专利名称：禽多杀性巴氏杆菌b的制作方法
技术领域：
本发明属禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒菌株领域。
背景技术：
禽巴氏杆菌病又名禽霍乱，由禽多杀性巴氏杆菌(Pm)引起，是鸡、鸭、鹅等多种禽类常见的一种急性传染病，是当前危害养禽业的主要传染病之一。
国外对禽巴氏杆菌弱毒疫(菌)苗的研究始于1881年，自Pasteur首次研制成功用于预防禽霍乱的弱毒疫苗以来，各种免疫力不同的禽巴氏杆菌弱毒菌株不断涌现。1918年Mannigen用培养基中加入化学诱变剂的方法选育出一株无毒的突变株，免疫后两天开始有免疫力，免疫期为6-8周；1950年Barker通过含结晶紫的血清琼脂培养基连续培养，获得一株无毒的变种；Carter(1950，1951)通过鸡胚继代致弱了的禽巴氏杆菌菌株，获得一突变株；但效果都不够好。Rice(1979)用Cu株制成弱毒疫苗，通过饮水、点眼、皮内注射等多种途径进行免疫，免疫期8-10周左右，Cu株具有抵抗巴氏杆菌异源株攻击的特点。
在20世纪六十至八十年代，对禽巴氏杆菌病的预防多采用禽霍乱氢氧化铝胶(灭活)苗，但该苗免疫期短，运输保存不方便。我国对禽霍乱弱毒疫苗的研究已达十几株之多，如G190-E40株(黑龙江兽药一厂)，华农系(华南农学院)，1010株(江苏家禽研究所)，731株(中国农科院哈尔滨兽医研究所)，C762株(广西兽药厂)，CNCOI株(广西农学院)，N系(江西生物制药厂)，G190-3(广东生物制药厂)，PTR株，PC株(中国农科院兰州兽医研究所)等，以上菌株的致弱方法多样，通过豚鼠、小白鼠或其它动物传代(如G190-E40，G190-3，C762)，或通过低温或高温选育(如731，PTR，华农系等)，或加化学诱变剂(如N系，PC株)，或经Co60-r射线处理(如CNCOZ)等。上述弱毒菌株均有一定的免疫效果，但普遍存在一些问题，例如菌苗的安全性差，免疫期短，菌株遗传性能差，不稳定；还有些菌苗副作用大，对禽产蛋率有一定影响。
尽管当前国内外对禽巴氏杆菌弱毒疫苗研究比较多，但由于禽巴氏杆菌弱毒疫苗生产工艺路线、工艺参数难掌握，使疫苗的生产成本普遍较高、产品质量不稳定、合格率低、免疫原性差、疫苗保存期短、疫苗产生免疫的时间慢等，满足不了家禽业健康发展的需要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种免疫保护率高、安全性高、稳定性好、免疫持续时间长的禽巴氏杆菌弱毒疫苗所需的弱毒菌株。
本发明以如下技术方案解决上述技术问题用于制备禽巴氏杆菌弱毒疫苗的弱毒菌株，是禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒株[AvianPasteurella multocida B26-T1200，于2005年4月27日保藏在中国武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，编号CCTCC No M205042]。
制备本发明的禽巴氏杆菌病疫苗的禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒菌株，可采用如下方式将B26本地鸭源强毒菌株，在含0.1％裂解羊全血的马丁汤中幼龄传代(12小时一代)，从37℃开始，在传代过程中逐渐将培养温度提高到45℃，每20-30代后，按原菌株的各种特征进行选种后继续传代，并对传代菌株的毒力和免疫原性进行测定，传至1200代获得禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒株。采用禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒菌株作为菌种，大量培养加保护剂后，经过真空冻干制成禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒冻干苗。
本发明研制成功的禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒苗安全性高、稳定性好，免疫持续时间长。经测定，该菌的最小免疫剂量为130万活菌，但41万活菌免疫鸡就有部分鸡已得到保护，3000万免疫鸡近期保护率达100％。实验室测定6批禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒苗免疫期，6批苗免疫4个月平均保护率为79.2％，5个月平均保护率为75％。田间试验5批苗免疫鸡140天平均保护率达80％。该弱毒苗于2000年已被国家农业部批准为正式规程苗，可在全国范围内生产及推广使用。
B26-T1200株与国内广泛使用G190-E40株，“731”株及美国广泛应用的Cu株弱毒苗比较结果如下B26-T1200株、G190-E40株、“731”株、Cu株性能比较
在应用范围上已从鸡的单一使用进一步推广到水禽。
本发明的禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒株已于2005年4月27日保藏在中国武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，编号CCTCC No M205042]。
具体实施例方式
禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒苗是申请人经过多年努力从一株鸭源强毒株，经过物理学方法，在37-45℃条件下幼龄传代至1200代获得的弱毒菌株，并研制成弱毒疫苗，该苗比原代强毒株毒力降低15亿倍以上，以93亿菌注射鸡表现安全，近期保护率100％，免疫保护率达94.6％，140天保护率达80％，优于常规氢氧化铝胶苗。
本发明以如下方式获得禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒株采用物理学诱变方法，将筛选出来的毒力较强、免疫原性较好的B26本地鸭源强毒株，在含0.1％裂解羊全血的马丁汤中幼龄传代(12小时一代)，从37℃开始，在传代过程中逐渐将培养温度提高到45℃，每传20-30代后，按原菌株的各种特征进行选种后继续传代，并对传代菌株的毒力和免疫原性进行测定，以保持原菌株的菌落形态、菌落荧光特征和免疫原性。传至1200代获得禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒株。采用常规的倾注平板培养法进行活菌计数。获得的禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒株置入常规的培养物，按常规的比例加入保护剂，经过真空冻干制成禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒冻干苗。
本发明的禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒菌株主要用于生产禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒冻干苗，采用禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒菌株作为菌种，经大瓶通气培养、真空冻干生产而成。该弱毒苗毒力比原代菌株毒力下降了15亿倍以上，通过血斜连传30代和敏感鸡体连传5代，其毒力无返祖(强)现象；且产生免疫力迅速，菌株免疫鸡后，4-5天产生坚强免疫力，80-100％的免疫鸡能抵抗强毒攻击；免疫期长，可达4-5个月，免疫鸡4个月总保护率79.2％，5个月总保护率达75％。
以下简述使用本发明的禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒冻干苗生产疫苗的工艺步骤
1、马丁肉汤制备pH值为7.4，供培养和稀释菌液用。
2、菌种菌种为禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒菌株，该菌株由申请人鉴定、保管和供应。效检用C48-1强毒株，由中国兽药监察所提供。
3、生产用种子制备(1)一级种子保存在2-8℃，使用期不超过14日。
(2)二级种子繁殖及检验取一级种子接种于含0.1％裂解血球全血的马丁肉汤中，36-37℃培养24小时，作纯粹检验后，置2-8℃保存，使用期不超过4日。
(3)制苗用培养基马丁肉汤，根据需要量制备马丁肉汤。
(4)制苗用菌液培养用培养罐或玻璃瓶通气培养，按容积装入适量培养基(70％左右)、消泡剂，灭菌后按培养基总量的1-2％接种二级种子液，并按0.1％(重量百分比或体积百分比均可，以下同)加入裂解血球全血。以逐渐增大通气量的方法，37-38℃培养8-12小时，当pH达到8.0-8.4时，停止培养。
(5)半成品检验A.纯粹检验取培养物进行涂片镜检，如无杂菌，立即配苗。同时用马丁琼脂作纯粹检验，应纯粹。
B.活菌计数用含0.1％裂解血球全血及4％健康动物血清的改良马丁琼脂平板培养，按常规活菌计数方法计算活菌数，作为配苗参考。
(6)配苗与分装将检验合格的若干瓶菌液，混合于同一容器中，加入适量明胶、蔗糖保护剂，充分混合，定量分装，每头份活菌数(鸡)应不少于3000万个。分装过程中，随时振荡，必要时可采取保温措施。
(7)冻干分装后立即冷冻真空干燥，按照生产该疫苗的温度曲线进行升温，冻干完成后，在真空状态下压紧胶塞，封铝盖后，置于2-8℃保存。
(8)贮藏在2-8℃保存，有效期为1年。
4成品检验(1)物理性状该产品为淡褐色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
(2)纯粹检验应无杂菌生长。
(3)鉴别检验在含0.1％裂解血球全血及10％羊血清的改良马丁琼脂平板上，37℃培养16-22小时，肉眼观察，菌落表面光滑，有淡淡的蓝色，在低倍显微镜下，45度折光观察，菌落结构细致，边缘整齐，呈蓝色，边缘有虹光。
(4)活菌计数取疫苗3瓶，按瓶签注明的羽份，用含0.1％裂解血球全血及4％健康动物血清的改良马丁琼脂平板培养，按常规活菌计数方法计算活菌数，每头份活菌(鸡)应不少于3000万个。
(5)安全检验取疫苗1瓶，按瓶注明的羽份，以20％铝胶生理盐水稀释为1mL 100羽份。用2-10月龄的健康易感鸡4只，各肌肉注射1mL，观察15日，应全部健活。
(6)效力检验取疫苗1瓶，按瓶签注明的羽份，以20％铝胶生理盐水稀释为1mL含1羽份。用2-10月龄的健康易感鸡4只，各肌肉注射1mL。14日后，连同条件相同的对照鸡2只，各肌肉注射致死量的C48-1强毒菌液，观察15日，对照鸡全部死亡，免疫鸡至少保护3只为合格。
(7)剩余水份测定用真空烘干法检测，应符合规定。
(8)真空度测定用高频火花真空测定器进行密封后容器内的真空度测定。如果容器内出现白色、粉色和紫色辉光，则真空度均属合格。
5.作用与用途用于预防2个月以上的鸡、鸭、鹅巴氏杆菌病。免疫期为120天。
6.用法与用量疫苗用20％铝胶生理盐水稀释为0.5mL/羽份，各肌肉注射0.5mL，鸡免疫注射含活菌3000万个/羽，鸭免疫注射含活菌9000万个/羽，鹅免疫注射含活菌1亿个/羽。
在配制疫苗过程中，攻毒剂量要适当，可通过试验鸡的测毒来确定剂量。
权利要求
1.一种用于制备禽巴氏杆菌弱毒疫苗的弱毒菌株，是禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒株[Avian Pasteurella multocida B26-T1200；保藏单位中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，编号CCTCC No M205042]。
2.如权利要求1所述的禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒株的制备方法，其特征是将B26本地鸭源强毒菌株，在含0.1％裂解羊全血的马丁汤中幼龄传代(12小时一代)，从37℃开始，在传代过程中逐渐将培养温度提高到45℃，每20-30代后，按原菌株的各种特征进行选种后继续传代，并对传代菌株的毒力和免疫原性进行测定，传至1200代获得禽多杀性巴氏杆菌B26-T1200弱毒株。
全文摘要
一种用于制备禽巴氏杆菌弱毒疫苗的弱毒菌株，是禽多杀性巴氏杆菌B
文档编号A61K39/02GK1789410SQ200510019200
公开日2006年6月21日 申请日期2005年7月29日 优先权日2005年7月29日
发明者谢芝勋, 刘加波, 庞耀珊, 谢志勤, 邓显文, 唐小飞 申请人:广西壮族自治区兽医研究所