专利名称：含有基因工程融合蛋白的冻干组合物的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制品的保存领域，生物制品大多是注射用的蛋白质药物，不易稳定保存，所以往往采用冻干的形式保存，本发明主要是选用不同组合的冻干保护剂，来达到保护GnRH-PE及其衍生物这类融合蛋白生物活性的目的。
二.
背景技术：
生物制品的冻干技术就是把含有大量水份的物质预先冻结成固体，然后在真空条件下适当加热使水蒸气直接从固体中升华出来，而物质本身留在冻结时的冰架中，因此干燥后的产品体积几乎不变，有利于蛋白或其他生物制品的长期保存，在冻干中，选定冻干的保护剂是十分重要的，白蛋白作为一种重要的保护剂，由于添加之后会使样品有很好的成型和对样品活性很好的保护作用，长期以来经常被人们所选用为常规的冻干保护剂，如作为基因工程干扰素的冻干保护剂。但是由于目前市场上所能得到的人白蛋白产品均为血液制品，其受病毒污染的潜在的危险性较大，目前已经不再提倡使用白蛋白作为生物制品的冻干保护剂了，所以利用新型的作为白蛋白替代品的冻干保护剂就很重要。
在本发明中，GnRH是指人促黄体激素释放因子，PE40是指假单胞杆菌外毒素A的去掉结构域I所剩下的部分，GnRH的C术端与PE40的N末端，或者PE40的C末端与GnRH的N末端通过肽键连接起来，就形成了GnRH-PE融合蛋白，及其各种突变体。该类蛋白是一类可特异性杀伤腺癌类肿瘤的导向蛋白，现已证实，腺癌类细胞都会过量表达GnRH的受体，导向蛋白进入血液后，通过导向的GnRH可以特异性地识别该类肿瘤细胞表明的GnRH受体并且能够特异性地与受体结合，而与其相连的毒素部分PE及其衍生物会将该细胞杀死，从而该融合蛋白可以达到特异性地杀死肿瘤细胞的目的，从而达到治疗肿瘤的目的。
GnRH-PE是一类自然界中不存在的人工蛋白，所以其稳定性不强。试验表明，GnRH-PE及其衍生物4度下放置30天后生物活性就开始下降，表明需要冻干的方法来保持其生物活性。本发明通过一系列的试验研究，解决了GnRH-PE及其衍生物这类蛋白的不稳定问题，使其可以方便地保存，运输。
三.
发明内容
本发明通过对GnRH-PE及其衍生物冻干组合物和对pH的选择，找到了适合于GnRH-PE及其衍生物这一类融合蛋白的冻干组合物，该类冻干组合物较惯用的白蛋白安全、实用，且价格低廉，对GnRH-PE及其衍生物的生物活性具有较好的保护效果，为本发明中提到的这类融合蛋白实现药品化提供了一个很好的药剂平台。GnRH-PE及其衍生物作为一类对癌症的可能的有效治疗药物，其生物活性体现了其特异性杀灭肿瘤细胞的效果，所以本发明在肿瘤细胞治疗的方面有着预期的积极意义。
作为本发明中使用的GnRH-PE及其衍生物，是一类自然界没有的人工蛋白，其特征为人促黄体激素释放激素GnRH或其突变体以及假单胞杆菌外毒素A(PE)或其突变体组成的融合蛋白，所以可以使用一种具有序列1或序列5所示氨基酸序列的蛋白，也可以使用一种对序列1或序列5氨基酸序列加以修饰，如插入，缺失，突变某个或某些氨基酸而得到的序列，只要保留其的生物活性即可。换句话说，也可以采用其氨基酸序列大体上与序列1和序列5所显示的氨基酸相同的蛋白，即除了序列1和序列5所示氨基酸序列外，也包括对序列1和序列5所示氨基酸序列进行部分插入，缺失，突变某个或某些氨基酸而得到的序列。比如序列3是通过在序列1的N末端加上一个Met，将第6位的Gly突变为Ala，在序列1的第10位氨基酸后插入了His-Met-Ala-Glu-Glu的连接序列，在序列1的C末端去掉Arg-Glu-Asp-Leu-Lys，替换为Lys-Asp-Glu-Leu而得到的序列。值得指出的是，本发明列出的序列仅仅是对本发明的进一步说明，而不构成对本发明待批权利要求的限制。
获得GnRH-PE及其衍生物的方法可以通过分子克隆的方法实现，可通过多片段全基因合成并结合PCR的方法可以合成目的蛋白的基因序列，然后通过酶切连接等手段将基因连接入目的载体，如pET等，然后转化入相应的宿主菌，进行表达。表达后通过收集菌体，机械法或渗透压等方法破碎宿主菌，通过常规的层析方法，如离子交换层析，凝胶过滤层析和疏水层析等，纯化到目的蛋白。对目的蛋白的生物活性的测定采用MTT法，首先对Hela细胞进行消化和收集，将细胞用RPMI 1640培养液稀释成6-8×104个/毫升的细胞悬液，接种于96孔板，100ul/孔，37度培养4小时。对照加入100ul培养液。样品先用RPMI 1640培养液稀释成100ul/mL，作为起始孔，然后按每孔与上孔2.5倍的关系稀释样品，各加入稀释的样品每孔100ul，37度，培养24小时，取出，用MTT法染色，用酶标仪570nm进行测定并计算IC50值。冻干程序选择-45℃冷冻4小时，然后抽真空，升温速度控制在2度/小时，样品温度超过0度后，升温控制在8度/小时，最高到20度保持6小时。冻干结束。
在GnRH-PE及其衍生物的主要保护剂方面，试用了甘露醇，甘氨酸，甘露醇和甘氨酸的混合物，在使用3％-20％之间的浓度发现其在冻干骨架成型方面均具有比较好的效果。
在浓度小于3％的时候冻干有塌陷的现象，并且考虑到保护剂浓度高的时候的浪费，将优选的保护剂浓度定在了5％。关于pH的方面，在冻干前其冻干组合物的pH小于7.0的时候，发现样品冻干后并且溶解后不是澄清透明的，而是微白色，并且样品的活性也出现了下降，并且考虑到成品的pH不宜大于pH7.5，我们将pH范围选择为7.0-7.5，优选7.25。
此外，冻干组合物中的保护剂还可以含有至少一种以下的物质单糖或其衍生物，氨基酸，二糖类，表面活性剂。其中单糖或其衍生物包括葡萄糖，果糖，山梨醇，右旋糖酐；氨基酸包括丙氨酸，精氨酸，赖氨酸；二糖类为蔗糖，乳糖，海藻糖，麦芽糖；表面活性剂包括Tween-80和Tween-20。
三.
具体实施例方式下面的实例目的在于进一步阐述本发明，而不会构成对本发明专利待批权利要求的限制。
实例一.
冻干组合物1的配方是，2mL剂型，序列3的蛋白1mg，冻干主要保护剂是甘露醇，100mg，pH是7.25。进行冻干。
实例二.
冻干组合物2的配方是，2mL剂型，序列3的蛋白1mg，冻干主要保护剂是甘露醇，120mg，还含有0.004％Tween-80，pH是7.30。进行冻干。
实例三.
冻干组合物3的配方是，2mL剂型，序列4的蛋白1mg，冻干主要保护剂是甘氨酸，100mg，还含有0.004％Tween-80，pH是7.20。进行冻干。
实例四.
冻干组合物4的配方是，1mL剂型，序列5的蛋白1mg，冻干主要保护剂是甘露醇50mg，还含有2％右旋糖酐，pH是7.25。进行冻干。
实例五.
冻干组合物5的配方是，2mL剂型，序列6的蛋白1mg，冻干主要保护剂是甘氨酸，90mg，还含有3％Arg，pH是7.15。进行冻干。
实例六.
冻干组合物6的配方是，2mL剂型，序列2的蛋白1mg，冻干主要保护剂是甘氨酸50mg，甘露醇50mg，pH是7.20。进行冻干。
结果
从上表可以看出，本发明的冻干配方有效地保护了目的蛋白的生物活性。
序列表<110>北京诺思兰德生物技术有限公司<120>含有基因工程融合蛋白的冻干组合物<140>
<141>
<160>6<210>1<211>371<212>PRT<213>序列1<400>1Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Gly Ser Leu Ala1 5 10 15Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe20 25 30Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Tro Glu Gln Leu Glu Gln Cys35 40 45Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg50 55 60Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala65 70 75Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln80 85 90Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser95 100 105Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala110 115 120Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly125 130 135Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg140 145 150
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1.一种含有基因工程融合蛋白的冻干组合物。其中的融合蛋白是指第一位氨基酸改为Glu的人促黄体激素释放激素GnRH或其突变体以及假单胞杆菌外毒素A(PE)或其突变体组成的融合蛋白。
2.权利要求1中，GnRH的突变体可包括第六位氨基酸突变为Ala，Trp或Leu的分子。
3.权利要求1中，PE的突变体可包括去掉1-252位氨基酸，剩下的253-613位氨基酸的一段，为PE40；可包括去掉1-252，365-380两段氨基酸序列，剩下的253-364和381-613两段氨基酸序列按原顺序相连，为PE38；可包括去掉PE分子的1-279位氨基酸，剩下280-613部分，并将287位Cys突变为Ser或Ala或Gly，为PE37；可包括去掉1-279和365-380两段氨基酸序列，剩下的280-364，381-613两段氨基酸序列按原顺序相连，并将287位的Cys突变为Ser或Ala或Gly，为PE35；可包括PE，PE40，PE38，PE37，PE35分子去掉C末端的5个氨基酸Arg-Glu-Asp-Leu-Lys，而替换成Lys-Asp-Glu-Leu的分子。
4.权利要求1中，冻干组合物中除了融合蛋白外，其冻干保护剂主要成分是甘露醇。
5.权利要求1中，冻干组合物中除了融合蛋白外，其冻干保护剂主要成分是甘氨酸。
6.权利要求1中，冻干组合物中除了融合蛋白外，其冻干保护剂的主要成分是甘露醇和甘氨酸的混合物。
7.权利要求4中，所用甘露醇的浓度是3％-20％，优选5％。
8.权利要求5中，所用甘氨酸的浓度是3％-20％，优选5％。
9.权利要求6中，所用的甘露醇和甘氨酸的混合物的总浓度是3％-20％，优选5％。
10.权利要求2、3、4、5、6中，冻干组合物的pH为7.0-7.5，优选7.25。
11.权利要求2、3、4、5、6中，冻干组合物中的保护剂还可以含有至少一种以下的物质单糖或其衍生物，氨基酸类，二糖类，表面活性剂类。其中单糖或其衍生物包括葡萄糖，果糖，山梨醇，右旋糖酐；氨基酸类包括丙氨酸，精氨酸，赖氨酸；二糖类包括蔗糖，乳糖，海藻糖，麦芽糖；表面活性剂类包括Tween-80和Tween-20。
全文摘要
含有基因工程融合蛋白的冻干组合物，其中的融合蛋白是GnRH－PE以及其系列衍生物，而其组合物的主要成分是由甘氨酸、甘露醇、甘露醇和甘氨酸的混合物组成的，此外该组合物还可以含有至少一种选自表面活性剂、氨基酸、糖组成的组合物，冻干后长时间放置可以避免GnRH－PE以及其衍生物失去生物活性。
文档编号A61P35/00GK1846785SQ20051006313
公开日2006年10月18日 申请日期2005年4月5日 优先权日2005年4月5日
发明者金美玉, 马素永, 聂李亚, 文美玉 申请人:北京诺思兰德生物技术有限责任公司