专利名称：抗单纯疱疹病毒－2感染的多表位dna疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属医药和基因工程技术领域，具体涉及一种新的抗HSV-2多表位DNA疫苗及应用背景技术单纯疱疹病毒(HSV)感染是人类比较常见的感染性疾病.。HSV-1主要引起唇疱疹、龈口炎、脑炎、角膜结膜炎等非生殖器感染，而HSV-2引起生殖器感染。大多数生殖器疱疹由HSV-2引起，可呈慢性复发过程，目前尚未有根治的良药。该病在全球的流行情况十分明显，已占性病的10％左右，由HSV-2感染造成的公共卫生问题促使人们研制可预防和控制感染的疫苗。有研究表明，DNA疫苗与常规的灭活苗、减毒苗、亚单位疫苗相比，DNA疫苗不仅可诱导产生特异性免疫球蛋白，且可同时激发机体的细胞免疫反应(尤其是CTL免疫)，对病毒感染性疾病等依赖细胞免疫清除病原的疾病预防更为有效。DNA疫苗另一个突出优点是免疫原的单一性。只有编码所需抗原的基因被导入细胞得到表达，载体本身没有免疫原性。而重组活载体疫苗除目的基因的表达外，其本身还具有庞大而复杂的免疫原蛋白。DNA疫苗不仅可用于预防，而且可用于治疗。
本发明从HSV入侵和繁殖的机理及整个生命周期过程角度出发，将HSV-2糖蛋白D、B、C基因(gD免疫原性较强、gB和gC与相应的受体结合能稳定病毒在细胞表面的吸附)和即刻早期蛋白ICP27基因(该基因能启动病毒DNA进入细胞后转录和表达)作为靶基因串连起来插入到pCDNA3.1，首次构建了HSV-2新型多表位DNA疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种能有效抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗及其制备方法。
本发明的技术路线为，首先培养扩增HSV-2病毒，并抽提其基因组DNA，同时用生物信息学方法根据糖蛋白的免疫原性分析，选取所需的抗原表位，设计相应引物，然后用PCR方法分段扩增所需的目的基因，最后把六段基因连接起来先克隆到pGEM-T载体上，再酶切装入pcDNA3.1，得到抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗(HV-pcDNA3.1质粒)。
本发明提出的有效抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗，其组成如下将HSV-2病毒胞膜糖蛋白的强免疫原gD、gB、gC和参与病毒复制的即刻早期蛋白ICP27的主要抗原表位区域，以主要保护性抗原gD为中心，选定6段抗原基因加间隔序列AAY串连到真核表达载体pcDNA3.1，得到HV-pcDNA3.1质粒；其中6段抗原基因为ICP27上第377～459氨基酸的一段抗原肽，gD上第1～77、第146～179、第223～306氨基酸的三段抗原肽，gB上第529～606氨基酸的一段抗原肽和gC上第247～282氨基酸的一段抗原肽。
本发明提出的抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗的制备方法，具体步骤如下1.设计引物根据靶抗原免疫原性分析，以人HSV-2全病毒基因组DNA为(SEQ ID NO.7)模板，设计6对引物(含酶切位点)，分别用于扩增三种包膜糖蛋白gD，gB和gC的主要免疫优势区段和ICP27片段，引物序列见表1所列表1.DNA疫苗引物序列表
2.抗原靶基因的分段克隆回收取HSV病毒裂解液，用Taqplus高保真DNA聚合酶分别对6段选定的抗原基因进行PCR扩增。这6段抗原基因分别为ICP27上第377～459氨基酸的一段抗原肽(SEQ ID NO.1)，gD上第1～77(SEQ ID NO.2)、第146～179(SEQ IDNO.3)、第223～306(SEQ ID NO.4)氨基酸的三段抗原肽，gB上第529～606(SEQ ID NO.5)氨基酸的一段抗原肽和gC上第247～282(SEQ ID NO.6)氨基酸的一段抗原肽；取PCR扩增产物，用琼脂糖凝胶电泳观察是否有目的基因条带，把得到的目的基因片段割胶回收、定量；3.将六段PCR产物的酶切和连接将纯化得到的各段HSV抗原片段分别用EarI酶切成粘性末端，然后用T4 ligase把它们按照下述顺序连接(见图1所示)
ICP27上的377～459，gD上的146～179，gD上的223～306，gB上的529～606，gC上的247～282；gD上的1～77，得到完整的抗原表位，用于连接的间隔序列为AAY；4.将串联后的目的基因构建质粒将上述得到的完整抗原表位和真核表达载体pcDNA3.1同时双酶切，然后连接起来，构成所需的DNA疫苗HV-pcDNA3.1。
由本发明制备获得的DNA疫苗，经过对小鼠免疫试验，结果表明该疫苗能有效引起小鼠特异性的体液免疫和细胞免疫应答。然后进行免疫小鼠毒性攻击试验测定其戚率指标，表明该疫苗免疫的有效性，而且具有特异性高、杀伤力强的优点。
图1为多表位DNA复合疫苗抗原示意图。
图2为克隆抗原片断的路线图示。
具体实施例方式
下面进一步描述本发明的实施方式。
1.引物设计参照图1设计6对引物，以人HSV-2全病毒基因组DNA为模板，设计引物(含酶切位点)分别扩增三种包膜糖蛋白gD，gB和gC的主要免疫优势区段和ICP27片段。引物序列参见表12.抗原靶基因的分段克隆回收取2ul HSV病毒裂解液，用Taqplus高保真DNA聚合酶分别对6段选定的抗原基因进行PCR扩增。条件如下50μl PCR扩增反应体系ddH2O9.5μl10×Buffer 5.0μl4×dNTP(10mM) 1.0μlPrimer F(10μM)1.0μlPrimer R(10μM)1.0μlTemplate 2.0μlTaqplus(5U/μl)0.5μlPCR扩增反应条件 取2μl PCR扩增产物，2.0％琼脂糖凝胶电泳观察是否有目的基因条带。把得到的目的基因片段割胶回收、定量。
3.六段PCR产物的酶切和连接纯化得到的各段HSV抗原片段分别用Ear I酶切成粘性末端，然后用T4 ligase把它们按照顺序先后联接。参照图1
Ear I酶切条件2ul Buffer；1ul EarI；10ul纯化的PCR片段；7.5ul ddH2O；反应Mix于37℃保温3h。
T4 ligase顺序连接各段酶切产物，4℃连接过夜，连接分别如下(1)2ul 10×T4 ligase buffer1ul T4 ligase8.5ul ICP1+8.5ul D2(2)2ul 10×T4 ligase buffer1ul T4 ligase8.5ul D3+8.5ul B4(3)2ul 10×T4 ligase buffer1ul T4 ligase8.5ul C5+8.5ul D6把3段联接产物用1.5％琼脂糖电泳观察结果。切下3段连接片段，(1)号联接产物中目的条带为377bp(A)，(2)号联接产物中目的条带为503bp(B)，(3)号联接产物中目的条带为376bp(II)。回收这些目的片段。
用T4 ligase联接回收的A和B片段，4℃连接过夜，Mix如下2ul 10×T4 ligase buffer1ul T4 ligase8.5ul A+8.5ul B把A和B的连接产物用1.5％琼脂糖电泳观察结果。切下600～1000bp条带对应的位置，回收DNA，进行用PCR扩增。
50μl PCR扩增反应体系ddH2O 39.5μl10×Buffer 5.0μl4×dNTP(10mM)1.0μlPrimer ICP-F(10μM) 1.0μlPrimer B4-R(10μM) 1.0μlTemplate 2.0μl
Taqplus(5U/μl)0.5μlPCR扩增反应条件 取100μl PCR扩增产物，2.0％琼脂糖凝胶电泳切下880bp条带(I)，回收目的片段，再用EarI酶切片段I，条件同前。
T4 ligase连接片段I酶切产物和回收的片段II，4℃连接过夜，Mix如下2ul 10×T4 ligase buffer1ul T4 ligase8.5ul I+8.5ul II连接产物用1.4％琼脂糖电泳，切下1100～1300bp条带(HV)，回收目的片段。PCR检验回收的HV片段是否有6段基因的连接产物50μl PCR扩增反应体系ddH2O39.5μl10×Buffer 5.0μl4×dNTP(10mM) 1.0μlPrimer ICP-F(10μM)1.0μlPrimer D6-R(10μM) 1.0μlTemplate 1.0μlTaqplus(5U/μl)0.5μlPCR扩增反应条件 共有6段抗原肽表位，分别为ICP27上第377～459氨基酸的一段抗原肽，gD上第1～77、第146～179、第223～306氨基酸的三段抗原肽，gB上第529～606氨基酸的一段抗原肽和gC上第247～284氨基酸的一段抗原肽。其中不同类型糖蛋白之间用间隔序列(AAY)连接起来，以提高免疫活性并防止N端被破坏，起保护作用。
4.HV连接片段的克隆测序将上述回收的HV片段连接到pGEM-T载体中，16℃连接过夜1ul Progema T4 ligase1ul pGEMT-vector5ul 2×Progema T4 ligase Buffer
3ul HV纯化液HV-pGEMT-vector连接产物，转化到E.coli DH5α感受态细胞，挑选阳性转化子鉴定。分别对阳性转化子和pcDNA3.1空载体用EcoRI和KpnI双酶切，EcoRI单切质粒，37℃保温3h3.0ul Buffer H2.0ul EcoRI20.0ul质粒5.0ul ddH2O纯化得到的EcoRI酶切质粒再用KpnI酶切37℃，3h3.0ul Buffer 10.3ul 100×BSA2.0ul KpnI24.7ul质粒对于HV-pGEMT-vector双酶切产物切胶1200bp条带；pcDNA3.1空质粒双酶切产物则切胶约5.4kb的条带，分别对其回收定量。HV片段联入pcDNA3.1载体，16℃过夜1ul 10×T4 ligase buffer1ul T4 ligase1ul双切pcDNA3.1回收片段3ul HV双切回收片段HV，pcDNA3.1连接产物转化入DH5α感受态细胞，挑选阳性重组子，得HV-pcDNA3.1，并测序验证。
5.免疫小鼠C57/BL6雌性6周龄小鼠10只，随机分为2组(空载体pcDNA3.1阴性组和HV-pcDNA3.1+IL2-pcDNA3.1实验组)，每组5只。方法是初次免疫为10ug质粒和1ug脂质体融合转染C57/BL6小鼠单个核细胞于皮下注射；14天后二次免疫为100ug质粒和10ug脂质体混合后直接注射C57/BL6小鼠肌肉中；再过14天后加强免疫一次50ug质粒和5ug脂质体混合后直接注射C57/BL6小鼠肌肉中。再过14天后检测。
6.通过以下方法进行HSV-2多表位DNA疫苗的免疫原性鉴定(1)特异性IgG抗体ELISA结果 血清稀释400倍时的OD值阴性组为0.113±0.035；实验组为0.288±0.091，效价约为500。
(2)杀伤性T细胞毒分析结果 用LDH法测定CTL杀伤率(％)，当效靶比为50∶1时，阴性组为8.301±2.906；实验组为47.913±15.086。
(3)细胞因子检测结果 ELISA测得血清中mIL2和mIFN-γ的含量(ng/L)，阴性组mIL2为685.21±104.20，mIFN-γ为547.71±189.33；实验组mIL2为1421.16±220.98，mIFN-γ为1956.19±219.60。
(4)T细胞抗原特异性增殖反应测定结果 MTT法测得的小鼠脾T淋巴细胞刺激指数(SI)，阴性组为0.709±0.035；实验组为2.751±0.259。
结论HSV-2多表位DNA疫苗能有效引起小鼠特异性的体液免疫和细胞免疫应答。
7.具体应用根据一系列小鼠免疫指标的测定结果，表明该DNA疫苗构建设计是成功的。然后直接进行HSV-2多表位DNA疫苗免疫小鼠病毒攻击实验，通过测定存活率指标，观察小鼠预防HSV感染的动物试验效果，进一步反应了该疫苗的有效性。
临床应用小鼠攻毒实验成功后，经临床I、II、III期实验，可作为抗HSV-2病毒的新型DNA疫苗，用于预防和治疗感染HSV-2的疾病，如生殖器疱疹、宫颈癌、新生儿疱疹等疾病。
序列表SEQ ID NO.1DPIIGTAAAVLENLATRLRPFLQCYLKARGLCGLDDLCSRRRLSDIKDIASFVLVILARLANRVERGVSEIDYTTVGVGAGETSEQ ID NO.2AKYALADPSLKMADPNRFRGKNLPVLDQLTDPPGVKRVYHIQPSLEDPFQPPSIPITVYYAVLERACRSVLLHAPSESEQ ID NO.3SEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRLVKINDWTEITQSEQ ID NO.4RFIPENQRTVALYSLKIAGWHGPKPPYTSTLLPPELSDTTNATQPELVPEDPEDSALLEDPAGTVSSQIPPNWHIPSIQDVAPHSEQ ID NO.5QNHELTLWNEARKLNPNAIASATVGRRVSARMLGDVMAVSTCVPVAPDNVIVQNSMRVSSRPGTCYSRPLVSFRYEDQSEQ ID NO.6EGQPFKATCTAATYYPGNRAEFVWFEDGRRVFDPAQSEQ ID NO.7ATGGACCCTATCATCGGAACGGCGGCCGCCGTGCTGGAAAACCTCGCCACGCGCCTGCGCCCCTTTCTGCAGTGCTACCTGAAGGCCCGAGGCCTGTGCGGGCTGGACGACCTGTGCTCGCGGCGACGCCTGTCGGACATTAAGGATATTGCCTCCTTTGTGTTGGTCATCCTGGCCCGCCTCGCCAACCGCGTCGAGCGCGGCGTGTCGGAGATCGACTACACGACCGTGGGGGTTGGGGCCGGCGAGACGGCCGCTTACAGCGAGGATAACCTGGGATTCCTGATGCACGCCCCCGCCTTCGAGACCGCGGGTACGTACCTGCGGCTAGTGAAGATAAACGACTGGACGGAGATCACACAACGCTTTATCCCCGAAAACCAGCGCACCGTCGCCCTATACAGCTTAAA AATCGCCGGGTGGCACGGCCCCAAGCCCCCGTACACCAGCACCCTGCTGCCGCCGGAGCTGTCCGACACCACCAACGCCACGCAACCCGAACTCGTTCCGGAAGACCCCGAGGACTCGGCCCTCTTAGAGGATCCCGCCGGGACGGTGTCTTCGCAGATCCCCCCAAACTGGCACATCCCGTCGATCCAGGACGTCGCGCCGCACGCTGCCTACCAGAACCACGAGCTGACTCTCTGGAACGAGGCCCGCAAGCTCAACCCCAACGCCATCGCCTCCGCCACCGTCGGCCGGCGGGTGAGCGCGCGCATGCTCGGAGACGTCATGGCCGTCTCCACGTGCGTGCCCGTCGCCCCGGACAACGTGATCGTGCAGAACTCGATGCGCGTCAGCTCGCGGCCGGGGACGTGCTACAGCCGCCCCCTGGTCAGCTTTCGGTACGAAGACCAGGCCGCTTACGAGGGCCAGCCGTTTAAGGCGACGTGCACGGCCGCCACCTACTACCCGGGCAACCGCGCGGAGTTCGTCTGGTTCGAGGACGGTCGCCGGGTATTCGATCCGGCCCAGGCTGCCTACGCCAAATACGCCTTAGCAGACCCCTCGCTTAAGATGGCCGATCCCAATCGATTTCGCGGGAAGAACCTTCCGGTTTTGGACCAGCTGACCGACCCCCCCGGGGTGAAGCGTGTTTACCACATTCAGCCGAGCCTGGAGGACCCGTTCCAGCCCCCCAGCATCCCGATCACTGTGTACTACGCAGTGCTGGAACGTGCCTGCCGCAGCGTGCTCCTACATGCCCCATCGGAGTGATGA
权利要求
1.一种能有效抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗，其特征在于组成如下将HSV-2病毒胞膜糖蛋白的强免疫原gD、gB、gC和参与病毒复制的即刻早期蛋白ICP27的主要抗原表位区域，以保护性抗原gD为中心，选定6段抗原基因加间隔序列AAY串连到真核表达载体pcDNA3.1，得到HV-pcDNA3.1质粒；其中6段抗原基因为ICP27上第377～459氨基酸的一段抗原肽，gD上第1～77、第146～179、第223～306氨基酸的三段抗原肽，gB上第529～606氨基酸的一段抗原肽和gC上第247～282氨基酸的一段抗原肽。
2.一种能有效抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗的制备方法，其特征在于具体步骤如下(1)设计引物以人HSV-2全病毒基因组DNA为模板，设计6对引物，分别用于扩增三种包膜糖蛋白gD，gB和gC的主要免疫优势区段和ICP27片段，引物序列见表1所列表1.DNA疫苗引物序列表
(2)抗原靶基因的分段克隆回收取HSV病毒裂解液，用Taqplus高保真DNA聚合酶分别对6段选定的抗原基因进行PCR扩增，这6段抗原基因分别为ICP27上第377～459氨基酸的一段抗原肽，gD上第1～77、第146～179、第223～306氨基酸的三段抗原肽，gB上第529～606氨基酸的一段抗原肽和gC上第247～282氨基酸的一段抗原肽；取PCR扩增产物，用琼脂糖凝胶电泳观察是否有目的基因条带，把得到的目的基因片段割胶回收、定量；(3)六段PCR产物的酶切和连接将纯化得到的各段HSV抗原片段分别用Ear I酶切成粘性末端，然后用T4 ligase把它们按照下述顺序连接ICP27上的377～459，gD上的146～179，gD上的223～306，gB上的529～606，gC上的247～282；gD上的1～77，得到完整的抗原表位，用于连接的间隔序列为AAY；(4)将串联后的目的基因构建质粒将上述得到的完整抗原表位和真核表达载体pcDNA3.1同时双酶切，然后连接起来，构成所需的DNA疫苗HV-pcDNA3.1。
全文摘要
本发明属医药和基因工程技术领域，具体为一种抗单纯疱疹病毒－2的多表位DNA疫苗及其制备方法。本发明的DNA疫苗是将HSV－2的gB、gC、gD和即刻早期蛋白ICP27的主要抗原表位区域加间隔序列串连到真核表达载体pcDNA3.1，获得HV－pcDNA3.1。该DNA疫苗可以用于预防和治疗HSV－2感染的疾病如生殖器疱疹等疾病。该疫苗的特点是特异性高、保护性好，制备方法简单。
文档编号A61P31/22GK1748797SQ20051002848
公开日2006年3月22日 申请日期2005年12月9日 优先权日2005年12月9日
发明者朱乃硕, 徐金华, 许炎, 夏天, 郑志忠 申请人:复旦大学, 复旦大学附属华山医院