专利名称：一种人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子喷雾剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种喷雾剂及其制备方法。具体地，本发明涉及一种天然或重组的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子喷雾剂及其制备方法。
背景技术：
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是近年来发现的重要的造血因子之一，是一种能调节造血祖细胞增殖分化的细胞因子。1977年人们才从小鼠肺组织条件培养液中分离纯化出能刺激粒细胞及巨噬细胞集落形成分子量为23KD的单一成分的糖蛋白，并因此被命名为GM-CSF(Burgess，et al。，1977)；1978年Nicola等率先从人的胎盘条件培养液中提取了人GM-CSF(Nicola et al。，1979)。1985年人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的基因被克隆出来，编码为127个氨基酸的糖蛋白。在酵母和在大肠杆菌中表达的糖基和非糖基化GM-CSF，仍具有天然GM-CSF的活性。1991年美国FDA批准rhGM-CSF正式投放市场，我国自行开发的rhGM-CSF在1998年由卫生部批准正式生产。近年来随着rhGM-CSF临床的广泛应用和在实验室对它进一步的深入研究，发现重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子能够顺序地启动中性粒细胞、嗜酸性细胞和巨噬细胞的系列生物学功能，使细胞产生趋化性，然后使它们集中于感染部位并发挥吞噬功能，加强细胞内氧化代谢，以杀灭摄入的病原体，从而达到调节机体抗感染和抗溃疡作用，对于免疫能力下和白细胞减少等引起的感染和溃疡具有特效作用。有报道称感染急性热带利什曼原虫的小鼠给予GM-CSF后，其腹腔内巨噬细胞经培养，细胞的感染率降至10％以下，对照组为30％(Cheers et al.，1988；Jensen et al.，1988；Anaissie et al.，1989)。据临床报道GM-CSF对急性白血病口腔炎有一定的防治作用(现代中西医结合杂志2005，14(7))。当人体的局部如口腔溃疡时，GM-CSF起到弱的化学引诱剂的作用，它可以抑制炎症细胞离开炎症部位，且可与G-CSF协同作用。Metcalf认为GM-CSF与其它集落刺激因子协同在炎症反应中发挥作用。体内试验证明GM-CSF应用于系统性白念珠菌病效果显著，尤其是应用于免疫功能低下患者时效果仍显著，这一点尤其重要，因为白念珠菌患者免疫功能多数低下。这表明GM-CSF有很好的抗白念珠菌感染的作用(中华医学杂志2003年第27卷第6期)。美国Berbudez报告，如用GM-CSF则能激活被感染了的巨噬细胞，进而抑制或杀灭细胞内的分枝杆菌，若将GM-CSF与抗分枝杆菌抗生素联用，可进一步提高疗效。
为了说明GM-CSF可加强抗感染的作用，慕尼黑大学选择了32例病人，其中22例接受过3种以上的抗菌素治疗，其余10例也用过全身性的抗真菌药物，结果发现，凡是使用GM-CSF后白细胞计数迅速升高到正常者，其所需抗菌素治疗时间明显比那些使用GM-CSF后白细胞计数未能迅速升高者少，这一结果有力说明GM-CSF具有一定的抗感染能力。Wandl报道了用GM-CSF来治疗乳腺癌患者的皮肤溃疡，也取得了令人满意的效果。对于很多复杂原因引起的感染，GM-CSF也都具有显著的作用。另外，有报道由白色念球菌引起的腿部溃疡以及生殖器感染使用GM-CSF有明显疗效(Marques da，et al.Am J Surg1997，65(7)28 76-82)。还有报道CM-CSF对治疗慢性气管炎、支气管炎、气喘病等有一定疗效(Balki B，et al.Eur Respir J 1977，10(4)846-50)。江丽芸等人于研究病毒致病的过程中认为GM-CSF在登革病毒的致病与免疫的过程中起重要作用。而我们通过动物实验进一步证实GM-CSF对抗单纯疱疹病毒和抗流感病毒感染有疗效。
以上均说明重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子是一种安全有效的抗感染药物。作为体表用药，如中国专利号02150093.2以及中国专利号0310044.X发明的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子凝胶剂，主要治疗皮肤烧伤、烫伤以及皮肤或粘膜的溃疡，这种凝胶剂只能在皮肤和口腔处用药，并不能在鼻腔、咽喉乃至气管及肺部的用药。而重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子喷雾剂克服了这一缺点，尤其是使用新的配方和新的制备方法，使重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子稳定性更好，配方中加入的辅料更有利于皮肤和粘膜对GM-CSF的透皮吸收。
而且，由于重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子是一种大分子的多肽类物质，由于分子结构和性能决定GM-CSF比起胰岛素、干扰素等多肽物质其稳定性较差，更易受外界条件的影响，一般制成冻干粉针剂较为稳定。但由于目前市场上的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子冻干粉针剂，是全身用药，主药经过肝脏的首过效应以及和机体其它抗蛋白的物质作用后再到达病灶，药效便明显降低；而若增加用药量，有会增加全身的毒副作用。因此需要提供能够更为有效给药的剂型。专利号为00114318.2的中国专利公开一种胰岛素喷雾剂，该剂型通过口腔用药从而治疗糖尿病；专利申请号为95102788.3的中国专利公开了一种白细胞干扰素喷雾剂；专利申请号为03147580.9的中国专利公开了一种重组人干扰素α喷雾剂均分别治疗呼吸道病毒感染以及皮肤表层疱疹病毒感染；专利申请号01142682.9的中国专利申请公开了一种重组人表皮生长因子喷雾剂，它是促进受伤的表皮细胞的再生的生物制剂。但在治疗口腔溃疡和抗炎症方面，还没有一种多肽类喷雾剂药物问世，更没有重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子喷雾剂报道。本发明的发明人对此进行的研究开发，填补了重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在该剂型方面的空白。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子喷雾剂，其中人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子包括天然的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和基因重组的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。
本发明的再一目的是提供制备上述喷雾剂的方法。
根据本发明的一个技术方案，本发明提供了一种人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子喷雾剂，每1000重量份喷雾剂溶液中包括0.02～0.5重量份的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、10.0～100.0重量份的稳定剂、和0.05～0.5重量份的吸收促进剂，其中所述稳定剂为选自包括人血白蛋白、乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇、甘油、丙二醇、甘氨酸、透明质酸的组中的一种或几种；所述吸收促进剂为选自包括卵磷脂、胆酸钠，脱氧胆酸钠、油酸、聚山梨酯80、苄泽的组中的一种或几种。
在根据本发明的喷雾剂中，优选主药人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的含量为0.15重量份/1000重量份喷雾剂溶液。
根据《(中华人民共和国药典》2005年版三部规定，人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的比活为1.0×107IU/mg，此喷雾剂溶液的比重在1.00到1.02，即1000克的此溶液相当于1000毫升，所以0.15重量份/1000重量份喷雾剂溶液相当于含主药活性单位为150万IU/ml，同样其它重量份的主药，对本领域人员来说，是可以推知溶液含有的活性单位浓度的。
本发明的喷雾剂中包括特别选定的稳定剂，该药物稳定剂对主药具有充分的保护作用。优选所用的稳定剂为人血白蛋白、甘露醇、海藻糖和甘油，并且优选四者的重量比1∶4∶2∶1。并且，在根据本发明的喷雾剂中，优选稳定剂的含量为40重量份/1000重量份喷雾剂溶液。该稳定剂在喷雾剂溶液中不仅能长时间保持主药有效的生物活性，而且有效地提高了喷雾剂的粘性，延长了药物在病灶的作用时间。
本发明的喷雾剂中使用透皮吸收促进剂。该吸收促进剂重要特点在于它兼顾着稳定剂和吸收促进剂双重功能，既对主药起到抗氧增效的稳定剂作用，又起到促进主药透皮肤吸收的作用。所述吸收促进剂对生物膜或皮肤无任何破坏作用，能够充分地提高主药机体的局部或全身的生物利用度，并且它可以被机体生物降解。优选使用豆磷脂和聚山梨酯80作为吸收促进剂，且当两者的重量比为2∶3时，促进主药的透皮吸收效果最佳。优选吸收促进剂的含量为0.2重量份/1000重量份喷雾剂溶液。
根据本发明的喷雾剂还可以含有防腐剂，所用的防腐剂可以为羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸乙酯和羟基苯甲酸丙酯中的一中或几种，优选羟基苯甲酸乙酯，防腐剂的含量为1.0～1.5重量份/1000重量份喷雾剂溶液，优选1.2重量份/1000重量份喷雾剂溶液。
根据本发明的喷雾剂所用的缓冲液为磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，其当量浓度为0.02N到0.2N，pH值为5.0到7.5，其中以0.1N、pH7.2的磷酸盐缓冲液为优选。
根据本发明的喷雾剂用氯化钠作为喷雾剂的渗透压调节剂，优选喷雾剂溶液的pH值为5.5～7.5，渗透压为280～310mOsm/L。所用的辅料均为药用级别，所以此喷雾剂药效明确，用药安全，长期使用也无任何潜在不良反应。
本发明提供了一种制备上述喷雾剂的方法。喷雾剂的制备方法有许多种，要根据所含的药物以及药物所添加的辅料来选择适当的制备方法。由于GM-CSF是一种大分子的蛋白质，易溶解于水，并具有一定的生物学活性，所以在制备GM-CSF喷雾剂时，首先要考虑不要破坏该蛋白分子的结构，其次还要考虑不能降低蛋白的生物学活性，这就要求我们选择温和的制备方法。在根据本发明的制备方法中，用磷酸盐缓冲液将复合稳定剂配置成母液I，将复合吸收促进剂配制成母液II，用母液I稀释GM-CSF原液，室温放置30分钟，母液I的用量为配成的喷雾剂溶液总量的8～15％、优选10％，再加入母液II以及防腐剂，母液II的用量为配成的喷雾剂溶液总量的8～15％、优选10％，最后用磷酸盐缓冲液定溶并过滤分装。所用到的GM-CSF是通过菌体发酵表达出的含有重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子分泌物，经粗提、精提得到符合国家质检标准的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子原液。
根据本发明的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子喷雾剂具有局部生物利用度高，全身副作用小，使用方便，易携带等特点。在根据本发明的液体喷雾剂中加入了适量的药用辅料，不仅使其主药稳定性不低于冻干剂，而且还可促进大分子多肽类的主药能够更好的被病灶吸收，大大地提高了主药的生物利用度。此喷雾剂应用于鼻腔、口腔、咽喉部、体表以及生殖器的溃疡或炎症，尤其抵抗白念珠菌等真菌引起的男性或女性生殖器感染和炎症。其主药喷射后不仅可以集中药力于病灶创面，使局部有较高的疗效，而且与该主药的注射剂相比，可以大大降低治疗感染的用药剂量，同时减少了全身副反应。
具体实施例方式
制备实施例制备实施例11.配方GM-CSF0.02g甘露醇20.0g乳糖 10.0g油酸 0.1g聚山梨酯-80 0.1g磷酸盐缓冲液(0.1N，7.2pH)加至 1000ml2.制备方法(1)用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配制pH为7.2，浓度为0.1N磷酸盐缓冲液溶；(2)用量筒量取已配好的磷酸盐缓冲液溶100ml，加入按配方称量好的甘露醇和乳糖，并搅拌至初步溶解，制成母液I；(3)用量筒量取已配好的磷酸盐缓冲液溶100ml，加入按配方称量好的油酸和聚山梨酯-80，并搅拌至初步溶解，制成母液II；
(4)向母液I中加入13ml的GM-CSF原液(含GC-CSF蛋白0.02g)；(5)混合母液I、II，再加入磷酸盐缓冲液溶，定溶于1000ml，充分均匀至完全溶解。
(6)用0.22μm的无菌微孔滤膜除菌过滤后分装。
制备实施例21.配方GM-CSF0.15g人血白蛋白2.0g海藻糖20.0大豆磷脂 0.1g聚山梨酯-80 0.1g羟苯乙酯 1.5g磷酸盐缓冲液(0.1N，7.2pH)加至 1000ml2.制备方法(1)用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配制pH为7.2，浓度为0.1N磷酸盐缓冲液溶。
(2)用量筒量取已配好的磷酸盐缓冲液溶100ml，加入按配方称量好的人血白蛋白和海藻糖，并搅拌至初步溶解，制成母液I；
(3)用量筒量取已配好的磷酸盐缓冲液溶100ml，加入按配方称量好的大豆磷脂和聚山梨酯-80，并搅拌至初步溶解，制成母液II；(4)向母液I中加入86ml的GM-CSF原液(含GC-CSF蛋白0.15g)；(5)将母液II加到母液I中，并加入防腐剂，再用磷酸盐缓冲液溶定溶到1000ml，并充分溶解。
(6)用0.22μm的无菌微孔滤膜除菌过滤后分装。
制备实施例31.配方GM-CSF 0.15g人血白蛋白 2.0g甘露醇 20.0g透明质酸5.0甘油5.0大豆磷脂0.1g聚山梨酯-80 0.1g羟苯乙酯1.3g磷酸盐缓冲液(0.1N，7.2pH)加至 1000ml2.制备方法(1)将人血白蛋白、甘露醇、透明质酸和甘油作为复合稳定剂用磷酸盐缓冲液(0.1N，7.2pH)溶解，配制成含血白蛋白2％、甘露醇20％、透明质酸5％和甘油5％的母液作为配制母液I。
(2)将大豆磷脂和聚山梨酯-80作为复合吸收促进剂用磷酸盐缓冲液(0.1N，7.2pH)溶解，配制成含0.1％大豆磷脂和0.1％聚山梨酯-80的母液II。
(3)取100ml母液I，然后加入67ml的GM-CSF原液(2.24mg/ml)，混匀后室温放置30分钟。
(4)加入100ml母液II，然后按配方加入防腐剂羟苯乙酯，搅拌溶解，再用磷酸盐缓冲液定溶到1000ml。
(5)用0.22μm的无菌微孔滤膜除菌过滤后分装。
制备实施例41.配方GM-CSF 0.15g人血白蛋白 5.0g甘露醇 20.0g海藻糖 10.0甘油5.0大豆磷脂0.08g聚山梨酯-80 0.12g羟苯乙酯1.2g磷酸盐缓冲液(0.1N，7.2pH)加至 1000ml2.制备方法(优选的制备方法)(1)将人血白蛋白、甘露醇、海藻糖和甘油作为复合稳定剂用磷酸盐缓冲液(0.1N，7.2pH)溶解，配制成含血白蛋白5％、甘露醇20％、海藻糖10％和甘油5％的母液作为配制母液I。
(2)将大豆磷脂和聚山梨酯-80作为复合吸收促进剂用磷酸盐缓冲液(0.1N，7.2pH)溶解，配制成含0.08％大豆磷脂和0.12％聚山梨酯-80的母液II。
(3)取100ml母液I，然后加入67ml的GM-CSF原液(2.24mg/ml)，混匀后室温放置30分钟。
(4)取100ml母液II与上述溶液混合，然后按配方加入防腐剂羟苯乙酯，搅拌溶解，再用磷酸盐缓冲液定溶到1000ml。
(5)用0.22μm的无菌微孔滤膜除菌过滤后分装。
制备实施例51.配方GM-CSF 0.15g人血白蛋白 3.0g甘露醇 20.0g蔗糖10.0甘氨酸 5.0大豆磷脂0.08g聚山梨酯-80 0.12g羟苯丙酯1.5g磷酸盐缓冲液(0.1N，7.2pH)加至 1000ml2.制备方法(1)将人血白蛋白、甘露醇、海藻糖和甘油作为复合稳定剂用磷酸盐缓冲液(0.1N，7.2pH)溶解，配制成含血白蛋白5％、甘露醇20％、蔗糖10％和甘氨酸5％的母液作为配制母液I。
(2)将大豆磷脂和聚山梨酯-80作为复合吸收促进剂用磷酸盐缓冲液(0.1N，7.2pH)溶解，配制成含0.08％大豆磷脂和0.12％聚山梨酯-80的母液II。
(3)取100ml母液I，然后加入67ml的GM-CSF原液(2.24mg/ml)，混匀后室温放置30分钟。
(4)加入100ml母液II，然后按配方加入防腐剂羟苯丙酯，搅拌溶解，再用磷酸盐缓冲液定溶到1000ml。
(5)用0.22μm的无菌微孔滤膜除菌过滤后分装。
制备实施例61.配方GM-CSF 0.05g人血白蛋白 5.0g甘露醇 20.0g海藻糖 10.0甘油5.0大豆磷脂0.08g聚山梨酯-80 0.12g磷酸盐缓冲液(0.1N，7.2pH)加至 1000ml2.制备方法(1)将人血白蛋白、甘露醇、海藻糖和甘油作为复合稳定剂用磷酸盐缓冲液(0.1N，7.2pH)溶解，配制成含血白蛋白4％、甘露醇16％、海藻糖8％和甘油4％的母液作为配制母液I。
(2)将大豆磷脂和聚山梨酯-80作为复合吸收促进剂用磷酸盐缓冲液(0.1N，7.2pH)溶解，配制成含0.05％大豆磷脂和0.08％聚山梨酯-80的母液II。
(3)取125ml母液I，然后加入22.5ml的GM-CSF原液(2.24mg/ml)，混匀后室温放置30分钟。
(4)取150ml母液II与上述溶液混合，再用磷酸盐缓冲液定溶到1000ml。
(5)用0.22μm的无菌微孔滤膜除菌过滤后分装。
制备实施例71.配方GM-CSF 0.15g蔗糖10.0g丙二醇 10.0g脱氧胆酸钠 0.05g醋酸盐缓冲液(0.1N，6.8pH)加至 1000ml2.制备方法(1)将蔗糖和丙二醇作为复合稳定剂用醋酸盐缓冲液(0.1N，5.6pH)溶解，配制成含蔗糖10％、丙二醇10％母液作为配制母液I。
(2)将大脱氧胆酸钠做为吸收促进剂用醋酸盐缓冲液(0.1N，5.6pH)溶解，配制成含0.5％脱氧胆酸钠的母液II。
(3)取100ml母液I，然后加入67ml的GM-CSF原液(2.24mg/ml)，混匀后室温放置30分钟。
(4)加入100ml母液II，再用醋酸盐缓冲液定溶到1000ml。
(5)用0.22μm的无菌微孔滤膜除菌过滤后分装。
制备实施例81.配方GM-CSF 0.50g甘氨酸 5.0g乳糖15.0g苄泽0.15g油酸0.1g羟苯甲酯1.2g磷酸盐缓冲液(0.1N，7.2pH)加至 1000ml2.制备方法(1)将甘氨酸和乳糖作为复合稳定剂用磷酸盐缓冲液(0.1N，7.2pH)溶解，配制成含甘氨酸6.25％、乳糖18.75％的母液作为配制母液I。
(2)将苄泽和油酸作为复合促进剂用磷酸盐缓冲液(0.1N，7.2pH)溶解，配制成含苄泽0.18％和油酸0.12％的母液II。
(3)取80ml母液I，然后加入202ml的GM-CSF原液(2.51mg/ml)，混匀后室温放置30分钟。
(4)加入85ml母液II，然后按配方加入防腐剂羟苯甲酯，搅拌溶解，再用磷酸盐缓冲液定溶到1000ml。
(5)用0.22μm的无菌微孔滤膜除菌过滤后分装。实验实施例实验实施例1喷雾剂的稳定性试验
(一)实验材料根据制备实施例1～8所制备的GM-CSF喷雾剂样品，25℃及37℃恒温恒湿保温箱。
(二)实验方法根据《(中华人民共和国药典》2005年版三部附录XF的方法，对以上样品定期进行活性测定。
(三)实验结果在不同保护剂保护的情况下，GM-CSF喷雾剂生物学活性稳定性的比较结果。
25℃放置的稳定性情况(GM-CSF的生物活性单位为×106国际单位/ml)
37℃放置的稳定性情况(GM-CSF的生物活性单位为1.5×106国际单位/ml)
根据稳定性试验结果，决定以制备实施例4做为优选配方。
实验实施例2鼻腔协同抗病毒试验(一)实验材料①受试药品根据制备实施例4(除GM-CSF的加量不同)配制的GM-CSF喷雾剂50ug/ml、150ug/ml、500ug/ml；喷雾剂基质(除不含GM-CSF外，其它成分和置备均根据制备实施例4)，阳性对照药病毒唑。
②动物昆明种小白鼠，体重18～22g，雌雄各半。
③病毒提供已知LD50的流感病毒。
(二)实验方法A、取小鼠90只，均分为正常对照组、模型组、阳性药对照组、试验组包括GM-CSF喷雾剂50ug/只组、150ug/只组、500ug/只组。每组15只小鼠，模型组鼻腔喷基质液，其余给药组鼻腔喷相应的药品，每日分2次给药，每次喷3次，其中试验组每次3喷中包括2喷GM-CSF喷雾剂和1喷病毒唑配成的喷雾剂。连续10天给药，第11天，除正常对照组外，其余各组均滴鼻感染10LD50病毒量，2小时后继续给药至14天，记录小鼠每天14天死亡数和平均生活日，观察2周，计算死亡保护率(％)及延长生命率(％)。
(三)实验结果观察的记录结果
以上结果说明，GM-CSF喷雾剂与抗病毒药联合使用，可以抵抗流感病毒的感染。
实验实施例3抗单疱疹病毒引起皮肤感染作用(一)实验材料①受试药品根据实施例四(除GM-CSF的加量不同)配制的GM-CSF喷雾剂50ug/ml、150ug/ml、500ug/ml；阳性对照药是用生理盐水将阿昔洛韦配制成浓度7％阿昔洛韦喷雾溶液。
②动物豚鼠为市售动物。
③病毒单纯疱疹病毒。
(二)实验方法
依照《新药(西药)临床研究指导原则汇编》，中华人民共和国卫生部药政局，1993年7月，169页的方法进行实验。
(三)实验结果①接种病毒后6-8天，在接种处发生一硬性丘疹、大泡或不规则的散在性水疱，模型成功。
②给药后1-2天，各给药组与模型组比较病情好转程度无明显差异。GM-CSF喷雾剂具有明显缩短单疱病毒性疱疹病程，加快水疱结痂、愈合的作用。
③与阳性对照药比较，GM-CSF喷雾剂能够滞留于病损部位诱导各种淋巴细胞发挥免疫和吞噬作用，从而增强抗单纯疱疹病毒感染的作用，同时它的毒副作用要比化学抗病毒药物小得多。
实验实施例4抗真菌感染试验(一)实验材料①受试药品根据实施例四(除GM-CSF的加量不同)配制的GM-CSF喷雾剂50ug/ml、150ug/ml、500ug/ml；喷雾剂基质(除不含GM-CSF外，其它成分和置备均根据实施例四)，环磷酰胺。
②动物Wistar大鼠，均雌性。
③真菌提供已知白念珠菌。
(二)实验方法
1.取成年雌性Wistar大鼠25只，分成5组，除1组做对照外，其它4组均每日口服环磷酰胺1.0mg，分两次服用，进行1周免疫抑制作用。
2.将新鲜沙氏氯霉素琼脂糖培养基培养的白念珠菌用灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)离心洗涤2次，然后配制成每毫升1.0×105个细胞的菌液。
3.用滴管取配好的菌液分别滴入5组雌性Wistar大鼠的生殖器，每只两滴。
4.次日，除对照组之外，其它4组分别按喷雾剂基质组、GM-CSF喷雾剂50ug/只组、150ug/只组和500ug/只组给药。每日分2次给药，每次喷3次，连续10天给药，第11天记录观察的结果。
(三)实验结果观察记录
(“+”号多少代表现象严重程度，“-”代表无此现象)解剖切片观察结果
(“+”号多少代表现象严重程度，“-”代表无此现象)以上观察结果说明，GM-CSF喷雾剂具有抗白念珠菌等真菌感染的作用。
实验实施例5一般药理试验(一)实验材料1、受试药品根据实施例四(除GM-CSF的加量不同)配制的GM-CSF喷雾剂50ug/ml、150ug/ml、500ug/ml。
2、动物昆明种小白鼠、健康猫。
3、仪器XZC-4型小动物自主活动测定仪LMS-2R二道热笔生理记录仪Cardiofax心电图机(二)实验方法1、对精神神经系统的影响(小鼠自主活动法)在预试的基础上将小鼠均分4组对照组、GM-CSF喷雾剂低、中、高剂量组，鼻腔喷雾后不同时间点将小鼠放入小动物自主活动测定仪中，测其10min内自主活动次数。各给药组与对照组进行组间t检验。
2、对心血管系统的影响将24只猫均分4组对照组、GM-CSF喷雾剂低、中、高剂量组，先将猫常规麻醉，气管插管，颈总动脉插管，通过压力换能器连接到二道热笔生理记录仪上，记录血压，同时用四肢二导联记录心电图，鼻腔喷雾，测定并记录给药前后血压、心电、心率、心率的变化，给药组各指标与对照组进行组间t检验。
3、对呼吸系统的影响将24只猫均分4组对照组、GM-CSF喷雾剂低、中、高剂量组，先将猫常规麻醉，用挂钩钩住猫胸腹部呼吸起伏较大的部位，通过张力换能器连接到二道热笔生理记录仪上，鼻腔喷雾，记录给药前后呼吸频率和深度的变化，给药组呼吸指标与对照组进行组间t检验。
(三)实验结果三项试验的不同剂量给药组的指标均与对照组无明显差别，说明本配方的GM-CSF喷雾剂对神经系统、心血管系统及呼吸系统均无不良影响。
实验实施例6急性毒性试验受试药品GM-CSF喷雾剂15mg/ml，为临床剂量100倍的高浓度喷雾剂。
动物Wistar大鼠。
3、方法预试，考察GM-CSF喷雾剂能否测出LD50，若能测出则按常规方测其LD50；若测不出则将大鼠均分2组对照组、GM-CSF喷雾剂组，喷雾剂组按最大药物浓度、最大给药体积给药测其最大耐受量，观察并记录1～2周内各组动物的活动情况、毛色、二便及体重变化。
(三)实验结果观察发现，15mg/ml的GM-CSF喷雾剂用药后，所有试验组和对照组的动物的活动情况、毛色、二便均无异常表现，即未出现毒性反应。该剂量为100倍临床剂量，说明GM-CSF喷雾剂的临床剂量用药非常安全。
实验实施例7长期毒性试验受试药品GM-CSF喷雾剂50ug/ml、150ug/ml、500ug/ml；空白基质液为对照液。
2、动物Wistar大鼠。
3、方法根据急性毒性试验结果，将大鼠分4组(对照组、GM-CSF喷雾剂高、中、低剂量组)每组20只，每天给药1次，连续30日，期间每周称体重1次，并记录饮食量、饮水量及二便、毛色、活动情况。于末次给药后24h，各组活杀1/2动物，取血测各血液学指标及血液生化指标，剖取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、性腺、脑等脏器称重计算脏器指数，然后将其固定做病理学检查并照相。另1/2动物于停药14天做上述同样检测。
4、计算各检测指标进行组间t检验。
(三)实验结果
用药组和对照组的动物每周的观察记录显示，饮食、饮水及二便、毛色、活动情况均正常。
停药后24小时的各用药组和对照组的t检验值均无明显差别，停药14天后的各用药组和对照组的t检验值也无明显差别，说明GM-CSF喷雾剂临床用量无长期毒性反应，临床用药很安全。
实验实施例8过敏试验(一)实验材料受试药品GM-CSF喷雾剂150ug/ml、10％新鲜蛋清。
2、动物白色豚鼠20只，体重250～300g，雌雄不限。
(二)实验方法将20只豚鼠均分两组GM-CSF喷雾剂50ug/只组和阳性对照药10％蛋清组，两组分别连续间日鼻腔喷雾3次，致敏后各组再均分2小组，2小组分别在第一次给药后14天和21天静脉给药进行激发，激发给药量GM-CSF注射液1.0ml/只、阳性对照药10％蛋清组1.0ml/只。观察并记录静脉给药激发时各豚鼠过敏反应症状。
(三)实验结果观察发现，阳性对照组豚鼠皮肤或鼻前均出现不同程度的红斑和水肿，而用药组的豚鼠中未发现一只皮肤或鼻前有红斑和水肿发生。说明150ug/ml的GM-CSF喷雾剂，给药量为0.2ml/次的剂量下，反复3次喷鼻，无过敏反应。
实验实施例9刺激性试验
(一)实验材料1、受试药品GM-CSF喷雾剂150ug/ml，生理盐水为对照液。
2、动物Wistar大鼠16只，体重180～200g，雌雄各半。
(二)实验方法将16只大鼠均分二组对照组、GM-CSF喷雾剂150IU/只组，鼻腔喷雾，每日给药2次，连续给药7天，观察并记录鼻腔粘膜有无充血、红肿等现象，于末次给药后2小时，处死动物剖取鼻腔粘膜置10％中性福尔马林溶液中，切片，做病理学检查、照相。
(三)实验结果切片做病理检查发现，GM-CSF喷雾剂和对照组的大鼠均出现充血、红肿及坏死现象，说明150ug/ml的GM-CSF喷雾剂，给药量为3次(0.2ml/次)的剂量喷鼻，对鼻腔无刺激性。
权利要求
1.一种人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子喷雾剂，其特征在于，每1000重量份的喷雾剂溶液中包括0.02～0.5重量份的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、10.0～100.0重量份的稳定剂、和0.05～0.5重量份的吸收促进剂，其中所述稳定剂为选自包括人血白蛋白、乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇、甘油、丙二醇、甘氨酸、透明质酸的组中的一种或几种；所述吸收促进剂为选自包括卵磷脂、胆酸钠，脱氧胆酸钠、油酸、聚山梨酯80、苄泽中的组中的一种或几种。
2.如权利要求1所述的喷雾剂，其特征在于，所述人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子包括天然人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和基因重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。
3.如权利要求1所述的喷雾剂，其特征在于每1000重量份喷雾剂溶液中含有0.15重量份的所述人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。
4.如权利要求1所述的喷雾剂，其特征在于，所述稳定剂为人血白蛋白、甘露醇、海藻糖和甘油。
5.如权利要求4所述的喷雾剂，其特征在于，人血白蛋白、甘露醇、海藻糖和甘油的重量比1∶4∶2∶1。
6.如权利要求1、4或5所述的喷雾剂，其特征在于，每1000重量份的喷雾剂溶液含有40重量份的稳定剂。
7.如权利要求1所述的喷雾剂，其特征在于，所述吸收促进剂为豆磷脂和聚山梨酯80。
8.如权利要求7所述的喷雾剂，其特征在于，豆磷脂和聚山梨酯80的重量比为2∶3。
9.如权利要求1、7或8所述的喷雾剂，其特征在于，每1000重量份的喷雾剂溶液中含有0.2重量份的吸收促进剂。
10.如权利要求1所述的喷雾剂，其特征在于喷雾剂溶液的pH值为5.5～7.5，渗透压为280～310mOsm/L。
11.制备如权利要求1所述的喷雾剂的方法，其特征在于该方法包括以下步骤1)将权利要求1中所述的稳定剂溶于无机盐缓冲液中，从而制成母液I；2)将权利要求1中所述的吸收促进剂溶于无机盐缓冲液中，从而制成母液II；3)用母液I稀释GM-CSF原液，母液I的用量为配成的喷雾剂溶液总量的8～15wt％；4)加入母液II，母液II的用量为配成的喷雾剂溶液总量的8～15wt％；5)用无机盐缓冲液定溶后过虑除菌及分装，其中，步骤1)、1)和5)中的所述无机盐缓冲液为选自磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液中的一种或多种。
12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，母液I的用量为配成的喷雾剂溶液总量的10％，母液II的用量为配成的喷雾剂溶液总量的10％。
13.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，在步骤1)、2)以及5)中使用的无机盐缓冲液为磷酸盐缓冲液。
14.如权利要求11或13所述的制备方法，其特征在于，所述无机盐缓冲液的当量浓度为0.02N～0.2N，pH值为5.0～7.5。
15.如权利要求11或13所述的制备方法，其特征在于，所述无机盐缓冲液的当量浓度为0.1N、pH值为7.2。
全文摘要
本发明提供了一种天然或重组的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子喷雾剂及其制备方法。所述喷雾剂包括0.02～0.5重量份的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、10.0～100.0重量份的稳定剂、和0.05～0.5重量份的吸收促进剂，其中所述稳定剂为选自人血白蛋白、乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇、甘油、丙二醇、甘氨酸、透明质酸中的一种或几种；所述吸收促进剂为卵磷脂、胆酸钠，脱氧胆酸钠、油酸、聚山梨酯80、苄泽中的一种或几种。根据本发明的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子喷雾剂具有局部生物利用度高，全身副作用小，使用方便，易携带等特点。
文档编号A61P43/00GK1739793SQ20051010320
公开日2006年3月1日 申请日期2005年9月16日 优先权日2005年9月16日
发明者王玉清, 吴歧 申请人:深圳市孚沃德生物技术有限公司