专利名称：一种富含人参单糖皂苷的提取物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种富含人参单糖皂苷的提取物及其制备方法和用途。
背景技术：
日本专利昭58-57399公开了人参皂苷Rh2具有治疗肿瘤活性。小田岛肃夫进行了人参皂苷Rh2体外抗癌活性研究，证明其对肝癌、黑色素瘤B16、宫颈癌及肉瘤S180等癌细胞的增殖有显著的特异性的抑制作用，并提出抗癌作用机理，认为癌细胞在其增殖过程中，经人参皂苷Rh2作用，使癌细胞停止在一定的增殖期，并促使其逆转为正常细胞。
人参皂苷Rh2具有较强的抗癌活性，而且毒性低，因此是一个很好的抗肿瘤药物。近年来，人们一直在研究人参皂苷Rh2的制备方法，CN1352977A描述了“一种从天然植物中提取治疗恶性肿瘤产品的生产工艺”，CN1225366A描述了“20(S)-人参皂苷Rh2的制备”，CN1293198A描述了“稀有人参皂苷的制备方法”，CN1415304A描述了“一种以20(S)-人参皂苷Rh2为有效成分的抗癌辅助药物及应用”。尽管已经有了上述制备Rh2单体的方法，但由于其在人参茎叶、红参或西洋参茎叶中的含量非常低，是微量成分，因此提取后得到的Rh2单体量少且价高，难以在制药业广泛应用。鉴于此本发明人提供了一种药效与Rh2相当且能够在制药业上广泛应用的富含人参单糖皂苷的提取物。
发明内容
本发明提供了一种富含人参单糖皂苷的提取物，其中100％＞人参单糖皂苷≥50％，优选100％＞人参单糖皂苷≥80％，更优选100％＞人参单糖皂苷≥90％，人参单糖皂苷由Rh2、Rh1和Rk2组成，其比例为1∶0.005～0.8∶0.005～0.8。
本发明提供了一种制备富含人参单糖皂苷提取物的制备方法。
本发明还提供了富含人参单糖皂苷的提取物在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
本发明提供的富含人参单糖皂苷的提取物的制备方法为以人参皂苷、西洋参皂苷或三七皂苷为原料，或以上述3种植物药的茎叶总皂苷为原料，优选西洋参茎叶皂苷原料，在反应釜中加入6～10倍的多元醇，多元醇可以是甘油或1，2-丙二醇，加热，在60～80℃时加入上述皂苷，在搅拌条件下加入强碱。油浴电加热，升温速度控制约10～15℃/10min，当温度升至195～205℃时，停止加热，保持10～30分钟，然后反应物加入到5～30倍量水中，边加边搅拌，皂苷水解产物形成灰白色沉淀析出，静置，离心或过滤，用去离子水冲洗至滤液不显碱性，测提取物pH值在6～10，干燥得碱降解产物。将碱降解产物用无水乙醇、无水甲醇或含水乙醇，也可用甲醇或含水甲醇加热搅拌溶解，加入硅胶、氧化铝、硅藻土、活性炭中的任何一种或其混合物拌样，将拌好的样干燥，供层析分离用。将硅胶、氧化铝、硅藻土、活性炭任何一种固定项加到层析柱中，其用量为碱降解产物的10～40倍。拌好的样装在层析柱的上部，用含C1～C5的酯类、醇类、卤素类有机溶剂或其混和溶剂洗脱，如用氯仿∶甲醇(9∶1)洗脱剂洗脱，收集富含Rh2，Rh1和Rk2的部分，回收溶剂，即得富含人参单糖皂苷的提取物。
人参单糖皂苷的化学结构式如图所示 人参皂苷Rh1人参皂苷Rh2 人参皂苷Rk2本发明提供的富含人参单糖皂苷的提取物在抗肿瘤方面与人参皂苷Rh2作用相当。但制备简单，更有利于临床推广应用。
本发明提供的富含人参单糖皂苷的提取物用于肿瘤的有效剂量为60～240mg/天。
本发明提供的富含人参单糖皂苷的提取物可以与药学上可接受的载体制成药物组合物，该组合物可以是片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、软胶囊、注射液、冻干粉针、乳剂或冻干粉针，该药物组合物的单元剂量为5-200mg。
具体实施例方式
制备例1制备富含人参单糖皂苷的提取物称取甘油50kg，加到反应釜中，开搅拌，油浴加热到65℃，称取西洋参茎叶总皂苷5kg，氢氧化钠5.5kg，依次加入反应釜中，升温速度控制约10～15℃/10min，当温度升至195～205℃时，停止加热，保持20分钟，然后反应物加入到15倍量水中，边加边搅拌，皂苷水解产物形成灰白色沉淀析出，静置，离心，用去离子水洗至滤液不显碱性，测提取物pH值在6.5，取出，干燥，得碱降解产物3.35kg。
取碱降解产物0.50kg，用无水乙醇加热溶解，加入硅胶粉，混合拌样，将拌好的样干燥，粉碎，过筛，供层析分离用。
称取200～300目层析硅胶12kg，加到层析柱中，拌好的样装在层析柱的上部，用氯仿∶甲醇(9∶1)洗脱剂洗脱，收集富含人参单糖皂苷Rh1，Rh2，Rk2部分，回收溶剂，得富含人参单糖皂苷的提取物126g。高效液相色谱测定，含有人参单糖皂苷70.18％，其中51.23％的Rh2，13.45％的Rh1，5.50％的Rk2。
制备例2制备富含人参单糖皂苷的提取物称取制备例1中碱降解产物0.50kg，用无水乙醇加热搅拌溶解，加入氧化铝粉，混合拌样，将拌好的样干燥，粉碎，过筛，供层析分离用。
称取层析氧化铝15kg，加到层析柱中，拌好的样装在层析柱的上部，用氯仿∶甲醇∶醋酸乙酯(9∶1∶20)洗脱剂洗脱，收集富含人参单糖皂苷Rh1，Rh2，Rk2部分，回收溶剂，得提取物130g。高效液相色谱测定，含有人参单糖皂苷68.67％，其中53.45％的Rh2，11.82％的人参皂苷Rh1和3.40％的人参皂苷Rk2。
制备例3制备富含人参单糖皂苷的提取物称取制备例1中碱降解产物0.50kg，用无水乙醇加热搅拌溶解，加入氧化铝粉，混合拌样，将拌好的样干燥，粉碎，过筛，供层析分离用。
称取层析用硅藻土15kg，加到层析柱中，拌好的样装在层析柱的上部，用氯仿∶甲醇∶醋酸乙酯(9∶1∶10)洗脱剂洗脱，收集富含人参单糖皂苷Rh1，Rh2，Rk2部分，回收溶剂，得人参单糖皂苷提取物42g。高效液相色谱测定，含有人参单糖皂苷94.81％，其中93.15％的Rh2，0.54％的人参皂苷Rh1，1.12％的人参皂苷Rk2。
制备例4制备富含人参单糖皂苷的提取物称取制备例1中碱降解产物0.50kg，用无水乙醇加热搅拌溶解，加入层析硅胶，混合拌样，将拌好的样干燥，粉碎，过筛，供层析分离用。
称取层析活性炭15kg，加到层析柱中，拌好的样装在层析柱的上部，用氯仿∶乙醇∶醋酸乙酯(2∶1∶10)洗脱剂洗脱，收集富含人参单糖皂苷Rh1，Rh2，Rk2部分，回收溶剂，得富含人参单糖皂苷的提取物58g。高效液相色谱测定，含有人参单糖皂苷58.45％，其中23.85％的Rh2，18.20％的人参皂苷Rh1，16.44％的人参皂苷Rk2。
试验例中所用
人参皂苷Rh2取制备例3所得样品10g，用乙醇重结晶，得人参皂苷Rh2，HPLC检测，含量97.2％；人参单糖皂苷提取物按制备例方法制备；昆明种小鼠，100只，体重18～22g，山东省天然药物工程技术研究中心动物中心提供；细胞株小鼠肝癌H22、小鼠宫颈癌U14、小鼠黑色素瘤B16、小鼠Lewis肺癌，购自中国医学科学院北京药物研究所；环磷酰胺上海华联制药有限公司生产。
试验例1富含人参单糖皂苷的提取物与人参皂苷Rh2对H22肝癌生长的抑制作用比较取已经传代一周生长状态良好的H22腹水传代小鼠，取腹水后，加入三倍体积的注射用生理盐水稀释，接种于100只昆明鼠腋下，每只0.2ml。接种第二天按体重随机分为10组，分别为模型组、阳性药组(环磷酰胺20mg/kg)、人参皂苷Rh2高(100mg/kg)、低(10mg/kg)剂量组，制备例2样品高(100mg/kg)、低(10mg/kg)剂量组，制备例3样品高(100mg/kg)、低(10mg/kg)剂量组和制备例4样品高(100mg/kg)、低(10mg/kg)剂量组。各药物均以0.5％羧甲基纤维素钠混悬后灌胃给药，给药体积0.2ml/10g，模型组给予羧甲基纤维素钠，每天一次，给药10天。于末次给药后24小时处死动物，称体重，剥取瘤组织称重，计算抑瘤率。
表1.人参皂苷Rh2与人参单糖皂苷提取物对H22肝癌生长的抑制作用(n＝10)
与模型组比较*，P＜0.05；**，P＜0.01。
结果表明，人参皂苷Rh2和各制备例提取物在10～100mg/kg剂量下均能明显抑制体内H22肝癌的生长，相同剂量的人参单糖皂苷提取物和人参皂苷Rh2各组间没有显著差异。
试验例2人参单糖皂苷提取物与人参皂苷Rh2对U14宫颈癌生长的抑制作用比较取已经传代一周生长状态良好的U14腹水传代小鼠，取腹水后，加入三倍体积的注射用生理盐水稀释，接种于100只昆明鼠腋下，每只0.2ml。接种第二天按体重随机分为10组，分别为模型组、阳性药组(环磷酰胺20mg/kg)、人参皂苷Rh2高(100mg/kg)、低(10mg/kg)剂量组，制备例2样品高(100mg/kg)、低(10mg/kg)剂量组，制备例3样品高(100mg/kg)、低(10mg/kg)剂量组和制备例4样品高(100mg/kg)、低(10mg/kg)剂量组。各药物均以0.5％羧甲基纤维素钠混悬后灌胃给药，给药体积0.2ml/10g，模型组给予羧甲基纤维素钠，每天一次，给药10天。于末次给药后24小时处死动物，称体重，剥取瘤组织称重，计算抑瘤率。
表2.人参单糖皂苷提取物与人参皂苷Rh2对U14宫颈癌生长的抑制作用(n＝10)
与模型组比较*，P＜0.05；**，P＜0.01。
结果表明，各制备例提取物和人参皂苷Rh2在10～100mg/kg剂量下均能明显抑制体内U14宫颈癌的生长，相同剂量时，人参单糖皂苷提取物和人参皂苷Rh2抑瘤作用各组间没有明显差异。
试验例3人参单糖皂苷提取物与人参皂苷Rh2对B16黑色素瘤生长的抑制作用比较取C57BL/6小鼠腋下传代一周，生长状态良好的B16肿瘤，加入五倍体积的注射用生理盐水，组织匀浆器匀浆，100目不锈钢网过滤后，接种于100只C57BL/6纯系鼠腋下，每只0.2ml。接种第二天按体重随机分为10组，分别为模型组、阳性药组(环磷酰胺20mg/kg)、人参皂苷Rh2高(100mg/kg)、低(10mg/kg)剂量组，制备例2样品高(100mg/kg)、低(10mg/kg)剂量组，制备例3样品高(100mg/kg)低(10mg/kg)剂量组和制备例4样品高(100mg/kg)、低(10mg/kg)剂量组。各药物均以0.5％羧甲基纤维素钠混悬后灌胃给药，给药体积0.2ml/10g，模型组给予羧甲基纤维素钠，每天一次，给药10天。于末次给药后24小时处死动物，称体重，剥取瘤组织称重，计算抑瘤率。
表3.人参单糖皂苷提取物与人参皂苷Rh2对B16黑色素瘤生长的抑制作用(n＝10)
与模型组比较*，P＜0.05；**，P＜0.01。
结果表明，人参单糖皂苷提取物和人参皂苷Rh2在10～100mg/kg剂量下均能明显抑制体内B16黑色素瘤的生长，相同剂量时，人参单糖皂苷提取物和人参皂苷Rh2抑瘤作用未表现出明显差别。
试验例4人参单糖皂苷提取物与人参皂苷Rh2对Lewis肺癌生长的抑制作用比较取C57BL/6小鼠腋下传代一周，生长状态良好的Lewis肺癌瘤组织，加入五倍体积的注射用生理盐水，组织匀浆器匀浆，100目不锈钢网过滤后，接种于100只C57BL/6纯系鼠腋下，每只0.2ml。接种第二天按体重随机分为10组，分别为模型组、阳性药组(环磷酰胺20mg/kg)、人参皂苷Rh2高(100mg/kg)、低(10mg/kg)剂量组，制备例2样品高(100mg/kg)、低(10mg/kg)剂量组，制备例3样品高(100mg/kg)低(10mg/kg)剂量组和制备例4样品高(100mg/kg)、低(10mg/kg)剂量组。各药物均以0.5％羧甲基纤维素钠混悬后灌胃给药，给药体积0.2ml/10g，模型组给予羧甲基纤维素钠，每天一次，给药10天。于末次给药后24小时处死动物，称体重，剥取瘤组织称重，计算抑瘤率。
表4.人参单糖皂苷提取物与人参皂苷Rh2对Lewis肺癌生长的抑制作用(n＝10)
与模型组比较*，P＜0.05；**，P＜0.01。
结果表明，各制备例提取物与人参皂苷Rh2在10～100mg/kg剂量下均能明显抑制体内Lewis肺癌的生长，相同剂量时，人参单糖皂苷提取物和人参皂苷Rh2抑瘤作用没有明显差别。
权利要求
1.一种富含人参单糖皂苷的提取物，其中100％＞人参单糖皂苷≥50％，人参单糖皂苷由Rh2、Rh1和Rk2组成，其比例为1∶0.005～0.8∶0.005～0.8。
2.根据权利要求1所述的提取物，其中100％＞人参单糖皂苷≥80％。
3.根据权利要求2所述的提取物，其中100％＞人参单糖皂苷≥90％。
4.权利要求1-3任一所述的提取物的制备方法为以人参皂苷、西洋参皂苷或三七皂苷为原料，或以上述3种植物药的茎叶总皂苷为原料，在反应釜中加入6～10倍的多元醇，加热，在60～80℃时加入上述皂苷，在搅拌条件下加入强碱；油浴电加热，升温速度控制约10～15℃/10min，当温度升至195～205℃时，停止加热，保持10～30分钟，然后反应物加入到5～30倍量水中，边加边搅拌，皂苷水解产物形成灰白色沉淀析出，静置，离心或过滤，用去离子水冲洗至滤液不显碱性，测提取物pH值在6～10，干燥得碱降解产物；将碱降解产物用低级醇加热搅拌溶解，加入硅胶、氧化铝、硅藻土、活性炭或其组合拌样，将拌好的样干燥，供层析分离用；将硅胶、氧化铝、硅藻土或活性炭任何一种固定项加到层析柱中，其用量为碱降解产物的10～40倍，拌好的样装在层析柱的上部，用含C1～C5的酯类、醇类、卤素类有机溶剂或其混和溶剂洗脱，收集富含Rh2，Rh1和Rk2的部分，回收溶剂，即得富含人参单糖皂苷的提取物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，优选以西洋参皂苷原料。
6.根据权利要求4所述的制备方法，多元醇可以是甘油或1，2-丙二醇，低级醇可以是无水乙醇、甲醇、含水乙醇、或含水甲醇；混合溶剂可以是氯仿∶甲醇(9∶1)。
7.权利要求1-3任一所述的提取物在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种富含人参单糖皂苷的提取物，其中100％＞人参单糖皂苷≥50％，人参单糖皂苷由Rh2、Rh1和Rk2组成，其比例为1∶0.005～0.8∶0.005～0.8。本发明还提供了人参单糖皂苷提取物的制备方法和在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
文档编号A61P35/00GK1726944SQ200510081669
公开日2006年2月1日 申请日期2005年7月6日 优先权日2004年7月6日
发明者姜永涛, 王振华, 范秀玉, 马双刚, 陈继永, 苟海涛, 何杰, 刘军锋, 刘珂 申请人:山东绿叶天然药物研究开发有限公司