专利名称：包合态环糊精/羟基喜树碱药物组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种含有环糊精与羟基喜树碱药物包合物包合态环糊精/羟基喜树碱药物组合物，及该组合物的制备方法。
背景技术：
羟基喜树碱是我国特有的珙垌科乔木-喜树种子中分离提取的一种微量生物碱，化学名称(S)-4-乙基-4，9二羟基-1H-吡喃并[3’，4’6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮，分子式C20H16N2O5，分子量364.37，系目前从喜树中分离的20多个单体中抗癌作用最强的化合物。本品通过选择性抑制拓扑异构酶而干扰DNA的复制，具有高效低毒、广谱抗癌的特点，临床用于膀胱癌、直肠癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、白血病及头颈部肿瘤等，皆取得良好疗效，静脉注射，每日剂量4-10mg。与大多数抗肿瘤药相似，目前临床使用的羟基喜树碱剂型只是单一的注射剂，有2mg/2ml-10mg/2ml不同制剂规格。
溶液状态下，羟基喜树碱结构中内酯环易开环成为羧酸(盐)因此分子存在两种互变结构的平衡内酯环结构羧酸盐结构体系pH＜5时，羟基喜树碱以内酯环结构为主；pH＞7.5时，以开环羧酸盐结构为主。(杨眉，曾裕建喜树碱及其衍生物的研究进展 现代医药卫生，2003，19(8)，977～978)，但是羟基喜树碱的内酯环结构是活性结构，而开环的羧酸盐结构活性低(Jichao Kang，Vijay Kumar，Dong Yang，PriyankaRoy Chowdhury，Raymond J.Hohl，Cyclodextrin complexationinfluence on thesolubility，stability，and cytotoxicity of camptothecin，an antineoplastic agent，European Journal of Pharmaceutical Sciences，2002，15(2)163-170)。由于羟基喜树碱难溶于水，所以临床上以水解开环的羧酸盐提高其水溶性并且加入助溶剂制备注射剂。为增强水溶性提高活性人们进行了多种研究改进一是通过引入极性基团进行喜树碱结构改造增加喜树碱的溶解性，达到提高疗效减少副作用增加使用剂型的目的，如Topotecan等药物。CN96112301公开了一种利用碱性氨基酸而不采用NaOH增溶的方法，但不能够解决碱性条件下羟基喜树碱水解开环影响疗效的发挥的问题。
国内最近的研究表明，羟基喜树碱口服有效，羟基喜树碱胶囊(剂量5mg/粒)和片剂(55mg/粒)正在临床试验中。已发表的资料显示人体口服给药可维持12h有效血药浓度，且较静脉给药有所延长，片剂生物利用度约32％。胶囊剂生物利用度约37％，口服给药可以提高羟基喜树碱在胃肠组织的局部浓度。利用这种给药途径可达到提高化疗指数、降低全身不良反应的目的(中国药房，2001，12(10)589)。口服制剂方便了广大患者，有很好的市场发展前景，但是，产品的用药剂量高于注射给药且为提高生物利用度需以内酯环结构含量高的原料制备，其成本大大高于注射剂，加大了患者的用药成本。由此可见，提高活性结构含量、增加羟基喜树碱水溶解度、降低制备成本成为需要解决的主要问题，也是目前羟基喜树碱制剂技术研究的难点。
环糊精用于增加药物的水溶性、提高药物的稳定性及生物利用度已有许多成功范例，正在得到越来越广泛的应用。环糊精与药物的作用不是简单的物理混合，该技术以环糊精为主体与药物客体形成具有特定“主-客体”作用的包合物，根据分子的大小，客体药物可整体或部分被主体环糊精包合于空腔中，药物分子中的活泼基团由于被环糊精的空腔包裹而稳定，同时包合体系中的“主-客体”分子比依据分子大小及作用强弱可以是1∶1或其他分子比例作用，包合作用使药物以分子状态呈现出高度分散性，因而使药物溶解度增大。
Jichao Kang等人报道了水溶液中环糊精/喜树碱的包合作用和性能，环糊精及其衍生物可使喜树碱水溶性分别提高5.7倍(1.5％β-CD)、或33倍(25％HP-β-CD)，其中二甲基-β-环糊精效果最好，25％二甲基-β-环糊精溶液使喜树碱增溶171倍，喜树碱包合物的体外细胞活性增加了20％左右，其原因是包合后喜树碱内酯环结构含量增加稳定性增强，水解开环的半衰期比非包合态延长了约10倍。喜树碱/环糊精分子包合物的特点是提高药物溶解性、增强药物稳定性、保护喜树碱的内酯环活性结构含量。Jichao Kang没有制备固体包合物，但是该技术提示有可能通过环糊精包合技术解决羟基喜树碱溶解性与生物利用度和活性结构的矛盾，开发优质价廉的新型抗肿瘤药物剂型服务于广大患者。
羟基喜树碱为喜树碱10位连接羟基的衍生物，一般而言，羟基有利于增强难溶药物溶解性，药物分子中的羟基易与含有多个羟基的环糊精发生作用，增强药物分子与环糊精包合作用和性能。分子中增加的羟基对其包合作用及包合物性质(包括内酯环活性结构含量及稳定性，溶解性的改变等)将产生影响。但是，目前羟基喜树碱的环糊精包合物还未见报道；环糊精/喜树碱的固体包合物及环糊精/羟基喜树碱的固体包合物皆未见报道。
发明内容
本发明的目的探索环糊精与羟基喜树碱分子的包合机理，通过试验提供环糊精与羟基喜树碱作用生成包合物的比例与方法，采用各种药用环糊精与羟基喜树碱作用生成稳定包合物，从而得到包合态环糊精/羟基喜树碱药物组合物，提高羟基喜树碱的溶解度、增加羟基喜树碱活性内酯环结构含量。
完成上述发明任务的技术方案是采用环糊精在水溶液条件下与普通羟基喜树碱原料(63.2％内酯环结构)作用，制备有效的羟基喜树碱/环糊精包合物，增强活性内酯环稳定性、增加内酯环结构含量，提高羟基喜树碱的溶解度。
更具体地说，本发明是包合态环糊精/羟基喜树碱药物组合物，环糊精与羟基喜树碱的摩尔比为1∶0.1～1.0，不同环糊精的包合稳定常数Ka＝195M-1～2264M-1。
以上方案中的环糊精，推荐采用β-环糊精或羟丙基-β-环糊精或磺丁基-β-环糊精，或其中任何两种和两种以上的混合物。
对该包合态组合物的进一步限定，所述的包合态环糊精/羟基喜树碱药物组合物，是指在环糊精的纯水混悬液或溶液中，加入0.1～1.0摩尔比的羟基喜树碱，充分混合，搅拌1～10小时，压滤、水洗、干燥，得到的固体包合物或直接过滤得到的液体包合物。
本发明的优化方案是所述环糊精与羟基喜树碱的摩尔比采用1∶0.5；所述的环糊精的纯水混悬液或溶液是指β-环糊精或羟丙基-β-环糊精或磺丁基-β-环糊精或以上任何两种或两种以上的混合物与1～6倍质量的纯水混合制成的混悬液或溶液。
包合可行性水溶液中，环糊精能够与羟基喜树碱形成稳定包合物。由经典的紫外分光光度法测定各种环糊精pH 2～7条件下形成包合物的稳定常数，结果包合稳定常数Ka＝195M-1～2264M-1。说明环糊精包合羟基喜树碱作用明显，形成的包合物稳定性好。红外光谱图和差示热分析试验证明，羟基喜树碱与环糊精形成了包合物，而非简单的物理混合物。HPLC试验分析显示，pH7条件下以内酯环结构含量63.2％的普通羟基喜树碱原料制备的包合物中羟基喜树碱几乎完全转化为内酯环结构(内酯环含量达96％以上)。
计算机模拟计算发现，虽然羟基喜树碱内酯环结构能量高于开环结构约2.02Kcal/mol，但内酯环结构的β-环糊精包合物能量低于开环结构包合物约3.57Kcal/mol(内酯环结构包合物更稳定)，形成包合物后内酯环结构释放出更多的能量(比开环结构包合物约多释放5.50Kcal/mol能量)，结果显示，内酯环结构更容易生成包合物，且由于其稳定性更强(能量差3.57Kcal/mol)，开环结构包合物有转化为内酯环结构包合物的可能。
羟基喜树碱的包合物制备一般方法如下将环糊精与1～10倍质量的纯水混合，制成混悬液或溶液，加入0.1～1.0摩尔比的羟基喜树碱，充分混合，压滤、搅拌1～10小时，水洗、干燥即得固体包合物或直接过滤得液体包合物。
本发明优选以下方案将β-环糊精或羟丙基-β-环糊精或磺丁基-β-环糊精或以上任何两种或两种以上的混合物与1～6倍质量的纯水混合，使成混悬液或溶液；加入0.5摩尔比的羟基喜树碱，充分混合、搅拌5～10小时，压滤，水洗固体物，干燥即得固体包合物或过滤得液体包合物。
为验证本发明的结果，我们进行了如下试验(1)测定不同pH值条件下羟基喜树碱与环糊精包合常数由于羟基喜树碱的结构类型与体系pH条件有关，考虑用药的pH变化可能性，于pH2，4和7条件下，采用紫外分光光度法(王亚娜，陆亚鹏，任勇等.环糊精及衍生物/药物包合常数的测定方法及其应用[J].药学进展，2004，28(1)23.)分别测定β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精与羟基喜树碱的包合常数，结果见表1所示。
表1不同环糊精与羟丙基喜树碱的包合常数
(2)包合物的制备羟基喜树碱难溶于水，DMSO中有较大溶解度，按照常规可以加入DMSO等有机溶剂助溶制备包合物。由于有机溶剂也能够与环糊精发生包合作用并且难以/不可能清除完全而不利于药物的使用(王亚娜等，苯丙醇/β-环糊精包合作用研究[J].中国药科大学学报，2005，36(1)13-17)，因此，本发明采用纯水条件制备包合物。
羟基喜树碱分子中一端为六元α-羟基内酯环，另一端为吡咯喹啉环，CAChe 6.1.8 Worksystem Pro.计算机分子模拟程序，计算羟基喜树碱两种结构与β-环糊精的包合作用体系的能量变化见表2。结果表明表2羟基喜树碱内酯环/开环结构能量及β-环糊精包合物能量
结果表明1)羟基喜树碱内酯环结构能量高于开环结构约2.02Kcal/mol；2)内酯环结构的β-环糊精包合物能量比开环结构包合物低约3.57Kcal/mol；3)内酯环结构的包合能(包合前后能量差)大于开环结构的约5.50Kcal/mol。提示，虽然羟基喜树碱的两种结构都可以与β-环糊精形成包合物，但是，内酯环结构具有更大的能量优势(热力学更有利)，β-环糊精将优先与羟基喜树碱的内酯环结构形成稳定的包合物。而且不稳定的开环结构包合物在适宜条件下，有向能量更加稳定的内酯环结构包合物转化的可能。
由于羟基喜树碱两种结构包合物存在能量差，同时内酯环结构在水中溶解性小于开环结构物。因此，采用适当升高体系温度或/和延长制备时间可以加快或增加结构转化，达到提高具有活性的内酯环结构含量的目的。经过试验探索发现，延长制备时间生成溶解度更小的内酯环结构包合物即可顺利制备出内酯环结构高含量的包合物。
包合物制备方法举例将羟丙基-β-环糊精与3倍量的纯水混合，使成溶液；加入0.3摩尔比的羟基喜树碱，充分混合、搅拌7小时，放置过夜，压滤，水洗固体物，干燥即得固体包合物。
(3)包合物差示热分析验证试验结果表明物理混合物保持了羟丙基-β-环糊精310℃和羟基喜树碱96℃的吸热峰，基本上是各化合物的叠加。而包合物无96℃羟基喜树碱的吸热峰，也无310℃羟丙基-β-环糊精的吸热峰；290℃体系比热开始增大，305℃出现吸热小拐点后体系即分解，其各峰的位置(温度)和形状(热效应)都发生了变化说明包合物已形成。样品差热分析图见附图1。
(4)IR光谱图分析羟基喜树碱IR图谱中，ν＝1748.26cm-1为羰基特征吸收(强)，羟基喜树碱/羟丙基-β-环糊精包合物IR图谱中，此特征吸收基本消失。提示羟基喜树碱化学结构中的羰基被羟丙基-β-环糊精的空腔所包裹。羟基喜树碱与羟基喜树碱/羟丙基-β-环糊精包合物的IR光谱图见附图2、图3。
(5)相溶解度法测定各环糊精对羟基喜树碱的增溶效果精密称取8.0mg羟基喜树碱，DMSO溶解并定容至100ml做为储备液，取不同体积储备液，用pH6.86混合磷酸盐缓冲液稀释储备液成不同浓度的系列溶液，380nm下测定紫外吸收A，以A对浓度C(mol/L)作图绘制标准曲线，得A＝29920 C+0.0043(r＝1)。
分别配制0.15％、0.3％、0.6％、0.9％、1.5％、1.8％(w/v)的β-环糊精溶液和2.0％、4.0％、8.0％、16.0％、24.0％、30.0％、40.0％(w/v)的羟丙基-β-环糊精(或磺丁基-β-环糊精)溶液，分别向上述溶液中加入过量羟基喜树碱，超声30min，25℃±1℃振荡5d，过滤，移取适量的滤液，缓冲液稀释，380nm处测定光吸收强度，依标准曲线得各环糊精对羟基喜树碱的增溶倍数，结果见下表。
表4各环糊精对羟基喜树碱的增溶倍数
从表中可以看出由于β-环糊精自身溶解度低，1.8％(w/v)的β-环糊精(接近饱和)能使羟基喜树碱增溶5.21倍；羟丙基-β-环糊精由于其高的水溶性(＞50％)，30％～40％的浓度可使羟基喜树碱增溶100～200倍。说明，羟基喜树碱被羟丙基-β-环糊精包合后，水溶性大大提高，增溶高达192倍，结果好于文献对喜树碱的增溶效果。这对提高羟基喜树碱生物利用度极其有利。
(6)HPLC法测定包合物中内酯环结构含量色谱条件色谱柱C18柱(Hanbon Science & Technology Co.，Ltd；250×4.6mm，5μm)；流动相55％甲醇-磷酸盐缓冲液(pH＝4.0)流速1ml/min；检测器紫外检测器，25℃；检测波长359nm；进样量20μl；采样时间30min。
样品溶液的配制样品溶液a以pH＝6.86磷酸缓冲液为溶剂的羟基喜树碱溶液；样品溶液b取实验(2)制备的固体包合物加10倍水超声30min，过滤；样品溶液c以0.1M NaOH为溶剂的羟基喜树碱溶液。
测定取a、b、c样品溶液按上述色谱条件进样测定，结果见表5和附图4、5、6。
表5样品溶液中内酯环结构含量的测定结果
结果发现，含有羟丙基-β-环糊精包合物的pH＝6.86溶液中以内酯环结构形式存在的药物分子含量＞96.8％，远大于以pH＝6.86无羟丙基-β-环糊精的水溶液中羟基喜树碱的药物内酯环结构含量(63.2％)。包合物中羟基喜树碱主要是内酯环结构形式。利用环糊精包合技术，可以大大提高羟基喜树碱活性结构含量，这对提高羟基喜树碱生物利用度将是十分有利的。
(7)UV谱测定溶液稳定性试验羟基喜树碱内酯环结构与开环结构具有显著不同的UV吸收特征，表现为吸收峰波长及强度有较明显的变化，采用UV谱亦能够反映羟基喜树碱各种结构形式，是相对HPLC更为简单的结构测定方法。
以HCl配制pH2、4水溶液，另取pH7的纯水，分别加入过量羟基喜树碱配制成饱和溶液a、b、c，另取实验(2)制得的包合物用纯水配制成溶液d，对各溶液进行UV扫描(200nm～400m)，结果见表6和附图7。
表6各羟基喜树碱溶液UV扫描曲线特征峰
表中吸收峰显示，pH＝2的溶液a与包合物配制的溶液d具有基本一致的吸收特征，溶液中样品结构主要是内酯环形式。
将上述的所有溶液a、b、c和d经灭菌处理后放置4℃冰箱贮存，同时包合物室温保存，1.5年后UV扫描各溶液及包合物重新配制的溶液e，试验结果表明，包合物配制的溶液d与重新配制的e几乎重合，且与0天谱图基本无区别，表明包合物及其溶液稳定性良好；其他样品谱图基本不变，但在200nm～210nm末段吸收范围峰形有所改变。结果表明，含环糊精的各羟基喜树碱溶液较羟基喜树碱纯水溶液稳定，环糊精包合提高药物稳定性效果明显。
本发明的优点(1)羟基喜树碱与环糊精形成包合物后，pH中性条件下羟基喜树碱的活性内酯环结构含量由非包合态的63％提高到96％以上。
(2)环糊精包合后，羟基喜树碱溶解度得到明显提高，溶解度提高达192倍；包合状态的固态、液态样品含量稳定，适宜用于口服和非口服剂型。
(3)本发明的包合物在纯水条件下制备，未使用不利于包合物形成的有机溶剂，避免了有机溶剂残留，有利于提高用药安全性。
(4)本发明的环糊精包合物性质稳定、固体包合物与其他药用辅料相容性好，易于配伍制剂加工。液态包合物药物浓度高，配制量适中含量稳定，便于制剂的制备，实用性强。
(5)制备方法简单、操作简便、成本低且无环境污染。包合物易储存易运输、无毒害。
图1差示热分析图。其中a为羟基喜树碱与羟丙基-β-环糊精包合物；b为羟基喜树碱与羟丙基-β-环糊精物理混合物；c为羟基喜树碱；d为羟丙基-β-环糊精。b保持了羟丙基-β-环糊精和羟基喜树碱的吸热峰，基本上是各化合物的叠加，而a图谱上，各峰的位置(温度)和形状(热效应)都发生了变化说明包合物已形成图2羟基喜树碱IR光谱图。羟基喜树碱化学结构中的α-羟基内酯环上的羰基的特征吸收峰ν＝1748.26cm-1。
图3羟基喜树碱/羟丙基-β-环糊精包合物IR光谱图。在此图中，没有羟基喜树碱化学结构中的α-羟基内酯环上的羰基的特征吸收峰ν＝1748.26cm-1。结果充分说明羟基喜树碱化学结构中的α-羟基内酯环被羟丙基-β-环糊精所包裹。
图4pH＝6.86磷酸缓冲液为溶剂的羟基喜树碱溶液的HPLC图谱，图中R＝8.585min为羟基喜树碱的羧酸盐结构形式，R＝12.367min为羟基喜树碱的内酯结构形式。
图5含羟丙基-β-环糊精的羟基喜树碱纯水溶液的HPLC图谱，图中R＝12.326min为羟基喜树碱的内酯结构形式。此图谱表明羟基喜树碱由于环糊精的包裹，可以有效的保护内酯环结构，从而提高了以内酯环结构形式存在的药物分子含量。
图6以0.1M NaOH为溶剂的羟基喜树碱溶液的HPLC图谱，图中R＝8.689min为羟基喜树碱的羧酸盐结构形式。此图谱表明在碱性溶液中，羟基喜树碱主要以羧酸盐形式存在。
图70天UV扫描图a为pH＝2的羟基喜树碱溶液；b为pH＝4的羟基喜树碱溶液；c为纯水配制的羟基喜树碱溶液；d为包合物用纯水配制的溶液。
具体实施例方式
实施例1将0.03molβ-环糊精与205ml纯水混合，加入0.015mol羟基喜树碱，充分混合搅拌5小时，放置24小时；过滤，水洗固体物，减压干燥，即得白色固体包合物。
实施例2将0.03mol羟丙基-β-环糊精与45ml纯水混合，加入0.015mol羟基喜树碱，充分混合搅拌1小时，放置24小时；过滤，水洗固体物，固体物减压干燥，即得白色固体包合物。
实施例3将0.03molβ-环糊精与0.01mol羟丙基-β-环糊精和55ml纯水混合，加入0.015mol羟基喜树碱，充分混合搅拌10小时，放置24小时；过滤，水洗固体物，固体物减压干燥，即得白色固体包合物。
实施例4与实施例l基本相同，但是与340ml纯水混合。
实施例5与实施例1基本相同，但是加入0.003mol羟基喜树碱，混合搅拌10小时。
实施例6与实施例2基本相同，但是用0.03mol磺丁基-β-环糊精。
实施例7与实施例2基本相同，但是用0.1mol羟丙基-β-环糊精。
实施例8与实施例2基本相同，但是用0.1mol磺丁基-β-环糊精。
实施例9与实施例2基本相同，但是用0.06mol羟丙基-β-环糊精。
实施例10与实施例2基本相同，但是用0.06mol磺丁基-β-环糊精。
实施例11与实施例2基本相同，但是用0.09mol羟丙基-β-环糊精，搅拌10小时，然后直接过滤得液体包合物。
实施例12与实施例2基本相同，但是用0.09mol磺丁基-β-环糊精，搅拌10小时，然后直接过滤得液体包合物。
实施例13与实施例11基本相同，但是用0.12mol羟丙基-β-环糊精。
实施例14与实施例12基本相同，但是用0.12mol磺丁基-β-环糊精。
实施例15与实施例3基本相同，但是用0.01mol磺丁基-β-环糊精代替羟丙基-β-环糊精。
实施例16与实施例3基本相同，但是再加入0.01mol磺丁基-β-环糊精混合包合。
实施例17与实施例3基本相同，但是用0.06mol羟丙基-β-环糊精，再加入0.06mol磺丁基-β-环糊精混合包合。
实施例18与实施例17基本相同，但是用0.06mol羟丙基-β-环糊精和0.006mol磺丁基-β-环糊精混合包合。
实施例19与实施例17基本相同，但是用0.006mol羟丙基-β-环糊精和0.06mol磺丁基-β-环糊精混合包合。
权利要求
1.一种包合态环糊精/羟基喜树碱药物组合物，其中，环糊精与羟基喜树碱的摩尔比为1∶0.1～1.0，包合稳定常数Ka＝195M-1～2264M-1。
2.按照权利要求1所述的包合态环糊精/羟基喜树碱药物组合物，其特征在于，所述的环糊精采用β-环糊精或羟丙基-β-环糊精或磺丁基-β-环糊精，或其中任何两种和两种以上的混合物。
3.按照权利要求1所述的包合态环糊精/羟基喜树碱药物组合物，其特征在于，所述的包合态环糊精/羟基喜树碱药物组合物，是指在环糊精的纯水混悬液或溶液中，加入0.1～1.0摩尔比的羟基喜树碱，充分混合，压滤、搅拌1～10小时，过滤水洗、干燥，得到的固体包合物或直接过滤得到的液体包合物。
4.按照权利要求1所述的包合态环糊精/羟基喜树碱药物组合物，其特征在于，所述环糊精与羟基喜树碱的摩尔比采用1∶0.5；所述的环糊精的纯水混悬液或溶液是指β-环糊精或羟丙基-β-环糊精或磺丁基-β-环糊精或以上任何两种或两种以上的混合物与1～6倍质量的纯水混合制成的混悬液或溶液。
5.一种权利要求1所述的包合态环糊精/羟基喜树碱药物组合物的制备方法，步骤如下将环糊精与1～10倍质量的纯水混合，制成混悬液或溶液，加入0.1～1.0摩尔比的羟基喜树碱，充分混合，压滤、搅拌1～10小时，水洗、干燥即得固体包合物或直接过滤得液体包合物。
6.按照权利要求1所述的包合态环糊精/羟基喜树碱药物组合物的制备方法，其特征在于，所述的制备步骤是将β-环糊精或羟丙基-β-环糊精或磺丁基-β-环糊精或以上任何两种或两种以上的混合物与1～6倍质量的纯水混合，使成混悬液或溶液；加入0.5摩尔比的羟基喜树碱，充分混合、搅拌5～10小时，压滤，水洗固体物，干燥即得固体包合物或过滤得液体包合物。
全文摘要
包合态环糊精/羟基喜树碱药物组合物，其中，环糊精与羟基喜树碱的摩尔比为1∶0.1～1.0，包合稳定常数Ka＝195M
文档编号A61K31/4745GK1977974SQ20051012294
公开日2007年6月13日 申请日期2005年12月9日 优先权日2005年12月9日
发明者任勇, 马学琴, 王敏, 董祥玉 申请人:南京师范大学, 南京巨环医药科技开发有限公司