专利名称：一种海岛棉dreb转录因子基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种海岛棉DREB转录因子基因以及其 构建的植物表达载体及其在耐旱转基因植物研制方面的应用。
背景技术：
转录因子(transcription factor, TF)又称为反式作用因子，是指可以与真核生 物基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性结合的蛋白，通过他们之间以及与其它相 关蛋白之间的相互作用激活或抑制某些基因的转录。根据结合方式的不同可以把转录因子 分为两类一类是普遍性转录因子，另一类是特异性转录因子，普遍性转录因子能够和启动 子的核心序列TATA框结合，可以激活所有基因的转录，而特异性转录因子与DNA序列上的 其它调节元件结合，只能激活特定的基因。自从1987年Paz-Ares首次报道了玉米转录因子 基因后，迄今从高等植物中分离出的调控干旱、低温、高盐、激素、生长发育及病原反应等相 关基因表达的转录因子已达数百种。研究发现在拟南芥中编码转录因子的基因至少有1533 个，约占其基因总数的5. 9%，而且这些转录因子在调节植物生长发育以及对外界环境的响 应方面起着重要作用。DREB (dehydration responsive element binding protein)转录因子是存在于植 物中，与DRE(dehydration responsive element)顺式作用元件相结合，调控对干旱、高盐、 低温等逆境应答相关基因表达的蛋白质。DREB类转录因子的发现是近年来植物抗逆性研究方面最具突破性的进展之一。它 在植物应答干旱、高盐及低温胁迫信号的过程中起重要的调控作用。自从1997年，Thotnashow研究小组和1998年刘强等率先从拟南芥中分离克隆出 CBFl (DREBlB) ,CBF2, (DREBlC)和 CBF3 (DREBlA) 3 个 CBF/DREB1 类转录因子以来，植物中的 这类转录因子的研究受到了广泛的关注。大多数转录因子基因的表达受到外界刺激和生长 发育进程的诱导，DREB基因介导复杂的胁迫信号传递网络，参与多种不同的信号传递。大 部分DREB基因的表达都受干旱、高盐、低温等逆境胁迫的诱导，但是不同种类的DREB转录 因子可能有不同的表达机制，即使是同一种类的，也可能有不同的表达机制，在植物对逆境 胁迫与激素应答反应中发挥不同的调控作用。目前尚未见关于海岛棉DREB转录因子基因 的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海岛棉DREB转录因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。本发明的第二个目的在于提供一种海岛棉DREB转录因子，由SEQ ID N0:1所示核 苷酸序列编码，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。本发明的第三个目的在于提供含有所述海岛棉DREB转录因子基因的植物表达载 体。
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本发明的第四个目的在于提供用所述植物表达载体转化的植物细胞、组织或植株。本发明的第五个目的在于所述海岛棉DREB转录因子基因在培育抗逆植物，尤其 是耐旱植物品种中的应用。本发明的技术路线为1)取海岛棉新海16叶片；2)从叶片提取基因组DNA和总RNA ；3)用总RNA进行逆转录反应，得到cDNA，以cDNA为模板PCR扩增DREB转录因子 基因，命名为XHDREB ；4)构建pC-XHDREB植物表达载体，用根癌农杆菌转化烟草，获得转XHDREB基因烟 草，采用干旱模拟实验验证转XHDREB基因烟草，因XHDREB的过表达而具有耐旱、耐盐、抗冷 能力。本发明克隆了一种海岛棉DREB转录因子基因XHDREB，构建pC_XHDREB植物表达载 体，用根癌农杆菌转化烟草，获得转XHDREB基因烟草，采用干旱模拟实验验证转XHDREB基 因烟草，因XHDREB的过表达而具有耐旱、耐盐、抗冷能力。
图1海岛棉DREB基因PCR扩增电泳图，泳道cDNA的扩增产物、泳道2 =DNA的扩 增产物、泳道M =DNA标准分子量DL2000 ；图2重组质粒pC-XHDREB构建流程3转基因烟草的PCR检测电泳图，泳道1 阳性对照、泳道2-9 转基因植株、泳道 10 阴性对照、泳道M =DNA标准分子量DL2000 ；图4A-4D转基因烟草的耐旱性分析结果图，图4A 干旱处理3d的转XHDREB基因 烟草、图4B 干旱处理3d的非转基因烟草、图4C 复水恢复生长3d的转XHDREB基因烟草、 图4D 复水恢复生长3d的非转基因烟草；图5A-5D转基因烟草的耐盐性分析结果图，图5A :200mmol/L NaCl连续处理3d的 转XHDREB基因烟草、图5B :200mmol/LNaCl连续处理3d的非转基因烟草、图5C 恢复生长 3d后的转XHDREB基因烟草、图5D 恢复生长3d后的非转基因烟草；图6A-6D转基因烟草的耐低温性分析结果图，图6A :4°C处理24h的转XHDREB基 因烟草、图6B :4°C处理24h的非转基因烟草、图6C 室温下恢复培养3d后的转XHDREB基因 烟草、6D 室温下恢复培养3d后的非转基因烟草。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。工具酶和试剂(1)限制性内切酶，修饰酶及试剂盒T4 DNA连接酶，Taq酶，反转录酶AMV，DNA回 收纯化试剂盒均购自北京天根生物技术公司。质粒小量提取试剂盒购自博大泰克公司，其 它化学试剂购自北京鼎国公司。(2)其他药品琼脂糖，Tris，焦碳酸二乙酯(DEPC)为北京鼎国公司产品。蛋白胨，酵母提取物，氯仿，异戊醇，乙醇，异丙醇，NaCl, CaC12等均为国产分析纯试剂。 5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(X-gal)，异丙基硫代_ β -D半乳糖苷(IPTG)，氨苄青霉素等 购自北京鼎国公司。DNA分子量标准Mark Ladder 2000购自北京天根生物技术公司。溶液的配置(1)植物基因组DNA提取缓冲液500mL 0. 35mol/L葡萄糖；0. lmol/L Tris-HCKpH 8.0) ；5mmol/L Na-EDTA(pH 8.0) ；2% PVP ； 1 % β -Me(2)植物基因组 DNA 提取裂解液 500mL 1. 4mmol/L NaCl ；0. lmol/L Tris-HCl (pH 8.0) ；20mmol/L Na-EDTA(pH 8.0) ；2% CTAB ；2% PVP ； 1 % β -Me(3)植物基因组 DNA 溶解液 TE (pH 8. 0) IL :10mmol/L Tris-HCl ； lmmol/LEDTA (pH 8. 0)(4)植物基因组 DNA 电泳缓冲液 50XTBE(500mL) =Tris 121. Og ；冰醋酸 28. 5mL ； 0.5mol/L EDTA 50.OmL(pH 8. 0) ；lmol/L Tris-HCl(pH 8.0)500. OmL ；Tris 60. Og ；水 400. OmL;浓 HCl 21. OmL培养基(I)LB液体培养基胰蛋白胨10. 0g，酵母提取物5. 0g, NaCl 10. 0，pH 7. 0定容到 1000mL。(2) LB固体培养基胰蛋白胨10. 0g，酵母提取物5. Og5NaCl 10. 0g，琼脂粉15. Og, pH 7. 0 定容到 IOOOmL0(3) LB选择培养基在LB铺平板前，待培养基温度降到50°C左右，加入抗生素至浓 度为100mg/L，摇勻后铺平板。主要仪器PCR扩增仪(Tachne T312)，高速冷冻离心机(Hettich MIKRO 200R)，电泳设备 (Bio RAD)，凝胶成像系统(Bio RAD)。实施例1 海岛棉XHDREB基因的克隆1、植物材料的培养海岛棉(Gossypium barbadense L.)新海16，种子用灭菌的蒸馏水浸泡，在37°C 保温箱中放置48h，露白后再用灭菌的蒸馏水清洗干净，挤掉种皮后置于1/2 MS培养基中， 于25°C、光照强度2500 Lux和12h光周期条件下培养。一周后，从无菌苗上摘取叶片存于 液氮以提取基因组DNA，RNA。2、海岛棉基因组DNA的提取提取方法参照CTAB法，具体步骤如下取叶片3 5g，在液氮中研磨后，装入1.5ml离心管；在1.5ml离心管中加入 800μ 的DNA提取缓冲液(65°C预热)，并加入50yL β -疏基乙醇，混勻后65 °C水浴 2011^11，中间混勻几次；加入30(^1^ 5mmol/L醋酸钾(pH 7.0)混勻，冰浴20 60min后，在 室温下解冻；加入300 μ L的DNA提取裂解液，混勻，65°C水浴20min，中间混勻几次，室温、 IOOOOrpm离心IOmin ；吸取上清置于一个新的1. 5ml离心管中，加入600 μ L氯仿异戊醇 (24 1)混勻，IOOOOrpm离心IOmin ；取上清置于一个新的1. 5ml离心管中，加入等体积4°C 预冷的异丙醇。轻轻混勻，_20°C冰浴30min以上；6000rpm离心5min，弃上清，用70%乙醇 洗涤沉淀2次，无水乙醇洗1次，吹干；加入50 μ L TE溶解DNA。
3、海岛棉总RNA的提取用改良的热酚法提取海岛棉(新海16)叶片总RNA，具体方法如下将4mL提取缓冲液(用前加入PVP及β -疏基乙醇)与4mL酚-氯仿加入离心管 中，混勻后，置于65°C水浴锅中水浴20min ；取海岛棉叶片1 2g，在液氮中研磨后转入装 有提取缓冲液及酚_氯仿混合物的离心管中，旋涡振荡30s ；4°C,12000rpm高速离心5min 后，将上清移至另一离心管中加入4mL酚-氯仿混合液，混勻，离心，重复该操作一到两次， 然后取上清；加入等体积的4mol/L的LiCl，混勻，-20°C放置2h以上，12000rpm离心20min ； 弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀，然后将沉淀溶解于0. 5mL的TE中，将混合液转入1. 5mL的 离心管中；加入等体积的酚-氯仿混合液抽提一到两次，将上清转入另一离心管中，加入 1/10体积3mol/L醋酸钠(pH 5. 3)和2 3倍体积的无水乙醇，混勻，_20°C放置1 2h， 14000rpm，4°C离心5min，用70%乙醇洗涤沉淀，室温放置2 3min ；加200 500 μ L的 DEPC水，溶解沉淀，-80°C保存备用。提取的海岛棉叶片总RNA通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，紫外分光光度仪检 测能见两条明显RNA条带则表明样品可用。4、海岛棉XHDREB转录因子基因全长的获得和克隆第一链cDNA的合成按Promega公司反转录试剂盒说明书进行。分为预变性与反转录两部分，预变性 反应体系见表1，反应条件为70°C温育5min，立即置冰上lOmin。反转录反应体系见表2，反 应条件为25°C、5min，42°C、lh，7(TC、15min灭活反转录酶，-20°C冰箱保存反转录产物。表1预变性反应体系
权利要求
一种海岛棉DREB转录因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.权利要求1所述的海岛棉DREB转录因子基因编码的蛋白质，具有SEQID NO :2所 示的氨基酸序列。
3.含有权利要求1所述海岛棉DREB转录因子基因的植物表达载体。
4.用权利要求3所述植物表达载体转化的植物细胞、组织或植株。
5.权利要求1所述海岛棉DREB转录因子基因在培育抗逆植物品种中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述海岛棉DREB转录因子基因在培育抗 旱植物品种中的应用。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程领域，提供了一种海岛棉DREB转录因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，构建pC-XHDREB植物表达载体，用根癌农杆菌转化烟草，获得转XHDREB基因烟草，采用干旱模拟实验验证转XHDREB基因烟草，因XHDREB的过表达而具有耐旱、耐盐、抗冷能力。
文档编号A01H5/00GK101984059SQ20101024525
公开日2011年3月9日 申请日期2010年7月28日 优先权日2010年7月28日
发明者张艳妮, 曲延英, 陈全家 申请人:曲延英;陈全家