专利名称：一种gtp酶在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞生物学领域，提供了一种GTP酶蛋白Septin1的新用途，即将其应用于制备抗肿瘤药物。
背景技术：
有丝分裂是细胞周期过程中很重要的一个阶段。大多数的肿瘤其发生原因是有丝分裂所致的基因组的不稳定性，基因组的不稳定又来源于染色体的不稳定，染色体的不稳定是癌症的特征性标志。染色体的分离、中心粒的复制和分离发生异常，会导致每个细胞染色体数目的异常，既非整倍体，增加杂合性缺失的机会，抑癌基因的缺失或原癌基因的数目增加都会使细胞生命代谢和信号传导发生紊乱，增加癌变的机会。肿瘤与正常细胞的区别就是无限制增生，即有丝分裂失去正常调控。激酶在完成有丝分裂和细胞周期调控中起着重要作用，从而成为目前分子生物学的研究热点。
AIK(Aurora/Ipl1 Kinase)是目前已知的五大调节性激酶家族之一。到目前为止，人类Aiks家族共发现三个成员Aik1、Aik2和Aik3。其中，Aik2作为染色体伴随蛋白参与调节着丝粒与纺锤体微管的相互作用，在中期至后期这一瞬时，Aik2由着丝粒迁移至细胞中间区带[Bischoff，J.R.，Anderson，L.，et al.(1998)EMBO J.17，3052-3065]，末期分布于细胞盘和后有丝分裂桥，参与后有丝分裂事件，故与染色体的分离和胞质分裂有关。Aik2的突变使分裂沟的形成被抑制，并导致形成多核细胞。Aik2定位于17q13，这一区域在人类多种癌细胞中出现异常，而在异常倍性的结肠癌细胞株中Aik2高表达。因此，科研人员纷纷寻找与Aik2作用的分子，并将其作为抗肿瘤药物来研究。
Septin是一个GTP酶家族，最早是在Saccharomyces cerevisiae酵母中被鉴定的。Septin的功能研究主要有两方面首先是Septin蛋白形成10nm直径的颈丝环绕胞浆膜内侧的母芽颈一周，作为胞质运动相关蛋白的载物台[Bi，E.，Maddox，P.，Lew，DJ.，et al.(1998)J Cell Biol.1421301-1312.；Boyne，JR.，Yosuf，HM.，Bieganowski，P.，etal(2000)J Cell Sci 1134533-4543.]。次之，Septin与极性生长的调节有关[Barral，Y.，Mermall，V.，Mooseker，MS.，et al.(2000).Mol Cell.5，841-851；Takizawa，PA.，Derisi，JL.，Wilhelm，JE.，et al.(2000).Science.290，341-344]。然而，尚未有人报道关于Septin1在发明内容本发明的目的是提供一种GTP酶蛋白Septin1的新用途，即将其应用于制备抗肿瘤药物。
本发明的提供了GTP酶蛋白Septin1的一种新用途，即将其应用于制备抗肿瘤药物。
同时，可将GTP酶蛋白Septin1的反义核酸或者蛋白抑制剂用于制备抗肿瘤药物。
原核表达GST-Septin1和GST蛋白。用Myc和Myc-Aik2(即Aurora-B)转染Hela细胞，培养生长48小时后裂解细胞，将各样品均分成两份，分别与GST-Septin1和GST蛋白孵育，之后加入50μl谷胱甘肽琼脂糖珠子4℃结合过夜。次日洗珠子去除非特异性结合。Western blotting检测结果发现，Myc组没有检测到阳性条带，而Myc-Aik2组检测到了一阳性条带。由此认为，Septin1与Myc-Aik2可在体外互作。
分别构建pCMV-HA-Aik2和pCMV-Myc-Septin1哺乳动物瞬时表达载体，与pCMV-HA或pCMV-Myc空载体共同转染293T细胞，用抗HA多克隆抗体免疫沉淀带HA Tag的靶蛋白，western bloting检测。结果发现pCMV-HA-Aik2和pCMV-Myc-Septin1共转组可检测到一个大小为43KD的阳性条带，符合Myc-Septin1蛋白大小；而pCMV-HA-Aik2和pCMV-Myc共转组及pCMV-Myc-Septin1和pCMV-HA共转组未发现阳性条带。
将各转染组的细胞裂解液用抗HA多抗和proteinA/G agarose孵育后将得到的免疫吸附物用抗Myc抗体检测，结果只在Aik2与Septin1共转组看到一大小为43KD的条带，即Myc-Septin1，说明Aik2能够与Septin1在体内相互结合。
构建pEGFP-N1-Aurora-B和pDs-Red-C1-Septin载体，共转染Hela细胞，24小时后固定。DAPI复染后置于LEICA DM RA2荧光显微镜观察、拍照。结果显示，在有丝分裂的前期、中期、后期及末期均有不同程度的共定位，这说明Septin1与Aurora-B在细胞分裂时有相互作用的空间。
将HA-Septin1-6m瞬时转染细胞，作为内源Septin1的dominant-negative形式，另选HA-Septin1和HA空载体作对照。转染72小时后收取细胞，固定、染色后流式细胞仪分析。结果发现HA-Septin1和HA两组之间在G1期(2N)、S期(2N和4N之间)、G2/M期(4N)和多倍体(＞4N)细胞的比例没有明显的差别，HA-Septin1-6m组G2/M期和多倍体的细胞比例均有提高。多倍体的增加说明核分裂和胞质分裂不平衡，胞质分裂不能很好的完成。G2/M期的增加说明有丝分裂受阻，不能顺利完成。
将Septin1蛋白的野生型HA-Septin1和6突变型HA-Septin1-6m及HA-Aik2-106m瞬时转染Hela细胞，作为内源Septin1和Aik2的dominant-negative形式，另选HA空载体作对照。转染48小时后收取细胞，Annex V试剂盒分析细胞群体的凋亡发生情况。结果发现各组在早期凋亡细胞比例并没有很大的差别，而晚期凋亡细胞和死亡细胞比例，HA、HA-Septin1组分别是7.74％和9.20％，HA-Septin1-6m是19.42％，差别较明显；HA-Aik2-106m是48.22％，说明Aik2蛋白对细胞生长更加重要。以上结果提示，与对照组相比，Septin1的6突变型更倾向于使细胞发生凋亡或死亡。
本发明的GTP酶蛋白Septin1的反义核酸或者蛋白抑制剂亦可用于制备抗肿瘤药物。
本发明中，所制备的抗肿瘤药物可以是针剂或片剂等。
Septin是一个GTP酶家族，Septin的功能主要围绕在胞质分裂方面。然而，本发明的研究表明Septin1可与调控染色体分离的Aik2(即Aurora-B)相互作用，Aurora-B可以磷酸化Septin1，而Septin1可以反馈促进Aurora-B的磷酸激酶活性。流式细胞仪检测表明，与正常组相比，Septin1突变会导致G2/M期和多倍体的细胞比例均有提高；同时Septin1的突变型更倾向于使细胞发生凋亡或死亡。上述结果说明，Septin1不仅与胞质分裂有关，还可与Aurora-B一起作用于细胞的染色体分裂。因此将Septin1的反义核酸制成药剂，在肿瘤部位释放；或者将Septin1蛋白的抑制剂作用于肿瘤细胞，可促使肿瘤细胞凋亡或者抑制细胞进一步分裂以控制肿瘤生长。
图1为Septin1与Aurora-B体外互作图。
图2为Septin1与Aurora-B体内互作图。
图3为Septin1与Aurora-B的细胞内共定位图。
图4为流式细胞仪检测Septin1及其突变体对细胞周期的影响结果图。其中，6为PCMV-HA空载体对照；7为HA-Septin1；8为ΔSeptin1(在24，206，253，307，312，315位氨基酸残基处突变)；9为ΔAik2(在106位氨基酸残基处突变)；10为ΔAik2突变和ΔSeptin1突变。
图5为流式细胞仪检测Septin1及其突变体对细胞凋亡的影响结果图。其中，11为PCMV-HA空载体对照；12为PCMV-HA-Septin1；13为PCMV-HA-ΔSeptin1(在24，206，253，307，312，315位氨基酸残基处突变)；14为PCMV-HA-ΔAik2(在106位氨基酸残基处突变)；15为PCMV-HA-ΔAik2突变和PCMV-HA-ΔSeptin1突变。
具体实施例方式
实施例1 Septin1与Aurora-B体外互作原核表达GST-Septin1和GST蛋白，并经GST柱亲和纯化。用Myc或者Myc-Aik2(即Aurora-B)转染Hela细胞，培养生长48小时后裂解细胞，将各样品均分成两份，分别与GST-Septin1和GST蛋白孵育，之后加入50μl谷胱甘肽琼脂糖珠子4℃结合过夜。次日用细胞裂解液洗珠子，去除非特异性结合。Western blotting检测结果发现，Myc组没有检测到阳性条带；而Myc-Aik2组检测到了一阳性条带。
实施例2 Septin1与Aurora-B体内互作为进一步验证Aik2和Septin1之间相互作用的可靠性，我们分别构建pCMV-HA-Aik2和pCMV-Myc-Septin1哺乳动物瞬时表达载体，与pCMV-HA或pCMV-Myc空载体共同转染293T细胞，48小时后收细胞，用抗HA多克隆抗体免疫沉淀带HA Tag的靶蛋白，western bloting检测。结果发现pCMV-HA-Aik2和pCMV-Myc-Septin1共转组可检测到一个大小为43KD的阳性条带，符合Myc-Septin1蛋白大小；而pCMV-HA-Aik2和pCMV-Myc共转组及pCMV-Myc-Septin1和pCMV-HA共转组未发现阳性条带，排除了其它因素可能存在的影响，说明Septin1和Aik2之间的相互作用是可靠的。
将各转染组的细胞裂解液用抗HA多抗和proteinA/G agarose孵育后将得到的免疫吸附物用抗Myc抗体检测，结果只在Aik2与Septin1共转组看到一大小为43KD的条带，即Myc-Septin1，说明Aik2能够与Septin1相互结合。
实施例3 Septin1与Aurora-B的细胞内共定位构建pEGFP-N1-Aurora-B和pDs-Red-C1-Septin载体，共转染Hela细胞，24小时后将细胞用3.7％预冷的甲醛/PBS固定10分钟。PBS洗3次，DAPI复染后置于LEICA DM RA2荧光显微镜观察、拍照。结果显示，在有丝分裂的前期、中期、后期及末期均有不同程度的共定位(见图3)，这说明Septin1与Aurora-B在细胞分裂时有相互作用的空间。
实施例4 流式细胞仪检测Septin1及其突变体对细胞周期的影响为了研究人Septin1蛋白突变后会对细胞产生何种效应，将HA-Septin1-6m瞬时转染细胞，作为内源Septin1的dominant-negative形式，另选HA-Septin1和HA空载体作对照。转染72小时后收取细胞，固定、染色后流式细胞仪分析。结果发现HA-Septin1和HA两组之间在G1期(2N)、S期(2N和4N之间)、G2/M期(4N)和多倍体(＞4N)细胞的比例没有明显的差别，HA-Septin1-6m组G2/M期和多倍体的细胞比例均有提高。多倍体的增加说明核分裂和胞质分裂不平衡，胞质分裂不能很好的完成。G2/M期的增加说明有丝分裂受阻，不能顺利完成。
实施例5 流式细胞仪检测Septin1及其突变体对细胞凋亡的影响为检测Septin1及其突变体对细胞生存率及凋亡是否有影响，将Septin1蛋白的野生型HA-Septin1和6突变型HA-Septin1-6m及HA-Aik2-106m瞬时转染Hela细胞，作为内源Septin1和Aik2的dominant-negative形式，另选HA空载体作对照。转染48小时后收取细胞，Annex V试剂盒分析细胞群体的凋亡发生情况。结果发现各组在早期凋亡细胞比例并没有很大的差别，而晚期凋亡细胞和死亡细胞比例，HA、HA-Septin1组分别是7.74％和9.20％，HA-Septin1-6m是19.42％，差别较明显；HA-Aik2-106m是48.22％，说明Aik2蛋白对细胞生长更加重要。以上结果提示，与对照组相比，Septin1的6突变型更倾向于使细胞发生凋亡或死亡。
权利要求
1.一种GTP酶在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，将GTP酶蛋白Septinl应用于制备抗肿瘤药物。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将GTP酶蛋白Septinl的反义核酸或者蛋白抑制剂用于制备抗肿瘤药物。
3.如权利要求1所述应用，其特征在于，该抗肿瘤药物是针剂或片剂。
全文摘要
本发明涉及细胞生物学领域，提供了一种GTP酶蛋白Septin1的新用途，即将其应用于制备抗肿瘤药物。有丝分裂是细胞周期过程中很重要的一个阶段。大多数的肿瘤其发生原因是有丝分裂所致的基因组的不稳定性，基因组的不稳定又来源于染色体的不稳定，染色体的不稳定是癌症的特征性标志。Septin是一个GTP酶家族，研究发现Septin1可与调控染色体分离的Aik2激酶相互作用，因此，可将Septin1应用于制备抗肿瘤药物。同时，可将GTP酶蛋白Septin1的反义核酸或者蛋白抑制剂用于制备抗肿瘤药物。
文档编号A61P35/00GK1907492SQ200510028378
公开日2007年2月7日 申请日期2005年8月1日 优先权日2005年8月1日
发明者祁美雁, 唐丽莎 申请人:复旦大学