酸、包含编码多肽的多核苷酸的核苷酸构建体，其中与一个或多个在宿主细胞中指导多肽产生的控制序列有效连接、包含本发明核苷酸构建体的重组体表达载体和包含本发明核苷酸构建体的重组宿主细胞。
另一方面本发明提供制备本发明多肽的方法，包括(a)培养包含编码本发明多肽的核苷酸序列的菌株，所述菌株能够表达并分泌多肽，和(b)回收多肽。
另一方面本发明提供包含本发明多肽的组合物和制备这样的组合物的方法，包括将本发明的多肽与赋形剂混合。
另一方面本发明提供包含本发明多核苷酸的组合物和制备这样的组合物的方法，包括将本发明的多核苷酸与赋形剂混合。
另一方面本发明提供本发明多肽或包含所述多肽的组合物在多种应用中的用途。
另一方面本发明涉及以保藏号DSM 15716保藏的细菌脂环酸芽孢杆菌。
最后一方面本发明提供包括本发明多肽氨基酸序列和本发明多核苷酸核苷酸序列信息的电子储藏媒体。
序列列表本申请包含序列列表形式的信息，其附属于申请并在伴随该申请的数据载体中提交。数据载体的内容在本文全部引入作为参考。SEQ ID NO1到SEQ ID NO25中编码成熟多肽的区域编码SEQ ID NO26到SEQ IDNO50的成熟多肽。因此SEQ ID NO1的编码成熟多肽的区域编码SEQID NO26中包含的成熟多肽序列，SEQ ID NO2的编码成熟多肽的区域编码SEQ ID NO27中包含的成熟多肽，等等。
发明详述定义本文使用的术语“同一性”旨在理解为两个氨基酸序列或两个核苷酸序列间的同源性。就本发明而言，通过使用Vector NTI程序7.1版中的AlignX测定两个氨基酸序列间的同一性程度(Informax inc.，7600Wisconsin Avenue，Suite#1100，Bethesda，MD 20814，USA)。使用ClustalW算法(Nucleic Acid Research，22(22)4673-4680，1994)进行氨基酸比对。使用以下的附加参数缺口打开罚分为10，缺口延伸罚分为0.05，缺口分离罚分范围为8。配对比对参数为Ktuple＝1，缺口罚分＝3，缺口长度打开罚分＝10，缺口延伸罚分＝0.1，窗口大小＝5和对角线＝5。使用与上述相同的算法和软件包测定两个核苷酸序列间的同一性程度，例如使用下面的设定缺口罚分为10且缺口长度罚分为10。配对比对参数为Ktuple＝3，缺口罚分＝3和窗口＝20。
本发明上下文中使用的术语“功能性多肽”是指可由细胞表达并分泌的多肽，其组成能够按照其设计的由细胞来执行的功能运作的运作单元。任选的，多肽可能需要辅因子以实现预期的功能。功能性多肽的一个实例为催化活性多肽或在细胞周围环境中帮助细胞催化反应的酶。另一实例可以是作为信号物质的多肽。其他的实例为作为环境参数(细胞周围环境中的化学品)传感器(受体)的多肽，或是针对其他生物(抗微生物(多)肽)的多肽，或促进细胞结构完整性的多肽。
本文使用的术语氨基酸序列或多肽部分的“成熟区域”是指氨基酸序列或多肽的部分或区域或结构域或片段，其为成熟的功能性多肽。
本文使用的术语“编码成熟多肽的核苷酸序列区域”是指从编码成熟多肽第一个氨基酸的三联体算起到编码成熟多肽最后一个氨基酸的最后三联体的核苷酸序列区域。
本文使用的术语“分泌多肽”应理解为在细胞中表达后被转运并释放到周围细胞外培养基中的多肽或结合/嵌入细胞膜使得至少多肽的一部分暴露于周围细胞外培养基中的多肽。
本发明的多肽本发明涉及与可从以保藏号DSM 15716保藏的脂环酸芽孢杆菌获得的分泌多肽相类似的多肽。具体而言，本发明提供成熟的功能性多肽，所述多肽与从以保藏号DSM 15716保藏的脂环酸芽孢杆菌获得的相应分泌多肽具有至少90％的同一性，并表现相同的功能。
此外，令人惊奇的是脂环酸芽孢杆菌DSM 15716表达的SEQ ID NO27的谷氨酸肽酶是第一个从细菌中分离的谷氨酸肽酶。因此，本发明还提供细菌谷氨酸肽酶(EC 3.4.23.19)。
本发明的多肽特别是是由脂环酸芽孢杆菌DSM 15716为了对该特定细胞发挥功能的目的而分泌的多肽。
在脂环酸芽孢杆菌DSM 15716基因组的数千个可能的基因中，该基因组的多肽编码了包含在SEQ ID NO26到SEQ ID NO50中的25个分泌功能性成熟多肽，其被确定为功能性的，即由选定的宿主细胞翻译为功能性多肽。
因此，脂环酸芽孢杆菌DSM 15716表达并分泌SEQ ID NO26到SEQNO50中包含的功能性成熟多肽，并且在特定菌株的基因组中，SEQ IDNO1到SEQ ID NO25的编码成熟多肽的区域为编码SEQ ID NO26到SEQ NO50中包含的成熟多肽的基因。在另一个具体的实施方案中，可表达所有编码SEQ ID NO26到SEQ NO50中包含的成熟多肽的基因，并且可在培养大肠杆菌宿主时分泌其相应的成熟多肽，所述大肠杆菌用包含SEQ ID NO1到SEQ ID NO25的编码成熟多肽的区域的多核苷酸转化。通过比较这25个多肽序列与已知序列的序列同源性或同一性注释多肽的具体功能。25个分泌功能性多肽中至少15个确定为酶。
具体而言，分离的多肽选自
(a)具有与选自SEQ ID NO26到SEQ ID NO50中所包含成熟多肽的氨基酸序列有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽，和(b)在高严格度条件下与选自下述多核苷酸探针杂交的核苷酸序列编码的多肽，所述多核苷酸探针选自(i)SEQ ID NO1到SEQ ID NO25编码成熟多肽的区域的核苷酸序列互补链，(ii)SEQ ID NO1到SEQ ID NO25编码成熟多肽的区域的核苷酸序列中所包含的cDNA序列的互补链；其中多肽显示SEQ ID NO26到SEQ ID NO50中相应成熟多肽的功能。
在一个具体的实施方案中，本发明多肽选自以DSM保藏号15716保藏的脂环酸芽孢杆菌分泌并由本发明者分离的酶，即由酸性内切葡聚糖酶、酸性纤维素酶、谷氨酸肽酶、多铜氧化酶、丝氨酸羧基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、HtrA样丝氨酸蛋白酶、二硫化物异构酶、γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶、内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、肽酰脯氨酰异构酶、酸性磷酸酯酶、植酸酶、磷脂酶C、多糖脱乙酰酶、木聚糖脱乙酰酶和亚硫酸盐氧化酶组成的酶组。
本发明还提供选自以下的分离的酶(a)含有下述氨基酸序列的酶，所述氨基酸序列与以DSM保藏号15716保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株分泌的选自酸性内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶、谷氨酸肽酶、多铜氧化酶、丝氨酸羧基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或HtrA样丝氨酸蛋白酶、二硫化物异构酶、γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶、内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、肽酰脯氨酰异构酶、酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C、多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶和亚硫酸盐氧化酶的成熟酶氨基酸序列具有至少90％同一性，和(b)由在高严格度条件下与选自下述多核苷酸探针杂交的核苷酸序列所编码的酶，所述多核苷酸探针选自(i)以DSM保藏号15716保藏的脂环酸芽孢杆菌包含的核苷酸序列的互补链，所述核苷酸序列编码由该菌株分泌的选自酸性内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶、谷氨酸肽酶、多铜氧化酶、丝氨酸羧基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或HtrA样丝氨酸蛋白酶、二硫化物异构酶、γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶、内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、肽酰脯氨酰异构酶、酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C、多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶和亚硫酸盐氧化酶的成熟酶；(ii)以DSM保藏号15716保藏的脂环酸芽孢杆菌包含的核苷酸序列包含的cDNA序列的互补链，所述核苷酸序列编码由该菌株分泌的选自酸性内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶、谷氨酸肽酶、多铜氧化酶、丝氨酸羧基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或HtrA样丝氨酸蛋白酶、二硫化物异构酶、γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶、内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、肽酰脯氨酰异构酶、酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C、多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶和亚硫酸盐氧化酶的成熟酶，其中该酶具有选自酸性内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶、谷氨酸肽酶、多铜氧化酶、丝氨酸羧基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或HtrA样丝氨酸蛋白酶、二硫化物异构酶、γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶、内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、肽酰脯氨酰异构酶、酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C、多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶和亚硫酸盐氧化酶的功能。
在具体的实施方案中，该酶是选自以下的分离的酶(a)具有与选自SEQ ID NO26到SEQ ID NO40中所包含成熟酶的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的酶，和(b)在高严格度条件下与选自以下的多核苷酸探针杂交的核苷酸序列所编码的酶，所述多核苷酸探针选自(i)SEQ ID NO1到SEQ ID NO15编码成熟酶的区域的核苷酸序列互补链，(ii)SEQ ID NO1到SEQ ID NO15编码成熟酶的区域的核苷酸序列中所包含的cDNA序列的互补链；其中该酶具有SEQ ID NO26到SEQ ID NO40中包含的相应成熟多肽的功能。
本发明的多肽为分离的多肽，本发明的多肽制品优选包含以重量计最多90％的其天然结合的其他多肽材料(优选更低百分比的其他多肽材料，例如以重量计最多80％，以重量计最多60％，以重量计最多50％，以重量计最多40％，以重量计最多30％，以重量计最多20％，以重量计最多10％，以重量计最多9％，以重量计最多8％，以重量计最多6％，以重量计最多5％，以重量计最多4％，以重量计最多3％，以重量计最多2％，以重量计最多1％和以重量计最多1/2％)。因此，优选本发明分离的多肽至少92％纯度，即以重量计本发明多肽构成制品中存在的总多肽材料的至少92％，并优选更高的百分数，例如至少94％纯度，至少95％纯度，至少96％纯度，至少96％纯度，至少97％纯度，至少98％纯度，至少99％和最多99.5％纯度。具体而言，优选本发明多肽为“基本纯净的形式”，即多肽制品基本不含与之天然结合的其他多肽材料。这可通过例如用熟知的重组方法制备本发明多肽来实现。
本发明多肽可合成制造、天然产生或二者组合。在具体的实施方案中，本发明多肽可得自微生物例如原核细胞、古细菌细胞或真核细胞。还可通过遗传工程修饰细胞。
在具体的实施方案中，本发明多肽为在约10℃到约80℃范围内，特别是约20℃到60℃范围内的温度下显示最佳酶活性的酶。
在具体的实施方案中，本发明多肽为在高至100℃，特别是高至80℃，更特别高至60℃的温度下功能稳定的酶。
在具体的实施方案中，本发明多肽为表现选自SEQ ID NO26到SEQID NO50中所包含成熟酶的至少20％，特别是至少40％，例如至少50％，特别是至少60％，例如至少70％，更特别至少80％，例如至少90％，最特别至少95％，例如大约或至少100％酶活性的酶。
具体而言，分离的成熟功能性多肽与得自以保藏号DSM 15716保藏的脂环酸芽孢杆菌细菌的相应的分泌多肽具有至少90％同一性并显示相同的功能，且特别地，本发明的多肽包含、含有与选自SEQ ID NO26到SEQID NO50中所包含成熟多肽的多肽序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。同一性百分比具体为至少95％，例如至少96％，例如至少97％，更特别至少98％，例如至少99％或甚至100％同一性。
在另一具体的实施方案中，同一性百分比为至少50％，特别是至少60％，特别是至少65％，特别是至少70％，特别是至少75％，特别是至少80％，甚至更特别至少85％同一性。
在具体的实施方案中，本发明多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO26到SEQ ID NO50中所包含成熟多肽最多存在10个氨基酸(例如10个氨基酸)的差异，特别是最多5个氨基酸(例如5个氨基酸)，例如最多4个氨基酸(例如4个氨基酸)，例如最多3个氨基酸(例如3个氨基酸)，特别是最多2个氨基酸(例如2个氨基酸)，例如1个氨基酸的差异。
本发明多肽可以是分离自天然来源(如脂环酸芽孢杆菌DSM 15716菌株或另一野生型菌株)的野生型多肽，然而本发明还包括人工变体，其中例如通过在所述多肽上添加、替代和/或缺失一个或多个氨基酸突变本发明多肽，同时保留多肽功能和/或其他性质。因此，本发明多肽可以是人工变体，其中对含有SEQ ID NO26和SEQ ID NO50中所包含成熟多肽或由其组成的氨基酸序列进行至少一个氨基酸替换、缺失和/或插入。
本发明的多肽还包括本文所述氨基酸序列的功能性片段和编码本文所述氨基酸序列功能性片段的核酸，包括以DSM保藏号15716保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株分泌的成熟酶片段，如本文所述，包括在DSM保藏号15716下保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株分泌的选自酸性内切葡聚糖酶、酸性纤维素酶、谷氨酸肽酶、多铜氧化酶、丝氨酸羧基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、HtrA样丝氨酸蛋白酶、二硫化物异构酶、γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶、内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、肽酰脯氨酰异构酶、酸性磷酸酯酶、植酸酶、磷脂酶C、多糖脱乙酰酶、木聚糖脱乙酰酶和亚硫酸盐氧化酶的酶片段。
可通过本领域公知的标准技术构建人工变体，通常接着进行筛选和/或鉴定。标准技术包括经典诱变，例如Gerhardt等(1994)所述通过UV辐射细胞或用化学诱变剂处理细胞；WO 97/07205所述的体内基因改组；Stemmer，(1994)或WO 95/17413所述的体外改组，如Eisenstadt E.等(1994)所述的随机诱变；Poulsen等(1991)所述的PCR技术；J.E.Ness等，NatureBiotechnology，卷17，893-896页(1999)所述的家族改组；Sambrook等(1989)，Sambrook等，《Molecular Cloning，A Laboratory Manual》，ColdSpring Harbor，NY.所述的定向诱变。核苷酸替代概述可见于例如Ford等，1991，《Protein Expression and Purification 2》，95-107页。
这些标准遗传工程方法还可用于从编码本发明一个或多个亲本酶的基因制备变体核苷酸序列的变种文库、在适当的宿主细胞中表达酶变体和选择优选的变体。可使用本领域公知的一些技术(Reetz MT；Jaeger KE，《Biocatalysis-from Discovery to Application》，Fessner WD编，卷200，31-57页(1999)；Stemmer，Nature，卷370，389-391页，1994；Zhao和Arnold，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，卷94，7997-8000页，1997或Yano等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，卷95，5511-5515页，1998)建立变种文库。
在本发明具体的实施方案中，氨基酸变化(人工变体及野生型酶中)是次要的性质，即不显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守氨基酸替代；一般1到约30个的小量缺失；氨基或羧基端的小量延伸，例如一个氨基端甲硫氨酸残基；上至约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能促进纯化的小量延伸，例如多组氨酸束、抗原表位或结合结构域。
保守替代的实例在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)之内。通常不改变和/或损害蛋白质功能的氨基酸替代为本领域公知，并描述于例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，《The Proteins》，AcademicPress，New York。最常出现的交换为丙氨酸/丝氨酸、缬氨酸/异亮氨酸、天冬氨酸/谷氨酸、苏氨酸/丝氨酸、丙氨酸/甘氨酸、丙氨酸/苏氨酸、丝氨酸/天冬酰胺、丙氨酸/缬氨酸、丝氨酸/甘氨酸、酪氨酸/苯丙氨酸、丙氨酸/脯氨酸、赖氨酸/精氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺、亮氨酸/异亮氨酸、亮氨酸/缬氨酸、丙氨酸/谷氨酸和天冬氨酸/甘氨酸以及相反的交换。
在具体的实施方案中，氨基酸交换具有改变多肽理化性质的性质。例如优选进行改善酶热稳定性、改变底物特异性、改变最佳pH等的氨基酸变化。
具体而言，本发明多肽(特别是选自SEQ ID NO26到SEQ ID NO50中所包含的成熟多肽的多肽)中这类产生人工变体的替换、缺失和/或插入的数目为最多10，例如最多9，例如最多8，更优选最多7，例如最多6，例如最多5，最优选最多4，例如最多3，例如最多2，特别是最多1。
在具体的实施方案中，人工变体为与亲本酶相比在动物(包括人)中具有改变的(优选降低的)免疫原性，特别是变应原性的变体。本文中的术语“免疫原性”应理解为将人工变体施用(包括静脉、皮肤、皮下、口腔和气管内给药)于动物时能够引起改变的(特别是降低的)免疫应答。本文中的术语“免疫应答”是指施用人工变体引起动物体内免疫球蛋白例如IgE、IgG和IgM水平的改变或动物体内细胞因子水平的改变。定位蛋白质免疫原/抗原表位、制备具有改变免疫原性变体的方法和测定免疫应答的方法为本领域公知，并描述于例如WO 92/10755、WO 00/26230、WO00/26354和WO 01/31989。本文中的术语“变应原性”应理解为人工变体引起动物改变，特别是降低产生IgE的能力以及结合来自所述动物IgE的能力。特别是由对动物气管内施用多肽变体引起的变应原性是特别有意义的(亦称为呼吸变应原性)。
在另一实施方案中，本发明多肽为由至少在高严格度条件下，特别是非常高严格度条件下与选自以下的多核苷酸探针杂交的核苷酸序列编码的多肽(i)选自SEQ ID NO1到SEQ ID NO25编码成熟多肽的区域的核苷酸序列的互补链，(ii)选自SEQ ID NO1到SEQ ID NO25编码成熟多肽的区域的核苷酸序列中所包含cDNA序列的互补链；(iii)编码具有SEQ ID NO26到SEQ ID NO50中所包含相应成熟多肽的功能的分泌多肽的(i)或(ii)的片段(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，《MolecularCloning，A Laboratory Manual》，第二版，Cold Spring Harbor，NewYork)。
具体而言，本发明的多肽由包含选自SEQ ID NO1到SEQ ID NO25编码成熟多肽区域的核苷酸序列或由于遗传密码简并性而与之不同的序列的多核苷酸编码。更具体地，本发明多肽由选自SEQ ID NO1到SEQ IDNO25编码成熟多肽区域的核苷酸序列或由于遗传密码简并性而与之不同的序列组成的多核苷酸编码。
SEQ ID NO1到SEQ ID NO25编码成熟多肽区域的核苷酸序列或其亚序列，以及SEQ ID NO26到SEQ ID NO50所包含的成熟多肽或其片段的氨基酸序列可用于设计根据本领域熟知的方法从不同种属菌株中鉴定并克隆编码本发明酶的DNA的多核苷酸探针。具体而言，这类探针可用于与目的属或种的基因组或cDNA杂交，随后进行标准Southern印迹以鉴定并分离其中相应的基因。这类探针可远短于整个序列，但是长度应至少为15个，优选至少25个，更优选至少35个核苷酸，例如长度至少为70个核苷酸。然而，多核苷酸探针长度优选为至少100个核苷酸。例如，多核苷酸探针长度可至少为200个核苷酸，长度至少为300个核苷酸，长度至少为400个核苷酸或长度至少为500个核苷酸。可使用更长的探针例如长度至少600个核苷酸，长度至少700个核苷酸，长度至少800个核苷酸或长度至少900个核苷酸长度的多核苷酸探针。DNA和RNA探针都可以使用。通常标记(例如用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白)探针以检测相应的基因。
因此，可从这些其他生物制备的基因组DNA或cDNA文库筛选与上述探针杂交并编码本发明酶的DNA。可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术分离来自这些其他生物的基因组或其他DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移并固定在硝酸纤维素或其他合适的载体材料上。为了鉴定克隆或DNA(所述DNA与选自SEQ ID NO1到SEQ IDNO25编码成熟多肽区域的核苷酸具有必须的同源性和/或同一性或与之同源和/或同一)，在Southern印迹中使用带有固定的DNA的载体材料。
就本发明而言，杂交表明核苷酸序列在高到非常高严格度杂交条件下与标记的多核苷酸探针杂交，所述探针又与选自SEQ ID NO1到SEQ IDNO25编码成熟多肽的核苷酸序列杂交。可使用X射线胶片或本领域公知的其他方法检测在这些条件下与多核苷酸探针杂交的分子。本文使用术语“多核苷酸探针”时都应理解为这类探针包含至少15个核苷酸。
在一个值得注意的实施方案中，多核苷酸探针为选自SEQ ID NO1到SEQ ID NO25编码成熟多肽区域的核苷酸序列的互补链。
在另一个值得注意的实施方案中，多核苷酸探针为编码选自SEQ IDNO26到SEQ ID NO50酶的核苷酸序列的互补链。在另一值得注意的实施方案中，多核苷酸探针为选自SEQ ID NO1到SEQ ID NO25编码成熟多肽区域的核苷酸序列成熟多肽编码区的互补链。
对于长度至少为100个核苷酸的长探针，高到非常高严格度条件定义为42℃下根据标准Southern印迹操作在5×SSPE，1.0％ SDS，5×Denhardt杂交溶液，100μg/ml剪切并变性的鲑精DNA中预杂交和杂交。优选地，至少100个核苷酸的长探针不含有多于1000个核苷酸。对至少100个核苷酸长度的长探针，载体材料最终用0.1×SSC，0.1％SDS在60℃(高严格度)洗涤三次，每次15分钟，特别是用0.1×SSC，0.1％SDS在68℃(非常高严格度)下洗涤三次，每次15分钟。
尽管并非特别优选，还可考虑使用较短的探针例如从约15个到99个核苷酸长度(如从约15到约70个核苷酸长度)的探针。对于这类短探针，严格条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy(1962，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 481390)算法计算的Tm低5℃到10℃下，在0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl pH 7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1×Denhardt杂交溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP和0.2mg/ml酵母RNA中按照标准Southern印迹操作预杂交、杂交和杂交后洗涤。
对于约15个核苷酸到99个核苷酸长度的短探针，载体材料在6×SCC加0.1％SDS中洗涤一次(15分钟)并使用6×SSC在比计算的Tm低5℃到10℃下洗涤两次，每次15分钟。
SEQ ID NO26酸性内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶在一具体的实施方案中，本发明多肽为酸性内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶，所述内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶包含与得自脂环酸芽孢杆菌特别是以DSM保藏号15716保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株的酸性内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶，更特别是SEQ ID NO26包含的成熟酸性内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟酸性内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶包含SEQ ID NO26位置25到959的序列或由其组成。本文中酸性内切葡聚糖酶定义为内水解(特别是在酸性条件下)纤维素、地衣淀粉、或谷物β-D-葡聚糖中1，4-β-D-糖苷键的酶。本文中酸性纤维素酶定义为内水解(特别是在酸性条件下)纤维素中1，4-β-D-糖苷键的酶。
SEQ ID NO27谷氨酸肽酶在一具体的实施方案中，本发明多肽为谷氨酸肽酶，所述谷氨酸肽酶包含与得自脂环酸芽孢杆菌特别是以DSM保藏号15716保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株的谷氨酸肽酶，更特别是SEQ ID NO27包含的成熟谷氨酸肽酶有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟谷氨酸肽酶包含SEQ ID NO27位置33到272的序列或由其组成。本文中谷氨酸肽酶定义为水解蛋白质或肽并包含保守活性位点残基Q和E的酶。
谷氨酸肽酶(PepG)(EC 3.4.23.19)先前归类为天冬氨酰蛋白酶(A4)但被MEROPS(http://merops.sanger.ac.uk/)重新归类，其公开了“作为Fujinaga，Cherney，Oyama，Oda & James(2004)出色文章The molecularstructure and catalytic mechanism of a novel carboxyl peptidase fromScytalidium lignicolum.PubMed的结果，我们目前认识到了第六种肽酶催化类型谷氨酸肽酶。已知的谷氨酸肽酶均属于以前的A4家族，现在称为G1家族。”(Fujinaga M，Cherney MM，Oyama H，Oda K，James MN.；The molecular structure and catalytic mechanism of a novel carboxylpeptidase from Scy-talidium lignicolum；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.；101(10)；3364-9页；Epub 01-Mar-2004；09-Mar-2004.)SEQ ID NO27多肽为谷氨酸肽酶还来自以下证实活性位点残基Q和E在SEQ ID NO27中为保守的多序列比对。
CLUSTAL W(1.81)multiple sequence alignmentSWISSPROT_P24665MKFSTILTGSLFATAALAAPLTEKRRA--RKEARAAGKRHS---NPPYIPGSDKEILK-LTREMBL_Q9P8R1 MKFSIVAATALLAGSAVAAPGTALRQA--RAVKRAARTHGN---PVKYVEGPTN------TREMBL_Q00551 MKYATVVAALLGANAALGARFTEKRRE--RNEARLARRSGSVRLPATNSEGVAIDAAESRSWISSPROT_P15369------------------------------------------------------------TREMBL_Q00550 MKYTAALAALVTLAAAAPTDGIIDIGDGVKLVPREPRAHTRLERLRTFRRGLMEGLESGETREMBL_Q8X1C5 ------------------------------------------------------------SEQ ID NO.27MNGTSVWKASGIAAASCLTAAALLAWP--HATSTLDASPAIFHAPRHALSPNTSPKPNSV
¤¤¤¤¤¤¤¤¤¤¤¤¤SWISSPROT_P24665NGTTNEEYSSNWAGAVLI----GDGYTKVTGEFTVPSVSAGSSGSSGYGGGYGYWKNKRQTREMBL_Q9P8R1 --KTDVSYSSNWAGAVLV----GTGYTSVTGTFTAPSPSTAGSGS---------------TREMBL_Q00551 NDTTNVEYSSNWAGAVLI----GSGYKSVTGIFVVPTPKSPGSGN---------------SWISSPROT_P15369------TVESNWGGAILI----SGDFDTVSATANVPSATGASGGSS--------------TREMBL_Q00550 RNSSDVSYDSNWAGAVKI----GTGLNDVTGTIVVPTPSVPSGGSST-------------TREMBL_Q8X1C5 ----------NWAGAVLTSPPSGSTFTSVSAQFTVPSPSLPQGSQQ--------------SEQ ID NO.27QAQNFGWSASNWSGYAVT----GSTYNDITGSWIVPAVSPSKRSTYS-------------**.** ::. .*: ..
SWISSPROT_P24665TREMBL_Q9P8R1 TREMBL_Q00551 SWISSPROT_P15369TREMBL_Q00550 TREMBL_QBX1C5 SEQ ID NO.27:*:**** . ::* * * ::*** :**::. ::.* SWISSPROT_P24665TREMBL_Q9P8R1 TREMBL_Q00551 SWISSPROT_P15369TREMBL_Q00550 TREMBL_Q8X1C5 SEQ ID NO.27* : .: .: : * . .. : : : .*** *SWISSPROT_P24665---LVAFADFG-SVTFTNAEATSGGSTVGPSDATVMDIEQDGSVLTETSVSG-DSVTVTYTREMBL_Q9PBR1 ---LVQFANFG-TVTFTGASATQNGESVGVTGAQIIDLQQN-SVLTSVSTSS-NSVTVKYTREMBL_Q00551 ---LVPFANFG-TVTFTGAEATTSSGTVTAADATLIDIEQNGEVLTSVTVSG-STVTVKYSWISSPROT_P15369SDEFVPFASFSPAVEFTDCSVTSDGESVSLDDAQITQVIINNQDVTDCSVSG-TTVSCSYTREMBL_Q00550 --- ---LVNFADFD-TVTFKDCSPSVSG-------STIVDIRQSLEVLTECSTTGTTTVTCEYTREMBL_Q8X1C5 ------------------------------------------------------------SEQ ID NO.27---IATLANYG-ETTFDPGTVNGGNPGFTLSDAGYMVQNNAVVSVPSAPDSDTDGFNVAYSWISSPROT_P24665V---------TREMBL_Q9P8R1 V---------TREMBL_Q00551 V---------SWISSPROT_P15369V---------TREMBL_Q00550 VG--------TREMBL_Q8X1C5 ----------SEQ ID NO.27GSNQPSPPAS
SWISSPROTP24665黑曲霉(Aspergillus niger)ASPERGILLOPEPSIN II；SEQ ID NO55TREMBL_Q9P8R1核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)内肽酶EapC；SEQ ID NO56TREMBLQ00551(Cryphonectria parasitica)内肽酶EapC；SEQ ID NO57SWISSPROTP15369(Scytalidium lignicolum)scytalidoglutamic肽酶；SEQ ID NO58TREMBL-Q00550(Cryphonectria parasitica)内肽酶EapB；SEQ ID NO59TREMBL_Q8X1C5(Talaromyces emersonii)胃蛋白酶抑制品不敏感酸性蛋白酶(片段)；SEQ ID NO60SEQ ID NO27本发明序列o＝形成Swissprot P24665活性位点的氨基酸/＝形成Swissprot P24665二硫键的半胱氨酸残基¤＝从Swissprot P24665酶原去除的前肽因此，本发明者鉴定并分离了已知的第一个来自细菌的(G1)谷氨酸肽酶，特别是在低pH和高温下有活性的谷氨酸肽酶。最近亲缘为真菌G1蛋白酶(例如Aspergillopepsin II)。
另外，令人惊奇的是该谷氨酸肽酶由于分子中缺乏二硫键而与大多数已知的真菌谷氨酸肽酶不同。与例如公开了由两个通过二硫键交联的肽组成的已知真菌谷氨酸肽酶的SEQ ID NO55相比，SEQ ID NO27包含的谷氨酸肽酶仅含有一个半胱氨酸，因此蛋白酶结构中不含二硫键。因此，脂环酸芽孢杆菌特别是以DSM保藏号15716保藏的脂环酸芽孢杆菌谷氨酸肽酶缺少第二前肽，因此其产生少需要一个成熟步骤。这对细胞制备是有益的。
SEQ ID NO28或SEQ ID NO35多铜氧化酶在一具体的实施方案中，本发明多肽为多铜氧化酶，所述多铜氧化酶包含与得自脂环酸芽孢杆菌特别是以DSM保藏号15716保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株的多铜氧化酶，更特别是SEQ ID NO28或35包含的成熟多铜氧化酶有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟多铜氧化酶包含SEQ ID NO28位置26到315或SEQ ID NO35位置50到597的序列或由之组成。本文中多铜氧化酶定义为至少具有三个光谱差异铜中心的蛋白质。多铜氧化酶可以是氧化多种不同类型酚和二胺的漆酶、抗坏血酸氧化酶、氧化多种无机和有机物质的血浆铜蓝蛋白或失去结合铜能力从而通过细菌周质中重金属螯合介导重金属抗性的蛋白质部分。
SEQ ID NO29或SEQ ID NO30丝氨酸羧基蛋白酶在一具体的实施方案中，本发明酶为丝氨酸羧基蛋白酶，所述丝氨酸羧基蛋白酶包含与得自脂环酸芽孢杆菌，特别是以DSM保藏号15716保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株的丝氨酸羧基蛋白酶，更特别是SEQ ID NO29或30包含的成熟丝氨酸羧基蛋白酶有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟丝氨酸羧基蛋白酶包含SEQ ID NO29位置190到626或SEQ ID NO30位置25到533的序列或由其组成。本文中丝氨酸羧基蛋白酶定义为属于EC 3.4.21.100(pseudomonapepsin)类酶的蛋白酶，所述水解酶折叠类似枯草菌素的折叠，具有独特的丝氨酸-谷氨酸-天冬氨酸催化三联体以及氧阴离子洞中存在天冬氨酸残基。如果催化位点氨基酸存在于序列中且其显示与MEROPS丝氨酸蛋白酶家族53肽序列相似的肽序列，则该多肽序列可归类于丝氨酸羧基肽酶。
SEQ ID NO31丝氨酸蛋白酶或HtrA样丝氨酸蛋白酶在一具体的实施方案中，本发明多肽为丝氨酸蛋白酶或HtrA样丝氨酸蛋白酶，所述丝氨酸蛋白酶或HtrA样丝氨酸蛋白酶包含与得自脂环酸芽孢杆菌，特别是以DSM保藏号15716保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株的丝氨酸蛋白酶或HtrA样丝氨酸蛋白酶，更特别是SEQ ID NO31包含的成熟丝氨酸蛋白酶羧基蛋白酶有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟丝氨酸蛋白酶包含SEQID NO31位置42到411的序列或由其组成。本文中丝氨基蛋白酶定义为水解蛋白质或肽且催化位点包含丝氨酸残基的酶。HtrA样蛋白酶定义为在提高的温度下降解细菌细胞细胞外区室中受损蛋白质的酶。
SEQ ID NO32二硫化物异构酶在一具体的实施方案中，本发明多肽为二硫化物异构酶，所述二硫化物异构酶包含与得自脂环酸芽孢杆菌，特别是在DSM保藏号15716下保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株的二硫化物异构酶，更特别是SEQ ID NO32包含的成熟二硫化物异构酶有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟二硫化物异构酶包含SEQ IDNO32位置31到212的序列或由其组成。本文中二硫化物异构酶定义为催化蛋白质链内和链间二硫键重排以形成天然结构的酶。
SEQ ID NO33γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶在一具体的实施方案中，本发明多肽为γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶，所述γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶包含与得自脂环酸芽孢杆菌，特别是在DSM保藏号15716下保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株的γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶，更特别是SEQ ID NO33包含的成熟γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶包含SEQ ID NO33位置30到266序列或由其组成。本文中γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶定义为水解L-丙氨酸-γ-D-谷氨酰-l-(L)内消旋二胺基庚二酸-(L)-D-丙氨酸中与(L)内消旋二胺基庚二酸结合的γ-D-谷氨酰的酶。需要(L)内消旋二胺基庚二酸基团的ω氨基和ω羧基是未替代的。
SEQ ID NO34内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶在具体的实施方案中，本发明多肽为内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶，所述内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶包含与得自脂环酸芽孢杆菌，特别是在DSM保藏号15716下保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株的内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶，更特别是SEQ ID NO34包含的成熟内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶包含SEQ ID NO34位置27到768的序列或由其组成。本文中内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶定义为水解原核细胞壁肽聚糖杂聚物中N-乙酰-D-葡糖胺和N-乙酰胞壁酸间1，4-β-键的酶。
SEQ ID NO36肽基脯氨酰异构酶在一具体的实施方案中，本发明多肽为肽基脯氨酰异构酶，所述肽基脯氨酰异构酶包含与得自脂环酸芽孢杆菌，特别是在DSM保藏号15716下保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株的肽基脯氨酰异构酶，更特别是SEQ ID NO36包含的成熟肽基脯氨酰异构酶有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟肽基脯氨酰异构酶包含SEQ ID NO36位置30到246的序列或由其组成。本文中肽基脯氨酰异构酶定义为通过催化寡肽中脯氨酸亚胺肽键顺反异构化加速蛋白质折叠的酶。
SEQ ID NO37酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C在一具体的实施方案中，本发明多肽为酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C，所述酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C包含与得自脂环酸芽孢杆菌，特别是在DSM保藏号15716下保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株的酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C，更特别是SEQ ID NO37包含的成熟酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C包含SEQ ID NO37位置28到608序列或由其组成。酸性磷酸酯酶定义为将正磷酸单酯水解为醇和磷酸的酶。本文中植酸酶定义为从肌醇六磷酸上除去磷酸基团的酶。磷脂酶C定义为将磷酸卵磷脂水解为1，2-二酰基甘油和胆碱的酶。
SEQ ID NO38或SEQ ID NO39多糖脱乙酰酶在一具体的实施方案中，本发明多肽为多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶，所述多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶包含与得自脂环酸芽孢杆菌，特别是在DSM保藏号15716下保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株的多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶，更特别是SEQ ID NO33或39包含的成熟多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶包含SEQ ID NO38位置26到251或SEQ ID NO39位置22到324的序列或由其组成。本文中多糖脱乙酰酶定义为通过水解从特异的乙酰化多糖上去除乙酰残基的酶。木聚糖脱乙酰酶定义为从乙酰化木聚糖上去除乙酰基团的酶。
SEQ ID NO40亚硫酸盐氧化酶在一具体的实施方案中，本发明多肽为亚硫酸盐氧化酶，所述亚硫酸盐氧化酶包含与得自脂环酸芽孢杆菌，特别是在DSM保藏号15716下保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株的亚硫酸盐氧化酶，更特别是SEQ ID NO40包含的成熟亚硫酸盐氧化酶有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟亚硫酸盐氧化酶包含SEQ IDNO40位置30到214的序列或由其组成。亚硫酸盐氧化酶定义为将亚硫酸氧化为硫酸的酶。
SEQ ID NO41功能性多肽在一具体的实施方案中，本发明多肽为功能性多肽，所述功能性多肽包含与SEQ ID NO41，特别是SEQ ID NO41包含的成熟功能性多肽有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟功能性多肽包含SEQ ID NO41位置22到257的序列或由其组成。
SEQ ID NO42功能性多肽在一具体的实施方案中，本发明多肽为功能性多肽，所述功能性多肽包含与SEQ ID NO42，特别是SEQ ID NO42包含的成熟功能性多肽有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟功能性多肽包含SEQ ID NO42位置25到1130的序列或由其组成。
SEQ ID NO43功能性多肽在一具体的实施方案中，本发明多肽功能性多肽，所述功能性多肽为包含与SEQ ID NO43，特别是SEQ ID NO43包含的成熟功能性多肽有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟功能性多肽包含SEQ ID NO43位置42到248的序列或由其组成。
SEQ ID NO44功能性多肽在一具体的实施方案中，本发明多肽为功能性多肽，所述功能性多肽包含与SEQ ID NO44，特别是SEQ ID NO44包含的成熟功能性多肽有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟功能性多肽包含SEQ ID NO44位置26到172的序列或由其组成。
SEQ ID NO45功能性多肽在一具体的实施方案中，本发明多肽为功能性多肽，所述功能性多肽包含与SEQ ID NO45，特别是SEQ ID NO45包含的成熟功能性多肽有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟功能性多肽包含SEQ ID NO45位置31到242的序列或由其组成。
SEQ ID NO46功能性多肽在一具体的实施方案中，本发明多肽为功能性多肽，所述功能性多肽包含与SEQ ID NO46，特别是SEQ ID NO64包含的成熟功能性多肽有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟功能性多肽包含SEQ ID NO46位置25到280的序列或由其组成。
SEQ ID NO47功能性多肽在一具体的实施方案中，本发明多肽为功能性多肽，所述功能性多肽包含与SEQ ID NO47，特别是SEQ ID NO47包含的成熟功能性多肽有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟功能性多肽包含SEQ ID NO47位置26到478的序列或由其组成。
SEQ ID NO48功能性多肽在一具体的实施方案中，本发明多肽为功能性多肽，所述功能性多肽包含与SEQ ID NO48，特别是SEQ ID NO48包含的成熟功能性多肽有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟功能性多肽包含SEQ ID NO48位置20到340的序列或由其组成。
SEQ ID NO49功能性多肽在一具体的实施方案中，本发明多肽为功能性多肽，所述功能性多肽包含与SEQ ID NO49，特别是SEQ ID NO49包含的成熟功能性多肽有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟功能性多肽包含SEQ ID NO49位置30到341的序列或由其组成。
SEQ ID NO50功能性多肽在一具体的实施方案中，本发明多肽为功能性多肽，所述功能性多肽包含与SEQ ID NO50，特别是SEQ ID NO50包含的成熟功能性多肽有至少90％，特别是至少95％，更特别至少96％，更特别至少97％，更特别至少98％，更特别至少99％或最特别100％同一性的氨基酸序列或由其组成。更具体地，成熟功能性多肽包含SEQ ID NO50位置29到400的序列或由其组成。
多核苷酸本发明还涉及多核苷酸，特别是包含编码本发明多肽的核苷酸序列或由其组成的分离多核苷酸。在一具体的实施方案中，核苷酸序列在SEQ IDNO1到SEQ ID NO25中公开，包括由于遗传密码简并性而与之存在差异的核苷酸序列。在另一实施方案中，本发明多核苷酸为包含选自SEQ IDNO1到SEQ ID NO25编码成熟多肽区域的核苷酸序列或由其组成的修饰核苷酸序列，所述修饰核苷酸序列与SEQ ID NO1到SEQ ID NO25包含的亲本核苷酸序列相比包含至少一个修饰/突变。
用于分离和/或克隆编码酶的核苷酸序列的技术为本领域公知，包括从基因组DNA中分离、由cDNA制备或它们的组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或抗体筛选表达文库检测有共享结构特征的克隆DNA片段来从这些基因组DNA中克隆本发明的核苷酸序列。参阅如Innis等，1990，《PCRA Guide to Methods and Application》，AcademicPress，New York。可使用其他扩增操作例如连接酶链反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。
可通过基因工程中使用的将核苷酸序列从其天然位置重新定位于其再产生的不同位点的标准克隆方法获得核苷酸序列。克隆方法可包括切除并分离包含编码多肽的核苷酸序列的所需片段、将片段插入载体分子和将重组体载体整合进核苷酸序列的多拷贝或克隆在其中复制的宿主细胞。核苷酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成的、合成来源的或其任意组合。
具体的多核苷酸包含与选自SEQ ID NO1到SEQ ID NO25编码成熟多肽区域的核苷酸序列有至少50％同一性的核苷酸序列，优选由其组成。具体而言，核苷酸序列与选自SEQ ID NO1到SEQ ID NO25编码成熟多肽区域的核苷酸序列有至少65％同一性，更特别至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性。特别的，核苷酸序列包含选自SEQ ID NO1到SEQ ID NO25编码成熟多肽区域的核苷酸序列。在更特别的实施方案中，核苷酸序列由选自SEQ ID NO1到SEQID NO25编码成熟多肽区域的核苷酸序列组成。
具体而言，多核苷酸包括编码选自以下的成熟酶的核苷酸序列酸性内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶、谷氨酸肽酶、多铜氧化酶、丝氨酸羧基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或HtrA样丝氨酸蛋白酶、二硫化物异构酶、γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶、内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、肽酰脯氨酰异构酶、酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C、多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶和亚硫酸盐氧化酶，或与编码选自以DSM保藏号15716保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株所分泌的酸性内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶、谷氨酸肽酶、多铜氧化酶、丝氨酸羧基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或HtrA样丝氨酸蛋白酶、二硫化物异构酶、γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶、内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、肽酰脯氨酰异构酶、酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C、多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶和亚硫酸盐氧化酶的成熟酶的核苷酸序列有至少50％同一性，特别的至少65％同一性，更特别至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列，优选由其组成。
SEQ ID NO1在一具体的实施方案中，本发明的多核苷酸编码酸性内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶，并包含与SEQ ID NO1位置73到2877的核苷酸序列有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
SEQ ID NO2在一具体的实施方案中，本发明的多核苷酸编码谷氨酸肽酶，并包含与SEQ ID NO2位置97到816的核苷酸序列有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
SEQ ID NO3和10在一具体的实施方案中，本发明的多核苷酸编码多铜氧化酶，并包含与SEQ ID NO1位置76到945或SEQ ID NO10位置148到1791的核苷酸序列有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
SEQ ID NO4和5在一具体的实施方案中，本发明的多核苷酸编码丝氨酸羧基蛋白酶，并包含与SEQ ID NO4位置568到1878或SEQ ID NO5位置73到1599的核苷酸序列有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
SEQ ID NO6在一具体的实施方案中，本发明的多核苷酸编码丝氨酸蛋白酶或HtrA样丝氨酸蛋白酶，并包含与SEQ ID NO6位置124到1233的核苷酸序列有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
SEQ ID NO7在一具体的实施方案中，本发明的多核苷酸编码二硫化物异构酶，并包含与SEQ ID NO7位置91到633的核苷酸序列有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
SEQ ID NO8在一具体的实施方案中，本发明的多核苷酸编码γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶，并包含与SEQ ID NO8位置88到798的核苷酸序列有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
SEQ ID NO9在一具体的实施方案中，本发明的多核苷酸编码内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶，并包含与SEQ ID NO9位置79到2304的核苷酸序列有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
SEQ ID NO11在一具体的实施方案中，本发明的多核苷酸编码肽酰脯氨酰异构酶，并包含与SEQ ID NO9位置88到735的核苷酸序列有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
SEQ ID NO12在一具体的实施方案中，本发明的多核苷酸编码酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C，并包含与SEQ ID NO12位置82到1824的核苷酸序列有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
SEQ ID NO13和14在一具体的实施方案中，本发明的多核苷酸编码多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶，并包含与SEQ ID NO13位置76到750或SEQ ID NO14位置64到972的核苷酸序列有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
SEQ ID NO15在一具体的实施方案中，本发明的多核苷酸编码亚硫酸盐氧化酶，并包含与SEQ ID NO15位置88到642的核苷酸序列有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
SEQ ID NO16在一具体实施方案中，本发明的多核苷酸编码成熟功能性多肽，并包含与SEQ ID NO16位置64到771的核苷酸序列具有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
SEQ ID NO17在一具体实施方案中，本发明的多核苷酸编码成熟功能性多肽，并包含与SEQ ID NO17位置73到3390的核苷酸序列具有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
SEQ ID NO18在一具体实施方案中，本发明的多核苷酸编码成熟功能性多肽，并包含与SEQ ID NO18位置124到744的核苷酸序列具有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
SEQ ID NO19在一具体实施方案中，本发明的多核苷酸编码成熟功能性多肽，并包含与SEQ ID NO19位置76到516的核苷酸序列具有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
SEQ ID NO20在一具体实施方案中，本发明的多核苷酸编码成熟功能性多肽，并包含与SEQ ID NO20位置91到726的核苷酸序列具有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
SEQ ID NO21在一具体实施方案中，本发明的多核苷酸编码成熟功能性多肽，并包含与SEQ ID NO21位置73到540的核苷酸序列具有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
SEQ ID NO22在一具体实施方案中，本发明的多核苷酸编码成熟功能性多肽，并包含与SEQ ID NO22位置76到1431的核苷酸序列具有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
SEQ ID NO23在一具体实施方案中，本发明的多核苷酸编码成熟功能性多肽，并包含与SEQ ID NO23位置58到1020的核苷酸序列具有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
SEQ ID NO24在一具体实施方案中，本发明的多核苷酸编码成熟功能性多肽，并包含与SEQ ID NO24位置88到1023的核苷酸序列具有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
SEQ ID NO25在一具体实施方案中，本发明的多核苷酸编码成熟功能性多肽，并包含与SEQ ID NO25位置85到1197的核苷酸序列具有至少70％同一性，更特别至少80％同一性，更特别至少90％同一性，更特别至少95％同一性，更特别至少96％同一性，更特别至少97％同一性，更特别至少98％同一性，更特别至少99％同一性或最特别100％同一性的核苷酸序列或由其组成。
修饰编码本发明多肽的核苷酸序列对于合成多肽可能是必需的，所述多肽包含与选自SEQ ID NO26到SEQ ID NO50包含的成熟多肽的氨基酸序列相比至少有一个替代、缺失和/或插入的氨基酸序列。
对本领域技术人员显而易见的是，为保持酶的功能可制造这样的修饰，即修饰在对酶功能至关重要的区域外进行。因此对功能必需的氨基酸残基优选不受修饰(如替换)。可根据本领域已知的方法例如位点定向诱变或丙氨酸分区诱变(见例如Cunningham和Wells，1989，Science 2441081-1085)鉴定功能必需的氨基酸残基。可通过对以核磁共振分析、晶体学或光亲和标记之类的技术(见例如de Vos等，1992，Science 255306-312；Smith等，1992，Journal of Molecular Biology 224899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters 30959-64)确定的三维结构进行分析来确定底物-酶相互作用位点。
此外，可通过引入核苷酸替代来修饰编码本发明酶的核苷酸序列，所述替代不产生由该核苷酸序列编码的酶的另一氨基酸序列，但是符合将用于产生该酶的宿主生物相应的密码子选择。
可使用任何本领域已知的方法通过位点定向诱变完成向核苷酸序列中引入将一个核苷酸与另一核苷酸交换的突变。特别有用的是利用带有目的插入片段的超螺旋、双链DNA载体和含有目的突变的两个合成引物的操作。分别与载体相反链互补的寡核苷酸引物通过Pfu DNA聚合酶在温度循环中延伸。引物整合产生含有交错切口的突变质粒。温度循环后用对甲基化和半甲基化DNA特异的Dpn I处理产物以消化亲代DNA模板并选择含有突变的合成DNA。也可使用其他本领域已知的方法。关于核苷酸替代的一般描述可查看例如Ford等，1991，《Protein Expression and Purification》295-107。
本发明还涉及含有编码本发明多肽的核苷酸序列并与选自(i)SEQ ID NO1到SEQ ID NO25编码成熟多肽的区域的核苷酸序列互补链，(ii)包含在选自SEQ ID NO1到SEQ ID NO25编码成熟多肽的区域的核苷酸序列中的cDNA序列的互补链；(iii)编码具有SEQ ID NO26到SEQ ID NO50中包含的成熟多肽相应功能的分泌成熟多肽的(i)或(ii)的片段的多核苷酸探针在高严格度条件下，特别是非常高严格度条件(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，《Molecular Cloning，ALaboratory Manual》，第二版，Cold Spring Harbor，New York)下杂交的核苷酸序列(优选由其组成)的多核苷酸。
应该理解关于核苷酸序列杂交的内容和细节将与本文题为“本发明多肽”的小节中讨论的杂交方面相同或类似。
本发明还包括适用于电子设备，优选数码设备的储存媒体，所述装置含有本发明多肽氨基酸序列或本发明多核苷酸核苷酸序列的信息，具体的为本发明任何多肽或多核苷酸序列为电子或数字形式，例如二进制代码或其他数字代码。合适的储存介质可以是用于电子设备和计算设备的磁盘或光盘，且信息可具体地以数字形式储存在储存媒体中。
核苷酸构建体本发明还涉及含有与一个或多个控制序列有效连接的本发明核苷酸序列的核酸构建体，所述控制序列在与控制序列兼容的条件下指导编码序列在适当的宿主细胞内表达。
可以以多种方式操作编码本发明多肽的核苷酸序列，以便提供多肽的表达。插入载体前的核苷酸序列的操作可能是需要的或者是必要的，这取决于表达载体。利用重组DNA方法来修饰核苷酸序列的技术是本领域众所周知的。
控制序列可以是适当的启动子序列——被宿主细胞识别用于表达核苷酸序列的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在所选择的宿主细胞内表现出转录活性的任何核苷酸序列，包括突变、截短和杂合启动子，并且可以从编码细胞外或者细胞内的与宿主细胞同源或者异源的的多肽的基因得到。
用于指导本发明核酸构建体转录(特别是在细菌宿主细胞中)的适当的启动子实例为从大肠杆菌乳糖操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)麦芽糖(maltogenic)淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 753727-3731)得到的启动子以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 8021-25)。其他的启动子描述于Scientific American，1980，24274-94中″Useful proteins from recombinant bacteria″和Sambrook等，1989，上文。
用于指导本发明核酸构建体在丝状真菌宿主细胞内转录的适当启动子有从米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉或者泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶和尖镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)基因得到的启动子，以及NA2-tpi启动子(从黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶得到的杂合启动子)和它们的突变、截短和杂合启动子。
在酵母宿主中有用的启动子得自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)基因、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)基因、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)基因和酿酒酵母3-磷酸甘油酸酯激酶基因。其他可用于酵母宿主细胞的启动子由Romanos等，1992，Yeast 8423-488描述。
控制序列还可以是适当的转录终止序列——被宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码酶的核苷酸序列3’末端有效连接。在所选择的宿主细胞内具有功能的任何终止子均可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选的终止子得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉临氨基苯甲酸核合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶基因。
用于酵母宿主细胞的优选的终止子得自酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因。其他可用于酵母宿主细胞的终止子由Romanos等，1992，上文，描述。
控制序列还可以是适宜的前导序列——对宿主细胞进行翻译而言重要的mRNA非翻译区。前导序列与编码多肽的核苷酸序列的5′末端有效连接。在所选择的宿主细胞内具有功能的任何前导序列均可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选的前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶基因得到的前导序列。
适用于酵母宿主细胞的前导序列可得自酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸酯激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)基因。
控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，即与核苷酸序列的3′末端有效连接并且转录后作为向转录的mRNA添加聚腺苷酸残基的信号而被宿主细胞识别的序列。在所选择的宿主细胞内具有功能的任何聚腺苷酸化序列均可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选的聚核苷酸化序列得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶基因。
可用于酵母宿主细胞的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 155983-5990描述。
控制序列还可以是信号肽编码区，其编码的氨基酸序列与多肽的氨基末端连接并且指导编码的酶进入细胞的分泌途径。在核苷酸序列编码序列的5′末端可以天然的含有信号肽编码区，该信号肽编码区于翻译阅读框内与编码所分泌多肽的编码区片段天然连接。另外，编码序列的5′末端可以含有对于编码序列而言为外来的信号肽编码区。在编码区天然不含有信号肽编码区时，可能需要外来的信号肽编码区。另外，外来的信号肽编码区可简单地替换天然的信号肽编码区以增强酶的分泌。然而，能够指导表达的酶进入所选择宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区都可用于本发明。
对于细菌宿主细胞，有效的信号肽编码区来自于芽孢杆菌NCIB 11837maltogenic淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA基因的信号肽编码区。其他信号肽由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57109-137描述。
对于丝状真菌宿主细胞，有效的信号肽编码区来自于米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、孤独腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶和柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)脂酶基因的信号肽编码区。
可用于酵母宿主细胞的信号肽得自酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。其他有用的信号肽编码区由Romanos等，1992，上文，描述。
控制序列还可以是编码位于酶氨基端的氨基酸序列的前肽编码区。产生的多肽可命名为酶原或多肽原。多肽原通常是非活性的并可通过从多肽原上催化或自身催化切除前肽转化为成熟活性多肽。前肽编码区可从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和Myceliophthora thermophila漆酶(WO 95/33836)基因获得。
在多肽氨基端同时存在信号肽和前肽区时，前肽区位于紧邻多肽氨基端而信号肽区位于紧邻前肽区氨基端。在酵母中可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。
调节序列的其他实例为允许基因扩增的调节序列。在真核系统中包括存在氨甲喋呤时扩增的二氢叶酸还原酶基因和有重金属时扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列应与调节序列有效连接。
重组表达载体本发明还涉及包含发明的核酸构建体的重组表达载体。上述多种核苷酸和控制序列可连接在一起产生重组表达载体，其可以包括一个或多个便利的限制性酶切位点，以便允许编码多肽的核苷酸序列在此种位点进行插入或替代。另外，本发明的核苷酸序列可以通过将该核酸序列或者含有该序列的核酸构建体插入到用于表达的恰当载体中来表达。在构建表达载体时，编码序列定位于载体，以致于编码序列与用于表达的恰当控制序列有效连接。
重组表达载体可以是能够方便地进行重组DNA操作并且能够引起核苷酸序列表达的任何载体(例如质粒或者病毒)。载体的选择通常依赖于载体和欲导入载体的宿主细胞的兼容性。载体可以是线性的或者闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如质粒、染色体外遗传因子、微型染色体或者人工染色体。
载体可含有保证自我复制的任何手段。另外，载体可以是导入宿主细胞原整合进入基因组并且与整合进入的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单一载体或质粒、或共同含有欲被导入宿主细胞基因组的全部DNA的两个或多个载体或质粒，或使用转座子。
本发明的载体优选含有便于选择转化细胞的一个或多个选择标记。选择标记是其产物能够提供杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、从原养型到自养型等等的基因。
细菌选择标记物的实例为来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标记物。适用于酵母宿主细胞的标记物为ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。在丝状真菌宿主细胞中使用的选择标记物包括(但不限于)，amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，以及它们的等效物。
在曲霉属细胞中优先使用的是构巢曲霉或者米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本发明的载体优选含有允许载体稳定整合到宿主细胞基因组中的元件或者允许载体在细胞内不依赖基因组而自主复制的元件。
为了整合进入宿主细胞基因组，载体可依赖于编码多肽的核苷酸序列或者载体中用于通过同源重组或者非同源重组将载体稳定整合进入基因组的任何其它元件。另外，载体可以包含用于通过同原重组指导整合进入宿主细胞基因组的附加核苷酸序列。附加核苷酸序列使载体能够在染色体上的精确位置整合进入宿主细胞基因组。为了提高在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核苷酸，例如100至1,500个碱基对，优选400至1,500个碱基对，并且最优选800至1,500个碱基对，它们与相应的靶序列高度同源以便增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码的或者编码的核苷酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组的方式整合进入宿主细胞的基因组。
为了自主复制，载体还可包含使得载体能够在所述宿主细胞中自主复制的复制起点。细菌复制起点的实例为允许在大肠杆菌中复制的pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184和允许在芽孢杆菌中复制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1质粒复制起点。用于酵母宿主细胞的复制起点实例为两微米复制起点ARS1、ARS4，ARS1和CEN3的组合以及ARS4和CEN6的组合。
复制起点可以是具有突变的复制起点，所述突变使其在宿主细胞中温度敏感地发挥功能(见例如Ehrlich，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 751433)。
可向宿主细胞中插入多于一个拷贝的本发明核苷酸序列以增加基因产物产生。可通过将至少一个附加拷贝的序列整合进宿主细胞基因组来提高核苷酸序列拷贝数，或通过在核苷酸序列中包含可扩增的选择标记基因使细胞中含有扩增拷贝的该选择标记，从而可通过在有适当选择剂时培养细胞选择核苷酸序列的附加拷贝。
用于连接上述元件以构建本发明重组表达载体的操作为本领域技术人员熟知(见例如Sambrook等，1989，上文)。
重组宿主细胞本发明还涉及含有本发明核酸构建体的重组宿主细胞，该细胞有利于多肽的重组产生。将含有本发明核苷酸序列的载体导入宿主细胞，以便载体以作为先前描述的染色体整合体或者自主复制的染色体外载体而得以维持。
宿主细胞可以是单细胞微生物(如原核生物)或非单细胞微生物(如真核生物)。
有用的单细胞细胞是细菌细胞，例如革兰氏阳性菌，包括(但不仅限于)芽孢杆菌细胞，例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、Bacilluslautus、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)或链霉菌细胞，例如变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)或革兰氏阴性菌例如大肠杆菌和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。在优选的实施方案中，细菌宿主细胞为迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另一优选的实施方案中，芽孢杆菌细胞为嗜碱芽孢杆菌。
可通过例如原生质体转化(见例如Chang和Cohen，1979，MolecularGeneral Genetics 168111-115)、使用感受态细胞(见例如Young和Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56209-221)、电穿孔(见例如Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6742-751)或接合(见例如Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 1695771-5278)完成将载体引入细菌宿主细胞。
宿主细胞可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
在优选的实施方案中，宿主细胞为真菌细胞。本文使用“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等在《Ainsworth and Bisby′s Dictionaryof The Fungi》，第8版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK，中所定义)，以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等1995，同前，171页，所引用)和所有的有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等1995，同前)。在更优选的实施方案中，真菌宿主细胞为酵母细胞。本文使用“酵母”包括产子囊酵母(Endomycetales)、产担孢子酵母和属于半知菌类(Fungi imperfect)(酵母菌)的酵母。由于酵母的分类将来可能发生变化，就本发明而言，酵母如《Biology and Activities of Yeast》(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)所述定义。
在更优选的实施方案中，酵母宿主细胞为假丝酵母(Candida)、汉逊属(Hansenula)、克鲁维属(Kluyveromyces)、毕赤属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、类酵母属(Schizosaccharomyces)或Yarrowia细胞。
在最优选的实施方案中，酵母宿主细胞为卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或Saccharomyces oviformis细胞。在另一最优选的实施方案中，酵母宿主细胞为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)细胞。在另一最优选的实施方案中，酵母宿主细胞为Yarrowialipolytica细胞。
在另一个更加优选的实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(如Hawksworth等1995，同前定义)细分的所有丝状形式。丝状真菌以由壳多糖、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖和其它复合多糖组成的菌丝体壁为特征。通过菌丝延长进行营养生长并且碳的分解代谢是专性需氧的。相反，诸如酿酒酵母之类的酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽完成并且碳的分解代谢可通过发酵进行。
在甚至更加优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是(但不限于)枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium或者木霉属(Trichoderma)种类的细胞。
在最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉或者米曲霉细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰胞(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides或者Fusarium venenatum的细胞。在一个甚至最优选的实施方案中，丝状真菌母细胞是Fusariumvenenatum(Nirenberg sp.nov.)细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是孤独腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉(Mucor miehei)、Myceliophthora thermophila、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Thielavia terrestris、Trichodrma harzianum、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或者绿色木霉(Trichoderma viride)的细胞。
真菌细胞可以通过包括原生质体形成、原生质体转化和细胞壁回收的过程以本质上已知的方式进行转化。转化曲霉属细胞的适宜的操作在EP238023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 811470-1474中有所描述。转化镰刀菌属物种的适宜的方法在Malardier等，1989，Gene 78147-156和WO 96/00787中有所描述。可以使用Becker和Guarente，在Abelson，J.N.和Simon，M.I.，编，“Guideto Yeast Genetics and Molecular Biology”，《Methods in Enzymology》，194卷，182-187页，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journalof Bacteriology 153163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 751920中描述的操作转化酵母。
供体菌株本发明还提供以保藏号DSM 15716保藏的脂环酸芽孢杆菌属细菌和含有该微生物的组合物。
制备酶多肽的方法本发明还涉及用于产生本发明酶的方法，该方法包括(a)培养含有编码本发明酶的核苷酸序列的菌株，所述菌株能够表达并分泌该酶，和(b)回收该酶。在一具体的实施方案中，该菌株为野生型菌株，例如脂环酸芽孢杆菌DSM 15716，而在另一实施方案中该菌株为如上所述的重组宿主细胞。
在本发明这些方法中，使用本领域已知的方法将细胞在适于生产酶的营养培养基中培养。例如，细胞可以通过在实验室或者工业发酵罐中，在适宜的培养基上以及允许多肽表达和/或分离的条件下进行摇瓶培养、小规模或者大规模发酵(包括连续、批式、补料分批式或者固态发酵)。使用本领域已知的操作，在含有碳源和氮源和无机盐的适宜的营养培养基中进行培养。适宜的培养基可以从商品供应商得到或者根据公布的组合物(例如American Type Culture Collection的目录中所公布的)进行配制。如果酶分泌到营养培养基中，则可从培养基中直接回收酶。
可使用本领域已知的方法回收产生的多肽。例如可通过包括(但不限于)离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或者沉淀的常规操作从营养培养基中回收多肽。
可通过本领域已知的多种方法，包括(但不限于)层析(例如离子交换层析、亲和层析、疏水层析、层析聚焦和大小排阻层析)、电泳方法(例如制备型等电聚焦电泳)、差异溶解性(如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE，或者抽提(例如见《蛋白质纯化》，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCHPublishers，New York，1989)对本发明多肽进行纯化。
本发明方法还包括在脂环酸芽孢杆菌DSM 15716样品上进行的WO01/77315A1的TAST方法，即通过将脂环酸芽孢杆菌DSM 15716基因组的基因(例如来自基因文库的基因)与编码无信号报告子的基因(例如β-内酰胺酶)经由转座子标签融合，在显示报告子存在的培养基(如含氨苄青霉素的培养基)上培养包含与编码无信号报告子的基因(例如β-内酰胺酶)经由转座子标签融合的脂环酸芽孢杆菌DSM 15716基因的宿主细胞克隆，检测分泌报告子的克隆并分离该克隆中含有的脂环酸芽孢杆菌DSM15716基因和多肽。
当在显示报告子存在的培养基(如含氨苄青霉素的培养基)上培养包含与编码无信号报告子的基因(例如β-内酰胺酶)经由转座子标签融合的脂环酸芽孢杆菌DSM 15716基因的宿主细胞克隆时，只有表达并分泌报告子(例如β-内酰胺酶)的克隆会被检测(例如存活)。然而，只有与报告子基因融合的基因具有在宿主菌株中能被识别的完整启动子和核糖体结合位点(即是真实生活中由细胞表达以产生多肽的基因)，并且报告子被翻译从而合成的多肽被转运穿过细胞质膜并正确折叠时，才分泌报告子。因此，向选择的宿主细胞中插入融合基因时，检测到报告子存在的克隆(例如氨苄青霉素抗性)会含有来自脂环酸芽孢杆菌DSM 15716的编码功能性分泌多肽的基因。
转基因植物本发明还涉及用编码本发明酶的核苷酸序列转化以表达并生产该酶的转基因植物、植物局部或植物细胞。在一个实施方案中，可以使用植物作为产生可回收数量酶的宿主。可以从植物或植物局部回收酶。另外，可以使用含有重组酶的植物或植物局部用于改善食物或饲料的品质(例如改善营养价值、味道和流变性质)或破坏抗营养因子。具体可以使用表达酶的植物或植物局部作为用于产生燃料醇或生物乙醇的改善的起始材料。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物实例为草，例如草场草(青草，Poa)，饲料草如羊茅属(festuca)、黑麦草属(Lolium)、temperate grass如Agrostis和谷类如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱和玉蜀黍(玉米)。
双子叶植物实例为烟草、豆类(如羽扇豆、马铃薯、甜菜、豌豆、豆和大豆)和十字花科植物(芸苔(Brassicaceae)科)(如花椰菜、rape seed和密切相关的模式生物拟南芥(Arabidopsis thaliana))。
植物局部的实例为茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎。特定的植物组织例如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质也认为是植物局部。此外，认为无论来源于什么组织的植物细胞是植物局部。
本发明范围还包括这类植物、植物局部和植物细胞的后代。
可按照本领域已知方法构建表达本发明酶的转基因植物或植物细胞。简言之，通过将一个或多个编码本发明酶的表达构建体整合进植物宿主基因组并将产生的修饰的植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
便利的表达构建体为包含与适当调节序列有效连接的编码本发明酶的核酸序列的核酸构建体，所述调节序列是在选择的植物或植物局部中表达核酸序列所必需的。此外，表达构建体还可包含用于鉴定整合入表达构建体的宿主细胞的选择标记和向所述植物中引入该构建体时必需的DNA序列(后者依赖于待使用的DNA引入方法)。
调节序列(如启动子和终止子序列和任选的信号或转运序列)的选择依赖于例如期望何时、何处和如何表达酶。例如，编码本发明酶的基因表达可以是组成型或诱导型的，或可以是发育特异、阶段或组织特异的，且基因产物可以靶向至特定组织或植物局部，例如种子或叶。调节序列由例如Tague等，1988，Plant Physiology 86506描述。
关于组成型表达可使用35S-CaMV启动子(Franck等，1980，Cell 21285-294)。器官特异启动子可以是例如来自储藏库组织，如种子、马铃薯块茎和果实(Edwards & Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet 24275-303)或来自代谢库组织，如分生组织(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24863-878)的启动子，种子特异启动子如来自稻的谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或清蛋白启动子(Wu等，1998，Plant and Cell Physiology 39885-889)，来自豆球蛋白B4的蚕豆(Vicia faba)启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白质基因(Con rad等，1998，Journal of Plant Physiology 152708-711)，来源于种子油体蛋白质的启动子(Chen等，1998，Plant and Cell Physiology 39935-941)，来源于欧洲油菜(Brassica napus)的储藏蛋白napA启动子和本领域已知的任何其他种子特异启动子(如描述于WO 91/14772的)。此外，启动子可以是叶特异的启动子，例如来源于稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology 102991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant Molecular Biology2685-93)或来源于稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，Molecular andGeneral Genetics 248668-674)或伤诱导启动子如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，Plant Molecular Biology 22573-588)。
还可使用启动子增强子元件以便在植物中更高表达本发明的酶。例如，启动子增强子元件可以是置于启动子和编码本发明酶的核苷酸序列之间的内含子。例如Xu等，1993(上文)公开了稻肌动蛋白1基因的第一个内含子增强表达的用途。
标记基因和表达构建体的任何其他部分可选自可从本领域获得的那些。
根据本领域已知的常规技术将核酸构建体整合进植物基因组，所述技术包括农杆菌介导的转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等，1990，Science 2441293；Potrykus，1990，BiolTechnology 8535；Shimamoto等，1989，Nature 338274)。
目前，根瘤农杆菌介导的基因转移是选择用于产生转基因双子叶植物的方法(综述见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 1915-38)。然而其也可用于转化单子叶植物，尽管通常优选其他转化方法用于单子叶植物。目前，选择用于产生转基因单子叶植物的方法为粒子轰击(转化DNA包被的显微金或钨颗粒)胚愈伤组织或发育中的胚(Christou，1992，Plant Journal 2275-281；Shimamoto，1994，Current OpinionBiotechnology 5158-162；Vasil等，1992，BiolTechnology 10667-674)。用于转化单子叶植物的另一方法如Omirulleh等，1993，Plant MolecularBiology 21415-428所述的基于原生质体转化。
转化之后，根据本领域熟知的方法选择其中整合了表达构建体的转化体并再生为完整的植株。
本发明还涉及生产本发明酶的方法，包括(a)在有助于酶产生的条件下培养含有编码本发明酶的核苷酸序列的转基因植物或植物细胞和(b)回收酶。
包含多肽的组合物及其制备方法本发明提供包含本发明多肽并优选含有赋形剂的组合物以及制备这类组合物的方法，包括将本发明的多肽与赋形剂混和。组合物具体包含至少两种不同的本发明多肽，优选至少3种，更优选至少5种，更优选至少10种，更优选至少15种，更优选至少20种。最优选该组合物包含发酵脂环酸芽孢杆菌DSM 15716样品或其突变体(其中缺失或添加了一个或多个基因)时分泌的所有多肽。
在具体的实施方案中，本发明多肽为组合物的主要(多肽)组分，例如单一组分组合物。上下文中赋形剂应理解为用于配制组合物的任何辅助剂或化合物，包括溶剂、载体、稳定剂等。
组合物还可包含一个或多个额外的酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、haloperoxidase、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
可根据本领域已知方法制备组合物并且可以是液体或固体组合物的形式。例如，可以使用本领域已知的配制多肽和/或药品的方法配制酶组合物，例如配制成包衣或未包衣的颗粒或微粒。因此本发明多肽可以以颗粒(优选无尘颗粒)、液体(特别是稳定化的液体)、浆液或受保护的多肽形式提供。对于某些应用，优选将多肽固定在固体基质上。
可使用本领域已知方法稳定欲包含在组合物中的多肽，例如通过添加抗氧化剂或还原剂以限制多肽氧化来稳定组合物中的多肽，或可通过添加多聚体如PVP、PVA、PEG或其他已知有益于多肽在固体或液体组合物中稳定的合适的多聚体来稳定多肽。
在另一实施方案中，本发明组合物为洗涤剂组合物，其除本发明多肽外还包含表面活性剂和选自增量组分(如沸石)、漂白剂(如过碳酸盐)、漂白增强剂(如TAED或NOBS)、抑泡剂、芳香剂的任选化合物。
在另一实施方案中本发明组合物为饲料组合物，其除本发明多肽外还包含谷类或谷物产品。
在另一实施方案中本发明组合物为包含本发明多肽的食品组合物，例如面包师面粉组合物、酿造产品、果汁、油或猪油产品。
在另一实施方案中本发明组合物包含多糖或多糖混合物并包含本发明多肽。
在另一实施方案中本发明组合物为果浆组合物，其除本发明多肽外还还有果肉。
在另一实施方案中本发明组合物为杀生物组合物，其除本发明多肽外还含有氧化还原酶增强剂。
多肽或含有多肽的组合物用途另一方面，本发明提供本发明多肽或多核苷酸或含有所述多肽或多核苷酸的组合物在多种应用中的用途，特别是(技术)方法例如用在工业或家庭的方法、下文为了商业研究目的进行的方法。因此本发明包含包括在(技术)工业、研究或家庭过程中使用本发明多肽或本发明多核苷酸的方法。
在一个实施方案中，本发明多肽或组合物用于清洁纤维织物。
在另一实施方案中，本发明多肽或组合物用于制备食品或饲料添加剂。
在另一实施方案中，本发明多肽或组合物用于处理lignolosic材料和果肉。
洗涤剂公开内容本发明多肽可添加到洗涤剂组合物中从而成为其组分。
本发明洗涤剂组合物可配制为例如手工或机器洗衣洗涤剂组合物(包含适用于预处理脏污织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物柔顺剂组合物)，或可配制为用于一般家庭硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或为手工或机器洗碗机操作配制。
特别的，本发明提供包含本发明多肽的洗涤剂添加剂。该洗涤剂添加剂和洗涤剂组合物可包含一种或多种其他酶，例如蛋白酶、脂肪酶、cutinase、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶和/或过氧化物酶。
通常所选择的酶的性质应与选择的洗涤剂兼容(即最适pH，与其他的酶或非酶成份兼容)，且该酶应以有效数量存在。
蛋白酶合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的蛋白酶。优选微生物来源。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶，特别是来自芽孢杆菌的蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶为胰蛋白酶(如猪或牛来源的)和WO 89/06270和WO94/25583描述的镰刀菌蛋白酶。
有用的蛋白酶实例为WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946描述的变体，特别是在一个或多个下面位置具有替换的变体27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
优选的市售蛋白酶包括Alcalase、Savinase、Primase、Duralase、Esperase和Kannase(Novozymes A/S)、Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase、Purafect、Purafect OxP、FN2和Fun3(Genencor International Inc.)。
脂肪酶合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的脂肪酶。包括化学修饰或蛋白质工程突变体。有用的脂肪酶实例包括来自腐质霉属(同物异名Thermomyces)的脂肪酶(例如来自EP 258 068和EP 305 216所述柔毛腐质霉(T.lanuginosus)或来自WO 96/13580描述的孤独腐质霉)，假单胞菌脂肪酶(例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012))，芽孢杆菌脂肪酶(例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422))。
其他实例为脂肪酶变体例如WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中所描述的脂肪酶变体。
优选的市售脂肪酶包括LipolaseTM、Lipolase UltraTM和Lipex(Novozymes A/S)。
淀粉酶适合的淀粉酶(α和/或β)包括细菌或真菌来源的淀粉酶。包括化学修饰和蛋白质工程突变体。淀粉酶包括例如得自芽孢杆菌(例如地衣芽孢杆菌特定菌株，更详细描述于GB 1,296,839)的α-淀粉酶。
有用的淀粉酶实例为WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424描述的变体，特别是在一个或多个下面位置有替换的变体15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
市售的淀粉酶为DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(Novozymes A/S)、RapidaseTM和PurastarTM(来自Genencor InternationalInc.)。
纤维素酶合适的纤维素酶包括细菌和真菌来源的纤维素酶。包括化学修饰或蛋白质工程突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如由US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259中公开的孤独腐质霉、Myceliophthorathermophila和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。
特别合适的纤维素酶为具有颜色保护优点的碱性或中性纤维素酶。这类纤维素酶的实例为EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他实例为如WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299描述的纤维素酶变体。
市售纤维素酶包括Celluzyme和Carezyme(Novozymes)、Clazinase和Puradax HA(Genencor International Inc.)和KAC-500(B)(KaoCorporation)。
过氧化物酶/氧化酶合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的过氧化物酶/氧化酶。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。有用的过氧化物酶实例包括来自鬼伞属(Coprinus)(例如来自C.cinereus)的过氧化物酶和WO 93/24618，WO 95/10602，and WO 98/15257中描述的它的变体。
市售过氧化物酶包括Guardzyme(Novozymes A/S)。
可通过添加含有一个或多个酶的独立添加剂或通过添加含有所有酶的组合添加剂使洗涤剂组合物中含有洗涤剂酶。本发明的洗涤添加剂(即独立添加剂或组合添加剂)可配制为颗粒、液体、浆体等。优选的洗涤添加剂制品为颗粒(特别是无尘颗粒)、液体(特别是稳定液体)或浆体。
可如US 4,106,991和4,661,452所公开产生无尘颗粒并可任选地通过本领域已知方法包被。蜡包衣材料的实例为平均分子量1000到2000的聚环氧乙烷产品(聚乙二醇，PEG)；具有16到50环氧乙烷单元的乙氧基壬基苯酚；乙氧基脂肪醇(其中醇含有12到20碳原子且其中有15到80个环氧乙烷单位)；脂肪醇；脂肪酸和单和双和三脂肪酸甘油酯。适于流化床技术应用的产膜包裹材料实例在GB 1483591中给出。可根据现有技术例如通过添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸稳定液体酶制品。可根据EP 238,216描述的方法制备受保护的酶。
本发明的洗涤剂组合物可以是任何便利的形式，例如棒、片剂、粉末、颗粒剂、泥膏剂或液体。液体洗涤剂可以是水性的(通常含有上至70％的水和0-30％的有机溶剂)或非水性的。
洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，其可以是非离子(包括半极性)的和/或阴离子的和/或阳离子的和/或两性离子的。表面活性剂通常以按重量计从0.1％到60％的水平存在。
洗涤剂通常包含从约1％到约40％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基笨磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、磺基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基黄酸盐、仲链烷磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或肥皂。
洗涤剂通常包含从约0.2％到约40％非离子表面活性剂例如醇乙氧基化物、乙氧基壬基苯酚、烷基聚糖苷、烷基二甲基氧化胺、乙氧基脂肪酸单乙醇胺、脂肪酸单乙醇胺、多羟基烷基脂肪酰胺或葡糖胺N-酰基N-烷基衍生物(″glucamides″)。
洗涤剂可含有0-65％洗涤剂增量组分或络合剂，例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二乙烯三胺五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶硅酸盐或分层硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。
洗涤剂可含有一种或多种多聚体。实例为羧甲基纤维素、聚乙烯替砒咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡啶-N-氧化物、聚乙烯基咪唑、聚羧酸酯例如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和十二烷基异丁烯酸/丙烯酸共聚物。
洗涤剂可包含漂白系统，其可包含与过酸形式的漂白激活剂(例如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸盐)组合的H2O2来源(例如过硼酸盐或过碳酸盐)。另外，漂白系统可以包含例如酰胺、二酰亚胺或砜类型的过氧酸。
本发明洗涤剂组合物的酶可以使用常规稳定剂稳定，所述稳定剂例如多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(如芳香族硼酸酯)或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰苯基硼酸)，且组合物可以如例如WO 92/19709和WO 92/19708所示配制。
洗涤剂还可以包含其他便利的洗涤成分，例如织物调节剂(包括粘土、发泡剂、抑泡剂、防蚀剂、土壤悬浮剂、抗土壤沉淀剂、染料、杀菌剂、增量剂、助水溶物、抑锈剂或香料)。
目前考虑可以向洗涤剂组合物中以对应于每升洗涤液0.01-100mg酶蛋白质，优选每升洗涤液0.05-5mg酶蛋白质，特别是每升洗涤液0.1-1mg酶蛋白质的数量添加任何酶，特别是本发明的酶。
本发明的酶可以附加地整合进WO 97/07202公开的洗涤制剂中，WO97/07202在本文中整体引入作为参考。保藏的微生物申请人根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约将下面的微生物保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，MascheroderWeg 1b，D-38124 Braunschweig，德国2003年6月30脂环酸芽孢杆菌CS81嗜热嗜酸菌；DSM保藏号15716。
实施例实施例1鉴定脂环酸芽孢杆菌DSM 15716分泌的功能性多肽构建基因组文库通过使用标准分子生物学技术(Ausuble等，1995《Current protocolsin molecular biology》，John Wiley and Sons出版)制备脂环酸芽孢杆菌DSM 15716的染色体DNA。用Sau3A部分酶切制备的DNA并在琼脂糖凝胶上分离。洗脱、沉淀并在适当的缓冲液中重悬3到8千碱基的片段。
通过使用Stratagene ZAP ExpressTM预消化载体试剂盒和StratageneZAP ExpressTM预消化Gigapack克隆试剂盒(Bam HI预消化的)(Stratagene Inc.，USA)按照制造商说明/推荐制备基因组文库。产生的λZAP包含38000pfu，选择其中10000用于大量酶切。混和产生的70000个大肠杆菌菌落并使用Qiagen Spin Mini prep试剂盒(Qiagen，德国)制备质粒。在离心管中用1体积份的醋酸钠pH 5和2体积份的96％乙醇在4℃以20000rpm沉淀约1ml含有质粒DNA的洗脱液，用70％v/v乙醇洗涤，在室温干燥并重悬于200μl TE缓冲液中。脂环酸芽孢杆菌基因组文库的质粒库DNA的DNA浓度为5.2μg/μl。
构建和制备转座子WO 01/77315A1中描述的转座子辅助的信号捕获(TAST)方法的原理为通过转座子标签将选定的基因组中所有基因与编码无信号β-内酰胺酶的基因融合。因此当在含氨苄青霉素的培养基上培养包含与编码无信号β-内酰胺酶基因经由转座子标签融合的基因组基因的宿主细胞克隆时，只有表达并分泌β-内酰胺酶的克隆能够存活。然而，只有与β-内酰胺酶基因融合的基因具有在宿主细胞中能被识别的完整启动子和核糖体结合位点(即真实生活中由细胞表达以产生多肽的基因)，并且β-内酰胺酶被翻译从而合成的多肽被转运穿过细胞质膜并正确折叠时，才分泌β-内酰胺酶。因此，当向选定的宿主细胞中插入融合基因时，具氨苄青霉素抗性的克隆含有编码功能性分泌多肽的基因。
通常使用TAST方法时，甚至不必须表达整个基因。当用转座子给基因加标签时，基因N末端部分作为为蛋白质融合物表达，显示该基因包含完整的转录、翻译和分泌序列。因此认为基因N末端部分作为蛋白质融合物的表达通常足够确保整个基因的表达和分泌。
因此可推断通过TAST方法获得的基因事实上的确编码分泌功的能性多肽。
构建含有β-内酰胺酶报告子基因的SigA4转座子按照WO 01/77315A1的说明，使用标准分子生物学技术完成含有无信号β-内酰胺酶基因转座子的构建。最初使用proofreading聚合酶(PfuTurbo，Stratagene，USA)从载体pUC19中PCR扩增无信号β-内酰胺酶。产生的PCR片段含有NotI和EcoRI限制性位点以便于克隆。从Finnzymes，OY(Espo芬兰)获得含有Entranceposon和抗生素抗性标记物CAT(编码转座子氯霉素抗性)的质粒pEntranceposon(Camr)。质粒用限制酶NotI和EcoRI消化，凝胶纯化并与含有无信号β-内酰胺酶的片段连接。将连接物转化进电感受态DH10B细胞中并通过限制性分析鉴定含有有无信号β-内酰胺酶重组质粒的大肠杆菌克隆，命名为SigA2。
为了制备转座子，构建SigA2的更小的衍生物，其缺乏编码β-内酰胺酶的bla基因使用两个寡核苷酸引物SigA2NotU-P 5′-TCG CGA TCCGTT TTC GCA TTT ATC GTG AAA CGC T-3′(SEQ ID NO51)和SigA2NotD-P 5′-CCG CAA ACG CTG GTG AAA GTA AAA GAT GCTGAA-3′(SEQ ID NO52)(其结合在SigA2的bla基因起点和末端指向外侧)PCR扩增不含有bla基因的SigA2。重连该PCR反应中产生的约3.6kb的扩增产物并转化进合适的大肠杆菌菌株。从能够在氯霉素LB上生长而不能在氨苄青霉素LB上生长的转化体中分离3.6kb的质粒。该质粒保留了所有两个BgIII位点并缺少活性bla基因并称为pSig4。
用BgIII消化60微升浓度为0.3微克/微升的pSig4质粒DNA制品并在琼脂糖凝胶上分离。洗脱2kb的SigA2转座子DNA条带并根据销售商说明使用GFXTMPCR、DNA和凝胶条带纯化试剂盒(Amersham PharmaciaBiotech Inc，美国)纯化并用200微升EB缓冲液洗脱。
C.转座子标记从pSigA4制得的转座子带有5’截短的编码其分泌信号被去除的内酰胺酶的bla基因。只有当蛋白质分泌进入周质时，β-内酰胺酶才能给予大肠杆菌氨苄青霉素抗性，而β-内酰胺酶的细胞质表达不能赋予氨苄青霉素抗性。不含信号序列时，β-内酰胺酶不能转运到周质从而克隆不能在含有氨苄青霉素的培养基上生长。无信号β-内酰胺酶基因以转座子边缘和β-内酰胺酶编码区之间存在连续的开放读码框的方式包含在转座子内。由此，修饰的转座子转座进入编码分泌蛋白的基因时能够引起与靶基因的框内融合。这导致了分泌进入大肠杆菌周质时给予对氨苄青霉素抗性的融合基因产物。如果转座子甚至框内整合进入编码非分泌蛋白的基因，其各自的宿主不会成为氨苄青霉素抗性的。
为了体外转座子标记脂环酸芽孢杆菌文库，含有约2,6μg DNA的4或8微升SigA2转座子与1微升脂环酸芽孢杆菌基因组文库质粒库DNA的DNA浓缩物和2微升Finnzymes MuA转座酶(0,22微克/微升)和5微升Finnzymes OY(Espoo，芬兰)5×缓冲液以50微升的总体积混和并在30℃孵育3,5小时，然后在75℃热激10分钟。通过加入5微升3M醋酸钠pH5和110微升96％乙醇并在20000rpm离心30分钟沉淀DNA。洗涤并干燥沉淀并用10微升TE缓冲液重悬。
D.转化和选择在Biorad Gene Pulse设备(50uF，25mAmp，1.8kV)中用5微升转座子标记的质粒库电穿孔转化电感受态大肠杆菌DH108细胞，与1ml SOC培养基混和，在37℃预孵育1小时并涂布在含有25微升/毫升氨苄青霉素、50微升/毫升卡那霉素、10微升/毫升氯霉素的LB上并孵育2-3天。从转化体中选择了1056个菌落并使用Qiaprep 96 Turbo Biorobot试剂盒根据供应商说明制备质粒。
E、质粒制备和测序在一个反应中使用从上游读入转座子标记基因的A2up引物AGCGTTTGCGGCCGCGATCC(SEQ ID NO53)并在另一反应中使用从下游读入转座子标记基因的B引物TTATTCGGTCGAAAAGGATCC(SEQ ID NO54)测序1056个转座子标记的质粒。
F、序列组合和注解使用PhredPhrap程序(Brent Ewing，LaDeana Hillier，Michael C.Wendl和Phil Green，Base-calling of automated sequencer traces usingphred 1.Accuracy assessment(1998)Genome Research 8175-185；BrentEwing和Phil Green，Base-calling of automated sequencer traces usingphred 11.Error probabilities(1998)Genome Research 8186-194)将得到的序列装配为重叠群。随后用BLASTX 2.0a19MP-WashU[1998年7月14日][Build linux-x86 1851441998年7月30日]程序比较获得的重叠群和得自标准公开DNA和蛋白质序列数据库的序列(Gish，Warren(1994-1997)，未发表；Gish，Warren和David J.States(1993)。通过数据库相似度搜索鉴定蛋白质编码区。Nat.Genet.3266-72)。
获得的序列是编码完整和功能性多肽的功能基因，如上文解释由于它们是作为氨苄青霉素抗性克隆获得的。
实施例2通过同源性确定功能通过与功能已知的基因或多肽序列比较注解SEQ ID NO26到SEQID NO50多肽的功能。将本发明多肽与来自公开和内部重叠群数据库的一列最相关序列比较。随后使用BLASTX 2.Oa19MP-WashU[1998年7月14]程序比较重叠群(SEQ ID NO26到SEQ ID NO50来自其中)和可以得自标准公开DNA和蛋白质序列数据库的序列。仔细分析SEQ IDNO26到SEQ ID NO40与它们最相关的来自其他数据库的功能已知序列的序列比对使得可能以氨基酸同一性程度为基础预测这些多肽的功能。甚至当总氨基酸同一性为40％时(通常难以进行好的预测)，我们可以通过仔细分析并解读多肽序列催化位点或重要区域的氨基酸残基来预测SEQ ID NO26到SEQ ID NO40的功能。当已知序列催化位点的氨基酸残基也存在于本发明多肽中时，结合充分的总氨基酸同一性可以推出来自脂环酸芽孢杆菌DSM 15716的多肽具有与已知序列相同的功能。
实施例3制备SEQ ID NO26到SEQ ID NO50的多肽为了制备SEQ ID NO26到SEQ ID NO50的多肽，通过将编码开放读码框的DNA与适于在合适的宿主菌株(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或Bacillus clausii或脂环酸芽孢杆菌衍生物)中表达基因的启动子、核糖体结合位点和终止子融合以表达SEQ ID NO1到SEQ IDNO25包含的编码这些多肽的基因。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。SEQ ID NO26到SEQ ID NO50的任何信号序列可以用另一细菌的适当信号肽交换。表达构建体可以是质粒或线性DNA的部分。可以通过重组将其整合进入宿主菌株的染色体或其可以以质粒存在于宿主细胞中。然后在适合的培养基中以所需体积培养带有目的基因的转化细胞。如果使用诱导型启动子，通过加入诱导剂起始基因表达。否则不需要诱导剂且培养细胞直到产生合适数量的来自目的基因的蛋白质。收集培养物并用标准方法回收蛋白质。
实施例4测定丝氨酸羧基蛋白酶活性可以对在适当缓冲液中合成并分泌丝氨酸羧基蛋白酶的宿主菌株的培养液或细胞裂解液测定该活性。将适当体积的这类样品点在琼脂糖平板上，所述平板含有不溶性显色底物AZCL胶原(MegazymeTM)或Azocoll(Sigma-Aldrich)和适合的酸性pH缓冲液，如pH3-5。平板在适当的温度(如55℃)孵育适当的时间(如一天)。活性显示为斑点周围蓝色的色圈。作为AZCL胶原或Azocoll的备选方案，向琼脂平板添加未标记的胶原，其中酶活性以亮区测定。添加胃蛋白酶抑制剂不能抑制丝氨酸羧基蛋白酶的蛋白酶活性。作为备选方案，可以如Tsuruoka N，Nakayama T，Ashida M，Hemmi H，Nakao M，Minakata H，Oyama H，Oda K，NishinoT；″Collagenolytic serine-carboxyl proteinase from Alicyclobacillussendaiensis strain NTAP-1purification，characterization，gene cloning，and heterologous expression.″Appl Environ Microbiol.卷69(1)；162-169页；2003年1月所述测量含有丝氨酸羧基蛋白酶样品的活性。
实施例5测定多铜氧化酶活性可以如Schneider等，《Enzyme and Microbial Technology 25》，(1999)502-508页所述用在适当缓冲液中合成并分泌多铜氧化酶的宿主菌株的培养液或细胞裂解液测定该活性。
例如将适当体积(可以是15微升)的这类样品点在琼脂糖平板上，所述平板含有在适当缓冲液(例如pH 5.5，0.1M醋酸钠缓冲液)中合适浓度(例如1mM)的ABTS(2，2′-联氮双-3-乙基苯并噻唑啉-6-硫酸)。将该平板在适当温度(如55℃)孵育适当时间(如16小时)。活性显示为样品周围绿色区域。该测定法用于上清液和提取物。
实施例6测定丝氨酸蛋白酶活性可以对在适当缓冲液中合成并分泌丝氨酸蛋白酶的宿主菌株的培养液或细胞裂解液测定该活性。将适当体积的这类样品点在琼脂糖平板上，所述平板含有不溶性显色底物AZCL酪蛋白(MegazymeTM)或AZCL-胶原(MegazymeTM)和适当pH的适当缓冲液。平板在适当的温度(如55℃)孵育适当的时间(如一天)。活性显示为斑点周围蓝色的色圈。作为AZCL酪蛋白或AZCL胶原(MegazymeTM)的备选方案，可以使用未标记的酪蛋白或未标记的胶原。在点了未标记胶原或未标记酪蛋白的平板上，存在丝氨酸蛋白酶时形成亮区。
实施例7测定谷氨酸肽酶活性可以对在适当缓冲液中合成并分泌谷氨酸肽酶的宿主菌株的培养液或细胞裂解液测定该活性。将适当体积的这类样品点在琼脂糖平板上，所述平板含有不溶性显色底物AZCL胶原(MegazymeTM)和适合的酸性pH缓冲液，如pH3-5。平板可以在适当的温度(如55℃)孵育适当的时间(如一天)。活性显示为斑点周围蓝色的色圈。作为AZCL胶原的备选方案，可以使用未标记胶原。在点了未标记胶原的平板上，存在谷氨酸肽酶时形成亮区。特定测试SEQ ID NO27谷氨酸肽酶后，用20微升培养液在pH3.4的0.1％AZCL胶原(MegazymeTM)LB-PG琼脂平板上以斑点测试测定活性。将平板在55℃孵育(过夜)且活性显示为斑点周围蓝色的色圈。
SEQ ID NO27包含的谷氨酸肽酶显示与属于现在被MEROPS重新分类为G1肽酶家族(PepG)(EC 3.4.23.19)的A4家族肽酶显著的序列相似性，参阅上文描述SEQ ID NO27的小节和Fujinaga M，Cherney MM，Oyama H，Oda K，James MN.；The molecular structure and catalyticmechanism of a novel carboxyl peptidase from Scytalidium lignicolum；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.；101(10)；3364-9页；Epub 2004年3月1日；2004年3月9日。
该家族包括其活性位点有保守的Q和E的肽酶序列。这两个残基在SEQ ID NO27包含的谷氨酸肽酶中均保守。由此SEQ ID NO27包含的谷氨酸肽酶是G1家族的第一个细菌多肽，该家族之前仅包括真菌肽酶。
SEQ ID NO27特别与G1家族肽酶的参考序列比较黑曲霉aspergillopepsin II(SEQ ID NO55；Swissprot P24665；Takahashi，K.；Inoue，H.；Sakai，K.；Kohama，T.；Kitahara，S.；Takishima，K.；Tanji，M.；Athauda，S.B.P.；Takahashi，T.；Akanuma，H.；Mamiya，G.；Yamasaki，M；The primary structure of Aspergillus niger acid proteinase A.；J.Biol.Chem.；卷266；19480页；1991)。该多肽含有信号肽(aa1-aa18)和两个前肽(aa 19-58和aa 99-109)，其在分泌后成熟时被去除。成熟时形成轻链和重链，其通过半胱氨酸残基间的二硫键交联。(Inoue，H.；Kimura，T.；Makabe，O.；Takahashi，K.；The gene and deduced protein sequences ofthe zymogene of Aspergillus niger acid proteinase A；J.Biol.Chem.；卷266；19484页；1991)。SEQ ID NO27缺失了与第二个前肽(aa99-109)类似的氨基酸和对应于SEQ ID NO55交联的半胱氨酸残基的氨基酸(见比对)。之前只描述有真菌G1肽酶缺失半胱氨酸残基(Maita，T.；Nagata，S.；Matsuda，G.；Maruta，S.；Oda，K.；Murao，S.；Tsuru，D.；Complete aminoacid sequence of Scytalidium lignicolum acid protease B；J.Biochem.；卷95；465页；1984)。
SEQ ID NO55和SEQ ID NO27的比对
SWISSPROT_P24665MKFSTILTGS-LFATAALAAPLTEKRRARKEARAAGKRHSNPPYIPGSDKEILKLNGTTNSeq ID No.27MNGTSVWKASGIAAASCLTAAALLAWPHATSTLDASPAIFHAPRHALSPNTSPKPNSVQA¤¤¤¤¤¤¤¤¤¤¤:
SWISSPROT_P24665EEY---SSNWAGAVLIGDGYTKVTGEFTVPSVSAGSSGSSGYGGGYGYWKNKRQSEEYCASeq ID No.27QNFGWSASNWSGYAVTGSTYNDITGSWIVPAVSP----------------SKR--STYS-: * :
SWISSPROT_P24665SAWVGIDGDTCETAILQTGVDFCYEDGQTSYDAWYEWYPDYAYDFSDITISEGDSIKVTVSeq ID No.27SSWIGIDG-FNNSDLIQTGTEQDYVNGHAQYDAWWEILPAPETVISNMTIAPGDRMSAHI:*SWISSPROT_P24665EATSKSSGSATVENLTTGQSVTHTFSGNVEGDLCETNAEWIVEDFESGDSLVAFADFGSVSeq ID No.27HNNGNGTWTITLTDVTRNETFSTTQSYSGPG----SSAEWIQEAPEIGGRIATLANYGETSWISSPROT_P24665TFTNAEATSG--GSTVGPSDAT--------------------------------------Seq ID No.27TFDPGTVNGGNPGFTLVPTRATWCRTTRSCLCRPHPTRIPTASTWPTAPTSRAHRPPDPRSWISSPROT_P24665-----VMDIEQDGSVLTETSVSGDSVTVTYV------------Seq ID No.27RSRRPCMEAQGPASFFARTLAPSRDVAAHAPQGHRPSALVRRA*＝形成Swissprot P24665活性位点的氨基酸＝形成Swissprot P24665二硫键的半胱氨酸残基¤＝从Swissprot P24665酶原去除的前肽实施例8测定酸性β-葡聚糖酶活性可以对在适当缓冲液中合成并分泌β-葡聚糖酶的宿主菌株的培养液或细胞裂解液测定该活性。将适当体积的这类样品点在琼脂糖平板上，所述平板含有不溶性显色底物AZCL β-葡聚糖(MegazymeTM)和适合的酸性pH缓冲液，如pH3-5。平板在适当的温度(如55℃)孵育适当的时间(如一天)。活性显示为斑点周围蓝色的色圈。
实施例9测定酸性磷酸酶活性可以将在适当缓冲液中在适当pH和适当温度(如55℃)合成并分泌酸性磷酸酶的宿主菌株的适当体积培养液或细胞裂解液与对硝基苯酚磷酸(pNPP)一起孵育以测定酶活性。酶促反应的产物为对硝基苯酚和无机磷酸盐或在合适的反应时间后加入Pi.NaOH以终止磷酸酶实验并形成对硝基苯酚盐。405nm处光学测量对硝基苯酚盐的吸光度。作为备选方案，使用在适当缓冲液中在适当pH和适当温度(如55℃)合成并分泌酸性磷酸酶的宿主菌株的适当体积培养液或细胞裂解液用EnzChek酸性磷酸酶测定试剂盒(E-12020)(Molecular Probes Europe BV；PoortGebouw，Rijnsburgerweg 10；2333 AA Leiden，The Netherlands)测量酶活性。
实施例10测定多糖脱乙酰酶活性使用在适当缓冲液中适当温度(如55℃)下合成并分泌多糖脱乙酰酶的宿主菌株的适当体积培养液或细胞裂解液测定活性。可使用细菌的胞壁质、N，N′-二乙酰壳二糖(Sigma)或半乳糖pentaacetate(Sigma)或/和乙酸纤维素(Sigma)作为该类型酶的底物。可以用适合酶物理需要的醋酸测定试剂盒(Biopharm)测量通过酶从底物中释放的醋酸(Kosugi A，Murashima K，和Doi RH；Xylanase and Acetyl Xylan Esterase Activities of XynA，a KeySubunit of the Clostridium cellulovorans Cellulosome for XylanDegradation；Appl.Environm.I Microbiol.；卷68；6399-6402页；2002)。
实施例11测定内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶活性使用在合适缓冲液(如pH3-5)适当温度(如55℃)下合成并分泌内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的宿主菌株的适当体积培养液或细胞裂解液，根据MH Rashid，M Mori和J Sekiguchi；Glucosaminidase of Bacillus subtiliscloning，regulation，primary structure and biochemical characterization；Microbiology；卷141；2391-2404页；1995测定该活性。
实施例12测定肽酰脯氨酰异构酶活性使用在合适缓冲液适当温度(如55℃)下合成并分泌多糖脱乙酰酶的宿主菌株的适当体积培养液或细胞裂解液测定该活性。可根据Fischer，G.，Bang，H.和Mech，C.；Determination of enzymatic catalysis for thecis-trans-isomerization of peptide binding in proline-containing peptides.；Biomed.Biochim.Acta；卷43；1101-1111页；1984测定活性。可对该实验进行适当的改进以适合特异的肽酰脯氨酰异构酶，如SEQ ID NO36中包含的酶。
实施例13测定酸性纤维素酶活性可对在合适的缓冲液中合成并分泌酸性纤维素酶的宿主菌株培养液或细胞裂解液测试该活性。将适当体积的这类样品点在琼脂糖平板上，所述平板含有不溶性显色底物AZCL-HE纤维素(MegazymeTM)和酸性pH(如pH为3-5)的适当缓冲液。平板在适当的温度(如55℃)孵育适当的时间(如一天)。酸性纤维素酶的存在显示为斑点周围蓝色的色圈。
实施例14测定木聚糖脱乙酰酶活性使用在合适缓冲液中适当温度(如55℃)下合成并分泌多糖脱乙酰酶的宿主菌株的适当体积培养液或细胞裂解液测定木聚糖脱乙酰酶活性。木聚糖脱乙酰酶活性由从乙酰化木聚糖(通过Johnson等，1988(Johnson，K.G.，J.D.Fontana和C.R.Mackenzie.1988 Measurement of acetylxylanesterase in Streptomyces.Methods Enzymol.160551-560)的方法由birchwood木聚糖制备)中释放的醋酸测量。可以用适合酶物理需要的醋酸测定试剂盒(Biopharm)测量通过酶从底物中释放的醋酸(Kosugi A，Murashima K，和Doi RH；Xylanase and Acetyl Xylan Esterase Activities ofXynA，a Key Subunit of the Clostridium cellulovorans Cellulosome forXylan Degradation；Appl.Environm.I Microbiol.；卷68；6399-6402页；2002)。
实施例15测定植酸酶活性可对在合适的缓冲液中合成并分泌植酸酶的宿主菌株培养液或细胞裂解液测试植酸酶活性。将适当体积的这类样品用0.1M醋酸钠和适当缓冲液中的0.01％Tween-20，pH 5.5稀释，该缓冲液可以是pH 3.0到3.5的HCl、pH 4.0到5.5的醋酸钠、pH 6.0到6.5的吗啉代乙磺酸(MES)和pH 7.0到9.0的Tris-HCl，并进一步在底物溶液(含5mM植酸钠[Sigma]的0.1M醋酸钠和0.01％Tween-20[pH 5.5]，并在37℃预孵育)中稀释26倍，以起始反应。37℃30分钟后，加入等体积10％的三氯醋酸终止反应。通过加入等体积钼酸试剂测量游离的无机磷酸，100ml试剂含有7.3g FeSO4，1.0g(NH4)6Mo7O24·4H2O和3.2ml H2SO4。750nm处测量吸光度(Vmax微孔板读数器；Molecular Devices)(Lassen SF；Breinholt J；OstergaardPR；Brugger R；Bischoff A；Wyss M；Fuglsang CC；Expression，genecloning.and characterization of five novel phytases from fourbasidiomycete fungiPeniophora Iycii，Agrocybe pediades，a Ceriporia sp.，and Trametes pubescens；Appl.Environ.Micr.；67；4701-4707页；2001)。
实施例16测定磷脂酶活性可对在合适的缓冲液中合成并分泌磷脂酶的宿主菌株培养液或细胞裂解液测试磷脂酶活性。向适当体积的这类样品中添加卵磷脂。在恒定的pH和温度下水解卵磷脂并根据中和释放的脂肪酸时的滴定剂(0.1N NaOH)消耗率测定磷脂酶活性。底物为大豆卵磷脂(L-α-Phosphotidyl-胆碱)且条件为pH 8.00，40.0℃，反应时间2分钟。单位(LEU)相对于标准定义。
实施例17在枯草芽孢杆菌中表达谷氨酸肽酶基因(SEQ ID NO2)通过PCR将来自蛋白酶SAVINASETMTM(也称为地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶309，来自Novozymes A/S)的信号肽与编码谷氨酸肽酶的基因(SEQ ID NO2)框内融合。通过同源重组将编码产生的编码序列的DNA整合进入枯草芽孢杆菌宿主细胞基因组。在三元启动子体系(如WO99/43835所述)控制下表达基因构建体，所述体系由来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子和包含稳定化序列的苏云金芽孢杆菌cryIIIa启动子组成。使用编码氯霉素乙酰转移酶的基因作为标记物(在例如Diderichsen等，A useful cloningvector for Bacillus subtilis.Plasmid，30，312页，1993中描述)。
通过DNA测序分析氯霉素抗性转化体以确认构建体的正确DNA序列。选择了一个这样的克隆。
在旋转摇床上于带有挡板的500ml Erlenmeyer摇瓶中发酵谷氨酸肽酶(SEQ ID NO2)表达克隆，每个所述摇瓶含有100ml添加了6mg/l氯霉素的PS-1培养基。克隆在37℃发酵6天并在3、4、5和6天时取样并分析蛋白水解活性。用20微升培养液在pH3.4的0.1％AZCL胶原(MegazymeTM)LB-PG琼脂平板上以斑点测试测定活性(参阅实施例7)。将平板在55℃孵育(过夜)且活性显示为斑点周围的蓝色色圈。
实施例18来自脂环酸芽孢杆菌的A4家族蛋白酶的纯化和表征纯化将培养液离心(20000xg，20分钟)并从沉淀上小心倒出上清液。组合的上清液通过Seitz EKS板过滤以去除剩余的芽孢杆菌宿主细胞。用柠檬酸将EKS滤出液调节至pH 4.0并在水浴中搅拌加热至70℃。溶液达到70℃时(从25℃到70℃大概用去15分钟)，立刻将溶液置于冰上。该热激处理产生一些沉淀，其用另一Seitz EKS滤板过滤去除。向第二次EKS滤出液中添加硫酸铵至1.6M的终浓度并将混合物加至用20mMCH3COOH/NaOH，1.6M(NH4)2SO4，pH 4.5平衡的Butyl Toyopearl S柱上。用平衡缓冲液大致洗涤Butyl柱后，用相同缓冲液中的线性(NH4)2SO4梯度(1.6到0M)洗脱酶。分析来自柱的级分的蛋白酶活性(使用pH4.0测定缓冲液和37℃测定温度)并合并具有活性的级分。将合并的级分转移至20mM CH3COOH/NaOH，pH 5.5的G25葡聚糖凝胶柱并应用于相同缓冲液平衡的SOURCE 30Q柱。用平衡缓冲液大致洗涤SOURCE 30Q柱后，用相同缓冲液中的线性NaCl梯度(0到0.5M)洗脱蛋白酶。分析来自柱的级分的蛋白酶活性(pH4.0，37℃)并合并具有活性的级分。用1％(w/v)活性炭对带有轻微颜色的合并物处理5分钟，并用0.45pm的滤膜去除炭。滤出液的纯度用SDS-PAGE分析，其中在考马斯染色凝胶上只看到一个条带。
测定使用Protazyme OL(交联并染色的胶原)测定法。通过温和搅拌将Protazyme OL片剂(来自Megazyme)悬于2.0ml 0.01％ Triton X-100。在Eppendorf离心管中混和500微升该悬液和500微升测定缓冲液并置于冰上。加入20微升蛋白酶样品(稀释于0.01％Triton X-100)。通过将Eppendorf离心管转移至Eppendorf热混和仪起始测定，混和仪设定为测定温度。管在Eppendorf热混和仪中最高摇动率(1400rpm)下孵育15分钟。通过将管移回冰浴上终止孵育。然后将管在冰冷的离心机中离心数分钟，将200微升上清液转移至微孔滴定板并在650nm处读出OD650。测定包括空白缓冲液(代替酶)。OD650(酶)-OD650(空白缓冲液)为蛋白酶活性测量值。
蛋白酶测定法
底物Protazyme OL片剂(Megazyme T-PROL)。
温度受控的。
测定缓冲液100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mMCABS、1mM CaCl2、150mM KCl、0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节至pH值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0。
表征pH活性、pH稳定性和温度稳定性使用上述蛋白酶测定法获得pH活性谱、pH稳定性谱以及pH3.0的温度活性谱。为了测定pH稳定谱，用测定缓冲液5×稀释蛋白酶并在37℃孵育2小时。孵育后测定剩余活性前通过用pH3测定缓冲液稀释将样品转移到pH3.0。
37℃的pH活性谱

PH稳定性谱(37℃2小时后的剩余活性)

温度活性谱(pH 3.0时)

其他特征由SDS-PAGE测定的A4蛋白酶的相对分子量为Mr＝26kDa.
实施例19在枯草芽孢杆菌中表达酸性纤维素基因(SEQ ID NO1)通过PCR将来自TermamylTM(Novozymes)的信号肽与编码酸性纤维素酶的基因(SEQ ID NO1)框内融合。通过同源重组将编码产生的编码序列的DNA整合进入枯草芽孢杆菌宿主细胞基因组。在三元启动子体系(如WO 99/43835所述)控制下表达基因构建体，所述体系由来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子和包含稳定化序列的苏云金芽孢杆菌crailla启动子组成。使用编码氯霉素乙酰转移酶的基因作为标记物(在例如Diderichsen等，A usefulcloning vector for Bacillus subtilis.Plasmid，30，312页，1993中描述)。
通过DNA测序分析氯霉素抗性转化体以确认构建体的正确DNA序列。选择了一个这样的克隆。
在旋转摇床上于带有挡板的500ml Erlenmeyer摇瓶中发酵酸性纤维素酶(SEQ ID NO1)表达克隆，每个所述摇瓶含有100ml添加了6mg/l氯霉素的PS-1培养基。克隆在37℃发酵3天并在1、2和3天时取样并分析纤维素酶活性。用20微升培养液在pH3.4的0.1％AZCL-HE纤维素酶(MegazymeTM)LB-PG琼脂平板上以斑点测试测定活性。将平板在55℃孵育(过夜)且活性显示为斑点周围的蓝色色圈。
附加说明(PCT/RO/134表)关于“专家意见”的声名保藏的微生物保藏号保藏日期DSM 15176 2003年6月30日关于PCT/RO/134表所列的保藏微生物，我们需要所谓的专家意见在欧洲专利受权公告之前，或如果该申请已被驳回、撤消或视为撤消的情况下，自申请日期二十年内，保藏的微生物样品只提供给样品请求人指定的独立专家(参见EPC细则28(4))。并且就澳大利亚而言，同样请求专家意见，参见澳大利亚法规1991No 71细则3.25。同时，在加拿大我们请求只批准由委员会指定的独立专家有权获得保藏的微生物样品。
Bagsvaerd，2005年1月5日诺和酶股份有限公司Morten Birkeland，专利律师序列表序列表<110>诺和酶股份有限公司<120>脂环酸芽孢杆菌的多肽<130>NZ 10406<160>60<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>2877<212>DNA<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
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cagggaaccg agtgggacat gaagccagct cccgtcgtga tcgagacggg cgatccgtcg 840aacaacacca ccgggtcaga tcccgcgaac agcacgggca acggcaccgg gaactcgacg 900ggcaacgcca cgggcgccgt gccaggcggc aataccgtga cgaacgtcac cacgggctcg 960tccaacgtca ccggcaactc gacgggcaac agtttgggga actcgacggg caacagcttg1020ggcaacagca cgtcgaacgc gacgggcaat gccaccggca acaccaccgg gaatgcgacc1080ggcaattcca cgggcacgag cagcgggtcg ttcacgaatg tcgacctgcg ctatccggcg1140ccgtccaaca tcaatgcgca gagcatcaac cagtttctgc tgcagaacag ctcgccgctc1200aatgggctgg gcaattcgtt catggacgcc cagaacctgt acagcgtcga cgccaactac1260cttgtctcgc acgccatcct cgagagtgcg tgggggcaaa gccaaattgc ccttcagaag1320aacaatctgt ttggctacgg cgcttacgat tcgaaccccg gacaggatgc gggcgtattc1380ccgagcgacg actacgccat ccgattcgag gcgtggaccg tgcgcatgaa ctacctcacg1440ccgggcgcga gcttgtacgt gacgccgacg ctcagcggaa tgaacgtgaa ctacgccaca1500gccaagacct gggcaagcgg cattgcggcc atcatgacgc agtttgcgag ctccgtcgga1560tcgaacgtga atgcgtacgt gcagtacacg ccgtccaaca atccgcccgc tccgagatcg1620acagcggaac cggtgtacta catgaacggc gcgcaagggg taacgcagca ggatccgtat1680tacccgaatg gcggcgttcc gtactacccg accatcgcgc agggtgagaa tcagcagttc1740tttggccagc taagtgtcgg cagcttcggt caacccgtgg tggaggttca gcagttcctg1800aaccggacca tcaacgcggg gctgaccgtg gacgggcagt ttggcccgct gacgcaggcc1860gcggtcgaga agttccagtc gcaggtcatg cacatgtcga acccgaacgg catttggacg1920ttcagcatgt gggtccagta catccagcct tctcagtcga acgccaatct catcccggct1980gggaccaccg tgaaaattga ccaggtcgcc gagggcatgg cgggcccgta cgtcgtgcct2040tggtaccacg tggtgggcta tggctgggtc gactcgcagt atatcaagtt gaccaacgtg2100
tatcgcgtca ttgtgcagaa cccggccgga acggccacca ccattcccgt ctaccaggtg2160ggcaacctgt cttcggtatt gctcaatctg cacagcggag actgggtggt tgccaactca2220gcgcagccct cgggcggcgt gtacaccatt cagattgcgg ctcaggatcc accgtgtcga2280acggctacgc cgccgggacg ctct 2304<210>10<211>1791<212>DNA<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
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cacggcatcg cggtgcccgg cgcggaagac ggcgtccctg gtgtcacgca aaacccaatt 480ccgcctggcg ggagctacac gtacgagttt caggttaacc agcccggaac gtactggtac 540cactcgcacg aggcgagctt tgaagaggtg ggcctcgggt tgtacggcgc cttcgtcgtt 600ctgcccaaac gggcggtcca tccggccgat cgcgactaca cgctcgtcct gcacgagtgg 660ccgaccgcat ccaccgcgca gacgatgatg gcgaacctca aggctgggaa cttgggattc 720tcagcgaaag gcgaatccgc aggcatgggc ggcatgggca tgcaacaaaa cggggacatg 780aacggcatgg gcatgatggg cgcggcggac ggcacgggtc agggaggaaa tagcgcgagc 840gacatcgcgc acgtgttgcc tggccccccg cttcaactga acggtttttc gccgaccgca 900aacgattggg ctgcgcttga cgaaatggcg ggcatgtatg acgccttcac ggtgaatcag 960aacgcgagcg gtacaacgct cttgccagcc aagccgggac agctcgttcg gcttcgcatc1020gtgaacagcg gcaacatgac acacctgttc acgctggtcg gcgcaccgtt tcgcgtcgtg1080gcgctcgacg gccacgacat tgccaacccc ggttggatcc gcggcgtctt gcttcccgtc1140ggcgctgcag agcgatacga catcgaattt cgcgtgccaa agtccggggc cgcattcctt1200gtgtgcgccg atcccgacac gactgcacag cgcgagcttc gcgccgccat cggtctgccc1260gacgcctggt cacaattcaa ggagacggat gcagcgagcc ttgaacgagc gccgtggttc1320gactttacac actatggcag cggcaggctg cccggcgaag ccgtgttccg cctgcatcag1380gcgtatcagg tacgctacaa catgaagctc accgtcggca tgtcgatgaa cggcatggtg1440tacgccatca acggcaaggt ctttccgaac atcccgccca tcgtcgtgcg aaagggcgac1500gccgtcctgg tccacatcgt gaacgacagc ccctacattc acccgatgca tctgcacgga1560cacgactttc aagtgctgac gcgcgatggg aaacctgtct ccggaagccc catcttcctg1620gacaccttgg acgtgttccc cggcgagagc tacgacatcg cgtttcgcgc cgacaacccg1680ggtttatgga tgtttcactg tcacgatctc gaacacgccg cggccggtat ggacgtcatg1740
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ttcatctgca cggccaatga cacgcaggtc ttccagccgc ccaacaatcg ctatacggaa600ttcggccgcg tgatctccgg aatggacgtg atcgacaaga ttgccgccat cccggtgacc660gaaaacccca tgacgcagga agacagctat cctctgaaga ctgcgtacat cgagtcgatt720caaattcaag aatcg 735<210>12<211>1824<212>DNA<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
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atcgatctcg actactacga cggaaacacg gtcaccgcgc tctggtatta cgcgcaacac 480ttcgccttga acgacaacgc gtactgcacg cagtacggcc cgtctacgcc tggcgccatc 540aacctgattt cgggcgacac cgcgggagcg acggtttatt cttcaagtga gaccagcggc 600gccgcacaag tcgtgccacc cggcagcaaa aactttccga atgccgtgac gccaaacggc 660gtcgacatcg gcgacatcga tccctactac gacagcgcct ccaaaggcat gaccatggcg 720atggccggca aaaacatcgg cgacctgtta aacgcgaagg gggtcacctg gggctggttc 780cagggcggct ttgcaaatcc gaacgccaag gacaacaata tcgccggcac agatgaaacc 840accgattaca gcgcacacca tgagccgttc cagtattatg cgtctacggc aaatccgaat 900catctgccgc ctacgagcgt ggcgatgatc gggcgcacgg atcaggcaaa ccaccagtac 960gacatcacga atttcttcca agcattgcaa aacggaaaca tgcccgccgt gagtttcctg1020aaagctcccg aatacgaaga cggtcacgcc ggctattccg atcccctcga cgaacagcgc1080tggctggtcc agaccatcaa tcaaatcgag gcgtcgcccg attggtcctc caccgccatc1140atcatcacct atgacgactc ggatggttgg tacgatcacg tcatgcctcc gctcgtgaac1200ggatcgagcg acaaggccgt ggacgtgctc ggtggcacgc cggttctgca aaacgggacc1260gacagggcgg gctatggacc gcgggtgccg ttcctcgtca tctcgcccta cgccaaacac1320aattttgtcg ataacacgct catcgaccag acttccgttc tgcggttcat cgaggagaac1380tggggcctcg gctcgttggg cccagcgtcg tacgactcgc tcgccggatc gatcatgaac1440atgtttgact ggaacacgca gaacccgcct gtgtttctcg atccgacgac cggtgaaccc1500gtgtccccag atatgcagcc ggaggtcatt cgcggcacca cgtatctcag cctgaatcac1560tacgctcaaa acctcgatgt cgtgctgcaa acctctcggg ggatggcgcg gttctcctac1620gaggggcacg aggtcgagat cgacgagcgt tccgggcttg tccgggtcga tggcgaagcg1680gtccatctca aggcgcctct tgtgcgggtg gacggcgtat ggatggtgcc cgtagaggaa1740
atggattcgc tcattggggc cacgctgcac acctacaccg acggtcatct cacctactat1800ctcttttctc cgcaagacgc ccat 1824<210>13<211>750<212>DNA<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
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gtcgaggtct cgggcgccga atccagtgtg caggccgtgg ccgaggtggc gggcgtcgtg 540gacgcgagcg gcctgtcgca gacggcgacc aagctcgtcg agttgttgcc gcttgaccaa 600gcgggcaagg cggtgccggg tgtgacggtc acgccatccg cgatttcggt cacgctgccg 660atcacgtccg ccaatcaggc ggtgaagctg acgcctgcgg tcaccggcag ccctgcgcct 720ggatacgccg tcgcctcggt gcacctggag cccgcgagcg ctgtggaaca ggggctagcg 780gccagccagc ttccgcagcg cgggctcctc gtgcccatcg acgtcactgg attgaaccgg 840cccacgacgg tgtcggtccc ggtgccgctt ttgccgggga tgacgagcgt ttcgcccacg 900gcagtgacgg ccgtgatcga cgtggagccg tccgccgtct acaccgtttc gaacgtcccg 960gtggccatca cgggcgcgac gggtgtcaag ctggtgacgc ctcggaccgt gaatgtcacg1020gtgacgggga tcgaggccga cgtgcgcgcg gtggagaggg atccggccgc ggtgcaggcg1080tttgtggacg cgaccgggtt gacacatggc tcggcgacgc tgcccgattc aaattcgtct1140gctgtcctgt ctcttgtgat ccggccacgg gaaaggcgta agcgaacaca tgtagtg 1197<210>26<211>959<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(24)<220>
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Asn Gly Tyr Tyr Asn Gly Asn Gly Trp Glu Ala Asp Asp His Ala Val345 350 355 360Ala Gly Gln Pro Gln Lys Gly Asn Pro Gly Leu Ser Pro Gln Ala Tyr365 370 375Ala Gln Asn Ala Leu Gln Phe Ile Lys Ala Met Arg Ala Glu Asp Pro380 385 390Ser Ile Lys Ile Gly Ala Val Leu Thr Met Pro Tyr Asn Trp Pro Trp395 400 405Gly Ala Thr Val Asn Gly Asn Asp Asp Trp Asn Thr Val Val Leu Lys410 415 420Ala Leu Gly Pro Tyr Ile Asp Phe Val Asp Val His Trp Tyr Pro Glu425 430 435 440Thr Pro Gly Gln Glu Thr Asp Ala Gly Leu Leu Ala Asp Thr Asp Gln445 450 455Ile Pro Ala Met Val Ala Glu Leu Lys Arg Glu Val Asn Thr Tyr Ala460 465 470Gly Ser Asn Ala Lys Asn Ile Gln Ile Phe Val Thr Glu Thr Asn Ser475 480 485Val Ser Tyr Asn Pro Gly Glu Gln Ser Thr Asn Leu Pro Glu Ala Leu490 495 500Phe Leu Ala Asp Asp Leu Thr Gly Phe Ile Gln Ala Gly Ala Ala Asn505 510 515 520
Val Asp Trp Trp Asp Leu Phe Asn Gly Ala Glu Asp Asn Tyr Thr Ser525 530 535Pro Ser Leu Tyr Gly Gln Asn Leu Phe Gly Asp Tyr Gly Leu Leu Ser540 545 550Ser Gly Gln Thr Thr Gln Asn Gly Trp Gln Glu Pro Pro Ala Asn Thr555 560 565Pro Leu Pro Pro Tyr Asn Gly Phe Gln Leu Val Ser Asp Phe Ala Gln570 575 580Pro Gly Asp Thr Met Leu Gly Ser Thr Thr Ser Gln Ser Ala Ile Asp585 590 595 600Val His Ala Val Arg Lys Pro Asn Gly Asp Ile Ser Leu Met Leu Val605 610 615Asn Arg Ser Pro Ser Ala Ile Tyr Ser Ala Asn Leu Asn Val Leu Gly620 625 630Phe Gly Pro Phe Val Val Thr His Ala Leu Ala Tyr Gly Glu Gly Ser635 640 645Ser Arg Val Ala Pro Met Pro Val Leu Pro Val Pro Gly Ala Pro Ile650 655 660Lys Leu Met Pro Tyr Ser Gly Ile Asp Leu Thr Leu His Pro Leu Ile665 670 675 680Pro Ala Pro His Ala Ala Ala Gln Val Thr Asp Thr Leu Thr Leu Ser685 690 695
Ser Pro Thr Val Thr Ala Gly Gly Ala Glu Thr Leu Ser Ala Ser Phe700 705 710Gln Ala Asp Arg Pro Val His His Ala Thr Val Glu Leu Glu Leu Tyr715 720 725Asp Ser Thr Asn Asp Leu Val Ala Thr His Thr Val Ser Asp Val Asp730 735 740Leu Gln Pro Gly Ser Ala Thr Ser Glu Thr Trp Ser Phe Thr Ala Pro745 750 755 760Ala Ala Asn Gly Asn Tyr Arg Val Glu Ala Phe Val Phe Asp Pro Val765 770 775Thr Gly Ala Thr Tyr Asp Ala Asp Thr Gln Gly Ala Val Leu Thr Val780 785 790Asn Gln Pro Pro Gln Ala Thr Tyr Gly Asp Ile Val Thr Lys Asp Thr795 800 805Val Ile Thr Val Asn Gly Thr Thr Tyr Asp Val Pro Ala Pro Asp Ala810 815 820Gly Gly His Tyr Pro Ser Gly Thr Asn Ile Ser Val Ala Pro Gly Asp825 830 835 840Thr Val Thr Val Gln Thr Thr Phe Val Asn Val Ser Ser Thr Asp Ala845 850 855Leu Gln Asn Gly Leu Ile Asp Met Glu Val Asp Gly Ser Asn Gly Ala860 865 870
Ile Leu Gln Lys Tyr Trp Pro Ser Thr Thr Leu Leu Pro Gly Gln Ser875 880 885Glu Thr Val Thr Ala Thr Trp Gln Val Pro Ala Asn Val Ala Ala Gly890 895 900Thr Tyr Pro Leu Asn Phe Gln Ala Phe Asn Thr Ser Ser Trp Thr Gly905 910 915 920Asn Cys Tyr Phe Thr Asn Gly Gly Val Val Asn Phe Val Ile Ser925 930 935<210>27<211>272<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(32)<220>
<221>mat_peptide<222>(33)..(272)<223>天冬氨酰蛋白酶<400>27Met Asn Gly Thr Ser Val Trp Lys Ala Ser Gly Ile Ala Ala Ala Ser-30 -25 -20Cys Leu Thr Ala Ala Ala Leu Leu Ala Trp Pro His Ala Thr Ser Thr-15 -10 -5 -1Leu Asp Ala Ser Pro Ala Ile Phe His Ala Pro Arg His Ala Leu Ser
1 5 10 15Pro Asn Thr Ser Pro Lys Pro Asn Ser Val Gln Ala Gln Asn Phe Gly20 25 30Trp Ser Ala Ser Asn Trp Ser Gly Tyr Ala Val Thr Gly Ser Thr Tyr35 40 45Asn Asp Ile Thr Gly Ser Trp Ile Val Pro Ala Val Ser Pro Ser Lys50 55 60Arg Ser Thr Tyr Ser Ser Ser Trp Ile Gly Ile Asp Gly Phe Asn Asn65 70 75 80Ser Asp Leu Ile Gln Thr Gly Thr Glu Gln Asp Tyr Val Asn Gly His85 90 95Ala Gln Tyr Asp Ala Trp Trp Glu Ile Leu Pro Ala Pro Glu Thr Val100 105 110Ile Ser Asn Met Thr Ile Ala Pro Gly Asp Arg Met Ser Ala His Ile115 120 125His Asn Asn Gly Asn Gly Thr Trp Thr Ile Thr Leu Thr Asp Val Thr130 135 140Arg Asn Glu Thr Phe Ser Thr Thr Gln Ser Tyr Ser Gly Pro Gly Ser145 150 155 160Ser Ala Glu Trp Ile Gln Glu Ala Pro Glu Ile Gly Gly Arg Ile Ala165 170 175Thr Leu Ala Asn Tyr Gly Glu Thr Thr Phe Asp Pro Gly Thr Val Asn
180 185 190Gly Gly Asn Pro Gly Phe Thr Leu Ser Asp Ala Gly Tyr Met Val Gln195 200 205Asn Asn Ala Val Val Ser Val Pro Ser Ala Pro Asp Ser Asp Thr Asp210 215 220Gly Phe Asn Val Ala Tyr Gly Ser Asn Gln Pro Ser Pro Pro Ala Ser225 230 235 240<210>28<211>315<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(25)<220>
<221>mat_peptide<222>(26)..(315)<223>多铜氧化酶<400>28Met Arg Arg Arg Met Ser Gly Phe Ala Thr Gly Leu Gly Ile Ala Ala-25 -20 -15 -10Gly Leu Ala Leu Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Phe Phe His Ala Gly-5 -1 1 5Asn Ala Ser Ala Ala Ser Thr Met Ser Met Ala Pro Thr Ser Thr Met10 15 20Gly Ala Leu Pro Ala Pro Glu Gly Val Pro Asp Ala Gly Pro Leu Ser
25 30 35Ile Thr Pro Glu Val Ile Arg Gln Gln Gln Ala Asp Ala Val Arg Val40 45 50 55Met Asp Glu Glu Gly Leu Lys Pro Gln Ile Leu Ser Gly Asp Ile Lys60 65 70Arg Phe Thr Leu Thr Ala Ser Gln Val Asn Trp Tyr Leu Tyr Pro Gly75 80 85Lys Ala Val Val Ala Cys Gly Tyr Asn Gly Gln Val Pro Gly Pro Val90 95 100Leu Arg Val Arg Val Gly Asp Arg Val Gln Ile Leu Leu Arg Asn Glu105 110 115Leu Asn Glu Pro Thr Thr Leu His Ile Gln Gly Leu Asp Leu Pro Ala120 125 130 135Ser Gln Leu Gly Ile Gly Asp Val Thr Glu Ser Pro Ile Pro Pro Gly140 145 150Gly Glu Arg Leu Tyr Ser Phe Thr Val Thr Pro Gln Met Val Gly Thr155 160 165His Leu Tyr Glu Ser Gly Thr Asp Met Ala Ser Glu Ile Asp Pro Arg170 175 180Thr Ala Arg Gly Ala Ala Arg Arg Ser Gly Pro Gly Ile Pro Leu Ser185 190 195Pro Gly Glu Gly Gly Arg Ala Leu Arg Asp Arg Arg Val Asp Gly Gly
200 205 210 215Arg Ile Asp His Arg Lys Arg Val Trp Pro Gly Arg Gln Ala Val Ser220 225 230Arg Arg Ala Arg Thr Asp Gly Ala Val Arg Gln Pro Arg Gly Ala Ala235 240 245His Arg Gln Arg Glu Arg Asp Val Leu Pro Arg His Ala Pro Ala Arg250 255 260Asp Asp Val Leu Ala Ala Gly Gly Arg Arg Ala Pro Pro Arg Gln Ala265 270 275Ala Ala Asp Glu Arg Ala Arg His Arg Ala Arg280 285 290<210>29<211>626<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(32)<220>
<221>PROPEP<222>(33)..(189)<220>
<221>mat_peptide<222>(190)..(626)<223>丝氨酸羧基蛋白酶<400>29Met Gly Leu Trp Lys Arg Leu Ala Leu Gly Val Pro Ala Ala Leu
-185 -180 -175Ser Met Leu Ala Val Gly Val Pro Val Met Ser Ala Asp Thr Val-170 -165 -160Glu Ala Ala Pro Leu Ala Asn Pro Ser Thr Glu Asn Ala Gln Asp-155 -150 -145Met Gly Pro Ala Ser Gly Ser Gln Thr Val Thr Ala Ser Ile Ile-140 -135 -130Leu Arg Val Gln Asn Pro Thr Ala Leu Gln Asn Tyr Ile Gln Glu-125 -120 -115Thr Glu Thr Pro Gly Ser Pro Leu Tyr His Lys Phe Leu Thr Thr-110 -105 -100Ala Gln Phe Ala Gln Gln Tyr Ala Pro Ser Ala Ala Thr Leu Gln Gln-95 -90 -85Ile Glu Gln Glu Leu Gln Gly Tyr Gly Leu Gln Val Val Asn Val Asp-80 -75 -70Ala Asp His Leu Asp Met Gln Val Gln Gly Thr Val Gln Gln Phe Asp-65 -60 -55Asn Ala Phe Asn Thr Val Ile Asp Leu Phe Lys Ala Asn Gly His Ile-50 -45 -40Phe Arg Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Ile Pro Val Ala Leu Leu Thr-35 -30 -25 -20Asn Val Leu Ala Val Val Gly Leu Asp Thr Ala Gln Ala Ala Gln Ser
-15 -10 -5Leu Thr Val Lys Thr Pro Asn Val Ala Gly Val Pro Ser Pro Lys Val-1 1 5 10Val Leu Pro Gln Gly Gly Ser Thr Ala Thr Gly Thr Pro Gly Ser Tyr15 20 25Thr Val Gly Asp Thr Ala Asn Arg Tyr Asp Ile Asn Pro Leu Tyr Gln30 35 40 45Lys Gly Ile Thr Gly Lys Gly Glu Thr Ile Gly Ile Val Thr Leu Ser50 55 60Ser Phe Asn Pro Gln Asp Ala Tyr Thr Tyr Trp Gln Gly Ile Gly Leu65 70 75Lys Val Ala Pro Asn Arg Ile Gln Met Val Asn Val Asp Gly Gly Gly80 85 90Gln Met Asp Asp Gly Ser Val Glu Thr Thr Leu Asp Val Glu Gln Ser95 100 105Gly Gly Leu Ala Pro Asp Ala Asn Val Val Val Tyr Asp Ala Pro Asn110 115 120 125Thr Asp Gln Gly Phe Ile Asp Ala Phe Tyr Gln Ala Val Ser Asp Asn130 135 140Gln Ala Asp Ser Leu Ser Val Ser Trp Gly Gln Pro Glu Ile Asp Tyr145 150 155Leu Pro Gln Met Asn Gln Gly Gln Ser Tyr Val Asp Glu Leu Leu Ala
160 165 170Phe Thr Gln Ala Phe Met Glu Ala Ala Ala Gln Gly Ile Ser Met Tyr175 180 185Ala Ala Ala Gly Asp Ser Gly Ala Tyr Asp Thr Ala Arg Asp Phe Pro190 195 200 205Pro Ser Asp Gly Phe Thr Thr Pro Leu Ser Val Asp Phe Pro Ala Ser210 215 220Asp Pro Tyr Ile Thr Ala Ala Gly Gly Thr Thr Val Pro Phe Thr Ala225 230 235Lys Phe Ser Leu Gly Thr Val Asn Ile Thr Gln Glu Gln Pro Trp Ser240 245 250Trp Gln Tyr Leu Gln Asn Leu Gly Tyr Gln Gly Leu Phe Ser Val Gly255 260 265Thr Gly Gly Gly Val Ser Val Ile Phe Pro Arg Pro Trp Tyr Gln Leu270 275 280 285Gly Val Gly Gly Met Gln Asn Ser Ala Ala Asn Gln Ala Phe Thr Asp290 295 300Ser Gln Gly Val Leu Tyr Gly Ser Pro Phe Thr Tyr Asn Leu Pro Ser305 310 315Asn Tyr Ala Gly Arg Asn Leu Pro Asp Ile Ser Met Asp Ala Asp Pro320 325 330Glu Thr Gly Tyr Leu Val Tyr Trp Ser Ala Gly Gly Gly Trp Ile Ala
335 340 345Gly Tyr Gly Gly Thr Ser Phe Val Ala Pro Gln Leu Asn Gly Ile Thr350 355 360 365Ala Leu Ile Asp Gln Glu Val His Gly Arg Val Gly Phe Leu Asn Pro370 375 380Leu Leu Tyr Thr Leu Leu Thr Gln Gly Val Gln Gly Gly Ala Gln Pro385 390 395Phe His Asp Ile Thr Thr Gly Asn Asn Trp Tyr Trp Asn Ala Val Pro400 405 410Gly Tyr Asp Pro Ala Ser Gly Val Gly Thr Pro Asp Val Ala Asn Leu415 420 425Ala Gln Asp Ile Ala Ser Leu Arg430 435<210>30<211>533<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(24)<220>
<221>mat_peptide<222>(25)..(534)<223>丝氨酸羧基蛋白酶<400>30Met Arg Ala Leu Ala His Leu Ala Ile Gly Ala Ile Ala Ser Gly Val
-20 -15 -10Phe Ala Ala Pro Val Ala Phe Ala Ser Pro Val Gln Glu Arg Val Val-5 -1 1 5Val Ala Ser Pro Asp Pro Arg Thr Arg Ser Val His Ala Asp Gly Glu10 15 20Ile Ser Pro Ser Gln Pro Met His Leu Val Ile Thr Leu Arg Leu Arg25 30 35 40His Glu Ala Gln Leu Glu Gln Leu Ile Arg Asp Leu Tyr Thr Pro Gly45 50 55Ser Pro Asp Ala Gly His Phe Leu Thr Pro Ala Ala Phe Asn Ala Ala60 65 70Tyr Ala Pro Thr Ala Glu Asp Val Gln Ala Val Val Gln Gly Leu Arg75 80 85Ala Tyr Gly Leu Arg Val Glu Pro Thr Val Asn Pro Met Val Leu Thr90 95 100Val Ser Gly Arg Ala Arg Asp Val Glu Arg Ala Phe Gly Val His Glu105 110 115 120Leu Gln Phe Gly Arg Gly Ala Gly Ala Trp Tyr Ala Pro Asp Gly Ala125 130 135Ala Thr Leu Pro Ala Pro Leu Ala Ala Arg Val Ser Ala Val Val Gly140 145 150Leu Thr Ser Asp Ala Met Glu Arg His Leu Val Leu Ala His Val Ala
155 160 165Pro Ala Gly Gly Gly Tyr Thr Pro Ala Gln Ile Gln Arg Ala Tyr Asp170 175 180Tyr Thr Pro Leu Tyr Ser Gln Tyr Met Gly Arg Gly Gln Val Ile Ala185 190 195 200Val Val Thr Ser Gly Ser Val Leu Arg Ser Asp Leu Leu Ala Phe Asp205 210 215Arg Ala Phe Gly Leu Pro Asn Pro Val Val Arg Gln Arg Val Ile Asp220 225 230Gly Ser Ser Thr Ser Pro Asp Asp Glu Thr Thr Leu Asp Cys Glu Trp235 240 245Ala His Ala Ile Ala Pro Thr Ala Ser Leu Ala Val Tyr Glu Ala Ala250 255 260Gln Pro Asp Ala Gln Ser Phe Ile Asp Ala Phe Ala Gln Val Ala Ala265 270 275 280Asp Asp Gly Ala His Val Val Thr Thr Ser Trp Gly Ala Pro Glu Ser285 290 295Glu Thr Asp Ala Ala Thr Met Gln Ala Glu His Gln Ile Phe Met Gln300 305 310Met Ala Ala Gln Gly Gln Ser Val Phe Ala Ala Ala Gly Asp Ser Gly315 320 325Ser Ser Asp Gly Thr Ser Gly Thr Asp Val Asp Tyr Pro Ser Ser Asp
330 335 340Pro Tyr Val Thr Ala Cys Gly Gly Thr Arg Leu Val Leu Gly Ala Gly345 350 355 360Ala Lys Arg Leu Gln Glu Thr Ala Trp Ala Asp Thr Gly Gly Gly Ala365 370 375Ser Ser Val Tyr Gly Glu Pro Trp Trp Gln Tyr Gly Pro Gly Val Pro380 385 390Gln Thr Gly Tyr Arg Gln Thr Cys Asp Val Ala Leu Asn Ala Asp Pro395 400 405Ala Thr Gly Tyr Asp Phe Ile Tyr Glu Gly Gln Trp Glu Val Ala Gly410 415 420Gly Thr Ser Phe Val Ala Pro Met Met Ala Ala Thr Phe Ala Leu Ile425 430 435 440Asp Gln Ala Arg Ala Leu Glu Gly Lys Pro Pro Val Gly Leu Ala Asp445 450 455Val Gly Ile Tyr Ala Met Ala Arg Asn Ala Ser Tyr Ala Pro Tyr Ala460 465 470Phe His Asp Ile Thr Ala Gly Ser Asn Gly Ala Tyr Ser Ala Gly Pro475 480 485Gly Trp Asp His Pro Thr Gly Phe Gly Ser Ile Asp Ala Tyr Tyr Phe490 495 500Leu His Gly Leu Asp
505<210>31<211>360<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(41)<220>
<221>mat_peptide<222>(42)..(411)<223>蛋白酶或HtrA样丝氨酸蛋白酶<400>31Met Arg Arg Arg Arg Trp Asp Tyr Glu Asp Trp Pro Ser Glu Asn Arg-40 -35 -30Arg Val Gly Val Trp Leu Ala Ser Gly Thr Ala Leu Leu Ala Ile Cys-25 -20 -15 -10Tyr Ile Leu Gly Ile Trp Thr Gly Ala Ala Leu Thr Arg Gly His Ser-5 -1 1 5Gln Thr Thr Val Glu Tyr Val Pro Pro Gln Thr Gly Asn Thr Ala Ser10 15 20Thr Ser Gly Ser Leu Thr Pro Ile Pro Gly Val Glu Asp Thr Thr Ile25 30 35Val Thr Gln Ile Tyr Asn Arg Val Lys Asn Ser Ile Phe Thr Ile Thr40 45 50 55Ala Val Ser Gly Gly Lys Pro Thr Ser Ser Asp Ala Glu Glu Asp Ile
60 65 70Gly Thr Gly Phe Leu Ile Asp His Asn Gly Asp Leu Leu Thr Asn Ala75 80 85His Val Val Gly Ser Ala Thr Thr Val Gln Val Ser Gly Asp Asn Arg90 95 100Gln Phe Val Gly Arg Val Ile Asp Ala Asp Gln Leu Asp Asp Leu Ala105 110 115Ile Val Arg Ile Pro Ala Pro Lys Ser Leu Glu Pro Leu Pro Leu Gly120 125 130 135Ser Val Lys Ser Leu Gln Pro Gly Ser Leu Val Ile Ala Ile Gly Asn140 145 150Pro Phe Glu Leu Thr Ser Ser Val Ser Ser Gly Ile Val Ser Gly Leu155 160 165Asn Arg Ser Met Ser Glu Ser Asn Gly His Val Met Asn Gly Met Ile170 175 180Gln Thr Asp Ala Pro Leu Asn Pro Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Leu185 190 195Asn Ala Ala Gly Gln Val Val Gly Ile Asn Thr Leu Ile Glu Ser Pro200 205 210 215Ile Glu Gly Ser Ile Gly Ile Gly Phe Ala Ile Pro Ile Asp Arg Phe220 225 230Ile Gln Leu Glu Pro Glu Leu Leu Ala Gly Lys Pro Val Ala His Ala
235 240 245Trp Leu Gly Ile Glu Gly Met Asp Ile Asp Asn Leu Met Arg Gln Ala250 255 260Leu His Leu Pro Val Ala Ser Gly Val Tyr Val Thr Glu Val Thr Pro265 270 275Gly Gly Pro Ala Ala Lys Ala Gly Leu Arg Gly Asp Ser Asn Ala Ala280 285 290 295Lys Leu Asn Ser Leu Ser Gln Ser Ala Asn Pro Tyr Ala Leu Leu Lys300 305 310Gly Asn Gly Asp Ile Ile Val Gly315<210>32<211>211<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(30)<220>
<221>mat_peptide<222>(31)..(212)<223>二硫化物异构酶<400>32Met Arg Arg Ser Trp Ser Val Leu Met Ala Val Cys Met Ser Trp Leu-30 -25 -20 -15
Ala Val Gly Cys Gly Thr Pro Ala Asn Ser Leu Ser Gln Ala Thr Ala-10 -5 -1 1Ala Ser Gly Arg His Ala Pro His Pro Leu Val Phe Gln Asn Leu Thr5 10 15Gly Ala Met Asn Glu Gly Gln Asp Pro Arg Trp Asp Pro Lys Ala Ala20 25 30Pro Thr Gly Val Tyr Asp Asp Val Thr Val Val Thr Ala Ser Gly Arg35 40 45 50Gln Glu Val Leu Ser Val Arg Asp Ala Pro Leu Leu Phe Ala Ala Tyr55 60 65Trp Cys Pro His Cys Gln Arg Thr Leu Gln Leu Leu Thr Ser Ile Glu70 75 80Ser Arg Leu Lys Gln Lys Pro Ile Leu Val Asn Val Gly Tyr Pro Pro85 90 95Gly Thr Thr Leu Gln Thr Ala Ala Arg Ile Ala Arg Glu Glu Ser Gln100 105 110Val Leu His Leu Ala Pro Phe Gln Glu Val Phe Ile Leu Asn Pro Asp115 120 125 130Ala Gly Asp Arg Tyr Ala Pro Leu Gly Tyr Pro Thr Leu Ala Phe Tyr135 140 145Arg Ala Gly Arg Asp Trp Thr Leu Tyr Gly Glu His Arg Ala Ser Ile150 155 160
Trp Glu Lys Ala Leu Ser Glu Ser Thr Ser Lys Ala Tyr Asn Gly Ser165 170 175Glu Glu Ser180<210>33<211>266<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(29)<220>
<221>mat_peptide<222>(30)..(266)<223>γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶<400>33Met Asp Glu Met Asn Ile Arg Ser Trp Cys Val Ala Ala Cys Thr Val-25 -20 -15Ala Leu Thr Ser Ala Val Gly Ala Thr Thr Ala Phe Ala Gln Thr Val-10 -5 -1 1Thr Val Gln Pro Gly Gln Ser Leu Trp Thr Ile Ala Arg Ala His Gly5 10 15Met Pro Val Gln Leu Val Ala Ser Ala Asn Pro Gln Tyr Asn Pro Leu20 25 30 35Asn Leu Pro Val Gly Ala Thr Val Thr Leu Pro Ser Leu Lys Asp Val40 45 50
Ala Val Gln Pro Gly Asp Ser Leu Phe Leu Ile Gly Arg Gln Tyr Gly55 60 65Val Ser Leu Ala Glu Met Leu Ala Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Leu70 75 80Asn Leu Gln Val Gly Ser Ser Val Arg Val Pro Leu Ala Ser Ser Ser85 90 95Thr Lys Ser Ser Thr Val Ser Ala His Val Ala Ala Ser Thr Pro Glu100 105 110 115Asn Ser Asn Asn Leu Tyr Trp Leu Glu Arg Val Ile His Ala Glu Ala120 125 130Gly Gly Glu Ser Leu Gln Ala Gln Ile Ala Val Ala Asp Val Ile Leu135 140 145His Arg Met Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Ser Thr Val Gln Gln Val Val150 155 160Phe Gln Val Ser Asp Gly His Tyr Gln Phe Glu Ser Val Ala Asn Gly165 170 175Ser Ile Tyr Gly Gln Pro Asp Ala Gln Asn Val Gln Ala Ala Leu Asp180 185 190 195Ala Leu Asn Gly Asp Asp Val Val Pro Gly Ala Leu Val Phe Tyr Asn200 205 210Pro Ala Gln Thr Pro Ser Gly Ser Trp Val Trp Gln Gln Pro Val Val215 220 225
Ala His Ile Gly His Leu Val Phe Ala Lys230 235<210>34<211>768<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(26)<220>
<221>mat_peptide<222>(27)..(768)<223>内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶<400>34Met Lys Thr His Arg Leu Leu Ala Val Ala Ala Leu Pro Ala Thr Val-25 -20 -15Leu Leu Thr Thr Pro Ala Pro Ala Leu Ala Glu Thr Ser Ser Ser Gln-10 -5 -1 1 5Ser Ala Ser Ala Pro Ser Leu Asn Val Pro Val Ala Ala Leu Thr Leu10 15 20Ala Gly Val Gln Ser Tyr Pro Met Leu Ser Tyr Gly Ser Thr Gly Val25 30 35Tyr Val Glu Ile Leu Gln Asn Ala Leu Asn Ala Leu Gly Tyr Asp Val40 45 50Gly Gln Ala Ser Gly Leu Phe Asp Ala Thr Thr Gln Ala Glu Val Lys55 60 65 70
Ala Phe Gln Gln Ala Met Gly Leu Gln Thr Asp Gly Ile Val Gly Pro75 80 85Leu Thr Trp Gly Ala Leu Ala Lys Ala Val Ala Asp Tyr Arg Gln Val90 95 100Met Thr Val Leu Ser Ser Arg Ser Ser Leu Val Gln Gln Val Glu Trp105 110 115Lys Arg Ile Val Trp Asn Gly Arg Leu Ile Ser Lys Pro Ile Gly Phe120 125 130Thr Tyr Gln Gly Thr Ala Tyr Met Pro Ile Trp Tyr Val Met Gln Ala135 140 145 150Leu Ser Lys Ala Gly Ile Ala Ser Thr Trp Gln Gly Gly Val Trp Thr155 160 165Leu Thr Pro Pro Gly Gly Gln Thr Val Asn Tyr Gly Lys Ile Ser Tyr170 175 180Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ile Ala Ile Gly Gln Thr Val Val Ala Asn185 190 195Val Pro Ala Val Val Tyr Pro Asp Pro Ala Ser Gly Lys Leu Thr Thr200 205 210Phe Met Pro Val Trp Tyr Val Met Asn Ala Leu Gln Arg Leu Gly Ile215 220 225 230Gly Ser Thr Trp Gln Gly Thr Glu Trp Asp Met Lys Pro Ala Pro Val235 240 245
Val Ile Glu Thr Gly Asp Pro Ser Asn Asn Thr Thr Gly Ser Asp Pro250 255 260Ala Asn Ser Thr Gly Asn Gly Thr Gly Asn Ser Thr Gly Asn Ala Thr265 270 275Gly Ala Val Pro Gly Gly Asn Thr Val Thr Asn Val Thr Thr Gly Ser280 285 290Ser Asn Val Thr Gly Asn Ser Thr Gly Asn Ser Leu Gly Asn Ser Thr295 300 305 310Gly Asn Ser Leu Gly Asn Ser Thr Ser Asn Ala Thr Gly Asn Ala Thr315 320 325Gly Asn Thr Thr Gly Asn Ala Thr Gly Asn Ser Thr Gly Thr Ser Ser330 335 340Gly Ser Phe Thr Asn Val Asp Leu Arg Tyr Pro Ala Pro Ser Asn Ile345 350 355Asn Ala Gln Ser Ile Asn Gln Phe Leu Leu Gln Asn Ser Ser Pro Leu360 365 370Asn Gly Leu Gly Asn Ser Phe Met Asp Ala Gln Asn Leu Tyr Ser Val375 380 385 390Asp Ala Asn Tyr Leu Val Ser His Ala Ile Leu Glu Ser Ala Trp Gly395 400 405Gln Ser Gln Ile Ala Leu Gln Lys Asn Asn Leu Phe Gly Tyr Gly Ala410 415 420
Tyr Asp Ser Asn Pro Gly Gln Asp Ala Gly Val Phe Pro Ser Asp Asp425 430 435Tyr Ala Ile Arg Phe Glu Ala Trp Thr Val Arg Met Asn Tyr Leu Thr440 445 450Pro Gly Ala Ser Leu Tyr Val Thr Pro Thr Leu Ser Gly Met Asn Val455 460 465 470Asn Tyr Ala Thr Ala Lys Thr Trp Ala Ser Gly Ile Ala Ala Ile Met475 480 485Thr Gln Phe Ala Ser Ser Val Gly Ser Asn Val Asn Ala Tyr Val Gln490 495 500Tyr Thr Pro Ser Asn Asn Pro Pro Ala Pro Arg Ser Thr Ala Glu Pro505 510 515Val Tyr Tyr Met Asn Gly Ala Gln Gly Val Thr Gln Gln Asp Pro Tyr520 525 530Tyr Pro Asn Gly Gly Val Pro Tyr Tyr Pro Thr Ile Ala Gln Gly Glu535 540 545 550Asn Gln Gln Phe Phe Gly Gln Leu Ser Val Gly Ser Phe Gly Gln Pro555 560 565Val Val Glu Val Gln Gln Phe Leu Asn Arg Thr Ile Asn Ala Gly Leu570 575 580Thr Val Asp Gly Gln Phe Gly Pro Leu Thr Gln Ala Ala Val Glu Lys585 590 595
Phe Gln Ser Gln Val Met His Met Ser Asn Pro Asn Gly Ile Trp Thr600 605 610Phe Ser Met Trp Val Gln Tyr Ile Gln Pro Ser Gln Ser Asn Ala Asn615 620 625 630Leu Ile Pro Ala Gly Thr Thr Val Lys Ile Asp Gln Val Ala Glu Gly635 640 645Met Ala Gly Pro Tyr Val Val Pro Trp Tyr His Val Val Gly Tyr Gly650 655 660Trp Val Asp Ser Gln Tyr Ile Lys Leu Thr Asn Val Tyr Arg Val Ile665 670 675Val Gln Asn Pro Ala Gly Thr Ala Thr Thr Ile Pro Val Tyr Gln Val680 685 690Gly Asn Leu Ser Ser Val Leu Leu Asn Leu His Ser Gly Asp Trp Val695 700 705 710Val Ala Asn Ser Ala Gln Pro Ser Gly Gly Val Tyr Thr Ile Gln Ile715 720 725Ala Ala Gln Asp Pro Pro Cys Arg Thr Ala Thr Pro Pro Gly Arg Ser730 735 740<210>35<211>597<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属
<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(49)<220>
<221>mat_peptide<222>(50)..(597)<223>多铜氧化酶<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(139)..(139)<223>推定的铜结合位点<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(141)..(141)<223>推定的铜结合位点<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(181)..(181)<223>推定的铜结合位点<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(183)..(183)<223>推定的铜结合位点<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(514)..(514)<223>推定的铜结合位点<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(566)..(566)<223>推定的铜结合位点<400>35Met Met Ala His Asp Arg Leu Asp Arg Arg Val Asn Glu Arg Arg Gln-45 -40 -35
Ala Met Arg Arg Ala Ala Lys Trp Ala Ile Ala Leu Gly Thr Thr Ala-30 -25 -20Val Val Ala Gly Val Ser Ser Val Phe Ala Leu Arg Ser Val Arg Glu-15 -10 -5Ala Asn Leu Asn Pro Asn Ala Pro Leu Ala Asn Val Pro Gly Pro Gln-1 1 5 10 15Gly Ala Tyr Thr Pro Ile Ser Ala Leu Gln Pro Val Val Pro Lys Asn20 25 30Ala Arg Ile Asp His Tyr Thr Leu Thr Ala Glu Ser Arg Thr Leu Thr35 40 45Val Gly Gly His Ala Leu Gln Ala Met Thr Phe Asn Gly Thr Ala Pro50 55 60Gly Pro Leu Leu Val Ala His Gln Gly Asp Val Val Lys Val Thr Val65 70 75His Asn Arg Leu Ser Val Pro Leu Thr Ile His Trp His Gly Ile Ala80 85 90 95Val Pro Gly Ala Glu Asp Gly Val Pro Gly Val Thr Gln Asn Pro Ile100 105 110Pro Pro Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Glu Phe Gln Val Asn Gln Pro Gly115 120 125Thr Tyr Trp Tyr His Ser His Glu Ala Ser Phe Glu Glu Val Gly Leu130 135 140
Gly Leu Tyr Gly Ala Phe Val Val Leu Pro Lys Arg Ala Val His Pro145 150 155Ala Asp Arg Asp Tyr Thr Leu Val Leu His Glu Trp Pro Thr Ala Ser160 165 170 175Thr Ala Gln Thr Met Met Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asn Leu Gly Phe180 185 190Ser Ala Lys Gly Glu Ser Ala Gly Met Gly Gly Met Gly Met Gln Gln195 200 205Asn Gly Asp Met Asn Gly Met Gly Met Met Gly Ala Ala Asp Gly Thr210 215 220Gly Gln Gly Gly Asn Ser Ala Ser Asp Ile Ala His Val Leu Pro Gly225 230 235Pro Pro Leu Gln Leu Asn Gly Phe Ser Pro Thr Ala Asn Asp Trp Ala240 245 250 255Ala Leu Asp Glu Met Ala Gly Met Tyr Asp Ala Phe Thr Val Asn Gln260 265 270Asn Ala Ser Gly Thr Thr Leu Leu Pro Ala Lys Pro Gly Gln Leu Val275 280 285Arg Leu Arg Ile Val Asn Ser Gly Asn Met Thr His Leu Phe Thr Leu290 295 300Val Gly Ala Pro Phe Arg Val Val Ala Leu Asp Gly His Asp Ile Ala305 310 315
Asn Pro Gly Trp Ile Arg Gly Val Leu Leu Pro Val Gly Ala Ala Glu320 325 330 335Arg Tyr Asp Ile Glu Phe Arg Val Pro Lys Ser Gly Ala Ala Phe Leu340 345 350Val Cys Ala Asp Pro Asp Thr Thr Ala Gln Arg Glu Leu Arg Ala Ala355 360 365Ile Gly Leu Pro Asp Ala Trp Ser Gln Phe Lys Glu Thr Asp Ala Ala370 375 380Ser Leu Glu Arg Ala Pro Trp Phe Asp Phe Thr His Tyr Gly Ser Gly385 390 395Arg Leu Pro Gly Glu Ala Val Phe Arg Leu His Gln Ala Tyr Gln Val400 405 410 415Arg Tyr Asn Met Lys Leu Thr Val Gly Met Ser Met Asn Gly Met Val420 425 430Tyr Ala Ile Asn Gly Lys Val Phe Pro Asn Ile Pro Pro Ile Val Val435 440 445Arg Lys Gly Asp Ala Val Leu Val His Ile Val Asn Asp Ser Pro Tyr450 455 460Ile His Pro Met His Leu His Gly His Asp Phe Gln Val Leu Thr Arg465 470 475Asp Gly Lys Pro Val Ser Gly Ser Pro Ile Phe Leu Asp Thr Leu Asp480 485 490 495
Val Phe Pro Gly Glu Ser Tyr Asp Ile Ala Phe Arg Ala Asp Asn Pro500 505 510Gly Leu Trp Met Phe His Cys His Asp Leu Glu His Ala Ala Ala Gly515 520 525Met Asp Val Met Val Gln Tyr Ala Gly Ile Arg Asp Pro Tyr Pro Met530 535 540Ser Glu Met Ser Glu545<210>36<211>245<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(29)<220>
<221>mat_peptide<222>(30)..(246)<223>肽酰脯氨酰异构酶<400>36Met Lys Arg Arg Thr Leu Leu Ala Gly Ile Thr Leu Ala Ala Leu Val-25 -20 -15Ala Val Ala Gly Cys Gly Thr Pro Ala Gly Asn Thr Ala Ser Pro Asp-10 -5 -1 1Asn Thr Ala Asn Leu Ser Asn Thr Asn Ala Pro Asp Thr Leu Ser Asn
5 10 15Glu Thr Gly Gln Thr Leu Asp Thr Ala Asn Pro Pro Tyr Leu His Thr20 25 30 35Ser Thr Glu Gln Trp Lys Ser Met Pro Lys Met Phe Ile Asn Pro Asn40 45 50Lys Thr Tyr Asp Ala Ile Val His Thr Asn Tyr Gly Thr Phe Thr Ile55 60 65Gln Leu Phe Ala Lys Asp Ala Pro Ile Thr Val Asn Asn Phe Val Phe70 75 80Leu Ala Glu His Asn Phe Tyr His Asp Cys Thr Phe Phe Arg Ile Val85 90 95Lys Asn Phe Val Ile Gln Thr Gly Asp Pro Arg Asn Asp Gly Thr Gly100 105 110 115Gly Pro Gly Tyr Thr Ile Pro Asp Glu Leu Ser His Gln Val Pro Phe120 125 130Thr Lys Gly Ile Val Ala Met Ala Asn Thr Gly Gln Pro His Thr Gly135 140 145Gly Ser Gln Phe Phe Ile Cys Thr Ala Asn Asp Thr Gln Val Phe Gln150 155 160Pro Pro Asn Asn Arg Tyr Thr Glu Phe Gly Arg Val Ile Ser Gly Met165 170 175Asp Val Ile Asp Lys Ile Ala Ala Ile Pro Val Thr Glu Asn Pro Met
180 185 190 195Thr Gln Glu Asp Ser Tyr Pro Leu Lys Thr Ala Tyr Ile Glu Ser Ile200 205 210Gln Ile Gln Glu Ser215<210>37<211>608<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(27)<220>
<221>mat_peptide<222>(28)..(608)<223>酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C<400>37Met Lys Lys Gly Lys Arg Trp Ser Ala Ala Leu Ala Thr Ser Val Ala-25 -20 -15Leu Phe Ala Thr Leu Ser Pro Gln Ala Leu Ala Ser Asp Thr Val Val-10 -5 -1 1 5Pro Gln Val Asn Thr Leu Thr Pro Ile His His Leu Val Val Ile Phe10 15 20Asp Glu Asn Val Ser Phe Asp His Tyr Phe Ala Thr Tyr Pro Asn Ala25 30 35Ala Asn Pro Ala Gly Glu Pro Pro Phe Tyr Ala Ala Pro Gly Thr Pro
40 45 50Ser Val Asn Gly Leu Ser Gly Ser Leu Leu Thr His Asn Pro Asn Gly55 60 65Val Asn Pro Gln Arg Leu Asp Arg Ser Gln Ala Val Thr Pro Asp Met70 75 80 85Asn His Asn Tyr Thr Pro Glu Gln Gln Ala Val Asp Gly Gly Arg Met90 95 100Asp Asn Phe Ile Asn Thr Val Gly Arg Gly Asn Pro Ile Asp Leu Asp105 110 115Tyr Tyr Asp Gly Asn Thr Val Thr Ala Leu Trp Tyr Tyr Ala Gln His120 125 130Phe Ala Leu Asn Asp Asn Ala Tyr Cys Thr Gln Tyr Gly Pro Ser Thr135 140 145Pro Gly Ala Ile Asn Leu Ile Ser Gly Asp Thr Ala Gly Ala Thr Val150 155 160 165Tyr Ser Ser Ser Glu Thr Ser Gly Ala Ala Gln Val Val Pro Pro Gly170 175 180Ser Lys Asn Phe Pro Asn Ala Val Thr Pro Asn Gly Val Asp Ile Gly185 190 195Asp Ile Asp Pro Tyr Tyr Asp Ser Ala Ser Lys Gly Met Thr Met Ala200 205 210Met Ala Gly Lys Asn Ile Gly Asp Leu Leu Asn Ala Lys Gly Val Thr
215 220 225Trp Gly Trp Phe Gln Gly Gly Phe Ala Asn Pro Asn Ala Lys Asp Asn230 235 240 245Asn Ile Ala Gly Thr Asp Glu Thr Thr Asp Tyr Ser Ala His His Glu250 255 260Pro Phe Gln Tyr Tyr Ala Ser Thr Ala Asn Pro Asn His Leu Pro Pro265 270 275Thr Ser Val Ala Met Ile Gly Arg Thr Asp Gln Ala Asn His Gln Tyr280 285 290Asp Ile Thr Asn Phe Phe Gln Ala Leu Gln Asn Gly Asn Met Pro Ala295 300 305Val Ser Phe Leu Lys Ala Pro Glu Tyr Glu Asp Gly His Ala Gly Tyr310 315 320 325Ser Asp Pro Leu Asp Glu Gln Arg Trp Leu Val Gln Thr Ile Asn Gln330 335 340Ile Glu Ala Ser Pro Asp Trp Ser Ser Thr Ala Ile Ile Ile Thr Tyr345 350 355Asp Asp Ser Asp Gly Trp Tyr Asp His Val Met Pro Pro Leu Val Asn360 365 370Gly Ser Ser Asp Lys Ala Val Asp Val Leu Gly Gly Thr Pro Val Leu375 380 385Gln Asn Gly Thr Asp Arg Ala Gly Tyr Gly Pro Arg Val Pro Phe Leu
390 395 400 405Val Ile Ser Pro Tyr Ala Lys His Asn Phe Val Asp Asn Thr Leu Ile410 415 420Asp Gln Thr Ser Val Leu Arg Phe Ile Glu Glu Asn Trp Gly Leu Gly425 430 435Ser Leu Gly Pro Ala Ser Tyr Asp Ser Leu Ala Gly Ser Ile Met Asn440 445 450Met Phe Asp Trp Asn Thr Gln Asn Pro Pro Val Phe Leu Asp Pro Thr455 460 465Thr Gly Glu Pro Val Ser Pro Asp Met Gln Pro Glu Val Ile Arg Gly470 475 480 485Thr Thr Tyr Leu Ser Leu Asn His Tyr Ala Gln Asn Leu Asp Val Val490 495 500Leu Gln Thr Ser Arg Gly Met Ala Arg Phe Ser Tyr Glu Gly His Glu505 510 515Val Glu Ile Asp Glu Arg Ser Gly Leu Val Arg Val Asp Gly Glu Ala520 525 530Val His Leu Lys Ala Pro Leu Val Arg Val Asp Gly Val Trp Met Val535 540 545Pro Val Glu Glu Met Asp Ser Leu Ile Gly Ala Thr Leu His Thr Tyr550 555 560 565Thr Asp Gly His Leu Thr Tyr Tyr Leu Phe Ser Pro Gln Asp Ala His570 575 580
<210>38<211>250<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
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<220>
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<221>mat_peptide<222>(22)..(324)<223>多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶<400>39Met Arg Lys Thr Ala Ala Gly Ala Cys Ala Leu Ala Leu Met Gly Val-20 -15 -10Leu Gly Gly Trp Ala Gly Ala Ala Gly Thr Ala Val Asn Ala His Ala-5 -1 1 5 10Pro Ala Ala Ser Ala Pro Ser Val Ser Ala His Val Trp Glu Glu Val15 20 25Ser Arg Thr Trp Gly Thr Leu Pro Val Asp Ala Arg His Asp Gly Val30 35 40Trp His Asn Ile Pro Gly Leu Ser Gly Phe Ala Leu Asp Thr Ala Ala45 50 55Ser Glu Arg Glu Thr Ala Arg Arg His Asp Gly Ala Leu His Leu Val60 65 70 75Trp Arg Thr Leu Pro Pro Lys Arg Arg Leu Gly Asp Leu Ser Pro Asp80 85 90Val Ile Tyr Arg Gly Pro Ala Gln Glu Lys Ser Val Ala Leu Met Val95 100 105
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Asp Glu Arg Pro Ala Val Thr Pro Pro Thr Thr Leu Ala Asn Glu Thr285 290 295Phe His Ser Ala300<210>40<211>214<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(29)<220>
<221>mat_peptide<222>(30)..(214)<223>亚硫酸盐氧化酶<400>40Met Met Arg Trp Asn Trp Lys Val Ala Val Gly Ser Leu Ala Leu Ala-25 -20 -15Ala Leu Gly Ala Gly Ala Ala Val Ser Pro Val Phe Ala Ala Ala Lys-10 -5 -1 1Ser Ser Lys Ala Ala Gln Ser His Ala Glu Ala Ser Ala Ala Val Val5 10 15Met Ala Gly Lys Leu Tyr Gly Asn Ile Pro Asn Val Thr Ile Arg Gly20 25 30 35Val Glu Ala Gly Lys Ala Pro Trp Val Val Asp Gly Ser Tyr Gln Leu
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<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(21)<220>
<221>mat_peptide<222>(22)..(257)<223>功能性多肽<400>41Met Asn Trp Ala Arg Val Gly Ala Trp Val Ser Thr Trp Leu Val Ala-20 -15 -10Thr Ala Leu Gly Ala Gly Cys Gly Thr Ala Ser Gln Glu His Pro Ser-5 -1 1 5 10Asn Thr Ser Thr Ser Asp His Arg Val Ala Pro Ala Ala Pro Gly Gly15 20 25Ser Ala Ser Met Gln Asn Arg His Ile Leu Gln Glu Pro Leu Pro Arg30 35 40Gly Val Lys Thr Glu Thr Asp Leu Tyr Asn Trp Leu Leu Trp Gln Arg45 50 55Leu Ala Glu Ile Asn Asn Pro Ala Gln Gly Glu Ile Cys Leu Asp Ala60 65 70 75Ala Cys Lys Ile Ala Ala Thr Val Phe Ser Gly Pro Ala Lys Ala Ala80 85 90Ala Gly Thr Pro Val Thr Leu Val Ala Phe Ser Pro Arg Ala Gly Trp95 100 105Gln Val Leu Val Gly Pro Leu Pro Gln Ser Asp Asn Pro Pro Arg Gln
110 115 120Ala Gln Ser Ile Thr Gly Gln Ser Ala Arg Leu Pro Ala Gln Arg Gly125 130 135Arg Met Arg Arg Ser Asn Pro Arg Asn Arg Leu Val Leu Asp Ser Gly140 145 150 155Arg Thr Pro Ala Ala Asp Ala Ser Ala Ala Arg Met Thr Arg Gln Leu160 165 170Arg Arg Ser Ala Ser Ser Thr Asn Ala Ser Arg Ser Arg Arg Ala Lys175 180 185Ser Met Ala Arg Cys Gln Lys Ser Gly Cys Val Arg Ser Ala Pro Met190 195 200Cys Phe Trp Ala Arg Ser Ser Thr Arg Met Arg Pro Val Ser Arg Ser205 210 215Asn Ala Thr Tyr Leu Ser Ala Asn Pro Val Pro Ser Ala Glu Ala Met220 225 230 235Ala<210>42<211>1130<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(24)
<220>
<221>mat_peptide<222>(25)..(1130)<223>功能性多肽<400>42Met Lys Arg Thr Leu Ser Gly Ile Ala Ser Ala Ala Ile Val Leu Gly-20 -15 -10Ala Ile Ser Pro Met Ala Phe Ala Gln Thr Ser Ser Ser Gly Leu Thr-5 -1 1 5Pro Ala Gly Gln Leu Pro Ile Val Val Asn Gly Gln Val Leu Ser Asn10 15 20Pro Tyr Glu Met Val Gly Met Asp Ser Gly Asn Lys Thr Gly Phe Phe25 30 35 40Pro Ile Tyr Tyr Phe Asp Gln Ala Leu Glu Lys Ile Gly Ile Thr Ala45 50 55Thr Trp Asn Gly Ala Thr His Thr Trp Ala Leu Thr Asp Ser Asn Val60 65 70Asn Ala Ser Asn Val Gln Val Ala Gly Gly Met Gly Thr Gly Asn Thr75 80 85Thr Val Thr Leu Asn Gly Thr Pro Ile Lys Met Phe Tyr Thr Gln Val90 95 100Ala Lys Asp Pro Ala Gly Gly Pro Val Thr Thr Tyr Met Pro Ile Tyr105 110 115 120Tyr Ile Asn Asn Ile Leu Ser Ala Leu Gly Ile His Gly Thr Phe Ser
125 130 135Gly Gln Thr Gly Leu Asn Ile Thr Thr Gly Gln Thr Leu Ala Gly Ser140 145 150Leu Ser Ala Ile Thr Val Thr Gly Ala Thr Ser Gly Thr Gly Thr Ser155 160 165Ser Ser Pro Ala Val Ala Leu Asn Asn Gly Lys Val Thr Leu Ser Thr170 175 180Thr Leu Thr Asp Ser Asn Gly Asn Pro Ile Gly Asn Ala Ala Val Thr185 190 195 200Phe Asn Phe Ser Glu Tyr Gly Ala Leu Pro Ser Asn Ala Pro Thr Val205 210 215Thr Asn Ala Ser Gly Ala Thr Ile Pro Ala Thr Thr Gly Ser Thr Ala220 225 230Tyr Gln Tyr Thr Val Tyr Thr Asn Ser Ser Gly Val Ala Ser Ile Thr235 240 245Val Ser Gly Pro Val Gly Leu Thr Tyr Ala Tyr Gln Val Thr Ala Thr250 255 260Ala Pro Ile Ser Asn Gly Ser Asn Gln Met Ile Ser Ser Gln Pro Ala265 270 275 280Tyr Val Glu Phe Val Ala Asn Asn Gln Ala Gly Ile Ala Pro Tyr Gly285 290 295Thr Ala Ser Gln Pro Tyr Ser Ala Ser Leu Gly Thr Ala Val Pro Ile
300 305 310Thr Val Ile Leu Pro Pro Gly Ala Asn Gly Gln Pro Gln Ala Asn Val315 320 325Leu Val Thr Leu Ser Leu Ser Asn Pro Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala330 335 340Tyr Phe Thr Asn Ser Ser Gly Ala Asn Leu Gly Thr Gln Ile Gln Val345 350 355 360Thr Thr Asn Ser Ser Gly Val Ala Gln Ala Trp Val Ser Asp Ala Asn365 370 375Ala Gln Pro Val Val Val Thr Ala Asn Val Ser Asn Ala Thr Asn Val380 385 390Ser Asn Thr Ser Val Ser Thr Tyr Leu Asn Phe Gly Gln Ala Gly Val395 400 405Pro Ala Ser Ile Ala Asn Tyr Asn Asp Pro Tyr Ser Ala Leu Val Ala410 415 420Asn Gly Gln Gln Pro Leu Ala Gly Thr Thr Val Thr Ile Thr Gly Thr425 430 435 440Leu Val Asp Ala Ala Gly Asn Pro Val Ala Asn Gly Gln Val Leu Val445 450 455Thr Gly Ser Ser Ser Ser Gly Asp Phe Gly Tyr Val Thr Thr Ser Asn460 465 470Gly Lys Ser Thr Thr Thr Asp Phe Pro Ser Val Gly Thr Leu Gln Pro
475 480 485Gly Gln Pro Val Ser Ser Ala Leu Gly Asp Val Ile Thr Ala Asp Ala490 495 500Asn Gly Asn Phe Ser Leu Gln Val Thr Asp Thr Gln Asn Glu Gln Ala505 510 515 520Ser Leu Thr Phe Tyr Ser Val Ser Asn Gly Val Ile Ser Pro Val Gly525 530 535Val Ile Lys Thr Asp Thr Leu Lys Phe Ala Val Asn Asn Gln Leu Ser540 545 550Thr Ile Ala Leu Gly Ala Thr Asp Ala Gln Ala Asp Gly Asn Gln Tyr555 560 565Thr Asn Leu Thr Gly Leu Thr Gly Ser Asp Asn Ala Pro Val Pro Val570 575 580Tyr Val Asp Pro Gln Asn Pro Ser Gly Thr Met Val Thr Asn Gln Ser585 590 595 600Ile Thr Tyr Thr Leu Ser Val Ser Ser Gly Asp Ile Val Gly Ile Gly605 610 615Ser Gly Ala Tyr Leu Ala Pro Thr Asn Ala Asn Asn Ser Thr Ile Pro620 625 630Ile Asn Ser Gly Asn Gly Leu Ser Ser Val Gln Val Thr Val Thr Ala635 640 645Leu Gly Asn Asn Gln Tyr Gln Ile Ser Val Pro Gly Gln Gln Gly Val
650 655 660Leu Thr Thr Ser Ser Pro Asp Phe Thr Val Leu Val Lys Gly Ser Thr665 670 675 680Gly Ser Thr Lys Leu Thr Val Ser Ser Gly Ser Leu Ser Ser Thr Ala685 690 695Thr Ile Thr Phe Thr Ser Ser Asn Pro Thr Val Val Ala Ser Leu Thr700 705 710Pro Val Ser Ser Val Leu Ala Ala Gly Gln Asn Glu Thr Val Thr Phe715 720 725Thr Val Glu Asp Ala Asp Gly Asn Pro Val Ser Gly Asn Thr Gln Val730 735 740Ala Ile Thr Ala His Asp Ser Asn Asp Pro Leu Trp Ile Thr Ala Val745 750 755 760Asn Gly Thr Asn Leu Ser Glu Tyr Glu Thr Ile Asn Gly Ala Ala Thr765 770 775Ser Val Ser Thr Pro Ile Pro Leu Gly Thr Ser Ser Tyr Ala Thr Ser780 785 790Gly Gly Ser Thr Leu Tyr Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Gly Tyr Phe Lys795 800 805Asn Gly Val Ser Ile Ser Gly Val Val Ser Trp Asp Gly Thr Val Gly810 815 820Asp Pro Ile Tyr Val Thr Thr Asn Ser Gln Gly Gln Val Thr Leu Thr
825 830 835 840Leu Gln Asn Gly Asn Val Thr Tyr Phe Asp Gly Asn Asn Thr Thr Leu845 850 855Ser Asn Gly Ile Ser Val Ala Gly Thr Ser Gly Ser Glu Gly Phe Tyr860 865 870Thr Tyr Ser Ser Asp Thr Ala Ala Thr Ala Ser Asp Leu Thr Asn Met875 880 885Gly Val Leu Val Ile Gly Gln Ala Asn Gly Asp Ala Ser Thr Ser Leu890 895 900Gly Thr Ile Tyr Ile Gly Ser Gly Gly Ala Thr Gln Thr Pro Ala Ala905 910 915 920Phe Thr Tyr Val Asp Ala Asn Asn His Ser Tyr Thr Tyr Ser Asn Thr925 930 935Ser Asp Thr Phe Thr Val Ser Ser Thr Gln Ser Val Ser Gly Gly Asn940 945 950Tyr Ala Ile Thr Ser Phe Thr Pro Val Gly Gly Thr Ala Thr Ser Thr955 960 965Ile Pro Ser Gly Val Ser Val Asn Ser Ser Thr Gly Thr Val Ser Val970 975 980Ser Gln Asn Ala Ala Val Gly Thr Tyr Thr Val Ser Tyr Tyr Leu Asn985 990 995 1000Gly Val Thr Glu Ser Thr Gly Thr Phe Lys Val Tyr Ser Gly Ser
1005 1010 1015Gly Val Ala Pro Thr Glu Ile Thr Gly Ser Ser Val Thr Val Pro1020 1025 1030Ala Ala Thr Tyr Ser Gly Thr Leu Lys Val Thr Val Ser Asn Gly1035 1040 1045Gly Ser Pro Leu Tyr Val Asn Val Thr Ala Gly Glu Ser Ala Asn1050 1055 1060Ala Val Ala Ala Ala Ile Tyr Asn Ala Leu Val Asn Ala Asn Ile1065 1070 1075Ser Gly Asp Thr Phe Ser Val Ser Gly Ser Thr Val Ser Val Thr1080 1085 1090Ala Ala Ser Gly Ser Pro Thr Leu Thr Val Val Asp Ala Thr Asn1095 1100 1105Phe<210>43<211>248<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(41)<220>
<221>mat_peptide<222>(42)..(248)<223>功能性多肽
<400>43Met Arg Ile Met Lys Val Leu Gly Trp Ile Leu Val Pro Tyr Ile Met-40 -35 -30Leu Phe Ile Gln Trp Gly Arg Met Asn Arg Ile Leu Arg Phe Ala Gly-25 -20 -15 -10Ser Leu Trp Ala Leu Ile Val Phe Ala Asn Thr Val Tyr Met Ile Arg-5 -1 1 5Gly Asn Thr Pro Arg Asn Ala Ser Thr Val Ser Ala Thr Thr Ser Leu10 15 20Val Asn Ser Thr Asn Ser Ser Gln Val Ala Lys Gln Glu Gln Asn Ser25 30 35Ser Thr Ser Pro Ala His Lys Ser Thr Asn Ser Leu Gln His Ala Gln40 45 50 55His Gln Ala Ala Thr Thr Ser Ser Ser Gln Ser Lys Leu Arg Tyr Ile60 65 70Pro Phe His Thr Tyr Gly Lys Val Gly Asp Leu Glu Ile Arg Val Asn75 80 85Ser Leu Gln Gln Val Lys Ser Val Gly Tyr Asp Gly Ile Gly Glu Thr90 95 100Ala Asn Gly Ala Phe Trp Val Ile Asn Ile Thr Ile Arg Asn Asp Gly105 110 115Ser Thr Pro Met Glu Val Val Asp Gly Ile Phe His Leu Gln Asn Leu
120 125 130 135Asn Gly Asn Val Tyr Gln Pro Asp Ser Thr Ala Glu Ile Tyr Ala Asn140 145 150Thr Asn Ser Gly Thr Ile Pro Thr Asp Leu Asn Pro Gly Val Ser Met155 160 165Thr Thr Asn Leu Val Phe Asp Met Pro Asp Phe Met Thr Tyr Gly His170 175 180Val Gly Gln His Tyr Ser Leu Val Ala Ser Met Gly Phe Phe Gly Ser185 190 195Asp Glu Thr Thr Tyr Ala Leu Pro200 205<210>44<211>172<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(25)<220>
<221>mat_peptide<222>(26)..(172)<223>功能性多肽<400>44Met Asn Arg Lys Ser Met Leu Ser Val Leu Gly Val Ala Ala Ala Val-25 -20 -15 -10Ala Leu Met Val Thr Gly Cys Gly Thr Ala Asn Ser Thr Asn Asn Thr
-5 -1 1 5Ala Ser Ser Gly Ala Ala Ser Thr Ala Val Thr Val Lys His Glu His10 15 20Lys Gly Ala Asn Ala Ser Lys Thr Glu Thr Lys Gln Thr Glu Ala Lys25 30 35Ser Ser Asn Lys Ala Gly Glu Thr Ala Lys Ser Ser Val Lys Leu Thr40 45 50 55Ala Pro Val Ala Gly Ala Thr Val Thr Ala Gly Gly Thr Leu Lys Val60 65 70Ser Gly Gln Val Ser Ser Asn Leu Ala Lys Lys Asp Val Gln Ile Thr75 80 85Leu Thr Asn Ser Ala Lys Lys Val Leu Val Gln Gln Ile Val Gly Thr90 95 100Asn Ser Thr Gly Ala Phe Val Asp Thr Leu Lys Leu Pro Lys Tyr Leu105 110 115Gly Lys Ala Gly Ser Asp Leu Thr Leu Ser Val Ser Val Val Gly Glu120 125 130 135Asn Gly Val Val Ser Thr Leu Ser Leu His Val Lys140 145<210>45<211>242<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属
<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(30)<220>
<221>mat_peptide<222>(31)..(242)<223>功能性多肽<400>45Met Arg Arg Ala Val Arg Ile Leu Ala Ala Leu Leu Phe Gly Leu Ala-30 -25 -20 -15Thr Val Thr Ala Thr Leu Met Phe Val Pro Gln Ala Arg Ala Ala Thr-10 -5 -1 1Val Thr Gly Ala Leu Ala Gln Ser Gln Val Val Ser Ile Thr Gly Gly5 10 15Tyr Asn Thr Thr Thr Gln Met Tyr Glu Gln Thr Gly Gln Gln Thr Val20 25 30Val Thr Asn Trp Thr Phe Ser Leu Gln Gln Thr Val Asn Gln Asn Asn35 40 45 50Glu Asn Pro Ser Tyr Ala Gln Cys Thr Val Leu Ala Gly Asn Gln Gln55 60 65Val Thr Cys Thr Ser Asp Ala Thr Asn Asn Gly Ala Ile Cys Thr Ser70 75 80Pro Tyr Pro Gly Ala Ile Asp Lys Gln Cys Thr Asn Leu Ile Gly Phe85 90 95
Thr Gly Asn Ile Ser Val Ser Ser Gln Asn Gly Asn Pro Thr Phe Thr100 105 110Phe Ser Leu Pro Ser Ile Asp Pro Ser Thr Met Lys Pro Val Gly Ile115 120 125 130Phe Val Thr Pro Glu Thr Ile Tyr Gly Gln Met Gly Thr Gly Ser Glu135 140 145Ser Tyr Leu Ser Ser Gly Gln Ser Gly Gly Trp Ser Phe Asn Phe Ser150 155 160Asn Val Ser Asp Pro Gln Asp Trp Tyr Phe Leu Leu Glu Phe Leu Ala165 170 175Asn Pro Ile Val Ala Ala Ile Ala Val Pro Thr Thr Gln Thr Val Pro180 185 190Ile Tyr Ser Trp Val Thr Thr Thr Val Trp His Pro Val Gln Ile Ser195 200 205 210Tyr Ser<210>46<211>180<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(24)<220>
<221>mat_peptide
<222>(25)..(180)<223>功能性多肽<400>46Val Val Arg Met Arg Lys Arg Leu Gly Leu Val Leu Ser Met Val Thr-20 -15 -10Ser Val Leu Val Gly Cys Gly Ala Ser His Pro Ser Pro Leu Asn Gln-5 -1 1 5Asp Lys Ser Leu Leu Thr Trp Asn Ala Ala Lys His Glu Val Arg Trp10 15 20Lys Val Val Ala Gly Asp Gly Arg Ala Asn Gly Gly Met Asn Phe Asp25 30 35 40Gly Tyr Ala Asn Gly Ser Met Thr Leu Val Val Pro Ile Gly Trp Arg45 50 55Val Val Ile Asp Phe Asp Asn Ala Ser Leu Met Pro His Ser Ala Met60 65 70Val Val Pro Tyr Gly Asp Arg Glu Arg Ser Asn Phe Asp Ala Thr Met75 80 85Val Ala Phe Pro Gly Ala Glu Thr Pro Asn Pro Ser Gln Gly Asp Pro90 95 100Gln Gly Thr His Arg Asp Val Ile Phe Thr Ala Ala Lys Val Gly Thr105 110 115 120Tyr Ala Leu Val Cys Gly Val Pro Gly His Ala Leu Ala Gly Met Trp125 130 135
Asp Gln Leu Val Val Ser Asp Glu Ala Lys His Pro Ser Leu Arg Val140 145 150Gln Arg Asp Ser155<210>47<211>477<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(25)<220>
<221>mat_peptide<222>(26)..(477)<223>功能性多肽<400>47Met Ala Val Arg Arg Ala Trp Leu Leu Ala Pro Leu Cys Ala Ser Ser-25 -20 -15 -10Leu Val Val Pro Ala Ser Val Gln Ala Gly Leu Ala Gln Gly His Gly-5 -1 1 5Ser Phe Ser Thr Val Arg Val Ser Val Gly Thr Ser Ser Ser Leu Ser10 15 20Val Pro Ala Leu Ile Gln Gly Asn Glu Thr Tyr Ile Pro Leu Trp Asp25 30 35Leu Met Gln Val Leu His Gln Leu Gly Phe Thr Ala Thr Trp Ala Lys40 45 50 55
Gly Gln Phe Ser Val Ser Ala Pro Pro Ser Val Pro Met Asp Glu Ala60 65 70Pro Gly Pro Ala Gly Lys Gly Gly Ala Leu Val Val Leu Asp Gly Gln75 80 85Val Val Glu Gln Val Pro Thr Val Ile Ala Thr Pro Pro Gly Ala Ala90 95 100Thr Pro Glu Val Phe Leu Pro Leu Thr Asn Ala Glu Glu Ile Leu Gly105 110 115Arg Leu Gly Ile Gln Ala Ser Ala Thr Gly Asn Gln Val Asn Leu Asp120 125 130 135Ala Ser Ala Val Pro Gln Ala Leu Pro Asn Gln Gln Val Ala Val Trp140 145 150Asn Val Leu Ala Ala Val Ala Ser Asp Leu Gly Val Ser Thr Ala Pro155 160 165Ala Gly Pro Ser Pro Tyr Ala Asp Leu Pro Thr Ala Ser Pro Ala Trp170 175 180Gly Ala Val Glu Ala Ala Ile Arg Leu Gly Trp Tyr Ser Pro Leu Ser185 190 195Ala Ser Ser Ser Gly Ala Phe Gln Pro Ile Thr Trp Ala Gln Thr Ala200 205 210 215Ser Ile Leu Trp Asn Ala Leu Gly Ile Ser Gln Gln Asp Ala Ala Tyr220 225 230
Gln Pro Gly Gly Ser Pro Thr Ala Trp Ala Ser Ala Leu Gly Leu Val235 240 245Pro Glu Asn Trp Asp Pro Ala Ser Tyr Met Thr Ala Gln Glu Leu Asp250 255 260Thr Leu Ala Ser Asn Leu His Glu Cys Leu Gln Gly Asp Val Glu Thr265 270 275Gly Ala Asn Thr Trp Arg Leu Trp Tyr Pro Pro Ala Asp Glu Val Glu280 285 290 295Ala Thr Leu Gln Ser Gly Gly Gly Gln Ser Leu Phe Thr Ser Thr Ala300 305 310Asp Ala Gln Ala Ala Ile Ser Ser Ala Tyr Gln Phe Phe Asn Gln Leu315 320 325Val Val Thr Arg Val Gly Gln Gly Tyr Val Val Thr Val Pro Ser Val330 335 340Pro Glu Gly Tyr Gly Phe Ala Thr Phe Ser Ala Leu Gly Gly Val Ala345 350 355Tyr Gln Thr Thr Pro Gly Gly Pro Trp Thr Val Val Pro Val Leu Asp360 365 370 375Thr Arg Asp Val Ser Ile Pro Ala Lys Gly Arg Leu Ser Val Lys Val380 385 390Pro Ala Gln Gly Ile Thr Ile Thr Trp Asn Gln Met Met Pro Ser Leu395 400 405
Gly Gly Thr Val Ala Met Gly Ala Leu Gln Val Ser Pro Gly Pro Ser410 415 420Gly Pro Ser Val Glu Arg Leu Asn Ile Val Thr Pro Asn Leu Pro Pro425 430 435Val Leu Pro Ser Ser Val Thr Ser Thr Gln Pro Gln Ser440 445 450<210>48<211>340<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(19)<220>
<221>mat_peptide<222>(20)..(340)<223>功能性多肽<400>48Met Asn Arg Gln Trp Arg Leu Ala Val Ala Thr Ser Ala Val Ala Ala-15 -10 -5Ser Leu Ala Gly Cys Gly Ala Pro Asp Leu Ala Ala Met Arg Pro Thr-1 1 5 10Val Gln Lys Ser Ala Val Leu Val Glu Val Val Gly Ala Pro Pro Phe15 20 25Ala Pro Ser Ala Ser Gln Leu Gly Thr Ala Gly Ala Thr Ser Val Glu
30 35 40 45Val Val His Val Ala Leu Gly Glu Trp Gln Ser Val Ala Ala His Ala50 55 60Leu Ala Lys Gly Gln Leu Thr Gly Val Met Val Val Cys Asp Asp Ala65 70 75Asn Ala Val Ala Ser Gly Leu Asn Gln Leu Ala Ala Asp His Pro Asp80 85 90Val Arg Phe Leu Val Val Ser Asn Trp Pro Ala Ser Gln Ile Thr Ser95 100 105Gly Asn Val Glu Asp Val Ala Gln Asp Pro Val Ala Val Ala Tyr Ser110 115 120 125Ile Gly Ala Leu Cys Gly Asp Trp Ile Ala Ser Ser Thr Ser Thr Ser130 135 140Gly Ala Val Tyr Ser Gly Val Pro Ser Ile Val Tyr Ala Pro Arg Gly145 150 155Ala Thr Val Ala Glu Gln Lys Ala Phe Phe Thr Gly Leu Tyr Gln Ala160 165 170Asn Pro Asn Val Arg Val Val Ala Leu Pro Gln Pro Ala Ala Gln Ser175 180 185Leu Ser Ser Tyr Gly Tyr Ala Val Asp Leu Gly Val Val Gly Gly Ser190 195 200 205Pro Ala Ala Gly Glu Leu Ser Ala Leu Arg Ser Ala Ala Pro Ala Trp
210 215 220Ala Ala Phe Gly Thr Ser Pro Ile Ala Gly Phe Ala Ile Ser Pro Gly225 230 235His Leu Ser Ser Ser Glu Ala Val Gln Ala Phe Gln Ala Leu Val Ser240 245 250Pro Asp Ala Trp His Ser Gly Glu His Leu Val Leu Asp Leu Ser Ser255 260 265Val Ala Phe Asp Asp Lys Gln Val Pro Ala Thr Val Ile Ala Ala Trp270 275 280 285Ala Lys Leu Glu Val Asn Ala Ile Ala Ala Ala Ala Gln Ser Asn Ala290 295 300Ala Phe Ala Ser Leu Pro Pro Ser Val Arg Ser Asp Leu Ala Asn Ala305 310 315Phe His Leu Ser320<210>49<211>341<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(29)<220>
<221>mat_peptide<222>(30)..(341)<223>功能性多肽
<400>49Met Val Met Arg Thr Arg Trp Ile Arg Trp Met Ala Leu Ala Leu Ala-25 -20 -15Val Cys Val Trp Leu Ser Pro Phe Pro Phe Ser Trp Gly Ala Thr Ser-10 -5 -1 1Leu Asp Ala Asp Leu Pro Gln Pro Thr Ile Pro Pro Ser Ala Trp Ser5 10 15Asn Leu Asn Gln Asp Trp Lys Asp Leu Gln Arg Leu Ala Gln Asn Thr20 25 30 35Val Pro Pro Ser Lys Glu Ser Ser Gln Thr His Ala Pro Thr His Lys40 45 50Ser Ser Gln Pro Pro Ala Gln Val Pro Gln Gly Pro Leu Val Gly Val55 60 65Gly Asp Thr Gly Glu Ala Ala Arg Trp Leu Asn Glu Ala Leu Ala Val70 75 80Leu Gly Tyr Leu Pro Ala Val Phe Ser Pro Ala Ala Gln Thr Ser Thr85 90 95Arg Gln Val Arg Leu Ala Leu Ala Ala Ser Ala Glu His Gln Thr Leu100 105 110 115Val Pro Ile Pro Gly Ser Phe Gln Leu Leu Tyr His Ala Pro Ser Ser120 125 130Trp Val Ala Leu Trp Ser Ala Asp Glu Asp Thr Pro Ile Thr Glu Gly
135 140 145Ala Val Met Ala Phe Glu Ala Gln His His Leu Gly Val Asp Gly Ile150 155 160Ala Gly Pro Asp Val Ile His Ala Leu Ala Gln Ala Leu Ala Gly Asn165 170 175Glu Thr Ala Glu Lys Ala Pro Tyr Ser Tyr Ile Leu Val Thr Thr Ser180 185 190 195Leu Pro Glu Thr Leu Glu Leu Trp Val Asn Gly Gln Leu Val Leu Lys200 205 210Ser Leu Cys Asn Thr Gly Ile Ala Gln Ser Pro Thr Pro Tyr Gly Thr215 220 225Tyr Gly Val Tyr Val Gln Tyr Thr Ser Gln Glu Met Lys Gly Lys Asp230 235 240Pro Asp Gly Thr Pro Tyr Asp Asp Pro Gly Val Pro Trp Val Ser Tyr245 250 255Phe Tyr Lys Gly Cys Ala Val His Gly Phe Leu Arg Ala Lys Tyr Gly260 265 270 275Phe Pro Gln Ser Leu Gly Cys Val Glu Leu Pro Tyr Ala Ala Ala Lys280 285 290Thr Val Phe Ser Tyr Thr His Ile Gly Thr Leu Val Thr Val Thr Ala295 300 305Ser Pro Leu Ser Ala310
<210>50<211>399<212>PRT<213>脂环酸芽孢杆菌属<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(28)<220>
<221>mat_peptide<222>(30)..(399)<223>功能性多肽<400>50Met Asp Arg Leu Leu Asn Asn Lys Val Ala Leu Arg Leu Thr Ala Leu-25 -20 -15Val Leu Ala Cys Ile Leu Trp Leu Ala Val His Ala Glu Gln Gly Ser-10 -5 -1 1Gly Ser Ser Ala Ser Thr Gly Val Thr Glu Ser Phe Glu Leu Pro Val5 10 15Arg Val Glu Thr Ser Ala Asp Glu Val Leu Val Ser Gln Val Pro Thr20 25 30 35Ile Thr Ala Arg Val Thr Thr Asn Leu Leu Ser Leu Pro Thr Leu Ala40 45 50Ser Asp Met Met Lys Ala Glu Ile Val Ala Asp Ala Glu Asn Leu Gly55 60 65Pro Gly Thr Tyr Thr Leu His Val Ala Ala Val Asn Met Pro Ala Gly
70 75 80Val Arg Ser Tyr Thr Leu Thr Pro Ser Thr Ile Thr Val Thr Leu Glu85 90 95Pro Lys Val Thr Val Glu Arg Thr Val Arg Val Asn Val Val Gly Thr100 105 110 115Pro Gly Gln Gly Tyr Val Leu Gly Lys Pro Glu Leu Gly Ala Gly Val120 125 130Val Glu Val Ser Gly Ala Glu Ser Ser Val Gln Ala Val Ala Glu Val135 140 145Ala Gly Val Val Asp Ala Ser Gly Leu Ser Gln Thr Ala Thr Lys Leu150 155 160Val Glu Leu Leu Pro Leu Asp Gln Ala Gly Lys Ala Val Pro Gly Val165 170 175Thr Val Thr Pro Ser Ala Ile Ser Val Thr Leu Pro Ile Thr Ser Ala180 185 190 195Asn Gln Ala Val Lys Leu Thr Pro Ala Val Thr Gly Ser Pro Ala Pro200 205 210Gly Tyr Ala Val Ala Ser Val His Leu Glu Pro Ala Ser Ala Val Glu215 220 225Gln Gly Leu Ala Ala Ser Gln Leu Pro Gln Arg Gly Leu Leu Val Pro230 235 240Ile Asp Val Thr Gly Leu Asn Arg Pro Thr Thr Val Ser Val Pro Val
245 250 255Pro Leu Leu Pro Gly Met Thr Ser Val Ser Pro Thr Ala Val Thr Ala260 265 270 275Val Ile Asp Val Glu Pro Ser Ala Val Tyr Thr Val Ser Asn Val Pro280 285 290Val Ala Ile Thr Gly Ala Thr Gly Val Lys Leu Val Thr Pro Arg Thr295 300 305Val Asn Val Thr Val Thr Gly Ile Glu Ala Asp Val Arg Ala Val Glu310 315 320Arg Asp Pro Ala Ala Val Gln Ala Phe Val Asp Ala Thr Gly Leu Thr325 330 335His Gly Ser Ala Thr Leu Pro Asp Ser Asn Ser Ser Ala Val Leu Ser340 345 350 355Leu Val Ile Arg Pro Arg Glu Arg Arg Lys Arg Thr His Val Val360 365 370<210>51<211>34<212>DNA<213>引物SigA2NotU-P<400>51tcgcgatccg ttttcgcatt tatcgtgaaa cgct 34<210>52<211>33<212>DNA<213>引物SigA2NotD-P
<400>52ccgcaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaa 33<210>53<211>20<212>DNA<213>引物A2up<400>53agcgtttgcg gccgcgatcc20<210>54<211>21<212>DNA<213>引物B<400>54ttattcggtc gaaaaggatc c 21<210>55<211>282<212>PRT<213>黑曲霉<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(18)<220>
<221>PROPEP<222>(19)..(59)<220>
<221>CHAIN<222>(60)..(98)<220>
<221>PROPEP
<222>(99)..(109)<220>
<221>CHAIN<222>(110)..(282)<220>
<221>MOD_RES<222>(110)..(110)<220>
<221>DISULFID<222>(115)..(139)<220>
<221>DISULFID<222>(127)..(210)<400>55Met Lys Phe Ser Thr Ile Leu Thr Gly Ser Leu Phe Ala Thr Ala Ala1 5 10 15Leu Ala Ala Pro Leu Thr Glu Lys Arg Arg Ala Arg Lys Glu Ala Arg20 25 30Ala Ala Gly Lys Arg His Ser Asn Pro Pro Tyr Ile Pro Gly Ser Asp35 40 45Lys Glu Ile Leu Lys Leu Asn Gly Thr Thr Asn Glu Glu Tyr Ser Ser50 55 60Asn Trp Ala Gly Ala Val Leu Ile Gly Asp Gly Tyr Thr Lys Val Thr65 70 75 80Gly Glu Phe Thr Val Pro Ser Val Ser Ala Gly Ser Ser Gly Ser Ser85 90 95
Gly Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Tyr Trp Lys Asn Lys Arg Gln Ser Glu100 105 110Glu Tyr Cys Ala Ser Ala Trp Val Gly Ile Asp Gly Asp Thr Cys Glu115 120 125Thr Ala Ile Leu Gln Thr Gly Val Asp Phe Cys Tyr Glu Asp Gly Gln130 135 140Thr Ser Tyr Asp Ala Trp Tyr Glu Trp Tyr Pro Asp Tyr Ala Tyr Asp145 150 155 160Phe Ser Asp Ile Thr Ile Ser Glu Gly Asp Ser Ile Lys Val Thr Val165 170 175Glu Ala Thr Ser Lys Ser Ser Gly Ser Ala Thr Val Glu Asn Leu Thr180 185 190Thr Gly Gln Ser Val Thr His Thr Phe Ser Gly Asn Val Glu Gly Asp195 200 205Leu Cys Glu Thr Asn Ala Glu Trp Ile Val Glu Asp Phe Glu Ser Gly210 215 220Asp Ser Leu Val Ala Phe Ala Asp Phe Gly Ser Val Thr Phe Thr Asn225 230 235 240Ala Glu Ala Thr Ser Gly Gly Ser Thr Val Gly Pro Ser Asp Ala Thr245 250 255Val Met Asp Ile Glu Gln Asp Gly Ser Val Leu Thr Glu Thr Ser Val260 265 270Ser Gly Asp Ser Val Thr Val Thr Tyr Val
275 280<210>56<211>252<212>PRT<213>核盘菌<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(252)<223>内肽酶EapC<400>56Met Lys Phe Ser Ile Val Ala Ala Thr Ala Leu Leu Ala Gly Ser Ala1 5 10 15Val Ala Ala Pro Gly Thr Ala Leu Arg Gln Ala Arg Ala Val Lys Arg20 25 30Ala Ala Arg Thr His Gly Asn Pro Val Lys Tyr Val Glu Gly Pro Thr35 40 45Asn Lys Thr Asp Val Ser Tyr Ser Ser Asn Trp Ala Gly Ala Val Leu50 55 60Val Gly Thr Gly Tyr Thr Ser Val Thr Gly Thr Phe Thr Ala Pro Ser65 70 75 80Pro Ser Thr Ala Gly Ser Gly Ser Ala Trp Val Gly Ile Asp Gly Asp85 90 95Thr Cys Gly Thr Ala Ile Leu Gln Thr Gly Ile Asp Trp Asp Lys Ser100 105 110
Gly Asn Ser Ile Thr Tyr Asp Ala Trp Tyr Glu Trp Tyr Pro Asp Tyr115 120 125Ala Tyr Asp Phe Ser Gly Ile Ser Ile Ser Ala Gly Asp Ser Ile Lys130 135 140Val Thr Val Thr Ala Ser Ser Lys Thr Thr Gly Thr Ala Thr Val Asp145 150 155 160Asn Leu Thr Lys Gly Lys Ser Val Thr His Thr Phe Ser Gly Gly Val165 170 175Asp Gly Asp Leu Cys Glu Tyr Asn Ala Glu Trp Ile Val Glu Asp Phe180 185 190Glu Glu Gly Ser Ser Leu Val Gln Phe Ala Asn Phe Gly Thr Val Thr195 200 205Phe Thr Gly Ala Ser Ala Thr Gln Asn Gly Glu Ser Val Gly Val Thr210 215 220Gly Ala Gln Ile Ile Asp Leu Gln Gln Asn Ser Val Leu Thr Ser Val225 230 235 240Ser Thr Ser Ser Asn Ser Val Thr Val Lys Tyr Val245 250<210>57<211>269<212>PRT<213>Cryphonectria parasitica<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(269)
<223>内肽酶EapC<400>57Met Lys Tyr Ala Thr Val Val Ala Ala Leu Leu Gly Ala Asn Ala Ala1 5 10 15Leu Gly Ala Arg Phe Thr Glu Lys Arg Arg Glu Arg Asn Glu Ala Arg20 25 30Leu Ala Arg Arg Ser Gly Ser Val Arg Leu Pro Ala Thr Asn Ser Glu35 40 45Gly Val Ala Ile Asp Ala Ala Glu Ser Arg Asn Asp Thr Thr Asn Val50 55 60Glu Tyr Ser Ser Asn Trp Ala Gly Ala Val Leu Ile Gly Ser Gly Tyr65 70 75 80Lys Ser Val Thr Gly Ile Phe Val Val Pro Thr Pro Lys Ser Pro Gly85 90 95Ser Gly Asn Thr Glu Tyr Ala Ala Ser Ala Trp Val Gly Ile Asp Gly100 105 110Asp Thr Ala Gln Asn Ser Ile Leu Gln Thr Gly Val Asp Phe Tyr Val115 120 125Glu Gly Ser Ser Val Ala Tyr Asp Ala Trp Tyr Glu Trp Tyr Pro Asp130 135 140Tyr Ala Tyr Asp Phe Ser Gly Ile Ser Ile Ser Ala Gly Asp Thr Ile145 150 155 160
Lys Val Thr Val Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ser Gly Thr Ala Val Val165 170 175Glu Asn Val Thr Lys Gly Thr Thr Val Thr His Thr Phe Thr Gly Gln180 185 190Ser Ala Ala Leu Gln Glu Leu Asn Ala Glu Trp Ile Val Glu Asp Phe195 200 205Glu Glu Gly Asp Glu Leu Val Pro Phe Ala Asn Phe Gly Thr Val Thr210 215 220Phe Thr Gly Ala Glu Ala Thr Thr Ser Ser Gly Thr Val Thr Ala Ala225 230 235 240Asp Ala Thr Leu Ile Asp Ile Glu Gln Asn Gly Glu Val Leu Thr Ser245 250 255Val Thr Val Ser Gly Ser Thr Val Thr Val Lys Tyr Val260 265<210>58<211>204<212>PRT<213>Scytalidium lignicolum<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(204)<223>scytalidoglutamic肽酶<400>58Thr Val Glu Ser Asn Trp Gly Gly Ala Ile Leu Ile Gly Ser Asp Phe1 5 10 15
Asp Thr Val Ser Ala Thr Ala Asn Val Pro Ser Ala Thr Gly Ala Ser20 25 30Gly Gly Ser Ser Ala Ala Trp Val Gly Ile Asp Gly Asp Thr Cys Gln35 40 45Thr Ala Ile Leu Gln Thr Gly Phe Asp Trp Tyr Gly Asp Gly Thr Tyr50 55 60Asp Ala Trp Tyr Glu Trp Tyr Pro Glu Val Ser Asp Asp Phe Ser Gly65 70 75 80Ile Thr Ile Ser Glu Gly Asp Ser Ile Gln Met Ser Val Thr Ala Thr85 90 95Ser Asp Thr Ser Gly Ser Ala Thr Leu Glu Asn Leu Thr Thr Gly Gln100 105 110Lys Val Ser Lys Ser Phe Ser Asn Glu Ser Ser Gly Leu Cys Arg Thr115 120 125Asn Ala Glu Phe Ile Ile Glu Asp Phe Glu Glu Cys Asn Ser Asp Gly130 135 140Ser Asp Glu Phe Val Pro Phe Ala Ser Phe Ser Pro Ala Val Glu Phe145 150 155 160Thr Asp Cys Ser Val Thr Ser Asp Gly Glu Ser Val Ser Leu Asp Asp165 170 175Ala Gln Ile Thr Gln Val Ile Ile Asn Asn Gln Asp Val Thr Asp Cys180 185 190Ser Val Ser Gly Thr Thr Val Ser Cys Ser Tyr Val
195 200<210>59<211>268<212>PRT<213>Cryphonectria parasitica<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(268)<223>内肽酶EapB<400>59Met Lys Tyr Thr Ala Ala Leu Ala Ala Leu Val Thr Leu Ala Ala Ala1 5 10 15Ala Pro Thr Asp Gly Ile Ile Asp Ile Gly Asp Gly Val Lys Leu Val20 25 30Pro Arg Glu Pro Arg Ala His Thr Arg Leu Glu Arg Leu Arg Thr Phe35 40 45Arg Arg Gly Leu Met Glu Gly Leu Glu Ser Gly Glu Arg Asn Ser Ser50 55 60Asp Val Ser Tyr Asp Ser Asn Trp Ala Gly Ala Val Lys Ile Gly Thr65 70 75 80Gly Leu Asn Asp Val Thr Gly Thr Ile Val Val Pro Thr Pro Ser Val85 90 95Pro Ser Gly Gly Ser Ser Thr Ala Lys Tyr Ala Ala Ser Ala Trp Val100 105 110
Gly Ile Asp Gly Asp Thr Cys Thr Ser Ala Ile Leu Gln Thr Gly Val115 120 125Asp Phe Tyr Ala Gly Arg Gly Gly Val Ser Phe Asp Ala Trp Tyr Glu130 135 140Trp Tyr Pro Asn Tyr Ala Tyr Asp Phe Ser Gly Phe Ser Val Ser Ala145 150 155 160Gly Asp Thr Ile Val Met Thr Ala Ser Ala Ser Ser Leu Lys Ala Gly165 170 175Thr Val Thr Leu Glu Asn Ser Thr Thr Gly Lys Lys Val Thr Gln Ser180 185 190Phe Ser Ala Glu Ser Ser Glu Leu Cys Glu Tyr Asn Ala Glu Trp Ile195 200 205Val Glu Asp Phe Glu Ser Gly Ser Ser Leu Val Asn Phe Ala Asp Phe210 215 220Asp Thr Val Thr Phe Lys Asp Cys Ser Pro Ser Val Ser Gly Ser Thr225 230 235 240Ile Val Asp Ile Arg Gln Ser Leu Glu Val Leu Thr Glu Cys Ser Thr245 250 255Thr Gly Thr Thr Thr Val Thr Cys Glu Tyr Val Gly260 265<210>60<211>147<212>PRT<213>埃默森篮状菌
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(147)<400>60Asn Trp Ala Gly Ala Val Leu Thr Ser Pro Pro Ser Gly Ser Thr Phe1 5 10 15Thr Ser Val Ser Ala Gln Phe Thr Val Pro Ser Pro Ser Leu Pro Gln20 25 30Gly Ser Gln Gln Ala Ser Ser Ala Ser Ala Trp Val Gly Ile Asp Gly35 40 45Asp Thr Tyr Thr Asn Ala Ile Leu Gln Thr Gly Val Asp Phe Asn Val50 55 60Asp Thr Asn Gly Gln Val Ser Tyr Asp Ala Trp Tyr Glu Trp Tyr Pro65 70 75 80Asp Tyr Ala His Asp Phe Thr Gly Ile Ser Phe Gln Ser Gly Asp Val85 90 95Val Ser Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Asn Ser Glu Gly Thr Ala Val100 105 110Ile Glu Asn Leu Thr Asn Gly Gln Lys Val Thr Lys Thr Leu Ser Ala115 120 125Pro Ser Ser Ser Ala Thr Leu Gly Gly Gln Asn Ala Glu Trp Ile Val130 135 140Glu Asp Phe14权利要求
1.分离的成熟功能性多肽，其与可从以保藏号DSM 15716保藏的脂环酸芽孢杆菌属细菌获得的相应分泌多肽具有至少90％的同一性并表现相同的功能。
2.细菌谷氨酸肽酶(EC 3.4.23.19)。
3.权利要求1的多肽，所述多肽选自(a)含有与SEQ ID NO26到SEQ ID NO50所包含成熟多肽的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列在高严格条件下与选自以下的多核苷酸探针杂交(i)编码成熟多肽的SEQ ID NO1到SEQ ID NO25区域的核苷酸序列的互补链；(ii)编码成熟多肽的SEQ ID NO1到SEQ ID NO25区域的核苷酸序列中所包含cDNA序列的互补链；(c)SEQ ID NO26到SEQ ID NO50中所包含成熟多肽的片段，且其中该多肽具有SEQ ID NO26到SEQ ID NO50中所包含的相应成熟多肽的功能。
4.权利要求1的多肽，其中该多肽为具有选自以下功能的酶酸性内切葡聚糖酶、酸性纤维素酶、天冬氨酰蛋白酶、多铜氧化酶、丝氨酸羧基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、HtrA样丝氨酸蛋白酶、二硫化物异构酶、γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶、内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、肽酰脯氨酰异构酶、酸性磷酸酯酶、植酸酶、磷脂酶C、多糖脱乙酰酶、木聚糖脱乙酰酶和亚硫酸盐氧化酶。
5.权利要求4的酶，其选自(a)含有与SEQ ID NO26到SEQ ID NO40所包含成熟多肽的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的酶；(b)由核苷酸序列编码的酶，所述核苷酸序列在高严格条件下与选自以下的多核苷酸探针杂交，所述多核苷酸探针选自(i)编码成熟酶的SEQ ID NO1到SEQ ID NO15区域的核苷酸序列的互补链；(ii)编码成熟多肽的SEQ ID NO1到SEQ ID NO15区域的核苷酸序列中所包含cDNA序列的互补链；(c)SEQ ID NO26到SEQ ID NO40中所包含成熟酶的片段，且其中该酶具有SEQ ID NO26到SEQ ID NO40中所包含的相应成熟多肽的功能。
6.权利要求1的多肽，其中严格度条件非常高。
7.权利要求1的多肽，其中编码多肽的多核苷酸由选自编码成熟多肽的SEQ ID NO1到SEQ ID NO25区域的核苷酸序列或由于遗传密码简并性而与之不同的序列组成。
8.权利要求4的酶，其表征为从以保藏号DSM 15716保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株获得的酸性内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶。
9.权利要求8的酸性内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶，其包含SEQ IDNO26包含的成熟酸性内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶或由其组成。
10.权利要求9的酸性内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶，其包含SEQ IDNO26位置25到959的序列或由其组成。
11.权利要求2的谷氨酸肽酶，其表征为蛋白酶结构中不含二硫键。
12.权利要求2中的谷氨酸肽酶，可从以保藏号DSM 15716保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株获得。
13.权利要求12的谷氨酸肽酶，其包含SEQ ID NO27中包含的成熟天冬氨酰蛋白酶或由其组成。
14.权利要求13的谷氨酸肽酶，其包含SEQ ID NO27位置33到272的序列或由其组成。
15.权利要求4的酶，其表征为可从以保藏号DSM 15716保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株获得的多铜氧化酶。
16.权利要求15的多铜氧化酶，其包含SEQ ID NO28或SEQ ID NO35中包含的成熟多铜氧化酶或由其组成。
17.权利要求16的谷氨酸肽酶，其包含SEQ ID NO28位置26到315或SEQ ID NO35位置50到597的序列或由其组成。
18.权利要求4的酶，表征为可从以保藏号DSM 15716保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株获得的丝氨酸羧基蛋白酶。
19.权利要求18的丝氨酸羧基蛋白酶，其包含SEQ ID NO29或SEQID NO30中包含的成熟丝氨酸羧基蛋白酶或由其组成。
20.权利要求19的丝氨酸羧基蛋白酶，其包含SEQ ID NO29位置190到626或SEQ ID NO30位置25到533的序列或由其组成。
21.权利要求4的酶，表征为可从以保藏号DSM 15716保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株获得的氨酸蛋白酶或HtrA样丝氨酸蛋白酶。
22.权利要求21的丝氨酸蛋白酶或HtrA样丝氨酸蛋白酶，其包含SEQ ID NO31中包含的成熟丝氨酸蛋白酶或HtrA样丝氨酸蛋白酶或由其组成。
23.权利要求22的丝氨酸蛋白酶或HtrA样丝氨酸蛋白酶，其包含SEQID NO31位置42到411的序列或由其组成。
24.权利要求4的酶，表征为可从以保藏号DSM 15716保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株获得的二硫化物异构酶。
25.权利要求24的二硫化物异构酶，其包含SEQ ID NO32中包含的成熟二硫化物异构酶或由其组成。
26.权利要求25的二硫化物异构酶，其包含SEQ ID NO32位置42到411的序列或由其组成。
27.权利要求4的酶，表征为可从以保藏号DSM 15716保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株获得的γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸。
28.权利要求27的γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸，其包含SEQ ID NO33中包含的成熟γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸或由其组成。
29.权利要求28的γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸，其包含SEQ ID NO33从位置30到266的序列或由其组成。
30.权利要求4的酶，表征为可从以保藏号DSM 15716保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株获得的内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶。
31.权利要求30的内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶，其包含SEQ ID NO34中包含的成熟内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶或由其组成。
32.权利要求31的内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶，其包含SEQ ID NO34位置27到768的序列或由其组成。
33.权利要求4的酶，表征为可从以保藏号DSM 15716保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株获得的肽酰脯氨酰异构酶。
34.权利要求33的肽酰脯氨酰异构酶，其包含SEQ ID NO36中包含的成熟肽酰脯氨酰异构酶或由其组成。
35.权利要求34的肽酰脯氨酰异构酶，其包含SEQ ID NO36从位置30到246的序列或由其组成。
36.权利要求4的酶，表征为可从以保藏号DSM 15716保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株获得的酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C。
37.权利要求36的酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C，其包含SEQ IDNO37中包含的成熟酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C或由其组成。
38.权利要求37的酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C，其包含SEQ IDNO37位置28到608的序列或由其组成。
39.权利要求4的酶，表征为可从以保藏号DSM 15716保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株获得的多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶。
40.权利要求39的多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶，其包含SEQ IDNO38或SEQ ID NO39中包含的成熟多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶或由其组成。
41.权利要求40的多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶，其包含SEQ IDNO38位置26到251或SEQ ID NO39位置22到324的序列或由其组成。
42.分离的酶，其选自(a)含有下述氨基酸序列的酶，所述氨基酸序列与以DSM保藏号15716保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株分泌的选自酸性内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶、天冬氨酰蛋白酶、多铜氧化酶、丝氨酸羧基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或HtrA样丝氨酸蛋白酶、二硫化物异构酶、γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶、内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、肽酰脯氨酰异构酶、酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C、多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶和亚硫酸盐氧化酶的成熟酶氨基酸序列具有至少90％同一性；(b)由在高严格度条件下与下述多核苷酸探针杂交的核苷酸序列所编码的多肽，所述多核苷酸探针选自(i)以DSM保藏号15716保藏的脂环酸芽孢杆菌包含的核苷酸序列的互补链，所述核苷酸序列编码由该菌株分泌的选自酸性内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶、天冬氨酰蛋白酶、多铜氧化酶、丝氨酸羧基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或HtrA样丝氨酸蛋白酶、二硫化物异构酶、γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶、内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、肽酰脯氨酰异构酶、酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C、多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶和亚硫酸盐氧化酶的成熟酶；(ii)以DSM保藏号15716保藏的脂环酸芽孢杆菌包含的核苷酸序列包含的cDNA序列的互补链，所述核苷酸序列编码由该菌株分泌的选自酸性内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶、天冬氨酰蛋白酶、多铜氧化酶、丝氨酸羧基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或HtrA样丝氨酸蛋白酶、二硫化物异构酶、γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶、内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、肽酰脯氨酰异构酶、酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C、多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶和亚硫酸盐氧化酶的成熟酶，(c)成熟酶片段，所述酶为以DSM保藏号15716保藏的脂环酸芽孢杆菌菌株分泌的选自酸性内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶、天冬氨酰蛋白酶、多铜氧化酶、丝氨酸羧基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或HtrA样丝氨酸蛋白酶、二硫化物异构酶、γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶、内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、肽酰脯氨酰异构酶、酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C、多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶和亚硫酸盐氧化酶；其中该酶具有选自酸性内切葡聚糖酶或酸性纤维素酶、天冬氨酰蛋白酶、多铜氧化酶、丝氨酸羧基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或HtrA样丝氨酸蛋白酶、二硫化物异构酶、γ-D-谷氨酰-L-二氨基酸内肽酶、内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、肽酰脯氨酰异构酶、酸性磷酸酯酶或植酸酶或磷脂酶C、多糖脱乙酰酶或木聚糖脱乙酰酶和亚硫酸盐氧化酶的功能。
43.以保藏号DSM 15716保藏的细菌菌株。
44.含有权利要求1-42的多肽的组合物。
45.权利要求44的组合物，包含至少两种权利要求1-42的不同多肽，优选至少3种，更优选至少5种，更优选至少10种，更优选至少15种，更优选至少20种权利要求1-42的不同多肽。
46.权利要求44的组合物，包含发酵脂环酸芽孢杆菌DSM 15716或其突变体样品时分泌的所有多肽，所述突变体中缺失或添加了一个或多个基因。
47.权利要求44的组合物，其还包含一个或多个额外的酶。
48.权利要求44的组合物，表征为除多肽外还含有表面活性剂的洗涤剂组合物。
49.权利要求44的组合物，表征为除多肽外还含有谷类或谷物产品的饲料组合物。
50.权利要求44的组合物，表征为食品组合物。
51.权利要求44的组合物，还包含多糖或多糖混合物。
52.制备权利要求44的组合物的方法，包括将权利要求1-42的多肽与赋形剂混和。
53.多核苷酸，其具有编码权利要求1-42中任一项定义的多肽的核苷酸序列。
54.包含权利要求53的多核苷酸的组合物。
55.包含权利要求53定义的核苷酸序列的核酸构建体，所述核苷酸序列与一个或多个指导多肽在宿主细胞中产生的控制序列有效连接。
56.包含权利要求55的核酸构建体的重组表达载体。
57.包含权利要求55的核酸构建体的重组宿主细胞。
58.用于产生权利要求1-42的多肽的方法，包括(a)培养菌株以产生多肽，所述菌株的野生型形式能够产生该多肽；和(b)回收该多肽。
59.用于产生权利要求1-42的多肽的方法，包括(a)在有助于产生多肽的条件下培养权利要求45定义的重组宿主细胞；和(b)回收多肽。
60.权利要求59的方法，包括(i)将脂环酸芽孢杆菌DSM 15716基因组的基因与编码无信号报告子的基因通过转座子标签融合，(ii)在显示报告子存在的培养基中培养含有脂环酸芽孢杆菌DSM 15716融合基因的宿主细胞克隆，(iii)检测分泌报告子的克隆和(iv)分离该克隆中含有的脂环酸芽孢杆菌DSM 15716的基因和多肽。
61.适用于电子设备的存储媒体，其包含权利要求1-42的多肽的氨基酸序列或权利要求53的多核苷酸的核苷酸序列的信息。
62.包括在工业或家庭技术方法中使用权利要求1-42的多肽或权利要求53的多核苷酸的方法。
全文摘要
公开了分离的成熟功能性多肽，其与可得自以保藏号DSM 15716保藏的细菌脂环酸芽孢杆菌的相应分泌多肽有至少90％的同一性并表现相同的功能。
文档编号C12N15/53GK1930285SQ200580007078
公开日2007年3月14日 申请日期2005年1月6日 优先权日2004年1月6日
发明者R·惠尔廷, S·F·拉森, P·R·奥斯特伽德 申请人:诺和酶股份有限公司