具有神经元祖细胞特性的细胞的制作方法

专利名称：具有神经元祖细胞特性的细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有神经元祖细胞特性的细胞，以及通过调节与骨髓附着干细胞的神经胶质转分化作用相关的在骨髓附着干细胞中的细胞通路而从骨髓附着干细胞获得其的方法。
背景技术：
中枢神经系统(CNS)或周围神经系统(PNS)疾病的治疗及研究上的局限是常规地认为末端分化的神经元被很大地限制了它们增殖的能力。因此，需要移植末端分化的神经元的CNS或PNS疾病的任何治疗都是难以完成的。为了克服该困难提出的一个方法是人工培养大量具有神经元祖细胞特性的有丝分裂的细胞(″CPCs″)。该细胞理论上可在体内分化成在CNS和/或PNS疾病的治疗中起作用的神经元。可选地，CPCs可在体外分化成神经元然后移植给患者。然而，这些CPCs很稀有并且很难从供体上分离开。因此，常规地，研究者已尝试从处理过的胚胎及胎儿干细胞(下文中全部称为“胚胎干细胞”)中获得CPCs。胚胎干细胞，作为多能细胞，已经用于产生多种多样的组织类型，并且可以是CPCs的来源。I.Weissman，Stem cellsunits of development，unitsof regeneration，and units in evolution(Review).Cell 100，157-168(2000)。然而，胚胎干细胞的使用引起了大量伦理方面的关注，并因此成为不赞成干细胞用于CPCs的生产的看法的根源。另外，胚胎干细胞可致瘤，这引起了人们对能潜在导致胚胎干细胞递送入患者中的任何移植过程的安全性问题的关注，例如从胚胎干细胞形成CPC移植物。一些研究者已尝试利用其他类型的干细胞，例如在CPCs的形成中的间充质干细胞。Prockop等人在2003年1月2日提交的题为“Directed in vitrodifferentiation of marrow stromal cells into neural cell progenitors”的美国专利申请20030003090公开了，在人间充质干细胞中经与0.5mM IBMX和1mM dbcAMP培育后可增加NSE和波形蛋白的表达水平。NSE与波形蛋白mRNAs的这种增加与神经细胞在培养中的表现相一致。然而，Prockop等报道，这并没有改变MAP1B或TuJ-1的表达水平。既然，NSE、MAP1B与TuJ-1都是早期神经元特征性的标记物，并且波形蛋白是神经胶质的早期标记物，因而Prockop等提出，hMSCs在体外能转分化成神经元或神经胶质的一些早期祖先。然而，Prockop的早期祖细胞可能不符合应用的要求，因为它们看上去具有非常不成熟的神经元表型，其临床疗效仍不太了解。因此，例如，对于在CNS或PNS疾病的研究和治疗中的使用，缺乏常规可利用的以及合适的CPCs的来源。进一步地，缺乏可以用于以合适的方式产生这些适合使用的CPCs的方法。因此，需要能够克服这些问题的方法和组合物。发明简介
一方面，本发明涉及一种从包含骨髓附着干细胞的材料中制备具有神经元祖细胞特性的细胞的方法，该方法包括调节与骨髓附着干细胞的神经胶质转分化作用相关的在骨髓附着干细胞中的细胞通路；其中充分调节该细胞通路以诱导至少一部分骨髓附着干细胞转分化成具有神经元祖细胞特性的细胞；条件是所述调节不包括用缺刻蛋白基因胞内域(notch intracel lular domain)转染骨髓附着干细胞。另一方面，本发明涉及一种用于制备具有神经元祖细胞特性的细胞的方法，包括用神经胶质调节剂来培育骨髓附着干细胞，所述神经胶质调节剂的量足以诱导至少一部分的骨髓附着干细胞转分化成具有神经元祖细胞特性的细胞；条件是，这种相互作用不包括用缺刻蛋白基因胞内域转染骨髓附着干细胞。

发明内容
发明人出乎意料地惊奇地发现，上述的问题以及局限可通过实施这里公开的发明进行克服。本发明提出了通过调节与MASCs的神经胶质转分化作用相关的在MASCs中的细胞通路来从骨髓附着干细胞(MASCs)中产生CPCs。施行和使用本发明的方法将在这里进行描述。
本文所引用的所有参考文献在此以其整体并且对于所有目的以相同的程度进行引用作为参考，就好像每个单独的出版物或专利或专利申请特定和单独地被指明对于所有目的以其整体进行引用作为参考。这里对参考文献的讨论仅仅只希望将这些参考文献的作者的主张概括在一起，并且不承认任何引用的参考文献构成了现有技术。申请人保留对所引用参考文献的准确性和相关性提出置疑的权利。
具有神经元祖细胞特性的细胞(“CPCs”)被定义为，为了本发明的目的，是这样的细胞，即其是有丝分裂的，表达巢蛋白以及特异于神经的前体/神经的祖细胞的其他细胞标记物，并且来源于MASCs。CPCs能够分化成神经元、神经胶质、和少突神经胶质细胞以及上述任一的前体。CPCs可以依据这里公开的方法从MASCs获得。在实施例中，人CPCs是EfnB2+、CD90-、以及PDGF受体β-的。这些标记物可在依据本发明的MASCs的神经胶质转分化作用之后，用来通过采用FACS从MASCs中分离CPCs。操作CPCs的适宜的方法是常规公知的，包括，例如，Goldman等在美国专利申请20020012903中公开的那些方法。
通常，依据本发明的CPCs可通过调节与MASCs的神经胶质转分化作用相关的在MASCs中的细胞通路来制得，充分调节该细胞通路以诱导至少一部分MASCs转分化成CPCs。
多种多样的调节方法在本发明的实践中是有用的。这些方法包括，但不限于，如果离体生长时，细胞生长的培养基及条件的改变；如果在体内生长时，MASCs所存在的组织环境的改动；或用神经胶质调节剂培育MASCs。调节的精确方式并不影响本发明的目的，只要MASCs的神经胶质转分化能得到有效地调节，因此允许MASCs分化成CPCs。通常，与MASCs的神经胶质转分化作用相关的在MASCs中的细胞通路的调节发生在适合维持任意MASCs或CPCs处于有丝分裂和有生存力状态的条件下。这些条件对于任一本领域普通技术人员来说是已知的，以及可以找到，例如，在M.Kallos等人，Large-scale expansion ofmammalian neural stem cellsa review.Med Biol Eng Comput.2003 May；41(3)271-82中。对于细胞培养以及体内环境的适宜条件以及技术也可以在该文献中的别处找到。
本发明的优选的实施方案中，与MASCs的神经胶质转分化作用相关的在MASCs中的细胞通路的调节，可通过使用神经胶质调节剂培育MASCs来完成。在更优选的实施方案中，与MASCs的神经胶质转分化作用相关的在MASCs中的细胞通路的调节，可通过用神经胶质调节剂培育MASCs来完成，所述神经胶质调节剂的量足以诱导至少一部分MASCs转分化成CPCs。本发明的上下文中的培育可包括在神经胶质调节剂存在下培养MASCs，目的是神经胶质调节剂与MASC细胞表面受体相互作用，或被转运到MASCs的内部而与内部的细胞通路相互作用。这种转运可能是被动的，例如扩散性的转运，或是主动的，例如通过主动转运蛋白，或者是两者的混合。体外培育可以以常规方式执行，例如在α-MEM或相似培养基中培育MASCs的培养物，在这些培养基中加入神经胶质调节剂。适宜的培育技术通常可在文献中找到，包括例如M Kallos等人，Large-scaleexpansion of mammalian neural stem cellsa review.Med Biol Eng Comput.2003 May；41(3)271-82。培育也可发生在体内的环境中，在这样的情况下可以全身或局部地并且使用常规方法施用依据本发明的神经胶质调节剂。
在培育的优选实施方案中，如果神经胶质调节剂是蛋白质或肽，培育的方法可以是将编码该蛋白或肽的DNA转染入MASCs。转染可以使用商业上可获得的转染方案，例如从Invitrogen处可获得的LipofectamineTM2000系统，或从Qiagen处可获得的EffecteneTM转染系统，或其他常规的转染方案。在培育的另一个优选的实施方案中，如果神经胶质调节剂是蛋白质或肽，培育的方法可以是使用常规病毒载体的神经胶质调节剂的病毒递送，例如为了稳定表达的慢病毒载体系统(BLOCK-iTTMLentiviral RNAi Expression System，Invitrogen)，以及为了瞬时表达的腺病毒载体系统(BLOCK-iTTMAdenoviralRNAi Expression System，Invitrogen)。
培育可以在不同的时间发生顺次地，平行地，或使用不同神经胶质调节剂的MASCs的顺次和平行培育的组合。
在本发明的实施方案中，存在这样的条件，即调节与MASCs的神经胶质转分化作用相关的在MASCs中的细胞通路不包括用缺刻蛋白基因的胞内域转染MASCs。在本发明的实施方案中，存在这样的条件，即使用神经胶质调节剂培育MASCs不包括用缺刻蛋白基因的胞内域转染MASCs。
骨髓附着干细胞(MASCs)被定义为，为了本发明的目的，常规地认为其可分化成几种类型的主要在结缔组织中发现的细胞的干细胞，这些主要在结缔组织中发现的细胞包括但不限于，成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞及肌细胞。MASCs明确排除了胚胎干细胞以及胎儿干细胞。MASCs可通过大量不同种类的动物获得，包括但不限于人类，以及其他哺乳动物例如大鼠、小鼠、灵长类、猪、牛及绵羊。MASCs可从不同种类的组织中获得；优选的来源包括骨髓以及脐带血。MASCs的有用的来源，以及获得它们的方法将在如下的实施例1以及本文其他地方中进行描述。在一个实施方案中，在本发明的实践中有用的人MASCs表达CD29以及CD90，但对CD15、CD34、CD11b/c、CD31、CD45以及冯·维勒布兰德因子呈阴性。
在一个实施方案中，MASCs可使用文献中描述的技术从脐带血中分离得到。例如，C.Campagnoli等人.，Identification of mesenchymalstem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood，liver，andbone morrow.1Blood.2001 Oct 15；98(8)2396-402，描述了获得胎儿血液MASCs的通常有用的方法。在A.Erices等人，Mesenchymal progenitorcells in human umbilical cord blood.1Br J Haematol.2000 Apr；109(1)235-42中，描述了从脐带血中获得MASCs的通常有用的方法。L.Hou等人，Induction of umbilical cord blood mesenchymal stem cells intoneuron-like cells in vitro.Int J Hematol.2003 Oct；78(3)256-61，描述了获得、纯化和扩增人类脐带血MASCs的通常有用的方法。
神经胶质调节剂被定义为，为了本发明的目的，除了其他特性之外尤其具有抑制MASCs转分化成神经胶质细胞以及提高它们转分化成CPCs的特性的物质。神经胶质调节剂可通过多种不同的机制发挥作用以指引MASCs远离神经胶质的命运。例如，促神经性(proneural)碱性螺旋-环-螺旋转录因子例如Mash1、Math 1以及neurogenin 1被认为是神经元基因表达的激活剂。
促神经性基因被认为是在抑制神经胶质转分化作用的同时驱动MASCs的神经元转分化作用。可能抑制神经胶质转分化作用的一个机制是通过调节STAT-介导的信号转导。经STAT的信号转导被认为是由磷酸化作用触发的，该磷酸化作用被认为是通过Janus家族的酪氨酸激酶(JAK)催化的。JAK-STAT信号转导的抑制因此可调节神经胶质转分化途径并促进MASCs的神经元命运。
依据本发明的神经胶质调节剂可包括抑制剂或拮抗剂或干扰神经胶质形因子的信号传导通路的试剂。神经胶质调节剂还可包括神经发生的激动剂，包括神经发生性因子。这些激动剂或因子的使用可在本发明的实践中负地控制MASCs的神经胶质形成。依据本发明的实践的神经胶质调节剂可包括治疗分子的常规形式，包括但不限于，小分子、肽、以及基因产物的整体或部分。
在一个实施方案中，依据本发明的神经胶质调节剂包括，但不限于，JAK/STAT抑制剂，包括STAT1与STAT3的抑制剂。在某些实施方案中，这样的JAK/STAT抑制剂可以包括用于JAK/STAT通路的基因沉默的RNAi，用于下调JAK/STAT通路的反义寡核苷酸，或小分子JAK抑制剂4-(4′-羟苯基)氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉。另外的JAK/STAT抑制剂已经公开在George Vasios公开于2004年10月21日的美国专利申请20040209799；以及Hua Yu等人公开于2004年3月18目的美国专利申请20040052762中。
在一个实施方案中，依据本发明的神经胶质调节剂包括但不限于，BMP2或7(骨形态发生蛋白)的拮抗剂。这样的拮抗剂可包括来自表达头蛋白、脊索发生素、滤泡素抑制素、sonic hedgehog(SHH)的基因的基因产物的整体或部分，或这些基因的激动剂。
在一个实施方案中，依据本发明的神经胶质调节剂包括，但不限于，Hes抑制剂，包括但不限于Hes 1和/或Hes 5抑制剂。在某些实施方案中，这样的Hes抑制剂可以包括用于Hes的基因沉默的RNAi，或用于下调Hes的反义寡核苷酸。
在一个实施方案中，依据本发明的神经胶质调节剂包括，但不限于，Id-1的抑制剂。参见S.Tzeng等人，Id1，Id2，and Id3 gene expression inneural cells during development.Glia.1998 Dec；24(4)372-81。在某些实施方案中，这样的Id-1抑制剂可以包括用于Id-1的基因沉默的RNAi，或下调Id-1的反义寡核苷酸。
在一个实施方案中，依据本发明的神经胶质调节剂包括，但不限于，果蝇glide/gcm(神经胶质细胞缺少)的哺乳动物同系物的抑制剂，包括但不限于Gcml(鼠类)或GCMB(人类)，参见Y.Iwasaki等人，The potential to induceglial differentiation is conserved between Drosophila and mammalianglial cells missing genes.Development.2003 Dec；130(24)6027-35.Epub2003 Oct 22；以及M.Kammerer等人，GCMB，a second human homolog of thefly glide/gcm gene.Cytogenet Cell Genet.1999；84(1-2)43-7)。在某些实施方案中，这样的glide/gcm同系列抑制剂可以钖用于glide/gcm同系物(例如Gcml(鼠类)或GCMB(人类))的基因沉默的RNAi，或用来下调glide/gcm同系物(例如Gcml(鼠类)或GCMB(人类))的反义寡核苷酸。
在一个实施方案中，依据本发明的神经胶质调节剂包括，但不限于，Sox9的抑制剂，其可能是少突神经胶质细胞谱系的转录因子。参见C.Stolt等人，The Sox9 transcription factor determines glial fate choice in thedeveloping spinal cord.Genes Dev.2003 Jul 1；17(13)1677-89。在某些实施方案中，这样的Sox9抑制剂可以包括用于Sox9的基因沉默的RNAi，或用来下调Sox9的反义寡核苷酸。
在一个实施方案中，依据本发明的神经胶质调节剂包括，但不限于，Neurogenin3的抑制剂，所述Neurogenin3可能是用于神经胶质形成的转录因子。在某些实施方案中，这样的Neurogenin3抑制剂可以包括用于Neurogenin3的基因沉默的RNAi，或用于下调Neurogenin3的反义寡核苷酸。
在一个实施方案中，依据本发明的神经胶质调节剂包括，但不限于，睫状神经营养因子(CNTF)的抑制剂。在某些实施方案中，这样的CNTF抑制剂可以包括用于CNTF的基因沉默的RNAi，或下调CNTF的反义寡核苷酸。
在某些实施方案中，神经胶质调节剂可以包括来自表达强烈抑制神经胶质形成的Wnt1的基因的基因产物的整体或部分。参见K.Tang等人，Wnt-1promotes neuronal differentiation and inhibits gliogenesis in P19 cells.Biochem Biophys Res Commun.2002 Apr 26；293(1)167-73。来自表达Wnt1的基因的基因产物的整体或部分可以通过转染或其他常规方法，例如包括病毒载体的基因治疗方法来施用。
在某些实施方案中，神经胶质调节剂可以包括来自表达一亚群神经碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)因子的基因的基因产物的整体或部分，该亚群神经碱性螺旋-环-螺旋因子在神经形成期间起到有益的作用或在增殖CPCs中表达。这样的神经胶质调节剂可包括来自表达Neurogeninl、Mashl、Math1、Math6或NeuroD的基因的基因产物的整体或部分。来自表达该亚群神经碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)因子(包括但不限于，Neurogeninl、Mashl、Math1、Math6或NeuroD)的基因的基因产物的整体或部分，可以通过转染或其他常规方法，例如包括病毒载体的基因治疗方法来施用。
另外，神经胶质调节剂可以单独或联合施用。在优选的实施方案中，如果神经胶质调节剂的组合用于本发明的实践中，那么，可选择对不同神经胶质调节通路起作用的神经胶质调节剂。这可用于加强神经胶质调节剂的总体神经胶质调节效果。
为了本发明的目的，分离CPCs包括从样品中的非CPCs细胞例如没有转分化成CPCs的MASCs中分离CPCs。该种分离可包括单一分离或多重分离。如果执行多重分离，优选使用不同的分离类型或技术，因为这些不同的分离类型或技术可以增强分离的结果。大量多种多样的分离方法在本发明的实践中是有用的。这些分离方法的例子包括，但不限于，流式细胞测量术(aka FACS分选)、磁分离技术以及目视分选。在细胞生存力不重要的情况下也可使用免疫细胞化学。
可使用常规的FACS设备和方案，使用特异于与一个或多个CPCs的特性相关联的抗体决定基的抗体来进行FACS分选。在人类CPCs的情况中，一个该种抗体决定基是EfnB2。N.Ivanova等人，A stem cell molecular signature.Science 298(5593)601-4(Oct 18，02002)。另外在本发明的实践中有用的抗体，虽然对于FACS分选并不是必需的，包括抗-D15、抗-CD29、抗-CD34、抗-CD90、抗-CD31、抗-CD45、抗-CD11 b/c以及抗-冯·维勒布兰德因子。在本发明的实践中有用的细胞群FACS设备包括，但不限于，具有CellQuestTM软件的FACScaliburTM分析器(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)，或从GuavaTechnologies(Hayward，California)可获得的FACS设备。
可选地，分离可利用磁分离技术来完成，例如可以从Qiagen以试剂盒的形式获得的BioMagTM方案和试剂。免疫细胞化学可以是另一种在本发明的实践中有用的分离技术；有用的免疫细胞化学方法在M.Dezawa等人，Sciaticnerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitrodifferentiated bone-marrow stromal cells.Eur.J.Neurosci.14，1771-1776(2001)中描述了。免疫细胞化学的检查可在共聚焦激光扫描显微镜下进行，例如Radians 2000(Bio-Rad，Hertfordshire，UK)。常规的目视细胞分迭技术可用于本发明的实践中。
神经元被定义为，为了本发明的目的，构成脑、脊髓和神经的任意一种脉冲传导性细胞，其由有一个或多个树突的带核细胞体以及一个单独的轴突组成。在生物化学上，神经元的特征在于与对于神经丝-M、β3-微管蛋白和TuJ-1的抗体反应。这些反应可用于利用例如FACS分选的技术来分离神经元或具有一个或多个神经元特性的细胞。神经细胞的特征还在于分泌神经传递素、神经传递素合成酶或神经传递素相关蛋白，例如神经肽Y与P物质。
神经营养剂被定义为，为了本发明的目的，除了其他特性之外尤其具有引起或促进CPCs分化成神经元或具有一个或多个神经元特性的细胞这样的特性的物质。在本发明的实践中有用的神经营养剂包括，但不限于，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，睫状神经营养因子(CNTF)，以及毛喉素(FSK)。神经营养剂可以利用本领域已知的细胞操作技术而与本发明的CPCs进行组合。优选的方法通常可在Dezawa等人的PCT/JP03/01260中找到。在优选的实施方案中，bFGF、CNTF和FSK与CPCs在细胞培养中进行组合，其量对于引起或促进CPCs分化成神经元或具有一个或多个神经元特性的细胞是有效的。
神经胶质细胞被定义为，为了本发明的目的，是构成支撑中枢神经系统组织的分枝细胞和纤维网络的任何细胞。神经胶质细胞包括，但不限于，星形胶质细胞、施万细胞、少突神经胶质细胞以及小胶质细胞。
基因被定义为，为了本发明的目的，是一组连接的转录物，其中转录物是一组经转录并随后(任选地)经前mRNA剪接而产生的外显子。基因产物被定义为，为了本发明的目的，是由基因翻译出的蛋白质。基因的部分被定义为，为了本发明的目的，是基因的亚群。基因产物的部分被定义为，为了本发明的目的，是基因产物的亚群。
患者指的是动物，典型的是哺乳动物，以及更典型的是人类，其是医学观察或研究的受试者。
依据本发明制得的CPCs可通过多种方法施用给患者，包括但不限于，通过注射套管、针或分流器的输注，或通过在载体例如生物可降解的胶囊中的植入，但其他施用途径也在本发明的范围之内。本发明的施用途径包括局部以及全身性途径。局部施用可优选包括施用给CNS或PNS的靶向部位，和优选包括实质内途径。全身性施用途径包括肠胃外途径，静脉内(i.v.)或动脉内(例如通过颈内动脉或颈外动脉)给药是优选的全身性施用途径。全身性施用技术可以根据通常用于施用前体细胞的技术而进行调整，例如公开在D Lu等人，Intraarterial administration of marrow stromal cells in a rat model oftraumatic brain injury.J Neurotrauma.2001 Aug；18(8)813-9中的那些。
施用给患者的CPCs的量可在临床上决定，使用常规剂量评定技术，以及特定患者疾病的临床评估。
就本申请中描述的特定实施例来说不是用来限制本发明的，而是作为本发明的个别方面的单独的举例说明。本发明的许多对于本领域技术人员显而易见的修饰以及变型可以在不脱离其精神及范围的情况下获得。本发明范围中的功能等效的方法，除了这里列举的之外，对于本领域技术人员根据上述描述来说都是显而易见的。这些修饰及变型被认为是落入所附的权利要求书的范围中。本发明仅仅受到所附权利要求书的限制，连同该权利要求书所赋予的等价形式的全部范围。
下文给出的实施例用来举例说明，而决不是对本发明的范围作出限制。
实施例材料和方法
MASCs分离大鼠MASCs(Wistar株系)，并如M.Dezawa等人，Sciaticnerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitrodifferentiated bone-marrow stromal cells.Eur.J.Neurosci.14，1771-1776(2001)中所述的进行培养。对于人类MASCs来说，使用商业上可购得的MASCs(PT-2501，BioWhittaker.Walkersville，MD)以及由健康供体获得的MASCs。细胞在含有10％胎牛血清(FBS)的α-MEM(Sigma，M-4526)中维持。
在从健康供体获得MASCs的情况中，最初的步骤是使用常规抽吸技术从健康供体上获得骨髓抽吸物。细胞抽吸物然后被转移到50ml管中。然后使用10ml吸移管小心地将13ml Histopaque置于下部。然后把管于2000rpm离心20分钟。然后收获界面上的细胞。然后加入PBS(至少3倍的界面体积)，混合物于1200rpm离心。用PBS洗涤细胞两次以上。然后将细胞沉淀重悬浮在DMEM+10％FCS中，计数细胞。在每个T-75组织培养瓶中再放入5×106个细胞，培育3天。第4天，将不贴壁的细胞移出，用培养基洗涤瓶子3次。贴壁细胞留在瓶中生长。当细胞达到20-30％的汇合时，2-3个瓶子的内容物被汇集到一起，并再放入一个T-75瓶中。当该汇集物中的细胞达到汇合时，使用0.05％胰蛋白酶与0.02％EDTA对细胞进行胰蛋白酶消化。然后洗涤细胞并计数。然后将细胞重悬浮在SigmaαMEM+10％FBS(M-4526)中。在使用脂转染法的实验中，确保培养基中不含有1-glu是很重要的。不加入谷氨酰胺。细胞扩展2-4周，并在早期传代阶段中冷冻。
用荧光激活细胞分析法(FACS)分析大鼠及人类MASCs中的细胞表面标记物。在一个实施方案中，MASCs表达CD29以及CD90，但对CD34、CD31、CD45、CD11 b/c和冯.维勒布兰德因子呈阴性，这与M.Pittenger等人在Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Science284，143-147(1999)以及J.Kohyama等人在Brain from boneefficient″meta-differentiation″of marrow stroma-derived mature osteoblasts toneuron with Noggin or a demethylating agent.Differentiation 68，235-244(2001)(Fig.1A)中公开的相一致。通过免疫细胞化学也获得相同的结果。依据由M.Pittenger等人，Multilineage potential of adult humanmesenchymal stem cells.Science 284，143-147中描述的方法可确认大鼠及人类MASCs的脂肪形成性、软骨形成性和骨形成性分化。
FACS分析。最终浓度为1×107/ml的细胞用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1mg单克隆抗体培育。培育可以在存在10mg小鼠免疫球蛋白的情况下进行，以防止非特异性的抗体结合。在大鼠MASCs中，小鼠抗-CD34(Santa CruzAntibodies)以及仓鼠抗-CD29(PharMingen，San Diego，CA)可用FITC标记，并且可用经FITC标记的抗-小鼠或仓鼠IgG来培育对照。小鼠抗-CD54与CD11b/c均可从PharMingen购得。在本发明的实践中需要的小鼠抗-冯·维勒布兰德因子以及其他抗体可商业获得。对照可包括用非免疫小鼠血清染色的细胞。如果这些抗体与FITC缀合，那么随后可用1mg的FITC-缀合的抗-小鼠IgG来培育细胞。在人类MASCs中，可使用经藻红蛋白标记的小鼠抗-CD34、CD29、CD54、CD11b/c和冯·维勒布兰德因子，并且对照可包括用经藻红蛋白标记的抗-小鼠IgG染色的细胞。获得数据并在FACScalibur上用CellQuest软件(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)进行分析。
免疫细胞化学。一般的程序已在M.Dezawa等人的Sciatic nerveregeneration in rats induced by transplantation of in vitrodifferentiated bone-marrow stromal cells.Eur.J.Neurosci.14，1771-1776(2001)中描述了。用含有4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水(PBS)固定细胞后，在4℃用一抗培育过夜。针对巢蛋白的抗体可从PharMingen处商业购得。然后将细胞用对经Alexa Fluor 488或546缀合的抗-小鼠IgG、IgM或兔IgG的二抗(分子探针，Eugene，OR)在室温下培育1小时，并进行TOTO-3碘化物(分子探针)对比染色。在共聚焦激光扫描显微镜(Radians 2000，Bio-Rad，Hertfordshire，UK)下观察。
实施例1
让人类MASCs(PT-2501，BioWhittaker，Walkersville，MD)在含有10％FBS的α-MEM中培养生长，大体依据E.Sudbeck等人，Structure-baseddesign of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducingantileukemic agents.Clin.Cancer Res.5，1569-1582(1999)。MASCs用40ug/ml 4-(4′-羟苯基)氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉(WHI-131，Calbiochem，SanDiego，CA)培育2天。两天后洗掉WHI-131。
实施例2
让依据材料和方法部分制得的人类MASCs在含有10％FBS的α-MEM中培养生长，大体依据E.Sudbeck等人的Structure-based design of specificinhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents.Clin.Cancer Res.5，1569-1582(1999)。一旦培养物达到90％汇合，将使用BLOCK-iTTMRNAi Designer(Invitrogen)设计的几种RNA与该培养物一起培育一段足以使Sox9的表达沉默的时间，使用从Invitrogen处可获得的BLOCK-iTTM方案。所产生的CPCs，通过随后使用包被有适当抗体的磁珠进行挑选，从未转分化的MASCs中分离开，抗体例如为抗-EfnB2(对于CPCs的正选择)、抗-CD90(对于CPCs的负选择)以及抗-PDGF受体β(对于CPCs的负选择)。抗体与经包被的小珠可从商业供应者获得。PBS中的细胞与经包被的小珠在室温下培育1小时。利用磁铁移出结合了细胞的小珠。洗涤CPCs使之无抗体，并在含有10％FBS的α-MEM中再次悬浮并进行增殖。
实施例3
让依据材料和方法部分制得的人类MASCs在含有10％FBS的α-MEM中培养生长，大体依据E.Sudbeck等人的Structure-based design of specificinhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents.Clin.Cancer Res.5，1569-1582(1999)。Hes 1的反义低聚物依据以下任一公开的技术产生，H.Moulton等人，Peptide-assisted delivery ofsteric-blocking antisense oligomers.Curr Opin Mol Ther.2003 Apr；5(2)123-32；C.Stein等人，Antisense oligonucleotides as therapeuticagents-is the bullet really magical？Science.1993 Aug 20；261(5124)1004-12；或C.Helene，The anti-gene strategycontrol of geneexpression by triplex-forming-oligonucleotides.Anticancer Drug Des.1991 Dec；6(6)569-84。一旦MASC培养物达到90％汇合，将Hes-1反义低聚物与MASCs一起培育一段足以下调Hes-1的表达的时间，依据本实施例中引用的三篇参考文献中的任一所公开的技术。得到的CPCs通过随后使用包被有适当抗体的磁珠进行挑选，从未转分化的MASCs中分离开，抗体例如为抗-EfnB2(对于CPCs的正选择)、抗-CD90(对于CPCs的负选择)以及抗-PDGF受体β(对于CPCs的负选择)。抗体与经包被的小珠可从商业供应者获得。PBS中的细胞与经包被的小珠在室温下培育1小时。利用磁铁移出结合了细胞的小珠。洗涤CPCs使之无抗体，并在含有10％FBS的α-MEM中再次悬浮并进行增殖。
实施例4
Wnt-1表达质粒可依据M.Sen等人，Regulation of fibronectinand metalloproteinase expression by Wnt signaling in rheumatoidarthritis synoviocytes.Arthritis Rheum.2002 Nov；46(11)2867-77产生。让依据材料和方法部分制得的人类MASCs在含有10％FBS的α-MEM中培养生长，大体依据E.Sudbeck等人的Structure-based design of specificinhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents.Clin.Cancer Res.5，1569-1582(1999)。一旦培养物达到90％的汇合，MASCs与Wnt-1表达质粒一起在37摄氏度和5％CO2下利用从Invitrogen处可获得的LipofectamineTM2000试剂和方案来培育2天。两天的培育后，培养物在10天的时期内利用常规的选择技术进行选择以挑选出经转染的细胞。得到的CPCs通过随后使用包被有适当抗体的磁珠进行挑选，从未转分化的MASCs中分离开，抗体例如为抗-EfnB2(对于CPCs的正选择)、抗-CD90(对于CPCs的负选择)以及抗-PDGF受体β(对于CPCs的负选择)。抗体与经包被的小珠可从商业供应者获得。PBS中的细胞与经包被的小珠在室温下培育1小时。利用磁铁移出结合了细胞的小珠。洗涤CPCs使之无抗体，并在含有10％FBS的α-MEM中再次悬浮并进行增殖。
实施例5
将依据实施例1制得的细胞置于含有20％胎牛血清(14-501 F，Lot#61-1012，BioWhittaker Co.)的Minimum Essential Mediam Alpha EagleModification (M4526，Sigma Co.)中。加入5μM毛喉素(344273，Calbiochem，La Jolla，CA)，10ng/ml的重组人碱性成纤维细胞生长因子(100-18B，Peprotech EC，Ltd.，London，UK)以及10ng/ml的睫状神经营养因子(557-NT，R & D Systems，Minneapolis，MN)。培养物生长3天，在此时辨别出具有神经元祖细胞特性的细胞，结果是29.46+/-3.0％的MAP-2ab-阳性细胞。使用Western印迹法来分析MAP-2ab，使用从经培育的细胞制得的细胞裂解物，将50ug裂解物蛋白在5％和10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。对于MAP-2的抗原(1∶500，Chemicon)利用碱性磷酸酶检测。
实施例6
收获实施例5的具有神经元祖细胞特性的细胞，并大体依据E.Sudbeck等人，Structure-based design of specific inhibitors of Januskinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents.Clin.Cancer Res.5，1569-1582(1999)，在含有10％FBS的α-MEM中培养生长达到90％汇合。下一步，把5mM的毛喉素(344273，Calbiochem)、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(100-18B，Peprotech EC，Ltd.)以及50ng/ml的睫状神经营养因子(557-NT，R & D Systems)加入到细胞培养物中。
细胞在神经营养剂存在时生长10天，然后就神经细胞的形态学特征，以及与针对MAP-2(MAB364，Chemicon)、神经丝(814342，Boehringer Manheim)和巢蛋白(BMS4353，Bioproducts)的抗体的阳性反应对这些细胞进行分析。
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权利要求
1.一种从包含骨髓附着干细胞的材料制备具有神经元祖细胞特性的细胞的方法，该方法包括调节与骨髓附着干细胞的神经胶质转分化作用相关的在骨髓附着干细胞中的细胞通路；其中充分调节该细胞通路以诱导至少一部分的骨髓附着干细胞转分化成具有神经元祖细胞特性的细胞；条件是所述调节不包括用缺刻蛋白基因胞内域转染骨髓附着干细胞。
2.权利要求1的方法，其中骨髓附着干细胞从下组中选出人类骨髓附着干细胞、大鼠骨髓附着干细胞、小鼠骨髓附着干细胞、灵长类骨髓附着干细胞、猪骨髓附着干细胞、牛骨髓附着干细胞以及绵羊骨髓附着干细胞。
3.权利要求1的方法，其中调节包括神经胶质调节剂与骨髓附着干细胞的培育。
4.权利要求3的方法，其中所述培育包括神经胶质调节剂转染入骨髓附着干细胞。
5.权利要求3的方法，其中神经胶质调节剂包括抑制剂或拮抗剂或干扰神经胶质形成因子的信号传导通路的试剂。
6.权利要求3的方法，其中神经胶质调节剂包括神经发生的激动剂。
7.权利要求3的方法，其中神经胶质调节剂包括JAK/STAT抑制剂；STAT1或STAT3的抑制剂；4-(4′-羟苯基)氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉；骨形态发生蛋白2或骨形态发生蛋白7的拮抗剂；来自表达头蛋白、脊索发生素、滤泡素抑制素、sonic hedgehog(SHH)的基因的基因产物的整体或部分，或这些基因的激动剂；Hes抑制剂；Hes1或Hes5抑制剂；Id-1的抑制剂；果蝇glide/gcm的哺乳动物同系物的抑制剂；Sox9的抑制剂；Neurogenin3的抑制剂；CNTF的抑制剂；来自表达Wnt1、Neurogenin1、Mash1、Math1、Math6或NeuroD的基因的基因产物的整体或部分，或这些基因的激动剂。
8.权利要求1的方法，进一步包括分离具有神经元祖细胞特性的细胞；以及将它们施用给患者。
9.权利要求1的方法，其中骨髓附着干细胞来源于脐带血。
10.权利要求1的方法，其中骨髓附着干细胞来源于骨髓。
11.一种制备具有神经元祖细胞特性的细胞的方法，其包括用神经胶质调节剂来培育骨髓附着干细胞，所述神经胶质调节剂的量足以诱导至少一部分的骨髓附着干细胞转分化成具有神经元祖细胞特性的细胞；条件是，这种相互作用不包括用缺刻蛋白基因胞内域转染骨髓附着干细胞。
12.权利要求11的方法，其中骨髓附着干细胞从下组中选出人类骨髓附着干细胞、大鼠骨髓附着干细胞、小鼠骨髓附着干细胞、灵长类骨髓附着干细胞、猪骨髓附着干细胞、牛骨髓附着干细胞以及绵羊骨髓附着干细胞。
13.权利要求11的方法，其中所述培育包括神经胶质调节剂转染入骨髓附着干细胞。
14.权利要求11的方法，其中神经胶质调节剂包括抑制剂或拮抗剂或干扰神经胶质形成因子的信号传导通路的试剂。
15.权利要求11的方法，其中神经胶质调节剂包括神经发生的激动剂。
16.权利要求11的方法，其中神经胶质调节剂包括JAK/STAT抑制剂；STAT1或STAT3的抑制剂；4-(4′-羟苯基)氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉；骨形态发生蛋白2或骨形态发生蛋白7的拮抗剂；来自表达头蛋白、脊索发生素、滤泡素抑制素、sonic hedgehog(SHH)的基因的基因产物的整体或部分，或这些基因的激动剂；Hes抑制剂；Hes1或Hes5抑制剂；Id-1的抑制剂；果蝇glide/gcm的哺乳动物同系物的抑制剂；Sox9的抑制剂；Neurogenin3的抑制剂；CNTF的抑制剂；来自表达Wnt1、Neurogenin1、Mash1、Math1、Math6或NeuroD的基因的基因产物的整体或部分，或这些基因的激动剂。
17.权利要求11的方法，进一步包括分离具有神经元祖细胞特性的细胞；以及将它们施用给患者。
18.权利要求11的方法，其中骨髓附着干细胞来源于脐带血。
19.权利要求11的方法，其中骨髓附着干细胞来源于骨髓。
20.依据权利要求1的方法制得的具有神经元祖细胞特性的细胞。
21.依据权利要求11的方法制得的具有神经元祖细胞特性的细胞。
22.一种方法，包括将权利要求20的具有神经元祖细胞特性的细胞施用给患者。
23.一种方法，包括将权利要求21的具有神经元祖细胞特性的细胞施用给患者。
24.一种方法，包括提供权利要求1的具有神经元祖细胞特性的细胞；以及将具有神经元祖细胞特性的细胞与至少一种神经营养因子相联合，其中至少一种神经营养因子是以下述有效量存在的，该有效量能够促进具有神经元祖细胞特性的细胞分化成具有一个或多个神经元特性的细胞。
25.权利要求24的方法，进一步包括分离具有一个或多个神经元特性的细胞。
26.权利要求24的方法，其中至少一种神经营养因子包括碱性成纤维细胞生长因子、睫状神经营养因子或毛喉素。
27.依据权利要求24的方法制备的具有一个或多个神经元特性的细胞。
28.一种方法，包括将权利要求24的具有一个或多个神经元特性的细胞施用给患者。
29.一种方法，包括提供权利要求11的具有神经元祖细胞特性的细胞；以及将具有神经元祖细胞特性的细胞与至少一种神经营养因子相联合，其中至少一种神经营养因子是以下述有效量存在的，该有效量能够促进具有神经元祖细胞特性的细胞分化成具有一个或多个神经元特性的细胞。
30.权利要求29的方法，进一步包括分离具有一个或多个神经元特性的细胞。
31.权利要求29的方法，其中至少一种神经营养因子包括碱性成纤维细胞生长因子、睫状神经营养因子或毛喉素。
32.依据权利要求29的方法制备的具有一个或多个神经元特性的细胞。
33.一种方法，包括将权利要求29的具有一个或多个神经元特性的细胞施用给患者。
全文摘要
公开了具有神经元祖细胞特性的细胞，以及通过调节与骨髓附着干细胞的神经胶质转分化作用相关的在骨髓附着干细胞中的细胞通路而从骨髓附着干细胞获得其的方法。
文档编号A61K35/30GK1973031SQ200580010978
公开日2007年5月30日 申请日期2005年4月7日 优先权日2004年4月12日
发明者出泽真理 申请人:桑比欧公司