专利名称：重组靶向促血小板生成的融合蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程制药领域，具体涉及一种具有靶向促巨核细胞增殖—血小板生成作用的TPO模拟肽与人生长激素融合蛋白的制备与应用。
背景技术：
由造血功能障碍而引起的原发性和继发性血小板减少症在临床上较为常见，有效地保护和促进血小板恢复是一个重要的科学难题。在众多升血小板方案中，造血生长因子的效果最佳，其中升血小板作用最显著的是血小板生成素(TPO)和白细胞介素-11(IL-11)。TPO又称巨核细胞生长发育因子(MGDF)或血小板生长因子(TSF)，人TPO由332个氨基酸残基组成，分子量为38KD。TPO通过与其受体(c-Mpl)结合而刺激巨核系祖细胞的增殖、分化，并促进血小板的生成和释放。但由于TPO在试用过程中出现严重的中和性抗体，至今一直未批准进入临床。重组人IL-11(rhIL-11)虽然在1997年就已经获得美国FDA的批准应用于临床，但由于经常出现浮肿、心律失常、头晕、骨膜炎等副反应，以及昂贵的价钱，使得其应用受到了一定的限制。
TPO模拟肽(TMP)是经过噬菌体表面展示技术筛选到的一种与天然TPO生物活性相似的短肽，总共只有14个氨基酸残基组成，氨基酸序列与TPO完全不同源(Cwirla et al，1997)。体外实验证实，该短肽与TPO受体却有着很高的亲和力，并能够刺激TPO细胞依赖株(Ba/F3/c-Mpl)增殖与分化。但该短肽分子量太小，进入体内后很容易被降解，同时也很难通过基因工程方法进行制备，因而其体内应用效果并不理想。
人生长激素(hGH)是由垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种蛋白质激素，共由191个氨基酸组成，分子量约为22KD。hGH主要的生理作用是促进蛋白质与核酸的合成，对人体几乎所有组织细胞(神经组织除外)都有显著促生长作用。经基因工程获得的重组人生长激素(rhGH)有着与天然hGH相同的生理功能，在临床上被广泛应用于治疗发育障碍、免疫调节及创伤后的组织修复等。此外，rhGH也能够促进骨髓及脾脏各系造血祖细胞的增殖。近年来，包括我们在内的一些国内外研究人员发现，应用rhGH可以显著促进肿瘤放、化疗及再生障碍性贫血等病人的造血重建过程，尤其在促巨核细胞增殖和血小板生成方面有着一定的疗效。然而，由于hGH广谱的促细胞生长作用，当被应用到体内后，它会广泛地作用全身各处的组织细胞，要想使其对某一特定组织或细胞具有突出的作用，如提高促巨核细胞增殖和血小板生成能力，必须要加大使用量。如此，不仅会增加其使用成本，而且还会给人体带来其它不利反应。解决此问题最好的办法是使hGH选择性地作用于靶组织或细胞。
发明内容
本发明的目的，是提供一种重组靶向促血小板生成的融合蛋白。它由TPO模拟肽区和人生长激素多肽区组成。
本发明的TMP与hGH的融合蛋白包括两个主体部分，一个是含有14个氨基酸残基的TMP(序列表SEQ ID NO1)；另一个是含有191个氨基酸残基的hGH(序列表SEQ ID NO2)，其氨基酸序列与天然人生长激素的氨基酸序列相同。
为了使融合蛋白的两个主体部分保持各自完整的结构，使TMP能有效地结合巨核细胞表面的TPO受体，所述TMP与hGH之间用桥接肽连接。优选地，所述TMP与hGH之间设有0到15个氨基酸组成的桥接肽，更优选地，以由Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 5个氨基酸组成的短肽。
本发明的融合蛋白包括两种形式，一种形式是TMP位于融合蛋白的N-末端，hGH位于融合蛋白的C-末端(序列表SEQ ID NO3)；另一种形式是hGH位于融合蛋白的N-末端，TMP位于融合蛋白的C-末端(序列表SEQ ID NO4)，优选的是前一种形式。
本发明的另一个目的是提供编码本发明融合蛋白的DNA序列(序列表SEQ IDNO5和6)和携带该DNA序列的重组表达载体。
编码hGH的多聚核苷酸可以用PCR、RT-PCR及人工合成的方法获得。用作PCR模板的cDNA可以从人胎肝cDNA文库(购自Clontech Laboratories Inc.USA)获得，用作RT-PCR的mRNA模板可以来源于人垂体组织。通过人工合成方法获得时，为了提高融合蛋白的表达量，可以选用宿主偏爱的密码子。编码TMP和桥接肽的多聚核苷酸可以通过人工合成而加载在hGH基因PCR引物的5′端，在PCR扩增hGH基因同时获得与其融合的TMP DNA片段。
由于hGH的第53位与第165位和第182位与189位之间有两个二硫键形成，为保证重组融合蛋白能形成正确的空间构像，所表达的重组融合蛋白最好是以可溶性形式存在。本发明的融合蛋白的重组表达载体包括pMAL/TMP-hGH及pPIC9K/TMP-hGH质粒等。
表达本发明融合蛋白的宿主可以是细菌、酵母及哺乳动物细胞等，优选地，原核表达的宿主是大肠杆菌，真核表达的宿主是毕赤酵母。
本发明的又一个目的，是提供制备重组靶向促血小板生成的融合蛋白的方法。将携带编码重组靶向促血小板生成融合蛋白DNA序列的重组表达载体转化、转染或转导宿主细胞，分离、纯化所述重组靶向促血小板生成的融合蛋白。
对于重组表达的本发明融合蛋白可以通过多种方法从相应的细胞培养物中进行提取、纯化，这些方法包括粗提、盐析及液相层析等本领域常用的技术，其中液相层析又包括了离子交换、亲和、疏水等层析技术。
因此，制备本融合蛋白的方法，包括以下步骤1.hGH的克隆；2.TMP与hGH融合蛋白表达质粒的构建；3.TMP-hGH融合蛋白的纯化。
本发明的融合蛋白可以与药物载体一起组成药物制剂进行使用，这些药物载体包括水、盐水、糖类等。由本发明融合蛋白制成的药物制剂优选的是含水液体制剂和含水量低于10％或不含水的冻干制剂，这些药物制剂可以通过静脉输注或注射(包括皮下和肌肉注射)进行给药。
本发明的融合蛋白及其药物制剂可用于治疗多种原发性或继发性血小板减少症等疾病，这些疾病包括再生障碍性贫血、白血病、淋巴瘤、原发性血小板减少性紫癜、慢性肾病、急性放射病、肿瘤放/化疗引起的血小板减少等。
本发明的优点是本发明重组靶向促血小板生成融合蛋白，是具TMP和hGH活性的融合蛋白。它使TMP和hGH在促巨核细胞增殖—血小板生成方面的作用得到优势互补。一方面，TMP通过与hGH融合而变得更加稳定，半衰期也被显著延长，同时还能够与hGH一起通过基因工程方法进行重组制备；另一方面，hGH通过与TMP融合，即可借助TMP识别和结合巨核细胞表面的TPO受体而靶向地刺激巨核细胞增殖、分化，显著提高hGH在促血小板生成方面的生物利用度，减少其使用剂量。此外，本发明的融合蛋白还能够通过TPO受体途径(由TMP介导)和非TPO受体途径(由hGH介导)两种不同的路径同时作用于巨核细胞，使得促巨核细胞增殖—血小板生成的作用得到协同与加强。因此，本发明融合蛋白能够靶向性地刺激巨核细胞增殖与分化，具有高效低毒的升血小板作用，适用于治疗原发性和继发性血小板减少症等疾病，效果良好。
图1为pMAL/TMP-hGH重组质粒的构建。
图2为pPIC9K/TMP-hGH重组质粒的构建。
图3为TMP-hGH融合蛋白的SDS-PAGE分析结果。
图4为TMP-hGH融合蛋白的升血小板活性分析结果。
具体实施例方式
材料1Pyrobest TM DNA Polymerase PCR试剂盒(Takara公司产品，中国大连)2.pMD18-T载体克隆试剂盒(Takara公司产品，中国大连)3.T4DNA连接酶(Takara公司产品，中国大连)4.EcoRI、BamHI、EcoRV、HindIII、Sac I、XmnI等内切酶(New EnglandBioLabs公司产品，美国)5.质粒载体pMAL-c2x(New England BioLabs公司产品，美国)6.质粒载体pPIC9K(Invitrogen公司产品，美国)7.胎肝cDNA文库(Clontech公司产品，美国)8.Amylose resin柱(New England BioLabs公司产品，美国)9.大肠杆菌DH5α(本室保存)10.大肠杆菌YZ2000(Gene Bridges公司产品，德国)11.酵母菌GS115(Invitrogen公司产品，美国)12.G418、氨苄青霉素(Roche公司产品，德国)13Supdex 200层析柱(Amersham Pharmacia Biotech公司产品，英国)14.酵母提取物、胰蛋白胨、右旋糖、无氨基酸酵母氮源(Oxford公司产品，美国)15.LB培养基酵母提取物5g胰蛋白胨 10gNaCl10g溶于1000ml去离子水中，并用1mol/L的NaOH调节pH值至7.0，高压蒸气灭菌。
16.YPD培养基酵母提取物2g胰蛋白胨 4g溶于180ml去离子水中，高压灭菌。冷却后加入20ml经滤器除菌后的20％的右旋糖和0.2ml浓度为100mg/ml的氨苄青霉素。
17.磷酸盐缓冲液NaCl8gKCl 0.2gNa2HPO41.44gKH2PO40.24g溶于水1000ml，并用HCl调节pH值至7.4，高压灭菌。
18.BMGY培养基酵母提取物2g胰蛋白胨 4g溶于140ml去离子水中，高压灭菌。冷却后加入20ml滤器除菌后浓度为13.4％的无氨基酸酵母氮源贮存液、20ml 1mol/L磷酸盐缓冲液、20ml 10％甘油、0.4ml0.02％生物素和0.2ml 100mg/ml的氨苄青霉素。
19.BMMY培养基酵母提取物 2g胰蛋白胨 4g溶于140ml去离子水中，高压灭菌。冷却后加入20ml滤器除菌后浓度为13.4％的无氨基酸酵母氮源贮存液、20ml 1mol/L磷酸盐缓冲液、20ml 5％甲醇、0.4ml0.02％生物素和0.2ml 100mg/ml的氨苄青霉素。
20.重组人IL-11(Genetics Institute公司产品，美国)实施例1hGH的克隆从胎肝cDNA文库中通过PCR方法获得hGH基因的cDNA序列，扩增所用的PCR上、下游引物分别为GH1和GH2。GH1和GH2的碱基序列如下GH-15′-ATG TTC CCA ACT ATT CCA CTG-3′GH-25′-TTA GAA GCC ACA CGA CCC TTC-3′PCR的反应体系为100ul，其中含引物GH-1和GH-2各100pmol，20nmol的dNTP，1ul胎肝cDNA文库，10×PCR反应缓冲液10ul，高保真的Pyrobest DNA聚合酶5U。PCR的反应条件为第一阶段95℃预变性5分钟；第二阶段94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，循环32次；第三阶段72℃延伸5分钟，10℃放置10分钟。所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见约600bp大小电泳带，将PCR产物回收、纯化后与pMD18-T载体进行连接。连接产物通过电转化法转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，经氨苄青霉素筛选后，挑取LB平板上的克隆于LB液体培养基中37℃振荡过夜，次日提取质粒DNA，用EcoRI和BamHI进行双酶切鉴定，对于有600bp大小DNA片段出现的重组质粒进行测序，测序结果表明阳性重组质粒多克隆位点中插入的DNA片段即是完整的hGH cDNA，该重组质粒命名为pMD-hGH。
实施例2TMP与hGH融合蛋白表达质粒的构建及鉴定为使TMP能与hGH形成融合蛋白，首先设计合成以下两条PCR引物MH-15′-ACTGAT ATCGAA GGT CCG ACT CTG CGT CAG TGG CTG GCT GCACGT GCT GGT TCT GGT TCT GGT TTC CCA ACT ATT CCA CTG AG-3′MH-25′-AGTAAG CTTTTA GAA GCC ACA CGA CCC TTC-3′在MH-1中下画线部分为内切酶EcoRV的识别位点，黑体部分为编码TMP(序列表SEQ ID NO1)的核苷酸序列，斜体部分为编码桥接肽Gly-Ser-Gly-Ser-Gly的核苷酸序列。在MH-2中下画线部分为内切酶Hind III的识别位点。
如图1所示，以pMD-hGH质粒DNA为模板，通过PCR扩增hGH基因，PCR的扩增条件同上。所获得PCR产物经琼脂糖电泳检测为650bp左右，回收PCR产物，并进行EcoR V和Hind III双酶切。酶切后的PCR产物与经Xmn I和Hind III双酶切后的质粒载体pMAL-c2x进行连接，连接产物通过电转化法转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。挑菌并过夜培养，提取质粒DNA，经Sac I和Hind III双酶切后可见700bp左右DNA片段出现。对此重组质粒进行序列测定，测序结果表明在pMAL-c2x质粒的Xmn I和Hind III位点之间插入有与序列信息表SEQ IDNO5碱基序列一致的DNA片段。该重组质粒命名为pMAL/TMP-hGH1，其表达的融合蛋白N端为TMP，C端为hGH，在TMP与hGH之间有Gly-Ser-Gly-Ser-Gly进行连接。
同理，将PCR引物MH-1和MH-2更换为MH-3和MH-4，采用相同的方法获得重组质粒pMAL/TMP-hGH2。该重组质粒的Xmn I和Hind III位点之间插入有与序列信息表SEQ ID NO6碱基序列一致的DNA片段，其表达的融合蛋白N端为hGH，C端为TMP，中间是桥接肽Gly-Ser-Gly-Ser-Gly。
MH-3和MH-4的碱基序列如下MH-35′-ACTGAA GGA TTT CAT TCC CAA CTA TTC CAC TGA G-3′MH-45′-AGTAAG CTTTTA AGC ACG TGC AGC CAG CCA CTG ACG CAG AGTCGG ACC TTC GAT CCA AGA CCA AGA CCA GAA GCC ACA CGA CCC TTC-3′在MH-3中下画线部分为内切酶Xmn I的识别位点。在MH-4中下画线部分为内切酶Hind III的识别位点，黑体部分为编码TMP(序列表SEQ ID NO1)的核苷酸序列，斜体部分为编码桥接肽Gly-Ser-Gly-Ser-Gly的核苷酸序列。
将上述所获得的重组质粒pMAL/TMP-hGH1和pMAL/TMP-hGH2分别转化大肠杆菌TB1感受态细胞，并从中随机各挑选10个克隆进行表达，诱导表达条件选择终浓度为0.5mM的IPTG 37℃诱导4小时，表达产物进行12％的SDS-PAGE电泳。TMP-hGH融合蛋白的分子量应在24KD左右，在重组质粒pMAL/TMP-hGH1和pMAL/TMP-hGH2中该蛋白会与麦芽糖结合蛋白MBP进行融合表达，所以最终形成的目的蛋白分子量约为66.5KD。实验结果提示每个克隆菌中均有分子量约为66.5KD的蛋白表达，其中各有5个克隆菌表达最高，蛋白表达量达40％左右。进一步经过Amylose resin柱纯化和Xa因子切除MBP(42.5KD)，可见有24KD左右蛋白释放出来，其分子大小与TMP-hGH融合蛋白一致。由于90％以上的目的蛋白都在上清中，表明TMP与hGH的融合蛋白主要是以可溶性形式表达。
在得到TMP-hGH融合蛋白的原核表达重组质粒pMAL/TMP-hGH1后，又设计合成以下两条寡核苷酸序列MH-55′-GAA GAA GGG GTA TCT CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT ATCGAA GGT CCG ACT CTG CGT C-3′MH-65′-CCA ACT TGA ACT GAG GAA CAG TCA TGT CTA AGG CGA ATT AGAAGC CAC ACG ACC CTT C-3′其中MH-5中斜体部分为pPIC9K质粒多克隆位点之前的50个碱基的序列，MH-6中斜体部分为pPIC9K质粒多克隆位点之后的50个碱基的序列。
如图2所示，以pMAL/TMP-hGH1质粒DNA为模板，以MH-5和MH-6为引物，PCR扩增TMP-hGH1的基因序列，PCR方法同前所述。PCR产物经琼脂糖电泳检测可见730bp左右DNA片段，取1ug该PCR产物与1ug经EcoR I酶切线性化后的pPIC9K质粒DNA共同转化YZ2000大肠杆菌感受态细胞(该细胞具有Red/ET同源重组功能)，转化后的细菌涂于氨苄青霉素LB平板，挑取菌落，以MH-5和MH-6为引物进行菌落PCR。菌落PCR条件如下反应体系为15ul，其中加入MH-5和MH-6各15pmol、dNTP 4nmol、菌落与LB的混合液1ul、1.5ul的10×PCR反应缓冲液和1U的Taq DNA聚合酶；PCR反应条件同前。所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，对有730bp DNA片段出现的菌落培养后提取质粒并进行测序，测序结果表明在pPIC9K质粒中的Ste13蛋白酶切位点后面连有与序列信息表SEQ IDNO5完全一致的DNA序列。该重组质粒命名为pPIC9K/TMP-hGH1。
同样方法，以MH-7和MH-8为引物，以pMAL/TMP-hGH2质粒DNA为模板，PCR扩增编码TMP-hGH2的DNA片段，经Red/ET同源重组获得pPIC9K/TMP-hGH2表达质粒。MH-7和MH-8的碱基序列如下
MH-75′-GAA GAA GGG GTA TCT CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT TTCCCA ACT ATT CCA CTG AG-3′MH-85′-CCA ACT TGA ACT GAG GAA CAG TCA TGT CTA AGG CGA ATT AAGCAC GTG CAG CCA GCC AC-3′其中MH-7中斜体部分为pPIC9K质粒多克隆位点之前的50个碱基的序列，MH-8中斜体部分为pPIC9K质粒多克隆位点之后的50个碱基的序列。
由于pPIC9K/TMP-hGH1和pPIC9K/TMP-hGH2质粒中融合蛋白与Ste13蛋白酶切位点之间没有多余的碱基序列存在，所以由该重组质粒表达的TMP与hGH融合蛋白的N端就不会有任何多余的氨基酸存在。将测序正确的pPIC9K/TMP-hGH1和PIC9K/TMP-hGH2质粒DNA线性化后转化GS115酵母感受态细胞，涂于氨苄青霉素抗性的YPD固体培养基平板，菌落PCR鉴定TMP-hGH融合基因DNA片段的存在(方法同前)，对于阳性克隆按常规方法再次进行Mut表型鉴定和抗性筛选后，对Mut阳性、可耐受高浓度G418的阳性菌落，接种培养后于-70℃保存菌种。
实施例3工程酵母的发酵及TMP-hGH融合蛋白的纯化取-70℃保存的含有pPIC9K/TMP-hGH的酵母工程菌种接种于YPD平板活化，挑取外观优良的单个菌落接种于BMGY培养基，28℃～30℃恒温摇床280rpm振荡培养16～18小时至OD600≈4，以此菌液为种子液。然后将种子液接种于装有2.5L BMMY培养基的15L发酵罐(B.Braun公司，德国)进行发酵。发酵温度控制在30℃，溶氧大于20％饱和度，pH值在5.0左右，培养至OD600≈150时开始补加甲醇诱导，使甲醇的终浓度始终保持在1％左右。诱导培养72小时后离心取上清，加入20％硫酸胺，混匀，4℃放置过夜，离心取沉淀。所得沉淀用pH值为7.0的0.025mol/L Tris-HCL溶解，然后过Supdex 2001.6×100cm柱进行层析分离，收集并获得纯化的融合蛋白。上述纯化所得融合蛋白经12％SDS-PAGE电泳检测可见大小为24KD的单一蛋白带(图3)。HPLC显示为单一蛋白峰，纯度大于99％。
纯化后的TMP-hGH融合蛋白经Lowry法测定蛋白浓度后，用0.15mol/L NaCL、20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)稀释并无菌过滤，可制成水针；加入2.5％甘露醇后则可进行冻干并制成白色粉针。
实施例4重组TMP-hGH融合蛋白的体内分布与代谢用同位素125I标记纯化后的重组TMP-hGH融合蛋白。按1.7mg/kg剂量给小鼠口服(灌胃)碘化钾以抑制125I与甲状腺的结合，24h后再给小鼠静脉注射上述125I标记的重组MP-hGH融合蛋白，在此之后的3h、6h、12h、24h和48h活杀动物，分别取血液、心、肝、肺、肾、骨髓等脏器，用放免计数仪进行放射性计数(cpm/mg)。
如表1所示静脉注入后3h以内，除血液和胃组织外，重组TMP-hGH融合蛋白均匀分布于全身各组织；之后该融合蛋白主要聚集在骨髓组织中，并于6h左右达最高峰，而它在其它组织中的含量则显著降低。分解代谢结果显示该融合蛋白在骨髓中的半衰期约为42小时。
表125I标记TMP-hGH融合蛋白在小鼠不同脏器组织中的放射性计数(cpm/mg)时间(h) 血液 心脏肝 肾 大脑肺 胃 小肠肌肉 骨髓股骨3 38.161.521.262.250.552.2713.973.801.24.721.736 15.481.401.192.020.402.173.82 1.301.02 5.751.9412 1.80 0.650.590.990.290.902.72 0.650.89 4.001.4924 1.30 0.650.560.830.190.961.80 0.720.41 3.140.7948 0.67 0.570.580.410.160.490.53 0.290.58 2.850.55实施例5重组TMP-hGH融合蛋白的升血小板活性测定以BALB/c小鼠为实验对象，60Coγ射线5Gy全身一次性照射实验小鼠，复制辐射损伤致血小板减少症动物模型(这种情况常见于急性放射病和肿瘤放疗所致的血小板减少症)。
实验动物分三组第一组照射后给予重组TMP-hGH融合蛋白治疗，100ug/kg/d，皮下注射，连续用14天；第二组照射后给予目前临床上用于治疗血小板减少症的特效药重组人IL-11治疗，50ug/kg/d，皮下注射，连续用14天；第三组为生理盐水对照组。
结果发现，如图4所示应用本发明的TMP-hGH融合蛋白可以显著抑制受照射小鼠外周血血小板的减少，显示出较强的升血小板活性，其效果甚至优于重组人IL-11。
结论由于辐射损伤致血小板减少在血小板减少症疾病中具有很强的代表性，因此，从实施例5的结果可以表明，重组TMP-hGH融合蛋白用于治疗原发性和继发性血小板减少症疾病，效果良好。同样，重组TMP-hGH融合蛋白用于治疗其它的原发性和继发性血小板减少症疾病，可以达到本发明同样的效果。
本发明为采用重组靶向促血小板生成的融合蛋白在临床上治疗原发性和继发性血小板减少症疾病提供了新的途径。
SEQUENCE LISTING(序列信息表)<110>中国人民解放军第三军医大学<120>一种重组靶向促血小板生成的融合蛋白及其制备<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>14<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>TPO模拟肽的氨基酸序列<400>1Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala1 510<210>2<211>191<211>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu1 5 10 15Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu20 25 30Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu35 40 45Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr50 55 60Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu65 70 75Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val80 85 90
Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala95 100 105Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly110 115 120Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr125 130 135Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser140 145 150His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys155 160 165Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val170 175 180Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe185 190<210>3<211>210<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>TPO模拟肽与人生长激素融合蛋白-1的氨基酸序列，其中TPO模拟肽区位于融合蛋白的N-末端，人生长激素多肽区位于融合蛋白的C-末端，两者之间由桥接肽“GSGSG”进行连接<400>3Lle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly1 5 10 15Ser Gly Ser Gly Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp20 25 30Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp35 40 45Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys50 55 60Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu65 70 75Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser80 85 90Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp95 100 105
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<223>TPO模拟肽与人生长激素融合蛋白-2的氨基酸序列，其中TPO模拟肽区位于融合蛋白的C-末端，人生长激素多肽区位于融合蛋白的N-末端，两者之间有桥接肽“GSGSG”进行连接<400>4Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu1 5 10 15Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu20 25 30Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu35 40 45Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr50 55 60Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu65 70 75Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val80 85 90Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala95 100 105
Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly110 115 120Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr125 130 135Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser140 145 150His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys155 160 165Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val170 175 180Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Gly Ser Gly Ser185 190 195Gly Lle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala200 205 210<210>5<211>630<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>编码TPO模拟肽与人生长激素融合蛋白-1的DNA序列<400>5atcgaaggtc cgactctgcg tcagtggctg gctgcacgtg ctggttctgg ttctggtttc 60ccaactattc cactgagtcg cctgttcgat aacgcgatgc tgcgtgcgca tcgtctgcac 120caactggctt tcgacactta ccaggagttc gaagaagcat acatcccgaa agaacagaaa 180tacagcttcc ttcagaaccc acagacctcg ttgtgtttct ctgaaagtat cccgacccct 240tctaaccgcg aagagaccca gcagaaatcg aaccttgaac tgcttcgtat ctcgctgctt 300ctcattcagt cgtggctgga gccagtacag ttcctgcgtt cggttttcgc aaactcactg 360gtttacggtg cgtctgacag taacgtttac gacctgctga aagaccttga agaagggatc 420cagaccctga tgggtcgcct ggaagatggt tcaccacgca ctggtcagat cttcaaacag 480acttactcca aattcgatac taactctcat aacgatgatg ctctgctgaa aaactacggc 540ctgctgtact gtttccgtaa agatatggat aaagttgaaa ctttcctgcg tatcgttcag 600tgtcgttctg ttgaagggtc gtgtggcttc 630
<210>6<211>630<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>编码TPO模拟肽与人生长激素融合蛋白-2的DNA序列<400>6ttcccaacta ttccactgag tcgcctgttc gataacgcga tgctgcgtgc gcatcgtctg 60caccaactgg ctttcgacac ttaccaggag ttcgaagaag catacatccc gaaagaacag 120aaatacagct tccttcagaa cccacagacc tcgttgtgtt tctctgaaag tatcccgacc 180ccttctaacc gcgaagagac ccagcagaaa tcgaaccttg aactgcttcg tatctcgctg 240cttctcattc agtcgtggct ggagccagta cagttcctgc gttcggtttt cgcaaactca 300ctggtttacg gtgcgtctga cagtaacgtt tacgacctgc tgaaagacct tgaagaaggg 360atccagaccc tgatgggtcg cctggaagat ggttcaccac gcactggtca gatcttcaaa 420cagacttact ccaaattcga tactaactct cataacgatg atgctctgct gaaaaactac 480ggcctgctgt actgtttccg taaagatatg gataaagttg aaactttcct gcgtatcgtt 540cagtgtcgtt ctgttgaagg gtcgtgtggc ttcggttctg gttctggtat cgaaggtccg 600actctgcgtc agtggctggc tgcacgtgct 630
权利要求
1.一种重组靶向促血小板生成的融合蛋白，其特征在于由TPO模拟肽区和人生长激素多肽区组成。
2.根据权利要求1所述的重组靶向促血小板生成的融合蛋白，其特征在于TPO模拟肽区的氨基酸具有SEQ ID NO1序列；人生长激素多肽区的氨基酸与人生长激素氨基酸残基序列同源。
3.根据权利要求1所述的重组靶向促血小板生成的融合蛋白，其特征在于TPO模拟肽区位于融合蛋白的N-末端，人生长激素多肽区位于融合蛋白的C-末端；或TPO模拟肽区位于融合蛋白的C-末端，人生长激素多肽区位于融合蛋白N-末端。
4.根据权利要求1所述的重组靶向促血小板生成的融合蛋白，其特征在于TPO模拟肽区与人生长激素多肽区之间设有桥接肽进行连接。
5.根据权利要求4所述的重组靶向促血小板生成的融合蛋白，其特征在于桥接肽为0到15个氨基酸组成的桥接肽。
6.编码权利要求1-5中任意一项的重组靶向促血小板生成的融合蛋白的DNA序列，其具有SEQ ID NO5和SEQ ID NO6序列。
7.包含权利要求6所述的DNA序列的重组表达载体。
8.制备重组靶向促血小板生成的融合蛋白的方法，包括将融合蛋白携带权利要求7所述DNA序列的重组表达载体转化、转染或转导宿主细胞，分离、纯化所述重组靶向促血小板生成的融合蛋白。
9.根据权利要求8所述的制备重组靶向促血小板生成的融合蛋白的方法，其特征在于原核表达的宿主为大肠杆菌，真核表达的宿主为酵母。
10.重组靶向促血小板生成融合蛋白用于治疗原发性和继发性血小板减少疾病的药物。
全文摘要
本发明涉及一种重组靶向促血小板生成的融合蛋白及其制备方法。本发明公开了一种重组靶向促血小板生成的融合蛋白，它包括TPO模拟肽区和人生长激素多肽区，在TPO模拟肽区与人生长激素多肽区之间设有桥接肽。本发明还公开了重组靶向促血小板生成的融合蛋白制备方法和用途。本发明不仅能够使生长激素靶向性地作用于巨核细胞，而且还有效延长了TPO模拟肽的半衰期，使TPO模拟肽和生长激素在促血小板生成方面的作用得到了优势互补与加强的优点。本发明融合蛋白能够靶向性地刺激巨核细胞增殖与分化，具有高效低毒的升血小板作用，适用于治疗原发性和继发性血小板减少症等疾病，效果良好。
文档编号A61P7/00GK1737012SQ20051005721
公开日2006年2月22日 申请日期2005年8月10日 优先权日2005年8月10日
发明者王军平, 粟永萍, 艾国平, 刘晓宏, 程天民 申请人:中国人民解放军第三军医大学