专利名称：一种pi3k酶抑制剂的快速筛选方法
技术领域：
本发明涉及药物筛选方法，尤其涉及PI3K酶抑制剂的筛选的方法。
背景技术：
癌症、高血压和血栓病都是人类目前最难克服的几种顽症，亦是世界医学的几大难题。癌症是世界上夺走生命最多的疾病，每年死亡人数有七百万左右。我国癌症年新发病例为200万，因癌症死亡人数为140万，每死亡5人中，即有1人死于癌症。癌症已成为我国城市的第一杀手，农村的第二大死因。高血压是常见高发疾病，据统计到2025年全世界将有超过15亿高血压患者，其中四分之三的患者将来自发展中国家。高血压会导致心血管、脑血管、肾血管以及大血管等病变。血栓病亦是困扰人们的常见疾病。因此针对上述几种疾病的药物开发与研制已成为近年来的重要课题。
PI3Ks(磷酯酰肌醇3-激酶)抑制剂作为这几种疾病治疗的潜在价值引起了广泛关注。PI3Ks主要包括PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kγ和PI3Kδ四种形态。其主要功能包括1)激活PI3Ks/Akt通路控制下游的凋亡抑制蛋白来抑制细胞凋亡，从而诱导了肿瘤细胞的耐药性；2)控制PI3Ks/Akt通路下游蛋白(GSK3，mTOR，Mdm2等)促进细胞增殖；3)磷酸化并激活鸟嘌呤交换因子(GEFs)，如Vav，Tiaml，SOS，P-Rexl，活化的GEFs进一步激活控制细胞游走的关键蛋白Rho-GTPases；4)控制细胞DNA的转录和表达，细胞营养物质的摄取，从而影响到细胞的生长与分裂。药理研究表明，PI3Kγ缺失老鼠对各种炎症和血栓病表现出强烈的抗性，抑制PI3Ks酶活性有助于改善心血管的收缩性和治疗高血压病；反之，高活性的PI3Ks能够促进肿瘤细胞的增殖和抑制肿瘤细胞的调亡。因此PI3Ks酶成为一个重要的疾病治疗靶标，PI3Ks酶抑制剂成为多种疾病治疗的潜在药物。
然而，常规的药物筛选方法需要耗费大量昂贵的PI3Ks酶、磷脂酰肌醇以及药物和使用对人体有害的放射性同位素进行检测(Robertson，2001；Sadhu，2001)，同时又具有很大的盲目性。因此，本领域迫切需要快速、准确和安全的筛选方法，以满足PI3Ks酶抑制剂药物开发的需要。
发明内容
本发明的目的在于建立一种快速、高效的PI3Ks酶抑制剂筛选方法，已弥补本发明的构思是这样的首先运用计算机辅助药物设计技术，建立PI3Ks酶抑制剂的数学模型，对目标化合物进行虚拟筛选；再次建立PI3Ks酶抑制剂的体外筛选模型，对虚拟筛选阳性的化合物进行第二轮生物活性筛选，得到PI3K酶抑制剂。
本发明提供的PI3K酶抑制剂的筛选方法，包括下列步骤(1)虚拟筛选A.用Autodock软件将目标化合物和PI3Kγ进行分子对接，获得目标化合物与PI3Kγ的理论结合自由能；B.用式I计算目标化合物的IC50-LogIC50＝-4.134(±0.825)-0.994(±0.087)×理论结合自由能……式IC.判断IC50≤100μM，结果为阳性，IC50＞100μM，结果为阴性，阳性的化合物进入生物活性筛选；(2)生物活性筛选A.目标化合物处理人前列腺肿瘤细胞PC-3细胞，提取处理后PC-3细胞的总蛋白，用western印迹法显示总蛋白提取液中的磷酸化AKT酶，再用生物电泳图像分析系统定量扫描磷酸化AKT酶条带；目标化合物对PC-3细胞中PI3K酶的抑制率为 B.用目标化合物浓度对PI3K酶抑制率作图，计算目标化合物的IC50；C.判断
IC50≤150μM，结果为阳性，IC50＞150μM，结果为阴性，阳性的化合物即为有效的PI3K抑制剂。
式I代表虚拟筛选的数学模型，是通过如下步骤建立的(1)使用Autodock软件将已知19种PI3Kγ抑制剂和PI3Kγ进行分子对接，获得抑制剂与PI3Kγ的理论结合自由能。所选择的19种PI3Kγ抑制剂分别是
上述19种PI3Kγ抑制剂同位素测活的IC50值见文献(William，1992；Chris，1994；Robertson，2001；Sadhu，2001；Lazaros，2002)，三维结构由软件Cerius2建立，PI3Kγ分子三维结构来自Protein Data Bank库。19种PI3Kγ抑制剂的IC50值以及与PI3Kγ分子进行对接的理论结合自由能总结见表1表1、19种PI3Kγ抑制剂的理论结合自由能和IC50
(2)抑制剂与PI3Kγ的理论结合自由能与它们对PI3Kγ的生物活性(IC50)的关系，见图1。采用偏最小二乘线性回归统计学方法(Fornell，1982)得到两者之间的线性关系方程，由式I表示-LogIC50＝4.134(±0.825)-0.994(±0.087)×理论结合自由能……式In＝19，R＝0.94，F＝129.95，SD＝0.087n代表用于建立该模型的已知抑制剂的数量，R为两变量之间的相关系数，F代表该线性方程的可行度，SD为标准偏差。
本发明所建立得PI3Ks抑制剂筛选方法具有如下优点1)进行western-blot测活前，通过虚拟筛选获得更可靠的潜在抑制剂，从而避免了实验的盲目性，节约实验成本。2)该方法采用虚拟筛选，因此能在短时间内筛选大量的化合物。3)与传统PI3Ks活性测定法不同，该方法不涉及到同位素检测，因此安全可靠。4)该方法除用于筛选目的也可用于指导先导化合物的结构改造。
图1、已知抑制剂LogIC50值同它们与PI3Kγ的理论结合自由能之间的相互关系。
图2、EGCG对PI3Ks酶活性的影响。
具体实施例方式
分子对接分子对接是分子模拟的重要方法之一，其本质是两个或多个分子之间的识别过程，其过程涉及分子之间的空间匹配和能量匹配。分子对接方法在药物设计、材料设计等领域有广泛的应用。Autodock是应用广泛的分子对接程序，由Olson科研组开发。AutoDock应用半柔性对接方法，允许小分子的构像发生变化，以结合自由能作为评价对接结果的依据。
PI3K酶抑制剂细胞筛选模型PI3Ks(磷酯酰肌醇3-激酶)是细胞PI3K/Akt信号传导通路的重要成员，PI3K激酶能间接催化下游信号分子Akt激酶的磷酸化，生成磷酸化Akt激酶。通常，可以用酶促反应终点的产物浓度来反映酶活性，即可以用磷酸化Akt激酶产生的多少，反映PI3K酶的活性。
PC-3细胞是PI3K酶处于活跃状态的人前列腺肿瘤细胞株，在标准的培养条件下，Akt激酶磷酸化程度较高。而在PC-3肿瘤细胞培养基中加入PI3K酶抑制剂，可显著降低Akt激酶磷酸化水平。因此，通过检测PC-3肿瘤细胞中Akt激酶磷酸化水平，可以反映PC-3肿瘤细胞中PI3K酶活性，进而反映PI3K酶抑制剂的抑制活性。
本发明建立了用于PI3K抑制剂的——PC-3细胞/磷酸化Akt激酶——评价模型。在PC-3细胞培养基中加入目标化合物(实验组)，阳性对照药物，同时设置不加药物的阴性对照；培养结束后用western-blot法显示磷酸化Akt激酶条带；用生物电泳图像分析系统进行定量分析，以阴性对照为基准，计算各个组别的磷酸化Akt激酶相对含量，进而算出各个实验组别PI3K酶的抑制率。
通过对目标化合物浓度和相应的抑制率作图，可求得每种化合物的IC50，反映目标化合物作为PI3K酶抑制剂的生物活性。
本发明采用的PI3Kγ三维结构来自Protein Data Bank库，采用文本编辑软件将水和配体除去，目标化合物的三维结构用Cerius2软件建立，AutoDock 3.0版本来源于the Scripps Research Institute Office of Thechology Development。
PC-3肿瘤细胞株购于中国科学研究院；表没食子儿茶素没食子酸酯和槲皮素购于Sigma公司、磷酸化AKT抗体购于Biosourc公司；western-blot印迹法结果采用复日Smartview生物电泳图像分析系统进行定量分析。
下面结合实施例，对本发明做进一步地说明，但本发明并不受限于下述实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、n个目标化合物的虚拟筛选目标化合物三维结构用Cerius2软件建立，在Linux操作系统下用软件AutoDock进行分子对接，测定的理论结合自由能以及根据数学模型(式I)换算的IC50值。
结果显示表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的IC50≤150μM，结果为阳性，其他化合物结果为阴性。
实施例2、EGCG对PI3Ks酶活性的抑制m×10n个PC-3肿瘤细胞接种到35mm的培养皿上，加细胞培养液1ml。加入20μM、40μM和80μM浓度的EGCG作为实验组，加入槲皮素100μM作为阳性对照组，同时设置阴性对照，处理肿瘤细胞株6小时。
药物处理后的细胞用PH＝7.4的冰浴PBS缓冲液洗涤两次。用细胞刮片收集细胞，4000转离心5分钟，去上清液，加1ml冰浴PBS(含蛋白酶抑制剂)，洗涤沉淀，并将细胞悬液转移至Ep管，4℃，14000g离心15秒。细胞沉淀重新悬浮于RIPA细胞裂解液(150mM NaCl、pH 8.0 100mM Tris、1％ Triton X-100、1％ deoxycholic acid、0.1％ SDS和5mM EDTA)中，静置20分钟，12000g离心7分钟，收集上清液于Ep管中备用。
按DC蛋白定量试剂盒(Bio-Rad公司)操作说明测定蛋白质浓度。配制试剂A，每毫升试剂A中添加20μl试剂S。配制不同浓度的蛋白标准品。移取5μl不同浓度的蛋白标准品和样品至Ep管，每管添加25μl试剂A’和250μl试剂B，摇均匀。15分钟后，在波长750nm下测定吸光度，作标准曲线，测定蛋白质含量。
取等量蛋白100μg，用7％SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白，而后从SDS-聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，封闭硝酸纤维素滤膜的免疫球蛋白结合位点。室温下，将5ml一抗(磷酸化AKT抗体，Biosourc公司)溶液加入至自封袋中。4℃下过夜。按常规方法加入二抗，用ECL试剂显影。结果见图2。
western-blot印迹法结果采用复日Smartview生物电泳图像分析系统进行定量分析，评价被筛选化合物的生物活性，EGCG在80μM浓度下能抑制45％的PI3Ks酶活性，体现出量效关系。
文献资料显示，目前世界上还没有关于这种化合物对PI3Ks酶有抑制作用的报道。本发明首次采用理论和实验相结合的方法筛选PI3Ks酶抑制剂。该方法可用于筛选化合物单体，也可用于指导先导化合物的改造。
权利要求
1.一种PI3K酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤(1)虚拟筛选A.用软件将目标化合物和PI3Kγ进行分子对接，获得目标化合物与PI3Kγ的理论结合自由能；B.用式I计算目标化合物的IC50-LogIC50＝-4.134(±0.825)-0.994(±0.087)×理论结合自由能……式IC.判断IC50≤100μM，结果为阳性，IC50＞100μM，结果为阴性，阳性的化合物进入生物活性筛选；(2)生物活性筛选A.目标化合物处理人前列腺肿瘤细胞PC-3细胞，提取处理后PC-3细胞的总蛋白，用western印迹法显示总蛋白提取液中的磷酸化AKT酶，再用生物电泳图像分析系统定量扫描磷酸化AKT酶条带；目标化合物对PC-3细胞中PI3K酶的抑制率为 B.用目标化合物浓度对PI3K酶抑制率作图，计算目标化合物的IC50；C.判断IC50≤150μM，结果为阳性，IC50＞150μM，结果为阴性，阳性的化合物即为有效的PI3K酶抑制剂。
2.表没食子儿茶素没食子酸酯作为PI3K酶抑制剂的应用。
全文摘要
本发明公开了一种PI3K酶抑制剂筛选的方法首先运用计算机辅助药物设计技术，使用Autodock软件将目标化合物和PI3Kγ进行分子对接，对目标化合物进行虚拟筛选；再次建立PI3Ks酶抑制剂的筛选模型，用western印迹法测定目标化合物对PI3K酶抑制率，对目标化合物进行第二轮生物活性筛选，得到PI3K酶抑制剂。本发明的PI3K酶抑制剂筛选方法快速、经济，而且不使用同位素，安全性更好。
文档编号A61P9/12GK1730665SQ200510028409
公开日2006年2月8日 申请日期2005年8月3日 优先权日2005年8月3日
发明者魏东芝, 匡荣仁 申请人:华东理工大学