抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌1gG抗体及制备方法

专利名称：抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌1gG抗体及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗体及其制备方法，特别是一种抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌IgG抗体及制备方法。
背景技术：
溶血性链球菌有许多不同的种和型的菌株，它们除了有各自特异性的抗原或称识别抗原外，还存在着不同程度及不同数量的共同抗原；葡萄球菌属也是如此，不同的种和型的菌株之间有着共同抗原的存在；白色念珠菌不同的种和型的念珠菌菌株之间存在着共同抗原。根据这个原理，我们使用少数几株溶血性链球菌、葡萄球菌以及白色念珠菌免疫产蛋母鸡，此鸡产生的特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌的鸡IgG抗体就可以不但与免疫的细菌菌株产生特异性抗原—抗体反应，而且也能够与不同种和型的具有共同抗原，即共同抗原决定簇的菌株产生抗原—抗体反应。当鸡IgG抗体与细菌表面抗原发生抗原—抗体反应时，就可能改变细菌表面结构、抑制细菌的一些功能活性、抑制细菌生长、减少和抑制细菌对细胞的黏附、促进分叶核细胞和巨噬细胞等吞噬细胞对细菌的吞噬和清除。不仅如此，临床上使用特异性鸡IgG抗体预防龋齿和治疗婴幼儿轮状病毒性腹泻(Randomized，placebo-controlled，clinical trial ofhyperimmunized chicken egg yolk immunoglobulin in children with rotavirus diarrhea.J PediatrGastroenterol Nutr.2001 Jan；32(1)19-25)，预防胆囊纤维化患者绿脓杆菌感染(Oraladministration of specific yolk antibodies(IgY)may prevent Pseudomonas aeruginosa infections inpatients with cystic fibrosisA phase I feasibility study.Pediatr Pulmonol.2003 Jun；35(6)433-40)，减轻幽门螺杆菌引起的胃炎(Effect of dietary anti-Helicobacter pylori-urease immunoglobulin Yon Helicobacter pylori infection.Aliment Pharmacol Ther 2004 Jul；20 Suppl 1185-92)，甚至保护猴子不被内毒素B损害(Retention of specific yolk IgY in the human oral cavity.BioDrugs.2002；16(6)433-7)。
特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体与抗菌素作用原理不同，其与细菌表面相应抗原发生特异性结合，改变了该抗原的状态，封闭了抗原的功能和影响细菌的活性；遮蔽了细菌表面与组织、细胞结合的受体，阻止细菌粘附于组织、细胞，排斥了细菌在炎症部位的存在；改变了细菌表面结构和电场，促进分叶核细胞和巨噬细胞等吞噬细胞对细菌的吞噬和清除，同时又完全不会诱发耐药菌株的产生。因此在当今抗菌素滥用和广泛的耐药菌株存生的情况下，更显示出特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体制剂的重要性和可行性。根据上述特异性鸡IgG抗体的作用原理，特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体制剂能够有效地治疗所有由溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌，以及具有与这三种菌有共同抗原决定簇的细菌和真菌引起的上呼吸道感染性炎症，如急，慢性鼻炎、鼻窦炎、扁桃体炎、咽炎、喉炎、支气管炎等。

发明内容
本发明的目的是提供一种特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌IgG抗体及其制备方法，并用这种抗体治疗由溶血性链球菌和葡萄球菌，以及白色念珠菌引起的上呼吸道感染性炎症，如急，慢性鼻炎、鼻窦炎、扁桃体炎、咽炎、喉炎、支气管炎等。
本发明的目的可以采取以下方法来实现一种抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌IgG抗体，其特征是它由以下方法取得(1)免疫原制备取致病的溶血性链球菌及溶血性链球菌菌体碎片50～70份，葡萄球菌及葡萄球菌菌体碎片20～40份、白色念珠菌及白色念珠菌菌体碎片10～20份混合成菌液；将等量体积的菌液与等量体积的福氏完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌免疫原；将等量体积的菌液与等量体积的福氏不完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂溶血性链球菌、葡萄球菌和白色念珠菌免疫原；每毫升福氏完全佐剂免疫原和福氏不完全佐剂免疫原中，均含有细菌21亿～27亿；(2)免疫将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉多点注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射1ml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉多点注射给产蛋母鸡，使用福氏不完全佐剂免疫原加强免疫二次后，每隔三周再使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉多点注射给产蛋母鸡加强免疫二次，前后共免疫五次；第一次免疫后第30天收集免疫母鸡的鸡蛋。第一次免疫后第30天至第300天的免疫母鸡的鸡蛋均有高效价的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体；(3)抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗提取物的制备收集免疫30天后的免疫母鸡的鸡蛋，鸡蛋表面用酒精消毒，取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1∶7～9的比例加蒸馏水，充分搅拌，并用1N HCl调节酸碱度至pH5.0～5.2，在温度4℃下静置10小时；将蛋黄稀释液高速离心30分钟，取上清，将蛋黄稀释液上清置于截留分子量为100kDa的中空纤维超滤器中超滤浓缩5～8倍，然后加入0.02％～2.0％的葡萄糖酸氯己定充分搅拌，并使用1N NaOH调节酸碱度至pH7.0～7.5，并在温度4℃下静置10小时；此后高速离心15分钟，取上清，除去脂质物质，将上清经0.45μ～0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，即得抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗提取物。
所述的免疫原制备中的溶血性链球菌及溶血性链球菌菌体碎片是乙型溶血性链球菌及菌体碎片，所述的葡萄球菌及葡萄球菌菌体碎片是金黄色葡萄球菌及菌体碎片。
所述的免疫原制备中的细菌与菌体碎片的比例是细菌50～80份，菌体碎片20～50份。
所述的免疫中的产蛋母鸡包括普通环境下饲养、清洁环境下饲养、以及SPF环境下饲养的家庭土鸡、白毛乌骨鸡、海兰褐鸡、莱杭鸡、罗曼鸡、明星鸡。
抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌IgG抗体的制备方法包括如下步骤将除去脂质物质后的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗提取物加硫酸胺至55％的饱和度，充分搅拌，室温静置4～12小时，然后高速离心10分钟，取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至33％的饱和度，充分搅拌，室温静置4～12小时，然后高速离心10分钟，取沉淀，用蒸馏水溶解后装入透析袋，用蒸馏水透析除盐，即得抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗纯品。
还包括如下步骤加入药学上可接受的附加剂制成含有抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的喷雾剂、气雾剂、滴鼻液和含片。
按本发明的方法提取的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗提取物的纯度，经非还原性SDS-PAGE测定，鸡IgG抗体的纯度达到30％以上(≥30％)；而经过本发明的方法提取的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗纯品的纯度，经非还原性SDS-PAGE测定，鸡IgG抗体的纯度达到85％以上(≥85％)。
按本发明的方法提取的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗提取物的生物学效价，经ELISA(酶联免疫吸附实验)方法测定，特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌的鸡IgG抗体结合溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌混合抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的效价大于或等于1∶512，即效价≥1∶512/mg蛋白，或者称粗提取物里每毫克蛋白中特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌的鸡IgG抗体的比活为≥1∶512；而按本发明的方法提取的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗纯品的生物学活性，即效价，经ELISA(酶联免疫吸附实验)方法测定，特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌的鸡IgG抗体结合溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌混合抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的效价大于或等于1∶2048，即效价≥1∶2048/mg蛋白，或者称粗纯品里每毫克蛋白中特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌的鸡IgG抗体的比活为≥1∶2048。
按本发明的方法制取的特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体局部施于鼻腔、口腔、咽、喉及支气管黏膜，既无全身用药的局限性和副作用，又有局部用药起效快、用药量少、疗效好、不吸收、不破坏鼻腔、口腔、咽、喉、支气管内正常菌群的生态环境、不导致局部菌群失调等效果，还无毒副作用，更无抗菌素局部使用易产生耐药性等问题。鸡IgG抗体不激活补体系统，不与类风湿因子产生非特异性结合，不固定金黄色葡萄球菌A蛋白，不与蛋白G，以及人类细胞FC受体结合，因而不易发生变态反应。抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体提取物不产生急性毒性反应和慢性毒性反应，属于实际无毒级；抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体提取物三致试验阴性，属于无致畸、致癌、致突变的制品。
具体实施例方式
下面结合实施例详细描述本发明的实现方案。
实施例1制备500克抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗提取物生产工艺流程(1)免疫原的制备来自于急性扁桃体炎患者扁桃体炎症部位分离的溶血性链球菌、葡萄球菌和白色念珠菌，经血基础培养基加10％的新鲜羊血的血平板和胰胨肉汤培养基，以及沙氏琼脂培养基分离培养和扩增培养的溶血性链球菌、葡萄球菌、白色念珠菌，经鉴定确认为溶血性链球菌、葡萄球菌和白色念珠菌。将上述菌体经石炭酸灭活处理。另外，用超声波粉碎机将细菌菌体超声粉碎30分钟，使细菌菌体粉碎裂解成细小的和/或分子的碎片。
溶血性链球菌及溶血性链球菌碎片、葡萄球菌及葡萄球菌碎片、白色念珠菌及白色念珠菌碎片均按60∶30∶10数量份混合。其中细菌与菌体碎片的比例为细菌70份，菌体碎片30份。
将200ml的菌液与200ml的福氏完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂免疫原。福氏不完全佐剂免疫原的制备则为将200ml的菌液与200ml的福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂免疫原。每毫升免疫原中含有细菌21亿；(2)免疫产蛋母鸡使用注射器将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉数十点注射给27周的海兰褐产蛋母鸡，每只注射1ml免疫原，然后隔一周使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉多点注射给产蛋母鸡，共二次，此后每隔三周再使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉多点注射给产蛋母鸡加强免疫共二次，前后共免疫五次，免疫母鸡总数为300只；(3)抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗提取物的制备收集第一次免疫后60～80天的免疫母鸡的鸡蛋，使用70％的酒精进行鸡蛋表面消毒，取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1∶9的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用1N HCl调节酸碱度至pH5.0，放置4℃冰柜10小时；然后将蛋黄稀释液高速离心10000rpm，30分钟，取上清，将上清置于截留分子量100kDa的中空纤维超滤器中超滤浓缩8倍，然后加入1.0％的葡萄糖酸氯已定充分搅拌，并使用1NNaOH调节酸碱度至pH7.0～7.5，并放置4℃ 10小时，此后高速离心10000rpm，15分钟，取上清，除去脂质物质，将上清经0.45μ～0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，即得抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗提取物；抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗提取物经ELISA(酶联免疫吸附实验)方法测定，粗提取物中每毫克蛋白里的鸡IgG抗体的效价为1∶1024/mg蛋白，或者称粗提取物中每毫克蛋白中的鸡IgG抗体的比活为1∶1024。在鸡IgG抗体粗提取物中，鸡IgG抗体的纯度经非还原性SDS-PAGE测定为32.1％。
实施例2制备500克抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗纯品生产工艺流程(1)免疫原的制备来自于急性扁桃体炎患者扁桃体炎症部位分离的乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌，经血基础培养基加10％的新鲜羊血的血平板和胰胨肉汤培养基，以及沙氏琼脂培养基分离培养和扩增培养的乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌，经鉴定确认为乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌。将上述菌体经石炭酸灭活处理。另外，用超声波粉碎机将细菌菌体超声粉碎30分钟，使细菌菌体粉碎裂解成细小的和/或分子的碎片。
乙型溶血性链球菌及乙型溶血性链球菌碎片、金黄色葡萄球菌及金黄色葡萄球菌碎片、白色念珠菌及白色念珠菌碎片均按55∶30∶15数量份混合。其中细菌与菌体碎片的比例为细菌60份，菌体碎片40份。
将500ml的菌液与500ml的福氏完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂免疫原。福氏不完全佐剂免疫原的制备则为将500ml的菌液与500ml的福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂免疫原。每毫升免疫原中含有细菌21亿；(2)免疫产蛋母鸡使用注射器将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉数十点注射给27周的海兰褐产蛋母鸡，每只注射1ml免疫原，然后隔一周使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉多点注射给的产蛋母鸡，共二次，此后每隔三周再使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉多点注射给产蛋母鸡加强免疫共二次，前后共免疫五次，免疫母鸡总数为800只；(3)抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗提取物的制备收集第一次免疫后60～80天的免疫母鸡的鸡蛋，使用70％的酒精进行鸡蛋表面消毒，取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1∶9的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用1N HCl调节酸碱度pH5.0，放置4℃冰柜10小时；然后将蛋黄稀释液高速离心10000rpm，30分钟，取上清，将上清置于截留分子量100kDa的中空纤维超滤器中超滤浓缩8倍，然后加入1.0％的葡萄糖酸氯己定充分搅拌，并使用1NNaOH调节酸碱度至pH7.0～7.5，并放置4℃10小时，此后高速离心10000rpm，15分钟，取上清，除去脂质物质，即得抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗提取物；将除去脂质物质后的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗提取物加硫酸胺至55％的饱和度，充分搅拌，室温静置4小时，然后高速离心10000rpm 10分钟，取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至33％的饱和度，充分搅拌，室温静置4小时，然后高速离心10000rpm 10分钟，取沉淀，用蒸馏水稀释溶解后装入透析袋，用蒸馏水透析除盐，即得抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗纯品；抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗纯品经ELISA方法测定，抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗纯品中每毫克蛋白的特异性鸡IgG抗体的效价为1∶2048/mg蛋白，或者称抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗纯品里每毫克蛋白中的特异性鸡IgG抗体的比活为1∶2048。在鸡IgG抗体粗纯品中，鸡IgG抗体的纯度经非还原性SDS PAGE测定为91.6％。
实施例3抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的口腔喷雾剂、气管气雾剂抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗提取物 0.20％薄荷脑 0.12％鲜柳橙香精 0.35％苹果香精 0.20％香兰精 0.20％甜味素 0.20％蒸馏水 补充至100ml先用95％的乙醇溶解薄荷脑至12％的原液，然后依次加入上述成分，最后将蒸馏水补充至100ml，经0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，无菌灌装入消毒的喷雾剂和气雾剂的罐中。
实施例4
抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的滴鼻剂抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗提取物 0.30％鲜柳橙香精0.20％甜味素0.10％蒸馏水补充至100ml将60ml蒸馏水加入烧杯中，再依次加入上述成分，最后将蒸馏水补充至100ml，经0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，无菌灌装入消毒的滴鼻剂的瓶中。
实施例5抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的含片抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体提取物 1.0％薄荷脑 0.20％鲜柳橙香精 0.50％苹果香精 0.30％香兰精 0.40％羧甲基纤维素 0.15％硬脂酸镁 0.10％山梨醇 补充至100g将上述含片药物低温制粒，然后压成不同形状的口含片，每片0.5g。
实施例6抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗纯品的口腔喷雾剂、气管气雾剂抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗纯品 0.05％薄荷脑0.12％鲜柳橙香精0.35％苹果香精 0.20％香兰精0.20％甜味素0.20％蒸馏水补充至100ml
(表3)试验结果

实验例2溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌三种菌免疫原按本发明的方法免疫海兰褐产蛋母鸡，取第一次免疫后60～80天的免疫母鸡的鸡蛋，并按本发明的方法制备出抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的粗纯品，应用ELISA方法测定抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体结合不同抗原的生物学效价(见表2)表2抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗纯品的效价

根据上述实验结果可以清楚地看到(1).按本发明的方法制备出抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的粗纯品要比实验例1中的按本发明的方法制备出抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的粗提取物的特异性鸡IgG抗体结合溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌三种菌混合抗原和溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌三种细菌和真菌各自抗原的生物学效价都要高，基本是按比例增加；(2).溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌三种菌混合免疫原免疫产蛋母鸡，可以产生分别抗三种细菌和真菌的特异性鸡IgG抗体；(3).根据免疫产蛋母鸡时每种细菌使用的剂量不同(即比例不同)，所产生的各自特异性鸡IgG抗体的效价也不相同，免疫剂量大的细菌产生鸡IgG抗体的效价也高，反之则低；(4).抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体与溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌三种菌的混合抗原都能起反应，而且总的特异性鸡IgG抗体的效价也增加了，其效价有一定的叠加作用；(5).由上述实验可见，一种抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体可以治疗由上述三种菌引起的急，慢性鼻炎、鼻窦炎、扁桃体炎、咽炎、喉炎、支气管炎等；(6).同时也可以用一种抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体治疗由上述三种菌中的任何一种细菌或真菌引起的急，慢性鼻炎、鼻窦炎、扁桃体炎、咽炎、喉炎、支气管炎等；(7).由此还可以扩大到由与上述三种菌有共同抗原决定簇的细菌和真菌引起的急，慢性上呼吸道感染性疾病，如急，慢性鼻炎、鼻窦炎、扁桃体炎、咽炎、喉炎、支气管炎等，都可以使用本发明的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体治疗。
实验例3比较不同鸡种的免疫应答和产生抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的能力以权利要求1所述的一种特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗提取物的制备方法，分别免疫规模化笼养海兰褐产蛋母鸡和莱杭产蛋母鸡，以及放养的产蛋土鸡，采用第一次免疫后60～80天的免疫母鸡的鸡蛋，并按权利要求1所述的方法提取抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的粗提取物，应用ELISA方法测定抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体结合抗原的生物学效价，结果见表3表3不同鸡种的产蛋母鸡对同一抗原的免疫应答能力及特异性鸡IgG抗体效价

根据上述实验结果可以清楚地看到在相同的免疫条件下，按本发明的方法制备出的不同鸡种的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的粗提取物，其特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的生物学效价基本一致，其中只有土鸡在不同的批次制备的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的粗提取物中，特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的生物学效价稍有变化，但差异不显著。
实验例4按本发明的方法制备出的溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌的菌体及溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌的菌体+菌体碎片等两种免疫原免疫海兰褐产蛋母鸡，并分别制备出抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌菌体鸡IgG抗体粗提取物和抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌的菌体+菌体碎片鸡IgG抗体粗提取物，应用ELISA方法测定它们抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌的混合抗原的结合生物学效价，结果见表4表4不同免疫原诱导的海兰褐母鸡特异性IgG结合三种细菌的生物学效价

根据上述实验结果可以清楚地看到在相同的免疫条件下，按本发明的方法制备出溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌菌体和溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌菌体+菌体碎片等两种不同免疫原免疫海兰褐产蛋鸡，并制备出第一次免疫后60～80天免疫母鸡的鸡蛋的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌菌体鸡IgG抗体粗提取物和抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌菌体+菌体碎片鸡IgG抗体粗提取物等两种鸡IgG抗体。这两种鸡IgG抗体分别与溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌菌体抗原反应，结果这两种鸡IgG抗体生物学结合效价有一定的差异，其中抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌菌体+菌体碎片的鸡IgG抗体的生物学结合效价更高和更稳定，而抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌菌体的鸡IgG抗体的生物学结合效价则批次之间有差异，从1∶512/mg蛋白-1∶1024/mg蛋白。这些结果说明溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌菌体+菌体碎片免疫原的效果比单纯溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌菌体免疫原的效果要更好。
实验例5溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌菌体+菌体碎片免疫原数十点肌肉和皮下注射免疫与单纯数点肌肉注射或单纯数点皮下注射免疫的免疫效果比较，结果见表5
表5不同免疫方式诱导的海兰褐母鸡产生的特异性IgG抗体的生物学效价比较

根据上述实验结果可以清楚地看到按本发明的方法制备的相同的免疫原以不同的免疫方式免疫相同海兰褐产蛋母鸡，并按本发明的方法制备出第一次免疫后60～80天免疫母鸡的鸡蛋的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的粗提取物，其抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的生物学效价要数本发明的数十点肌肉和皮下注射免疫的方式所产生的生物学效价最高，因此本发明的免疫方法最好。
实验例6溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌菌体+菌体碎片免疫原数十点肌肉和皮下注射免疫与单纯数点肌肉注射或单纯数点皮下注射免疫所产生的高生物学效价特异性鸡IgG抗体的时间长短的比较，结果见表6表6不同免疫方式诱导的海兰褐母鸡产生高效价的特异性IgG抗体的时间比较

根据上述实验结果可以清楚地看到按本发明的方法制备的相同的免疫原以不同的免疫方式免疫相同海兰褐产蛋母鸡，并按本发明的方法制备出第一次免疫后280～300天免疫母鸡的鸡蛋的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的粗提取物。通过ELISA方法测定长达9～10个月时间的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的效价变化，结果发现数十点肌肉和皮下注射免疫的方法，其在9～10个月后特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体效价下降不明显，而单纯数点肌肉注射或单纯数点皮下注射免疫的母鸡产生特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的能力明显下降，特异性鸡IgG抗体效价也明显下降。这进一步说明，本发明的数十点肌肉和皮下注射免疫的方式在高效价的特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体产生的时间长短方面有着显著优势，效果明显好于其它两种方法。
实验例7本发明的五次免疫注射的方法与传统的三次免疫注射的方法的效果比较，结果见表7表7不同免疫次数诱导的海兰褐母鸡产生高效价的特异性IgG抗体能力的比较

根据上述实验结果可以清楚地看到按本发明的五次免疫方法免疫的海兰褐产蛋母鸡与传统的三次免疫方法免疫的海兰褐产蛋母鸡比较其特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的产生能力，并按本发明的方法制备出第一次免疫后60～80天的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗提取物和280～300天的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗提取物。通过ELISA方法测定不同时间的两种免疫方法所诱导的特异性鸡IgG抗体的生物学效价，结果表明两种免疫方法在首次免疫后第60～80天的时间里产生的特异性鸡IgG抗体的生物学效价变化并不大，本发明的五次免疫方法略微比传统的三次免疫方法要好一点；但是在长达280～300天的时间后，本发明的五次免疫方法要比传统的三次免疫方法好很多，其特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的生物学效价与之相比有十分显著的差异。本发明的五次免疫方法所免疫的母鸡产生高效价的特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的时间更长。
实验例8溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌等三种细菌和真菌不同组成比例对特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体产生的影响，结果见表8表8三种菌不同组成比的免疫原诱导海兰褐母鸡产生特异性鸡IgG抗体的比较

根据上述实验结果可以清楚地看到按本发明的方法制备的相同的免疫原虽然溶血性链球菌、葡萄球菌和白色念珠菌等三种细菌和真菌组成比例不同，但免疫产蛋海兰褐母鸡后，并按本发明的方法制备出第一次免疫后60～80天免疫母鸡的鸡蛋的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的粗提取物，其抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌混合抗原的鸡IgG抗体的生物学效价基本是一致的。这说明虽然溶血性链球菌、葡萄球菌和白色念珠菌等三种细菌和真菌组成比例不同，但产生总的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的生物学效价不变。
实验例9溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌等三种细菌和真菌不同组成比例对分别抗溶血性链球菌，抗葡萄球菌和抗白色念珠菌的鸡IgG抗体产生的影响，结果见表9
表9三种菌不同组成比对抗三种不同细菌和真菌的特异性鸡IgG抗体的影响

根据上述实验结果可以清楚地看到溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌等三种细菌和真菌不同组成比例分别按本发明的方法制备免疫原，免疫产蛋海兰褐母鸡，并按本发明的方法制备出第一次免疫后60～80天免疫母鸡的鸡蛋的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的粗提取物，其抗溶血性链球菌的抗体效价，抗葡萄球菌的抗体效价，以及抗白色念珠菌抗体效价分别随不同的细菌和真菌免疫剂量的增减而发生基本相同的抗体效价的增减变化。这些抗体效价的变化都在有效鸡IgG抗体活性范围内增减，这说明虽然溶血性链球菌、葡萄球菌和白色念珠菌等三种细菌和真菌组成比例不同，但它们诱导鸡产生抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌的鸡IgG抗体的生物学效价仍在有效范围。
实验例10抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体对中性粒细胞吞噬金黄色葡萄球菌的影响本发明的方法制备出第一次免疫后60～80天免疫母鸡的鸡蛋的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗提取物与活金黄色葡萄球菌或灭活金黄色葡萄球菌及人耳垂血或静脉血，在37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中共同孵育30分钟，结果促进了人耳垂血和静脉血中性粒细胞吞噬活金黄色葡萄球菌和灭活金黄色葡萄球菌。中性粒细胞的吞噬率随着IgY浓度的升高而增加，见表10，表11，表12表10特异性鸡IgG抗体对耳垂血中性粒细胞吞噬灭活金黄色葡萄球菌的作用

注1、细胞吞噬率(％)1组∶3组 t＝0.009；1组∶2组 t＝0.048；2组∶3组 t＝0.026。
2、吞噬指数1组∶3组 t＝0.008；1组∶2组 t＝0.760；2组∶3组 t＝0.057。
表11特异性鸡IgG抗体对静脉血中性粒细胞吞噬灭活的金黄色葡萄球菌的作用1(序列号1)、肽2(序列号2)、肽3(序列号3)。这些肽的质谱分析的结果如下表1所示。
表1

表1的质谱分析的结果和蛋白质定序仪的结果一致，因而鉴定了本发明的肽的序列。
制剂例1化妆水配合以下各成份，按照通常的方法调制成化妆水。
乙醇 5重量％甘油 4重量％BG(1，3-丁二醇)4重量％实施例1所获得的蜂王浆蛋白质酶分解物0.5重量％柠檬酸 适量柠檬酸钠 适量净化水 残余制剂例2保健药水配合以下各成份，按照通常的方法调制成保健药水。
水 88重量％葡萄糖 10重量％抗坏血酸钠 4重量％实施例1所获得的蜂王浆蛋白质酶分解物1重量％柠檬酸 适量EDTA2Na0.5重量％
权利要求
1.一种抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌IgG抗体，其特征是它由以下方法取得(1)免疫原制备取致病的溶血性链球菌及溶血性链球菌菌体碎片50～70份，葡萄球菌及葡萄球菌菌体碎片20～40份、白色念珠菌及白色念珠菌菌体碎片10～20份混合成菌液；将等量体积的菌液与等量体积的福氏完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌免疫原；将等量体积的菌液与等量体积的福氏不完全佐剂混合，搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂溶血性链球菌、葡萄球菌和白色念珠菌免疫原；每毫升福氏完全佐剂免疫原和福氏不完全佐剂免疫原中，均含有细菌21亿～27亿；(2)免疫将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉多点注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射1ml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉多点注射给产蛋母鸡，使用福氏不完全佐剂免疫原加强免疫二次后，每隔三周再使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉多点注射给产蛋母鸡加强免疫二次，前后共免疫五次；(3)抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗提取物的制备收集免疫30天后的免疫母鸡的鸡蛋，鸡蛋表面用酒精消毒，取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1∶7～9的比例加蒸馏水，充分搅拌，并用1N HCl调节酸碱度至pH5.0～5.2，在温度4℃下静置10小时；将蛋黄稀释液高速离心30分钟，取上清，将蛋黄稀释液上清置于截留分子量为100kDa的中空纤维超滤器中超滤浓缩5～8倍，然后加入0.02％～2.0％的葡萄糖酸氯己定充分搅拌，并使用1N NaOH调节酸碱度至pH7.0～7.5，并在温度4℃下静置10小时；此后高速离心15分钟，取上清，除去脂质物质，将上清经0.45μ～0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，即得抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗提取物。
2.根据权利要求1所述的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌IgG抗体，其特征是所述的免疫原制备中的溶血性链球菌及溶血性链球菌菌体碎片是乙型溶血性链球菌及菌体碎片，所述的葡萄球菌及葡萄球菌菌体碎片是金黄色葡萄球菌及菌体碎片。
3.根据权利要求1所述的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌IgG抗体，其特征是所述的免疫原制备中的细菌与菌体碎片的比例是细菌50～80份，菌体碎片20～50份。
4.根据权利要求1所述的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌IgG抗体，其特征是所述的免疫中的产蛋母鸡包括普通环境下饲养、清洁环境下饲养、以及SPF环境下饲养的家庭土鸡、白毛乌骨鸡、海兰褐鸡、莱杭鸡、罗曼鸡、明星鸡。
5.如权利要求1所述的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌IgG抗体的制备方法，其特征是包括如下步骤将除去脂质物质后的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗提取物加硫酸胺至55％的饱和度，充分搅拌，室温静置4～12小时，然后高速离心10分钟，取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至33％的饱和度，充分搅拌，室温静置4～12小时，然后高速离心10分钟，取沉淀，用蒸馏水溶解后装入透析袋，用蒸馏水透析除盐，即得抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体粗纯品。
6.根据权利要求4所述的抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌IgG抗体的制备方法，其特征是还包括如下步骤加入药学上可接受的附加剂制成含有抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体的喷雾剂、气雾剂、滴鼻液和含片。
全文摘要
本发明公开了一种特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌的鸡IgG抗体及其制备方法。它是使用溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌的菌体和细菌碎片，制备成福氏完全佐剂免疫原和福氏不完全佐剂免疫原，经皮下多点免疫产蛋母鸡，从免疫的母鸡鸡蛋黄中应用水稀释法粗提取鸡IgG抗体，应用硫酸胺盐析法纯化鸡IgG抗体，获得抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体。使用本发明特异性抗溶血性链球菌、葡萄球菌及白色念珠菌鸡IgG抗体配制的制品，如喷雾剂、气雾剂、滴鼻液、含片等，可以用于治疗由链球菌和葡萄球菌以及白色念珠菌引起的上呼吸道感染性炎症，如急，慢性鼻炎、鼻窦炎、扁桃体炎、咽炎、喉炎、支气管炎等。
文档编号A61P31/00GK1680445SQ200510031150
公开日2005年10月12日 申请日期2005年1月12日 优先权日2005年1月12日
发明者胡国柱, 李松, 聂荣庆, 李清, 邓水生, 张进, 李建芳 申请人:江西3L医用制品集团有限公司