专利名称：鼻腔喷雾型流感病毒灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种鼻腔喷雾型流感病毒灭活疫苗及其制备方法，属于药物制剂领域。
背景技术：
流行性感冒(流感)具有发生突然，传播迅速的特点，小则局部流行，大则遍及全球，同时易引起并发症，严重者可导致死亡，危害性很大。免疫接种是预防流感的有效方法，流感的预防一直是全球性的公共卫生问题，应用流感疫苗进行免疫预防受到越来越多的重视。
上一世纪全球曾发生3次流感大流行1918-1919年的西班牙流感；1957年的亚洲流感；1968年的香港流感。1918-1919年的西班牙流感流行，仅11个月造成约5000万人死亡。目前世界卫生组织(WHO)发出警告禽流感H5N1可能是下次流感大流行的毒株。
流感病毒灭活疫苗肌肉接种免疫副反应较重，不利于大范围尤其是儿童、老人或体弱者接种，而鼻腔接种具有良好的耐受性，较低的副反应，可以用于儿童、成人和老年人，而且使用方便，可以自行接种，可以大面积人群中应用，是目前国际上改进流感的疫苗的方向。
目前市场上出售的流感灭活疫苗均是需注射接种的疫苗。即便是裂解型流感疫苗，在广大人群中注射接种时，仍存在很大的不方便，而且费用较高，不利于更好的推广。如能将流感灭活疫苗制成鼻腔喷雾剂型，则不仅能够提高疫苗接种的方便性，而且利于降低接种者的医疗成本，达到更好的推广接种疫苗的目的。
鼻腔生理功能是空气在到达下呼吸道之前空气进行过滤，加温和加湿。任何吸入的颗粒或微生物可被鼻前庭或覆盖鼻腔呼吸道区域的粘液层所俘获。有粘膜纤毛的清洁机制，粘液层将逐渐携带这些颗粒到咽背部，下到食道，或进一步到胃肠道。此外，鼻粘膜还有代谢功能，能帮助将内在物质转变成易于排除的物质。
鼻中隔将人的鼻腔分成两个不相连接的部分。每部分由如下3个区域组成第一，鼻前庭，由鼻孔的内面区域所组成，约为0.6cm2；第二，嗅觉区，在人类位于鼻腔的顶部，仅为整个鼻区(1502cm)的10％左右，而在犬，占77％；第三，呼吸区，即为鼻腔的其它区域。呼吸区由3个鼻甲组成，上鼻甲，中鼻甲和下鼻甲，它们成为每半个鼻腔的外壁。这种螺旋形的鼻甲可使吸入的气流更好地与鼻粘膜表面接触。
同样，在所有的动物膜型上，鼻器官均有类似的前庭结构。鼻前庭覆盖有分层的鳞状上皮细胞，并逐渐转变成伪成层的柱状上皮细胞，后者覆盖有呼吸道上皮细胞。呼吸道上皮细胞表面有微纤毛，这些细胞的主要部分同样覆盖有纤毛。这些纤毛是长度为4-6mm的细薄突起，能够运动，每分钟颤动的频率为1000次。每根纤毛的颤动造成很快的向前运动。纤毛的顶端可到达粘液层，粘液层的运动方向是从鼻腔的前到鼻腔后部。粘液流动的速率为5mm/分，因此，粘液层每15-20分钟更新1次。鼻咽部还有丰富的淋巴组织。
肽或蛋白质在鼻腔或在通过粘膜屏障时被酶所降解。此处均含有外肽酶(exopeptidases)，如单和双氨肽酶，它能在肽的N和C端切断分子，以及内肽酶(endopeptidases)，如丝氨酸和半胱氨酸，它能破坏内肽结合。肽的降解半衰期为30分钟。
流感病毒是通过呼吸道粘膜入侵的，是鼻腔疫苗接种的良好对象。鼻道富有淋巴样组织，是鼻腔接种疫苗的靶部位，即鼻相关淋巴样组织(NALT)，它主要位于咽部的淋巴样组织环，称为Waldeyer氏环。所以鼻腔免疫的优点是1.鼻粘膜是接触抗原的首先部位2.鼻腔富有淋巴组织(鼻相关淋巴组织NALT)即Waldeyer环3.腺样的或鼻咽扁桃腺4.双侧淋巴带5.双侧管和面或颚扁桃腺6.双侧舌扁桃腺7可产生局部粘膜免疫(sIgA)和系统免疫(IgG)反应8.价格低，病人方面，非注射，安全在我们的流感病毒灭活疫苗鼻腔喷雾剂的组方中添加了一定浓度的生物粘附多糖-壳聚糖。壳聚糖是一种带阳电荷的线性多糖，它是一种生物粘附物质，能够与鼻上皮细胞及其粘液层起强烈作用，以保证在被粘膜纤毛清除之前使药物搬运通过鼻粘膜。此外，壳聚糖还可通过上皮细胞之间紧密连接处的暂时开放而增加极性药物细胞旁路搬运的能力。
在我们的流感病毒灭活疫苗鼻腔喷雾剂的组方中还添加了一定浓度的重组人白细胞介素-2，后者的作用有二一是作为安全的局部免疫佐剂；二是扩张血管，增加了抗原的免疫原性。
因此，本发明中的流感病毒抗原与人白细胞介素-2和天然多糖在药物的组方中存在着十分有效的协同作用，既增加了病毒抗原在鼻腔中的停留时间，又增加了抗原的免疫原性，从而显著的增加了疫苗的有效性，揭示了本发明疫苗组成方案能够很好的应用于鼻腔接种生物大分子，在刺激机体产生呼吸道局部(粘膜)免疫反应和系统免疫反应的同时，具有很好的预防流感病毒感染的保护效果。
这种流感病毒灭活疫苗喷雾剂的组方在文献上未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鼻腔喷雾型流感病毒灭活疫苗。
本发明的另一目的在于提供上述鼻腔喷雾型流感病毒灭活疫苗的制备方法。
本发明所述的鼻腔喷雾型流感病毒灭活疫苗含有以下组分细胞免疫因子、天然多糖、流感病毒抗原。
上述细胞免疫因子可以是人白细胞介素、重组人白细胞介素、人干扰素、重组人干扰素。优选人白细胞介素-2或重组人白细胞介素-2。
天然多糖可以是纤维素、淀粉、几丁质、壳聚糖及其衍生物，或者可以选择前述天然多糖的任意组合，这些组合在不同程度上均能达到本发明产品所具有的作用。优选使用几丁质、壳聚糖。
本发明所述的鼻腔喷雾型流感病毒灭活疫苗含有的流感病毒抗原包括全病毒抗原、裂解病毒抗原或病毒亚单位抗原。优选裂解病毒抗原。流感病毒抗原是根据WHO推荐的病毒株组成，既可以自行制备，也可以直接购买得到。
裂解病毒的制备方法已是成熟的工艺，国内外均已商品化，包括单价裂解病毒和三价裂解病毒。本发明的目的是应用现有技术中已有的裂解病毒与天然多糖及其它辅料混配，制备适合于鼻腔吸收的喷雾药剂。
以上组分在最终制剂中的重量含量为
细胞免疫因子104-106单位/L天然多糖0.1-10％流感病毒抗原30-70％其余部分为缓冲溶液。
优选含量为细胞免疫因子104-106单位/L天然多糖0.5-5％流感病毒抗原40-60％其余部分为缓冲溶液。
最优选含量为细胞免疫因子105单位/L天然多糖1％流感病毒抗原50％其余部分为缓冲溶液。
所述的缓冲溶液为pH为7的磷酸缓冲溶液；所述的磷酸缓冲溶液可以进一步含有0.05-0.10％重量比的人血清白蛋白，作为疫苗抗原成分的保护剂。
所述的磷酸缓冲溶液可以进一步含有药剂学上可以接受的辅料，例如，苯甲醇、甘露醇等等，辅料总含量为0.1-5％重量比。
本发明所述的缓冲溶液不含任何对鼻粘膜有刺激性的防腐剂。
本发明所述的鼻腔喷雾型流感病毒灭活疫苗的制备方法是将上述组分细胞免疫因子、天然多糖、流感病毒抗原按照药剂学中描述的鼻腔喷雾剂制备方法进行操作。
上述方法中的细胞免疫因子可以是人白细胞介素、重组人白细胞介素、人干扰素、重组人干扰素。优选人白细胞介素-2或重组人白细胞介素-2。
上述方法中的天然多糖可以是纤维素、淀粉、几丁质、壳聚糖及其衍生物，或者可以选择前述天然多糖的任意组合，这些组合在不同程度上均能达到本发明产品所具有的作用。优选使用几丁质、壳聚糖。
上述方法中的流感病毒抗原包括全病毒抗原、裂解病毒抗原或病毒亚单位抗原。优选裂解病毒抗原。流感病毒抗原是根据WHO推荐的病毒株组成，既可以自行制备，也可以直接购买得到。
裂解病毒的制备方法已是成熟的工艺，国内外均已商品化，包括单价裂解病毒和三价裂解病毒。本发明的目的是应用现有技术中已有的裂解病毒与天然多糖及其它辅料混配，制备适合于鼻腔吸收的喷雾药剂。
以上组分在最终制剂中的重量含量为细胞免疫因子104-106单位/L天然多糖。
0.1-10％流感病毒抗原30-70％其余部分为缓冲溶液。
优选含量为细胞免疫因子104-106单位/L天然多糖0.5-5％流感病毒抗原40-60％其余部分为缓冲溶液。
最优选含量为细胞免疫因子105单位/L天然多糖1％流感病毒抗原50％其余部分为缓冲溶液。
所述的缓冲溶液为pH为7的磷酸缓冲溶液；所述的磷酸缓冲溶液可以进一步含有0.05-0.10％重量比的人血清白蛋白，作为疫苗抗原成分的保护剂。
所述的磷酸缓冲溶液可以进一步含有药剂学上可以接受的辅料，例如，苯甲醇、甘露醇等等，辅料总含量为0.1-5％重量比。
本发明所述的缓冲溶液不含任何对鼻粘膜有刺激性的防腐剂。
流感病毒培养法有两种，即细胞培养法和鸡胚培养法；细胞培养法具有培养量大的优势，收获液病毒血凝效价可达到1∶256；鸡胚培养法的培养效率相对较高，收获液血凝效价可达1∶640甚至超过1∶1000。
本发明流感病毒抗原的制备按照以下过程进行种子库建立、病毒培养和收获、病毒灭活、病毒纯化、病毒裂解、病毒膜抗原醇化、裂解剂去除(单价疫苗原液)、混合配制。
本发明流感病毒抗原也可以直接商购得到。
本发明产品的制备方法中各组分不同浓度的配互是经过多次研究的最佳组合。可以产生最佳的免疫效果。
本发明所述的鼻腔喷雾型流感病毒灭活疫苗组分是有相互协同作用的细胞免疫因子作为免疫佐剂和血管扩张剂；天然多糖作为生物粘附物质和上皮细胞间隙的扩张剂，与流感病毒抗原联合使用，既增加了病毒抗原在鼻腔中的停留时间，又增加了抗原的免疫原性，从而显著的增加了疫苗的有效性，还减少了疫苗喷雾剂对鼻腔粘膜的刺激性。
图1是各组的小鼠滴鼻接种后的平均IgA滴度图2是各组的小鼠滴鼻接种后的平均IgA滴度图3是各组的小鼠滴鼻接种后的血凝抑制滴度(HI)
具体实施例方式实施例1取10000单位人重组白细胞介素2，该人重组白细胞介素2由北京远策药业有限公司惠赠；1％壳聚糖购自美国Sigma公司，分子量为150kD，脱乙酰化85％以上，缓冲液为含有重量比1％苯甲醇、1％甘露醇、0.05％人血清白蛋白的磷酸溶液，其pH值为7.0；上述三者混合后，与三价裂解流感病毒血凝素抗原(购自巴思德研究所)按照1∶1的体积比混合，制备三价裂解流感病毒灭活疫苗鼻腔喷雾剂，每支体积为100微升，用于鼻腔免疫。
实施例2应用WHO推荐的流行的流感病毒株H3N2甲型流感病毒、H1N1甲型流感病毒和乙型流感病毒，三种病毒分别接种9-11日龄鸡胚尿囊，在37C培养48小时后，分别收集尿囊液，用福尔马林灭活病毒，采用SDS流感病毒裂解剂裂解病毒颗粒，再分别分离和纯化，得到裂解病毒；
将5*105单位的人干扰素α2b、5g淀粉加入500mL的pH为7.0的磷酸缓冲溶液，磷酸缓冲溶液含有1g人血清白蛋白、1g的苯甲醇、5g甘露醇；取500g裂解病毒，加入上述缓冲液，制得三价裂解流感病毒灭活疫苗鼻腔喷雾，剂，用于鼻腔免疫。
实施例3应用WHO推荐的当年流行的流感病毒株H3N2甲型流感病毒、H1N1甲型流感病毒和乙型流感病毒，三种病毒分别接种9-11日龄鸡胚尿囊，在37C培养48小时后，分别收集尿囊液，分别提取三株病毒的病毒血凝素(HA)；取104单位人重组白细胞介素2(北京远策药业有限公司惠赠)、10g几丁质加入500mL的pH为7.0的磷酸缓冲溶液，磷酸缓冲溶液含有0.6g人血清白蛋白、5g的苯甲醇、0.5g甘露醇；取500g裂解病毒，加入上述缓冲液，制得三价裂解流感病毒灭活疫苗鼻腔喷雾，剂，用于鼻腔免疫。
实施例4应用WHO推荐的当年流行的流感病毒株H3N2甲型流感病毒、H1N1甲型流感病毒和乙型流感病毒，采用基因重组技术分别克隆、重组、表达、纯化三株流感病毒的HA；取106单位人干扰素α1b、3g壳聚糖(美国Sigma公司、分子量为150kD、脱乙酰化85％)加入500mL的pH为7.0的磷酸缓冲溶液；取500g裂解病毒，加入上述缓冲液，制得三价裂解流感病毒灭活疫苗鼻腔喷雾，剂，用于鼻腔免疫。
比较例1按照实施例1的方法，制备对照组1鼻腔喷雾剂，用于鼻腔免疫。该对照组药剂直接使用缓冲液与流感病毒血凝素抗原混合制得，不含人重组白细胞介素2和壳聚糖，其余同实施例1。
同时将4.5微克流感病毒血凝素抗原，总体积为100微升，用于肌肉免疫，作为对照组2，用于比照实施例1产品的鼻腔免疫效果。
本比较例的免疫方案是将实施例1产品与对照组1的药剂分别滴鼻接种8只雌性成年BALB/c小鼠(6-8周，购自北京动物所)鼻孔，每孔50微升；对照组2按100微升肌肉接种(注射)8只雌性成年BALB/c小鼠(6-8周)。
实施例1组和对照组1中每只小鼠等量鼻腔免疫二次，间隔期为14天。对照组2肌肉注射只免疫一次。
取样方式为采集小鼠眼眶血清，测定血清中抗血凝素抗原的血凝抑制滴度(HI)和抗流感病毒的IgG滴度，收集小鼠肺部气管洗液(用1毫升磷酸缓冲液pH7.0)，测定抗流感病毒的IgA滴度。取样的的时间是第二次免疫后的第15天。
用酶联免疫吸附方法(ELISA)测定了小鼠产生的粘膜免疫反应(IgA)和系统免疫反应(IgG)结果。以免疫前小鼠的血清和肺部气管洗液作为阴性对照，在消除分析方法的背景后，以光密度吸收值确定血清和气管洗液的抗流感病毒的抗体滴度。
表1和图1抗体应答的结果表明，在第二次免疫后，来自实施例1组的小鼠滴鼻接种后IgA的平均滴度大于200。来自对照组2、3的小鼠滴鼻接种后气管洗液中无抗流感病毒的应答(IgA的平均滴度小于4)。
表1IgA检测结果OD值
表2和图2抗体应答的结果表明，在第二次免疫后，来自实施例1组的小鼠滴鼻接种后的平均IgG滴度与来自对照组2的小鼠肌肉注射后的平均IgG滴度相比无显著性差别，而比较来自对照组1的小鼠(不含人重组白细胞介素2和壳聚糖)滴鼻接种后血清IgG的应答强。
表2IgA检测结果OD值
图3测定的血清中抗血凝素抗原的血凝抑制滴度(HI)结果表明，在第二次免疫后，来自对照组2的小鼠肌肉注射后的平均HI滴度最高，为1∶320，其次为来自实施例1组的小鼠滴鼻接种后的平均HI滴度(1∶160)，来自对照组1的小鼠滴鼻接种(不含人重组白细胞介素2和壳聚糖)后的平均HI滴度和免前小鼠的血清阴性对照相当(1∶40)。一般认为HI滴度大于1∶80的免疫血清具有保护作用。
比较例2对照组1、2同比较例1。
用100LD50(半数致死剂量)鼠肺适应株A/PR/8/34(H1N1)攻毒，血凝滴度1∶2048以上攻击免疫小鼠(对照组1、2，实施例1组)，4只未免疫小鼠作为阴性对照。
攻毒时间为第二次免疫57天后，攻毒方法为用乙醚将小鼠麻醉，用注射器将稀释后的鼠肺适应株100ul，滴入小鼠鼻孔，50ul/鼻孔，逐日进行观察。攻毒10天后，对照组1、2中4只小鼠均死亡，实施例1组中2只死亡，2只存活，具体结果见下表3。
表3免疫小鼠攻毒试验结果
实施例1组和对照组2虽然没有100％的保护效率，结果仍然表明实施例1组的鼻腔免疫保护效果较对照组2高。
权利要求
1.一种鼻腔喷雾型流感病毒灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗含有以下组分细胞免疫因子、天然多糖、流感病毒抗原。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的细胞免疫因子是人白细胞介素、重组人白细胞介素、人干扰素、重组人干扰素；优选人白细胞介素-2或重组人白细胞介素-2。
3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的天然多糖是纤维素、淀粉、几丁质、壳聚糖及其衍生物，或者可以选择前述天然多糖的任意组合；优选使用几丁质、壳聚糖。
4.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的流感病毒抗原为全病毒抗原、裂解病毒抗原或病毒亚单位抗原；优选裂解病毒抗原。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的疫苗，其特征在于，所述组分在最终制剂中的重量含量为细胞免疫因子104-106单位/L天然多糖0.1-10％流感病毒抗原30-70％其余部分为缓冲溶液。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述组分在最终制剂中的重量含量为细胞免疫因子104-106单位/L天然多糖0.5-5％流感病毒抗原40-60％其余部分为缓冲溶液。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述组分在最终制剂中的重量含量为细胞免疫因子105单位/L天然多糖1％流感病毒抗原50％其余部分为缓冲溶液。
8.根据权利要求5、6或7所述的疫苗，其特征在于，所述的缓冲溶液为pH为7的磷酸缓冲溶液；所述的磷酸缓冲溶液可以进一步含有0.05-0.10％重量比的人血清白蛋白。
9.根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述的缓冲溶液含有药剂学上可以接受的辅料，例如，苯甲醇、甘露醇等等，辅料总含量为0.1-5％重量比。
10.一种鼻腔喷雾型流感病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的方法是将细胞免疫因子、天然多糖、流感病毒抗原按照药剂学中描述的鼻腔喷雾剂制备方法进行操作。
全文摘要
本发明提供了一种新颖的鼻腔喷雾型流感病毒裂解疫苗及其制备方法。所述的流感病毒裂解疫苗含有以下组分细胞免疫因子、天然多糖、流感病毒抗原。本发明中的人白细胞介素－2与天然多糖在药物的组方中存在着十分有效的协同作用，增加了病毒抗原在鼻腔中的渗透性，从而避免了酶对抗原的降解作用，显著的增加了药物的有效性，揭示了本发明疫苗组成方案能够很好的应用于鼻腔接种生物大分子，在刺激机体产生局部(粘膜)免疫反应和系统免疫反应的同时，具有很好的保护效果。
文档编号A61K9/72GK1810291SQ200510004938
公开日2006年8月2日 申请日期2005年1月28日 优先权日2005年1月28日
发明者侯云德, 赵静, 马学军, 段招军, 张丽兰 申请人:北京金迪克生物技术研究所, 北京远策药业有限责任公司, 深圳市普邦生物技术有限公司