专利名称：成骨细胞特异性转录因子－2基因修饰的组织工程化骨的构建方法
技术领域：
本发明为成骨细胞特异性转录因子-2基因修饰的组织工程化骨的构建方法，属于骨组织工程技术领域。
背景技术：
由于肿瘤切除、外伤、骨疾病及骨异常生长所造成的骨缺损，单纯依靠自行修复很难愈合，因此植骨术是治疗大段骨缺损的最有效措施。在美国植骨术已成为仅次于输血的组织移植技术。据美国疾病预防与控制中心不完全统计，在美国每年因骨缺损需要进行骨移植手术的患者超过100万例，医疗费用超过50亿美元，在英国的费用也超过了9亿英镑。传统的移植方式主要有自体骨移植和异体骨移植，但自体骨移植面临着骨源受限、增加创伤和感染率等缺陷，而异体骨移植存在生物活性差、免疫排斥反应和传播疾病的危险。近年来组织工程技术的发展为骨缺损的治疗提供了新思路。
骨髓间充质干细胞(MSCs)因具有明确的成骨分化潜能，易于获得及扩增，其独特的细胞增殖分裂模式使外源基因易于导入和表达，因此成为目前研究最广泛的的组织工程骨种子细胞。MSCs具有成骨潜能，一方面其中的定向性骨祖细胞能自动分化为成骨细胞，另一方面其中的诱导性骨祖细胞在诱导物的作用下也能转化为成骨细胞系。尽管已经有大量的实验证实了MSCs的成骨分化，然而如何通过合适的基因修饰使MSCs进行定向诱导成骨分化，从而更好的应用于骨组织工程是亟待解决的问题。成骨细胞特异性转录因子-2(Osf2)，又称核心结合因子α1(Cbfa1)，属于runt结构域基因家族的转录因子，已被证实对成骨细胞分化和骨形成具有重要作用，但国内外未见将Osf2应用于组织工程化骨构建的报道。
另外，在骨组织工程中，良好的支架材料利于细胞和/或生物活性因子的定位及递送，既而影响新组织的三维空间构型的形成，以及最终与受体很好地适应并结合在一起，形成具有适宜结构和功能的新组织。理想的骨组织工程材料应满足以下要求①良好的生物相容性；②良好的生物降解性；③易加工成形，并具有一定的强度；④材料表面易于细胞粘附且不影响其增殖分化。已有大量的实验应用人工合成材料进行骨缺损的修复尝试，并取得一定的效果，但生物相容性、降解产物代谢、力学特性等诸多问题限制了其应用。因此，寻求一种综合考虑生物相容性、生物降解性、骨诱导性和骨传导性，以及力学性质的材料制备方法十分必要。天然生物衍生材料抗原性较弱，并有良好的组织亲和性和结合力，其天然的孔隙结构，为种子细胞的粘附、增殖、分化和成骨提供了天然的三维空间结构。但目前的生物衍生材料也有其弊端脱蛋白处理较好地保留了材料的孔隙结构和机械强度，降低了抗原性，但同时降低了材料的骨诱导性；脱钙处理虽较好的保留了诱导性，但大大降低了机械强度。
细胞在生物支架材料的体外培养是目前骨组织工程研究中的一个难点，主要原因是简单的三维培养会导致细胞分布不均匀，深部细胞的营养交换障碍等问题，因此应用合理而实用的体外种植和培养体系是构筑组织工程化骨的关键。
发明内容
本发明针对目前的骨组织工程研究中种子细胞、支架材料和体外培养三个方面进行改进，目的是提供一种具有明确成骨效应的组织工程化骨的构建方法，用于临床上修复骨缺损。
本发明的技术解决方案如下本方法以成骨细胞特异性转录因子-2基因修饰的骨髓间充质干细胞为种子细胞，与脱细胞骨基质天然生物衍生材料复合构建骨组织，经体外动态培养后，进行大段长骨缺损的修复，包括以下三个步骤(1)种子细胞的获取所述种子细胞为骨髓间充质干细胞，细胞融合度约为90％后利用成骨细胞特异性转录因子-2(Osf2)腺病毒感染，感染24小时后收集细胞用于与支架材料的复合；(2)天然生物衍生材料的制备由异种或同种骨组织去除抗原性和细胞成分，保留骨基质的天然孔架结构及力学特性；(3)种子细胞的种植与组织工程化骨的动态培养完成支架材料的制备后，在支架材料上接种种子细胞。继而在反应器内动态培养5-7天，即获得组织工程化骨。
本发明的有益效果本发明针对目前的骨组织工程研究中种子细胞、支架材料和体外培养三个方面进行改进。通过Osf2基因修饰骨髓MSCs，增强了种子细胞的成骨定向分化能力，并在修复过程中促进骨形成；脱细胞骨基质生物衍生材料的应用，只脱去细胞成分，而保留组织的无机和有机成分，极利于细胞的附着及新骨的形成，使支架材料在生物相容性、生物降解性、骨诱导性、骨传导性及力学性质方面较为理想；动态培养促进了种子细胞在支架材料的黏附、生长增殖，并进一步促进Osf2基因修饰的MSCs的成骨分化能力，解决了细胞在生物支架材料的体外培养是目前骨组织工程研究中难题。本发明适用于骨科、整形、颌面外科等多种常见修复，具有广阔的临床应用前景。
图1是实施例1中组织工程化骨裸鼠背部皮下种植。4周后可见大量新骨生成。荧光示踪观察和组织学检查发现，组织工程化骨内大量经基因修饰的种子细胞发挥成骨效应(200×)。
图2.是实施例2中兔桡骨1.2cm缺损的修复。X线检查术后12周A组支架材料完全降解并被新生骨组织所取代，新骨塑形完成，骨髓腔通畅。A组在新骨形成、骨改建和髓腔再通等方面明显优于其它组。
具体实施例方式
以下结合实施例详细说明本发明的构建过程实施例11.种子细胞的制备抽取小鼠骨髓悬液约2m1，通过密度梯度离心，收集界面的单核细胞层，调整至2×105/cm2的密度接种。24小时后首次换液，弃取未贴壁细胞，此后每周半量换液2次。14d后单层细胞基本融合。0.25％胰蛋白酶消化，按1∶2传代。使用第1-6代细胞，细胞融合度约为90％后利用携带人Osf2基因腺病毒感染，感染1天后收集细胞用于与支架材料的复合。
1.1骨髓间充质干细胞的获取自小鼠股骨抽取骨髓悬液约2ml，缓慢加至预先加入Percoll分离液5mL(比重1.073g/mL)的离心管中，以2000r/min×20min离心，收集界面的单核细胞层，PBS洗2次，去除多余脂肪及组织液，加入DMEM培养液，吹打，稀释成细胞悬液，调整至2×105/cm2的密度接种于25ml培养瓶。加入足量培养液，培养基为DMEM+10％FCS，5％CO2，37℃孵育，24h后换液，弃取未贴壁细胞，此后每周半量换液2次，逐日观察。14d后单层细胞基本融合。0.25％胰蛋白酶消化，按1∶2传代。收集1-6代细胞用于下面的构建。
1.2携带人Osf2腺病毒载体构建如下设计引物，上游5’-GAAGATCTTCATGGCATCAAACAGCCTCTT-3’(加入BgllI酶切位点)；下游5’-GCCTCGAGCGTCAATATGGTCGCCAAACAGATTCA-3’(加入XhoI酶切位点)，抽提成骨细胞总RNA，用RT-PCR方法克隆人Osf2基因cDNA，定向克隆于穿梭质粒pShuttle-CMV(美国Stratagene公司编号#240007)的BglII(第947bp)和XbaI(第972bp)位点，继而利用细菌内重组原理与骨架质粒pAdeasy-1(美国Stratagene公司编号#240005)重组得到pAdEasy-1/Osf2质粒，脂质体法转染293细胞，重组腺病毒在293细胞大量扩增繁殖，氯化铯密度梯度超离心法纯化，得到Osf2重组腺病毒。
以上述所构建的重组腺病毒基因组DNA为模板，可以扩增出Osf2基因片断，而未能扩增出腺病毒E1蛋白的特异条带，表明获得的腺病毒携带Osf2基因，且无具备复制能力的腺病毒污染，可以应用于种子细胞的基因修饰。
1.3 Osf2腺病毒感染骨髓间充质干细胞的具体操作如下将MSCs以2×104/cm2的密度传代于6孔板，约3d后细胞融合约90％时，用PBS洗2次，加入感染复数(MOI)＝50的Osf2重组腺病毒，感染1小时后PBS洗2次，加入条件培养液(DMEM+10％胎牛血清+地塞米松10nmol/l+维生素C50mg/l+β-甘油磷酸钠10mmol/L)。
2.天然生物衍生材料的制备方法采用以下方式将异种或同种松质骨块置入1∶2甲醇氯仿溶液中脱脂12h→0.05M Tris-HCl(PH7.4)缓冲液中，缓冲液中加入蛋白酶抑制剂(4U/mlDispase，lμM Acetyl-Pepstain，0.5μM AEBSF，2μg/ml Aprotinins，100μM Leupeptin)，4℃恒温震荡3d→骨块置入含3％TritonX-100的Tris-HCl(PH7.4)缓冲液中，内加蛋白酶抑制剂，4℃恒温震荡3d→去离子水连续冲洗12h后，加入DNAase和RNAase混合液室温下消化12h→重复第3步。最后骨块经蒸馏水充分冲洗后，真空制干，经10kGy钴60-γ射线照射消毒灭菌后-20℃保存备用。
将上述方法制备的脱细胞骨基质材料行形态学检测HE染色可见脱细胞骨基质胶原纤维排列整齐，骨小梁结构完整，无明显断裂，骨陷窝内空虚，未见细胞和其它细胞成分。哈佛氏系统中央管及周围陷窝中均未见细胞，整个基质呈伊红色。边缘部与中心部脱细胞效果相同。扫描电镜显示脱细胞骨基质结构较完整，骨陷窝空虚，陷窝内壁光滑规则，未见任何细胞残留成分。脱细胞骨基质的网孔测量脱细胞骨基质呈现不规则的网架-空隙结构，经测量50个视野的500个孔隙，经统计脱细胞骨基质的孔隙直径为253±106μm，孔隙率约75.8％。
该支架材料的力学指标骨的压缩破坏载荷、最大抗压强度、弹性模量等几项指标稍有减小和降低，但无统计学意义(P＞0.05)，其纵向压缩的力学性质没有明显的改变。异种抗原α-gal无表达。
3.种子细胞的种植与组织工程化骨的动态培养实际例为①将脱细胞骨基质(1.0cm×1.0cm×0.5cm)在DMEM培养基中预湿2h。②然后将2.0×106个经Osf2腺病毒感染的MSCs制成400μl细胞悬液，利用1ml注射器加入基质材料，尽量使细胞灌入孔隙中。24孔板静置培养，37℃，5％CO2孵箱培养4小时。③最后加入含10％FCS的DMEM培养基覆盖基质材料，培养过夜(12-16小时)。每周换液2次。④在自行设计制备的细胞灌流系统，或者旋转式细胞培养系统(RCCS)等进行组织工程化骨的动态培养。将细胞-材料复合物置于流动腔，调整位置，使培养基可以充分流经支架材料，培养5-7天，每周换液2次。
经上述步骤进行种子细胞的种植静置培养4小时，加入可覆盖材料的培养基培养过夜后，倒置显微镜下观察，可以发现材料孔隙和周边有细胞粘附，随着细胞培养的时间延长，附着于材料上的细胞逐渐增多。电镜显示经反应器内培养5天后，细胞在材料中粘附良好，细胞形态呈纤维状梭形或扁平，伸出细胞突起“铆伏”在材料的孔隙或者表面。相邻细胞之间有突起相连接，细胞表面有钙颗粒沉积。细胞的碱性磷酸酶活性和骨钙素产物均高于静态培养组和未经Osf2基因修饰MSCs组，表明在流体促进细胞分化的基础上，通过Osf2的基因修饰，可以进一步增强MSCs向成骨细胞的分化，从而更好的发挥组织工程化骨的修复功能。
按照步骤3进行体外的动态培养5天后，裸鼠背部皮下种植。4周后可见大量新骨生成。见图1，荧光示踪观察和组织学检查发现，组织工程化骨内大量经基因修饰的种子细胞发挥成骨效应(200×)。
实施例2按实施例1中的步骤1方法获得兔骨髓间充质干细胞，经Osf2基因修饰后，种植在按步骤2所制备的支架材料，继而按照步骤3进行体外的动态培养5天。选择3月龄日本大白兔40只，建立单侧桡骨1.2cm缺损，根据不同的修复方式分成4组，每组10只A组.Osf2基因修饰MSCs与脱细胞骨基质材料复合后修复；B组.未基因修饰MSCs与脱细胞骨基质材料复合后修复；C组.单纯支架材料修复；D组.空白对照，不加任何植骨处理。结果参见图2，X线检查和组织学观察显示A组在新骨形成、骨改建和髓腔再通等方面明显优于其它组，术后12周A组支架材料完全降解并被新生骨组织所取代，新骨塑形完成，骨髓腔通畅；修复后修复侧桡骨与健侧相比破坏压缩载荷差异不显著(P＞0.05)。
上述方法若是对于人，种子细胞为取自髂前上棘的骨髓间充质干细胞，其余实施步骤相同。
权利要求
1.成骨细胞特异性转录因子-2基因修饰的组织工程化骨的构建方法，其特征是采用如下的方法制备(1)种子细胞的获取所述种子细胞为骨髓间充质干细胞，细胞融合度约为90％后利用成骨细胞特异性转录因子-2(Osf2)腺病毒感染，感染24小时后收集细胞用于与支架材料的复合；(2)天然生物衍生材料的制备由异种或同种骨组织去除抗原性和细胞成分，保留骨基质的天然孔架结构及力学特性；(3)种子细胞的种植与组织工程化骨的动态培养完成支架材料的制备后，在支架材料上接种种子细胞，继而在反应器内动态培养5-7天。
2.根据权利要求1所述的成骨细胞特异性转录因子-2基因修饰的组织工程化骨的构建方法，其特征是，在其制备方法(1)中骨髓间充质干细胞的获取如下抽取骨髓悬液约2ml，缓慢加至预先加入Percoll分离液5mL的离心管中，以2000r/min×20min离心，收集界面的单核细胞层，以2×105/cm2的密度接种于25ml培养瓶；24h后换液，弃取未贴壁细胞，此后每周半量换液2次，逐日观察；14d后单层细胞基本融合；0.25％胰蛋白酶消化，按1∶2传代。
3.根据权利要求1所述的成骨细胞特异性转录因子-2基因修饰的组织工程化骨的构建方法，其特征是，在其制备方法(1)中携带人Osf2基因腺病毒载体构建如下设计引物上游5’-GAAGATCTTCATGGCATCAAACAGCCTCTT-3’；下游5’-GCCTCGAGCGTCAATATGGTCGCCAAACAGATTCA-3’，抽提成骨细胞总RNA，用RT-PCR方法克隆人Osf2基因cDNA，定向克隆于穿梭质粒pShuttle-CMV的BglII和XbaI位点，既而利用细菌内重组原理与骨架质粒pAdeasy-1重组得到pAdEasy-1/Cbfal质粒，脂质体法转染293细胞，重组腺病毒在293细胞大量扩增繁殖，纯化。
4.根据权利要求1所述的成骨细胞特异性转录因子-2基因修饰的组织工程化骨的构建方法，其特征是，在其制备方法(1)中Osf2腺病毒感染骨髓间充质干细胞的具体操作如下将MSCs以2×104/cm2的密度传代于6孔板，约3d后细胞融合约90％时，加入感染复数(MOI)＝50的Osf2重组腺病毒，感染1小时后PBS洗2次，加入条件培养液。
5.根据权利要求4所述的成骨细胞特异性转录因子-2基因修饰的组织工程化骨的构建方法，其特征是，制备方法(1)中加入的条件培养液为DMEM+10％胎牛血清+地塞米松10nmol/L+维生素C50mg/L+β-甘油磷酸钠10mmol/L。
6.根据权利要求1所述的成骨细胞特异性转录因子-2基因修饰的组织工程化骨的构建方法，其特征是，在其制备方法(2)中天然生物衍生材料的制备方法如下将异种或同种松质骨块置入1∶2甲醇氯仿溶液中脱脂12h→0.05M Tris-HCl缓冲液中，PH7.4，缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，4℃恒温震荡3d→将骨块置入含3％TritonX-100的Tris-HCl缓冲液中，PH7.4，内加蛋白酶抑制剂，4℃恒温震荡3d→去离子水连续冲洗12h后，加入DNAase和RNAase混合液室温下消化12h→重复第3步；最后骨块经蒸馏水充分冲洗后，真空制干，经10kGy钴60-γ射线照射消毒灭菌后-20℃保存备用。
7.根据权利要求6所述的成骨细胞特异性转录因子-2基因修饰的组织工程化骨的构建方法，其特征是，制备方法(2)中加入的蛋白酶抑制剂为4U/mlDispase，1μMAcetyl-Pepstain，0.5μM AEBSF，2μg/ml Aprotinins和100μM Leupeptin。
8.根据权利要求1所述的成骨细胞特异性转录因子-2基因修饰的组织工程化骨的构建方法，其特征是在其制备方法(3)中种子细胞的种植操作如下首先将脱细胞骨基质在DMEM培养基中预湿2小时；然后将2.0×106个经Osf2腺病毒感染的MSCs制成400μl细胞悬液，利用1ml注射器加入基质材料，尽量使细胞灌入孔隙中；24孔板静置培养，37℃，5％CO2孵箱培养4h；最后加入含10％FCS的DMEM培养基覆盖基质材料，培养12-16h，每周换液2次。
9.根据权利要求1所述的成骨细胞特异性转录因子-2基因修饰的组织工程化骨的构建方法，其特征是，在其制备方法(3)中组织工程化骨的动态培养组织工程化骨在反应器内动态培养，利用细胞灌流系统或旋转式细胞培养系统RCCS，将细胞-材料复合物置于流动腔，调整位置，使培养基可以充分流经支架材料，培养5-7天，每周换液2次。
全文摘要
本发明涉及成骨细胞特异性转录因子－2基因修饰的组织工程化骨的构建方法，属于骨组织工程领域。本方法采用一种天然生物衍生材料(脱细胞骨基质)与种子细胞(成骨细胞特异性转录因子－2基因修饰的骨髓间充质干细胞)复合构建骨组织，经体外动态培养后，进行大段长骨缺损的修复，可实现骨缺损的临床愈合。本发明适用于骨科、整形、颌面外科等多种常见修复。
文档编号A61L27/38GK1733318SQ200510057220
公开日2006年2月15日 申请日期2005年8月9日 优先权日2005年8月9日
发明者董世武, 应大君, 谢肇 申请人:中国人民解放军第三军医大学