专利名称：含蜂胶佐剂的人用疫苗及其制备方法
所属领域本发明涉及疫苗及其制备方法。具体地说，是涉及蜂胶提取、纯化达到“三脱一溶”(脱铅、脱敏、脱色，溶于水)的要求；并用纳米技术裂解的含蜂胶佐剂的人用疫苗及其制备方法，属于生物药品领域。
背景技术：
蜂胶是蜜蜂从胶源植物新生枝叶芽或树皮上或花蕾处采集的树胶(树脂类物质)，混以蜜蜂上腭腺及蜡腺分泌物的腊质加工而成的芬香性不透明的胶状固体，它是经蜜蜂反复加工涂到蜂巢入口、内壁，以保持巢内相对无菌状态的胶块状物质。所以蜂胶是蜜蜂生命延生的物质基础。当蜂王产卵前，蜜蜂预先在巢房内涂抹蜂胶，蜂王只在涂过蜂胶的巢房里产卵。由于有了蜂胶的保护与营养，加上蜜蜂的哺育及充足的食料供应，经过产卵、孵化、幼虫，蛹这一发育过程，很快成长为新的蜜蜂个体。蜂胶是蜜蜂的神奇药品，无论是野生还是家养的蜜蜂，都必须经历幼龄、青年、壮年、老年的生命过程，在这一过程中也会受到细菌、真菌、霉菌、病毒，病原虫的侵害，蜜蜂的抗病力与自愈力特别强，因为他们拥有蜂胶。当蜂场到没有胶源植物放蜂时，蜂群中的蜂胶消耗殆尽，蜜蜂抗感染能力下降，便会爆发毁灭性的“幼虫腐臭病”，即使大剂量抗生素也很难奏效，当蜂场来到有胶源植物的场地，蜜蜂生产并使用蜂胶，“幼虫腐臭病”自然治愈，蜜蜂生命群体蓬勃发展。可见蜂胶是天然消毒剂，天然防腐剂。蜜蜂生产的蜂胶，主要储存于巢内蜂路两边与顶部，以及蜂巢缝隙处。当蜜蜂从野外工作回巢，要通过三面都有蜂胶的蜂路，就完成了严格的消毒杀菌，蜂巢缝隙处的蜂胶，相当于一道消毒杀菌，保护蜂群免受外界不良因素侵害的屏障。野生或家养的蜜蜂每群有好几万只，它们群居的蜂巢内阴暗潮湿，空间狭小，存有大量营养丰富的蜂产品，湿度等条件非常适合微生物生长。但是，蜂巢内非常清洁，卫生状况极好，永远不会发现任何发霉变质的东西，蜂巢内贮存有大量的蜂产品，老鼠，蜥蜴等小动物偶尔会侵入掠食，蜜蜂立即群起而攻之，将其蛰死后在尸体表面涂一层蜂胶。于是尸体就不会腐败了，这都是蜂胶的功效。因此人们称蜂胶是蜜蜂王国的“保护神”。蜂胶是天上众神通过蜜蜂给人类带来的至高无尚的治疗“仙丹”，是药物成份高度浓缩物。
蜂胶的有效成分是树脂(55％)、蜂蜡(30％)、精油(10％)与花粉(5％)所组成的混合物。树脂是植物的分泌物含有许多具有抗氧化作用的类黄酮素。蜂胶里含有其特有的芳香味，就是来自植物的精油，而这些香精亦具有疗效。蜂胶中主要作用的功效成份是黄酮类化合物，目前已经分离确认的就有30多种。还有阿魏酸等10多种芳香酸，香豆酸苯乙酯等30多种芳香酯，当归酸等30多种脂肪酸及酯类化合物，赖氨酸等20多种氨基酸，没药醇等10多种萜烯类化合物，锌等30多种矿物质，维生素P等多种维生素，胰蛋白酶等多种活性酶；目前，科技工作者已经基本搞清了蜂胶的组成成份，是一种稀有珍贵的蜂产品，一般情况下每群蜂几万只每天只能生产生0.2克左右。
神奇的蜂胶具有天然的防腐、抑菌、杀菌、抗病毒作用，提高机体免疫能力，抑制肿瘤细胞，镇痛，降低血糖功能。所以有着广泛的医疗和保健作用。因此，我国权威药典《中华本草》列举蜂胶有八大功效抗病原微生物；增强免疫功能；调节神经机能；促进组织修复；改善血液循环；保护肝功；清除自由基；无毒副作用。但是，目前蜂胶应用有限，仅限于口服，尚未在生化领域开发和应用，生物药品方面更是欠缺。
发明内容
本发明是含蜂胶佐剂的人用疫苗及其制备方法，针对人用疫苗要求更高、更严、更安全，更有效，通过对蜂胶原料的标化、提取、纯化变共达到“三脱一溶”的技术，与疫苗免疫抗原配比并纳米技术裂解，制备出人用蜂胶佐剂疫苗。
含蜂胶佐剂的人用疫苗，各种疫苗每毫升含蜂胶佐剂为2-20毫克，尺度一般要大于免疫活性抗原5-10纳米。
疫苗免疫活性抗原与蜂胶佐剂的配比及纳米技术处理，各种疫苗灭活后，免疫活性抗原符合国家规定的标准，每毫升含蜂胶佐剂为2-20毫克为宜。按此比例配好，再按疫苗免疫活性抗原纳米尺度大小，选择最佳纳米尺度，一般要大于免疫活性抗原5-10纳米，用纳米对撞机，进行纳米技术处理，使疫苗与佐剂充分裂解、乳化和均质，以提高和增强免疫活性、稳定性、防腐性和渗透性及进一步疫苗的灭活性。确保疫苗安全可靠，有效稳定。
含蜂胶佐剂的人用疫苗制备方法粗蜂胶→冷冻→粉碎→提取→滤液→过滤→连续离心→除去残渣→除去沉淀→加疫苗→纳米技术处理→超滤→真空浓缩→含蜂胶佐剂的人用疫苗→冻藏保存。
1.严格蜂胶原料来源和标准控制蜂胶属于环保生态型天然有机保健医药食品。用于人用疫苗佐剂必须遵循“绿色制造”保真正“纯天然，无污染，富活性，高品质”的原料，最好取自产于国家级自然保护区，如东北长白山、兴安岭产地蜂胶等；最低要符合国家SB/T10096-92行业标准，还必须备有国家权威研究机构出示检定报告或从国家农科院蜜蜂研究所提取纯化的符合标准的蜂胶产品作为疫苗佐剂原料。
2.合格蜂胶原料提取纯化，确保佐剂无毒、安全高效、稳定。疫苗佐剂天然蜂胶在采集过程中混入的蜂蜡、蜂尸等杂质，因此，在生产蜂胶产品时需要对粗蜂胶进行提取纯化。目前，在所有的溶剂中，乙醇被认为是疫苗佐剂最理想的溶剂。含蜂胶佐剂的人用疫苗制备工艺流程及操作要点如下(1)工艺流程(见图1)(2)操作要点1.冷冻处理 原料蜂胶由于在常温下呈粘滞状态，很难对其进行粉碎，因此，必须将蜂胶进行冷冻处理，通常在-5-8℃条件下冷冻5-6小时，使蜂胶变硬，变脆。
2.蜂胶的粉碎 为了加快蜂胶有效成分溶入溶剂中，必须对其进行粉碎，以增加蜂胶和溶剂的接触面积，溶出速度也随之加快。由于蜂胶遇热变软，很容易粘在容器上，因此经冷冻后的蜂胶应尽快在10-15分钟内用球磨机进行粉碎。
球磨机是一种适合粉碎结晶物料、易熔化的树脂、树胶及其他非组织性脆性物料的粉碎设备。在操作时将大块蜂胶进行粗破碎，然后装入球磨机的罐内并盖严，由电动机带动球罐转动，转速控制在使其中的圆球能在一定的角度落下的速度。蜂胶在圆球起落产生的撞击作用、圆球与罐壁及球与球之间的研磨作用中被粉碎。蜂胶一般被粉碎15-25目即可，不可粉碎得过小，否则蜂胶提取液在过滤时很困难。另外，球磨机的工作环境应在10-15℃，否则，因摩擦和撞击产热，引起蜂胶熔化，难以实施粉碎作业。
3.蜂胶的浸提操作 天然蜂胶几乎不溶于水，我们选最佳溶剂乙醇来提纯蜂蛟，按1∶5比例加75-95％乙醇，浸提30-35小时，并正常搅拌。
4.过滤 置于储罐中的蜂胶溶液加2-2.5％活性炭充分搅拌后静置24小时，上清液用过滤机过滤，滤400-600目，即得到澄清的蜂胶溶液。
5.超滤 离心和纳米技术处理 澄清蜂胶溶液用(3000-5000转/分)连续离心，除去沉淀(脱铅)，离心溶液再用8000-10000万分子量超滤膜超滤，以除去过敏原脱敏，最后用纳米技术处理，较好解决水溶性问题。
6.真空浓缩回收乙醇 采用真空浓缩，具体操作(1)将蜂胶溶液泵入浓缩锅内；(2)接通冷凝器的冷却水；(3)开启水力真空泵，使浓缩罐内的真空度达到66.7KPa(500mmHG)；(4)接通蒸汽或热水加热器；(5)控制蒸汽压使罐内温度达到125-145℃，罐内蜂胶提取液开始沸腾，乙醇蒸气由导管进入冷凝器，乙醇蒸气被液化流入储罐中；(6)乙醇挥发完后，停止水力真空泵和蒸气，等罐冷却后再关闭冷却水；(7)放出蜂胶膏，冷却、分割、称量、包装。
蜂胶佐剂疫苗的动物实验(1)蜂胶提取物对禽流感H9亚型Shandong/chicken/98株的灭活作用效果研究。
鸡胚接种的方法就蜂胶乙醇浸出物对禽流感H9亚型Shandong/chicken/98株灭活作用进行了研究。结果表明，常温下3分钟、30分钟；37℃，3分钟、30分钟，含蜂胶乙醇浸出物0.1mg/ml的95％乙醇稀释液，含蜂胶乙醇浸出物2.5mg/ml的47.5％乙醇稀释液，含蜂胶乙醇浸出物10mg/ml的生理盐水稀释液，接种鸡胚后病毒HA测定为0。这充分说明以上浓度蜂胶乙醇浸出物对禽流感H9亚型Shandong/chicken/98株具有完全的灭活作用；37℃ 3分钟、30分钟，含蜂胶乙醇浸出物01.mg/ml的47.5％乙醇稀释液，含蜂胶乙醇浸出6.25mg/ml的生理盐水稀释液对禽流感H9株有部分灭活作用。
(2)复合新城疫+减蛋+传支多价三联蜂胶灭活疫苗中NDV和EDSVHI抗体的消长规律。
复合新城疫+减蛋+传支多价三联疫苗NDV抗原由Clone-30病毒株及地方分离病毒株经鸡胚增殖，IBV抗原由H52病毒株及地方分离病毒株经鸡胚增殖，EDS-76V抗原由地方分离病毒株经鸭胚增殖，灭活检验后与纯化的天然免疫增强剂蜂胶进行乳化制备而成。取60日龄经监测的两种抗体水平在2Log左右免疫鸡300只，平均分成三组，100只/组，分别胸部肌肉注射免疫三批复合新城疫+减蛋+传支多价三联疫苗，剂量为0.5ml/只。
以血凝抑制(HI)试验测定复合新城疫+减蛋+传支多价三联蜂胶灭活疫苗的NDV和EDSVHI抗体的消长规律及其稳定性，即对用不同批号的该疫苗免疫后不同时间段的鸡群分别进行新城疫(ND)和减蛋综合症(EDS)的抗体水平常规监测。试验结果表明，60日龄鸡接种后，两种抗体均在5-7天即可产生坚强免疫力，均在免疫后30天抗体水平进入高峰期。ND维持在12Log2以上可达4个多月；EDS维持在10Log2以上可达4个多月。免疫期分别长达6个月、7个月以上，且三个不同批号的疫苗中ND和EDS抗体的消长水平差异不显著(P＞0.05)，说明该疫苗中的ND和EDS抗原具有高度的稳定性，两种抗原无干扰现象。与传统佐剂疫苗相比，具有快速、高效、持久等特点。
(3)复合鸡新城疫+减蛋综合症+传支多价联蜂胶灭活疫苗与油苗注射部位的动态病理组织学比较观察。
用复合鸡新城疫+减蛋综合征+传支多价三联蜂胶灭活疫苗和油佐剂疫苗分别胸肌注射免疫肉鸡，分别于免疫后7天、14天和28天剖杀，取注射部位的肌肉组织，常规石蜡包埋切片观察。蜂胶疫苗免疫组免疫后7天时，肌纤维轻度水肿，纤维间有大量淋巴细胞和巨噬细胞的浸润，巨噬细胞吞噬有蜂胶颗粒；4天时肌纤维则恢复正常；油苗注射组免疫后，7天时肌肉中度水肿，其间有大量油乳状疫苗残留，镜检可见肌纤维断裂、坏死，其间有较多较大的油囊，囊壁由大量增生的成纤维细胞、异嗜性粒细胞、巨噬细胞、小血管及淋巴样细胞组成。细胞增生持续存在到28天，最后形成肉芽肿结构。研究结果表明，蜂胶疫苗免疫后对局部组织学影响明显小于油苗注射组。
具有灭活剂、防腐剂、免疫增强剂、稳定剂和促渗剂“五位一体”的功效。其主要特点是1、疫苗安全可靠无化学残留，对人体无毒副作用。注射部位无炎症，无肿胀，极少有过敏反应。
2、疫苗注射后免疫抗体形成快速、高效，、持久，一般免疫后5-7天即可产生坚强的免疫力(与弱毒苗相同或接近)；保护率高达90-100％；免疫期延长达一倍以上。
3、能全面启动机体的免疫防卫系统，刺激机体细胞免疫、体液免疫、红细胞免疫系统和巨噬细胞补体系统都能产生免疫应答。这在疫苗的大家族中是绝无仅有的。
4、独特的纳米疫苗结构，将疫苗的速释机制与缓释机制有机结合，巧妙地解决了疫苗快速与持久相矛盾的难题，並具有促渗透作用。
5、蜂胶能通过促进免疫器官的发育来提高机体的免疫力，还可刺激机体产生各种细胞因子。
6、能显著增强机体的非特异性免疫力，蜂胶含有大量的免疫刺激因子。
7、蜂胶是天然的抗生素和抗病毒物质，在疫苗中无需添加任何抗生素和防腐剂。
8、更易于运输和保存；-10℃不结冰，可保存24个月，2-8℃保存18个月，10-15℃保存12个月，20-30℃保存3-6个月。
9、使用更方便，蜂胶佐剂疫苗的流动性好，不需要有冷藏链，不会因为温度的变化而造成注射困难。
本发明附图1是含蜂胶佐剂的人用疫苗制备工艺流程示意图。
实施例例1、含蜂胶佐剂的人用疫苗，流感病毒含蜂胶佐剂的人用疫苗，每毫升含蜂胶佐剂为5毫克；按流感病毒疫苗免疫活性抗原纳米尺度，大于免疫活性抗原5纳米。
例2、粗蜂胶→冷冻→粉碎→乙醇提取→滤液→活性炭过滤→连续离心→除去活性炭→除去沉淀→加疫苗→纳米技术处理→超滤→真空浓缩→含蜂胶佐剂的人用疫苗→冻藏保存。
例3、取静水压灭活后流感全病毒或纳米裂解流感病毒或纳米裂解流感病毒纯化后亚单位抗原或流感病毒鼻腔喷雾抗原10000毫升，加至蜂胶佐剂若干使每毫升疫苗含蜂胶5毫克並充分混合，再根据每种疫苗免疫活性抗原纳米尺度大小，一般选定大于免疫活性抗原5纳米，用调节好纳米对撞机进行纳米技术处理使其被加工的高速流体物粒瞬间裂解、粉碎、分散、乳化、催化与合成等功能融为一体，以进一步提高蜂胶为疫苗免疫佐剂的增强免疫原性和防腐功能，以确保疫苗的安全性和稳定性。
例4、取自然培养幽门螺杆菌全细菌纯化，灭活制备出合格幽门螺杆菌口服疫苗10000毫升，加至蜂胶佐剂若干使每毫升疫苗含蜂胶10毫克，取代大肠杆菌LT毒素B亚单位融合蛋白，充分混合；再用纳米对撞机选定50纳米尺度进行纳米技术处理，无需冻干，可直接分装为液体疫苗，供预防治疗幽门螺杆菌病用胃病疫苗。
例5、取国家自然保护区产的原始蜂胶50公斤，置于-5-8℃冷冻5小时，用球磨机粉碎20-30目加80％医用酒精250公斤浸提30-35小时，再静置20-25小时，上液用500-600滤膜过滤机过滤，再用分子量10000超滤膜超滤；最后真空浓缩，放出蜂胶冷却即是疫苗佐剂用合格蜂胶。
例6、畜禽疫苗蜂胶佐剂的应用(1)禽用蜂胶灭活疫苗系列产品。
复合型新城疫蜂胶灭活疫苗；复合型新城疫减蛋综合症肾型传染性支气管炎三联蜂胶灭活疫苗；复合型新城疫+大肠杆菌多价二联蜂胶灭活疫苗；复合型新城疫肾型传染性支气管炎二联蜂胶灭活疫苗；复合型新城疫+传支+大肠杆菌多价三联蜂胶灭活疫苗；鸡传染性鼻炎多价蜂胶灭活疫苗；禽霍乱+大肠杆菌多价二联蜂胶灭活疫苗；霉形体+鸡传染性鼻炎多价二联蜂胶灭活疫苗；霉形体+大肠杆菌多价二联蜂胶灭活疫苗；霉形体蜂胶灭活疫苗；禽霍乱蜂胶灭活疫苗；鸭疫+大肠杆菌多价二联蜂胶灭活疫苗；兔瘟巴氏杆菌二联蜂胶灭活疫苗；兔瘟巴氏杆菌魏氏梭菌三联蜂胶灭活疫苗；兔大肠杆菌+波氏杆菌二联蜂胶灭活疫苗；细小病毒性肠炎蜂胶灭活疫苗。
(2)猪用蜂胶灭活疫苗系列产品。
猪伪狂犬病基因缺失蜂胶灭活疫苗；猪细小病毒蜂胶灭活疫苗；
猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)蜂胶灭活疫苗；仔猪大肠杆菌四价基因工程蜂胶灭活疫苗；仔猪水肿病多价蜂胶灭活疫苗；猪链球菌病多价蜂胶灭活疫苗；猪气喘病蜂胶灭活疫苗。
权利要求
1.含蜂胶佐剂的人用疫苗，各种疫苗每毫升含蜂胶佐剂为2-20毫克，尺度一般要大于免疫活性抗原5-10纳米。
2.根据权利要求1所述含蜂胶佐剂的人用疫苗，流感病毒含蜂胶佐剂的人用疫苗，每毫升含蜂胶佐剂为5毫克；按流感病毒疫苗免疫活性抗原纳米尺度，大于免疫活性抗原5纳米。
3.含蜂胶佐剂的人用疫苗制备方法粗蜂胶→冷冻→粉碎→提取→滤液→过滤→连续离心→除去残渣→除去沉淀→加疫苗→纳米技术处理→超滤→真空浓缩→含蜂胶佐剂的人用疫苗→冻藏保存。
4.根据权利要求3所述含蜂胶佐剂的人用疫苗制备方法，粗蜂胶→冷冻→粉碎→乙醇提取→滤液→活性炭过滤→连续离心→除去活性炭→除去沉淀→加疫苗→纳米技术处理→超滤→真空浓缩→含蜂胶佐剂的人用疫苗→冻藏保存。
5.根据权利要求3或4所述含蜂胶佐剂的人用疫苗制备方法，严格蜂胶原料来源和标准控制蜂胶属于环保生态型天然有机保健医药食品，最低要符合国家SB/T10096-92行业标准，还必须备有国家权威研究机构出示检定报告或从国家农科院蜜蜂研究所提取纯化的符合标准的蜂胶产品作为疫苗佐剂原料；合格蜂胶原料提取纯化，确保佐剂无毒、安全高效、稳定，在生产蜂胶产品时需要对粗蜂胶进行提取纯化；冷冻处理必须将蜂胶进行冷冻处理，通常在-5-8℃条件下冷冻5-6小时，使蜂胶变硬，变脆；蜂胶的粉碎经冷冻后的蜂胶应尽快在10-15分钟内用球磨机进行粉碎，蜂胶一般被粉碎15-25目即可，工作环境应在10-15℃；蜂胶的浸提操作选最佳溶剂乙醇来提纯蜂蛟，按1∶5比例加75-95％乙醇，浸提30-35小时，並正常搅拌；过滤置于储罐中的蜂胶溶液加2-2.5％活性炭充分搅拌后静置24小时，上清液用过滤机过滤，滤400-600目，即得到澄清的蜂胶溶液；超滤澄清蜂胶溶液用3000-5000转/分连续离心，除去沉淀，离心溶液再用8000-10000万分子量超滤膜超滤，以除去过敏原脱敏，最后用纳米技术处理；真空浓缩回收乙醇∶采用真空浓缩，将蜂胶溶液泵入浓缩锅内；接通冷凝器的冷却水；开启水力真空泵，使浓缩罐内的真空度达到66.7KPa，500mmHG；接通蒸汽或热水加热器；控制蒸汽压使罐内温度达到125-145℃，罐内蜂胶提取液开始沸腾，乙醇蒸气由导管进入冷凝器，乙醇蒸气被液化流入储罐中；乙醇挥发完后，停止水力真空泵和蒸气，等罐冷却后再关闭冷却水；放出蜂胶膏，冷却、分割、称量、包装。
6.根据权利要求3所述含蜂胶佐剂的人用疫苗制备方法，取静水压灭活后流感全病毒或纳米裂解流感病毒或纳米裂解流感病毒纯化后亚单位抗原或流感病毒鼻腔喷雾抗原10000毫升，加至蜂胶佐剂若干使每毫升疫苗含蜂胶5毫克並充分混合，再根据每种疫苗免疫活性抗原纳米尺度大小，一般选定大于免疫活性抗原5纳米，用调节好纳米对撞机进行纳米技术处理使其被加工的高速流体物粒瞬间裂解、粉碎、分散、乳化、催化与合成等功能融为一体，以进一步提高蜂胶为疫苗免疫佐剂的增强免疫原性和防腐功能，以确保疫苗的安全性和稳定性。
7.根据权利要求3所述含蜂胶佐剂的人用疫苗制备方法，取自然培养幽门螺杆菌全细菌纯化，灭活制备出合格幽门螺杆菌口服疫苗10000毫升，加至蜂胶佐剂若干使每毫升疫苗含蜂胶10毫克，取代大肠杆菌LT毒素B亚单位融合蛋白，充分混合；再用纳米对撞机选定50纳米尺度进行纳米技术处理，无需冻干，可直接分装为液体疫苗，供预防治疗幽门螺杆菌病用胃病疫苗。
8.根据权利要求3所述含蜂胶佐剂的人用疫苗制备方法，取国家自然保护区产的原始蜂胶50公斤，置于-5-8℃冷冻5小时，用球磨机粉碎20-30目加80％医用酒精250公斤浸提30-35小时，再静置20-25小时，上液用500-600滤膜过滤机过滤，再用分子量10000超滤膜超滤；最后真空浓缩，放出蜂胶冷却即是疫苗佐剂用合格蜂胶。
全文摘要
含蜂胶佐剂的人用疫苗及其制备方法，各种疫苗每毫升含蜂胶佐剂为2－20毫克，尺度一般要大于免疫活性抗原5－10纳米。粗蜂胶→冷冻→粉碎→提取→滤液→过滤→连续离心→除去残渣→除去沉淀→加疫苗→纳米技术处理→超滤→真空浓缩→含蜂胶佐剂的人用疫苗→冻藏保存。具有灭活剂、防腐剂、免疫增强剂、稳定剂和促渗剂“五位一体”的功效。安全可靠无化学残留，对人体无毒副作用；免疫抗体形成快速、高效、持久；免疫期延长达一倍以上；能全面启动机体的免疫防卫系统；巧妙地解决了疫苗快速与持久相矛盾的难题；产生各种细胞因子；能显著增强机体的非特异性免疫力；是天然的抗生素和抗病毒物质，无需添加任何抗生素和防腐剂；更易于运输和保存；使用更方便。
文档编号A61K39/39GK1683011SQ20051004596
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月4日 优先权日2005年3月4日
发明者苟仕金, 苟鸿鹰, 王成余 申请人:辽宁天成生物制药研究所有限公司