专利名称：从不饱和官能化的多元醇酯得到的可注射微球的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种形成负载药物/生物活性剂的注射水凝胶微球的方法，因此所形成的负载药物/生物活性剂的微球在药物/生物活性剂的体内控制释放中是有用的。
背景技术：
具有包封的或共价键结合的药物的微球允许提供可注射悬浮液作为手术植入的替代品，并可以将多种药物在单注射剂中给药。这些微球会提供初始爆发以达到治疗浓度，然后通过补偿代谢损失来进行药物的零级释放以维持治疗浓度。这些微球因此提供了控制释放的治疗浓度。
人们已经注意到，来自D，L-丙交酯/乙交酯的生物可降解的聚酯的微球和来自ε-己内酯的生物可降解的聚酯的微球用于药物试剂和大分子在体内的控制释放。但是这些聚酯是相对疏水的，而在可注射的微球上需要一个更亲水的表面以增加在循环系统中的有效存留时间并减少炎症应答的发生。用亲水性聚合物对聚酯微球进行表面修饰可以实现亲水的性质。迄今为止，人们还没有获得不依赖于亲水性聚合物的化学附着或物理吸收的具有更亲水表面的聚酯微球。
发明简述已发现，具有表面亲水性的生物可降解的可注射的聚酯微球可以不需要亲水性聚合物的表面修饰而制备，而是可以从聚酯的不饱和官能化的，例如双键官能化的多元醇酯来形成微球，例如在美国专利U.S.6,592,895和Lang，M.，等人，Journal of Polymer SciencePart APolymer Chemistry，Vol.40，1127-1141(2002)中描述的那些，在此将这两篇文献全部引入本文作为参考。
在一个实施方案中，即第一实施方案中，本发明涉及形成负载药物/生物活性剂的生物可降解的可注射微球的方法，其依赖于复乳剂技术，包括下列步骤(a)将聚酯的不饱和官能化的，例如双键官能化的多元醇酯溶解于疏水性有机溶剂中，(b)将水溶性药物和/或其他的生物活性剂溶解于水中，(c)将在步骤(a)和步骤(b)中形成的溶液混合形成第一乳剂，其中在步骤(a)中形成的溶液构成连续相，在步骤(b)中形成的溶液构成分散相，(d)将稳定剂溶解于水中，(e)将在步骤(d)中形成的溶液与在步骤(c)中形成的乳剂混合，形成水包油包水型(water-in-oil-in-water)乳剂，其中步骤(d)的溶液构成连续相，在步骤(c)中形成的乳剂构成分散相，(f)从步骤(e)形成的水包油包水型乳剂中蒸发有机溶剂，以从聚酯的不饱和官能化的多元醇酯来形成硬化微球，其包封所述药物和/或其他生物活性剂，(g)回收包封有药物和/或其他生物活性剂的微球。
在另一种情况下，即第二实施方案中，药物和/或其他生物活性剂能够反应以共价键合至不饱和官能团，在步骤(f)中形成和在步骤(g)中回收的硬化微球在所述的不饱和官能团反应以共价键合至该微球。
优选地，在第一和第二实施方案中的不饱和官能化的，例如双键官能化的多元醇酯的制备包括，在包含3到6个羟基的多元醇存在下，聚合ε-己内酯单体或者ε-己内酯和丙交酯单体或乙交酯单体的混合物，形成多元醇酯，其中酰基包含游离的羟基作为其末端(PGCL)，并与马来酸酐反应，从而将一些或每个游离的羟基转换成包含2-羧基乙烯基，特别是1-羧基-2羧基乙烯基的部分，形成了(PGCL)的马来酸酯，术语称之为(PGCLM)。
聚酯的多元醇酯一般具有三种不同种类的官能团末端基，即未反应的-OH、-COOH和＞C＝C＜，其是多臂，例如三臂化合物。
在第一实施方案的方法的步骤(f)中蒸发溶剂，通过聚合物沉淀导致微球硬化。
在另一个实施方案中，即本发明的第三实施方案中，本发明涉及平均横向尺寸范围15到60μm的生物可降解的可注射微球，其是由硬的聚酯的不饱和官能化，例如双键官能化的，多臂的多元醇酯形成的，例如，其负载的药物或其他的生物活性剂例如蛋白质占微球的1到10％重量，用于在注射微球后的一段时间至数个月内持续释放。不饱和的官能团可以共价结合到生物活性剂上以延迟释放，以及提供在微球表面形成水凝胶的可能性，这样它就具有了允许两种不同释放模式的优点，一种是从微球中释放，而另一种是从水凝胶中释放。在优选的情况下，微球是由硬的聚酯的双键官能化的多元醇酯形成的，而该多元醇酯是在甘油的存在下通过聚合ε-己内酯单体形成多元醇酯而得到的，其中酰基在其末端包含游离的羟基，并与马来酸酐反应，从而将一些或每个游离的羟基转换成包含羧基乙烯基，特别是1-羧基-2羧基乙烯末端基的部分；也就是说，该微球是由聚酯的双键官能化的多元醇酯形成的，其中该多元醇酯是具有OH、-COOH和＞C＝C＜官能团的末端官能化的三臂聚(ε-己内酯)马来酸。可替代地，微球的表面例如，通过表面双键的交联转变成了水凝胶。负载通过在微球中和/或微球表面的水凝胶中和/或通过与微球的官能团的共价结合(即通过末端的OH、-COOH和＞C＝C＜官能团)包含，例如包封药物或其他生物活性剂，例如任何水溶性肽或蛋白质或水溶性维生素(例如所有的维生素B类、生物素、叶酸和抗坏血酸)而得到。与微球的官能团共价结合的药物或其他生物活性剂包括，例如烯炔(抗癌染料)，其是包含碳-碳双键(烯)和碳-碳三键(炔)的化合物。该微球具有亲水性表面，与具有疏水性表面的微球相比，其在循环系统中的存留时间更长，并且可以更好和更持久地递送治疗剂。
此处的术语“生物可降解”是指能够被各种各样的酶，例如胰蛋白酶、脂肪酶和溶酶体以人体内的正常功能分解和/或被活的生物体(例如细菌)和/或水环境分解。
用聚苯乙烯标准品通过凝胶渗透色谱法来确定分子量和多分散性。更具体地，用凝胶渗透色谱法(GPC)来确定制备的聚合物的分子量(Mn和Mw)，其中用四氢呋喃(THF)作为洗脱液(1.0ml/min)，使用Water 510HPLC泵，Water U6K注射器，串联的3个PSS SDV柱(直的，104到100埃)，Milton ROM差示折光仪，样本浓度是5-10mg/mlTHF，通过分子量分布狭窄的聚苯乙烯标准品给柱标注刻度。
附图简述附
图1显示的是PGCL和PGCLM的化学结构和NPGCLM的代表性结构；附图2A显示的是在操作实施例中形成的PGCLM65微球的尺寸分布；附图2B显示的是在操作实施例中形成的PGCLM81微球的尺寸分布；附图2C显示的是在操作实施例中形成的PGCLM61微球的尺寸分布；附图3A显示的是在操作实施例中形成的PGCLM41，PGCLM61，PGCLM81和PGCLM85的OVA的累积释放；附图3B显示的是在操作实施例中形成的PGCLM61，PGCL61，和交联PGCLM61，即NPGCLM61的OVA的累积释放；详述现在，我们转向第一实施方案的方法。
在步骤(a)中聚酯的不饱和官能化的多元醇酯包括在美国专利U.S.6,592,895和Lang，M.，等人，Journal of Polymer SciencePart APolymer Chemistry，Vol.40，1127-1141(2002)中描述的聚酯的双键官能化的多元醇酯，可以如其所示合成出来。
非常优选的聚酯的双键官能化的多元醇酯通过如下方式得到在多元醇存在下聚合ε-己内酯单体，以提供在酰基的末端具有游离羟基的酯(PGCL)，并与马来酸酐反应，从而将一些或每个游离的羟基转换成包含2-羧基乙烯基，特别是1-羧基-2羧基乙烯基的部分。这些聚酯的双键官能化的多元醇和它们的制备方法在美国专利U.S.6,592,895中进行了描述，在本文中该物质称为PGCLM。所得到的化合物具有平均的分子量，Mn，范围例如是，从1,000到5,000。
步骤(a)的溶剂是在室温下溶解该聚酯的不饱和官能化的多元醇酯并且沸点范围是，例如，30-45℃(这允许容易地除去溶剂)的溶剂。步骤(a)的优选溶剂是二氯甲烷(bp为38.9-40℃)。步骤(a)的其他适当的溶剂包括氯仿、乙酸乙酯、和N，N-二甲基甲酰胺。
对于步骤(a)，将聚酯的双键官能化的多元醇酯以例如0.5到10％w/v的量溶解于疏水有机溶液中。浓度的增加会导致最终得到的微球的平均直径增加，以及使如下文所述负载的水溶性药物的负载效力增加，至少达6％w/v时导致负载水平增加(微球的药物％，w/w)。
现在，我们转向负载到微球中持续释放的药物和/或其他生物活性剂；即，药物和/或其他生物活性剂。该药物或生物活性剂可以是，例如氨基氧根的载体或抗炎剂(例如，serolimos)或抗增殖药(例如，紫杉醇)，或生物活性剂、或蛋白质，或细胞因子、或寡核苷酸包括反义寡核苷酸、或基因、或糖类、激素、或如上所述。
对于步骤(b)，将水溶性药物和/或其他生物活性剂以1-500mg/ml的水平溶解于水中。
在步骤(c)中混合的步骤(b)的溶液和步骤(a)的溶液的体积比可以是，例如3∶1到10∶1，例如在步骤(c)中水和二氯甲烷的体积比是9∶1到1∶1。可以用磁力搅拌机以800到1,000rpm混合5分钟到1小时。
步骤(d)的稳定剂是在步骤(a)的溶剂中不溶的化合物，其可以通过用水洗涤来除去，其在日光和人工光下是稳定的，在步骤(f)获得硬微球前其降低了水相和有机相之间的界面张力并限制了步骤(e)的微滴的塌陷。
一个优选的稳定剂是平均分子量10,000到30,000的85-90％水解的聚乙烯醇(PVA)，其在步骤(d)形成的溶液中的存在量是0.5到10％，例如0.5到5％w/v。PVA使用量小于0.5％w/v会导致微球凝固并随后形成不希望有的较大的凝聚物。
PVA的替代品包括Pluronic F68(环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物，其结构为HO(C2H4O)n(C3H6O)b(C2H4O)nH其中a是80，b是27，分子量是7680到9510，CAS登记号9003-11-6)、人血清白蛋白(HSA)、和氯酸钠。
在步骤(e)中混合到步骤(c)的乳剂中的步骤(d)的溶液的体积可以是，例如5∶1到1∶1。
当步骤(e)形成的乳剂暴露在空气中时，维持该乳剂在室温到45℃下进行搅拌，可以容易地实现步骤(f)的蒸发。由于在乳剂微滴表面上存在较多的稳定剂，一蒸发微球就会沉淀并变硬。
进行步骤(g)的回收，包括离心所收集的微球，用蒸馏水洗涤该微球以除去PVA或其他稳定剂，冷冻干燥，然后贮存直到使用。
现在，我们转向微球的表面变成水凝胶的情况。其制备方法包括，在步骤(a)的溶液例如0.05到0.5％w/w水平的双键官能化的多元醇酯中包含光敏引发剂，例如0.1(w/w的PGCLM)水平的2，2-二甲氧基2-苯基苯乙酮(DMPA)，然后将步骤(a)和步骤(b)形成的溶液混合以形成步骤(c)的乳剂，在步骤(e)中将步骤(d)形成的溶液和步骤(c)形成的乳剂混合，在进行步骤(e)时会导致双键官能团例如通过光致交联而交联，即导致乙烯键的断裂，通过施用辐射能例如通过室温下波长较长的UV灯(365nm，16瓦特)的照射并同时小心搅拌过夜而形成交联物。此后，如同微球表面没有形成水凝胶的情况，可以使用与其相同的硬微球形成和收集方法。
现在我们转向第三实施方案。在下文的操作实施例中的可注射微球其平均横向尺寸范围是约20μm到约55μm，微球负载的药物或其他生物活性剂的量是约1到约8％重量。在一个可替代的方案中，如上所述PGCLM微球的表面转变成水凝胶。在所有情况下，微球表面的双键和羧基都可以与药物或其他生物活性剂反应而共价结合。可以容易地达到约45％的负载效力(实际负载的药物(g)/理论负载(g)×100％)(在一种情况下得到的是46％)，可以容易地得到达到约8％的负载水平(实际负载的药物(g)/微球重量(g)×100％)，37℃下在50天的时间里在0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)中得到的累积释放高达约50％。
如上所述，第三实施方案的包括在微球表面形成水凝胶的可注射微球是生物可降解的。
在“一些或每个”的表述中，“一些”是指多于1个，但少于全部，“每个”就意味着是全部。
通过下面的操作实施例来说明本发明。
操作实施例所使用的聚合物是美国专利U.S.6,592,895所述的PGCL-Ma-3，其制备方法如美国专利U.S.6,592,895所述。
聚合物的制备方法如下简言之，羟基官能化的三臂聚(ε-己内酯)(PGCL)的合成包括，在多元醇存在下将ε-己内酯(CL)开环聚合来作为核，其中在silinizedPyrox压力反应管中CL与多元醇的进料摩尔比是20∶1，还包括辛酸亚锡催化剂(CL的0.1wt％)。在真空和用氩气再充满数次后，在真空中密封该聚合作用管，置于130℃的油浴中48小时。将得到的聚合物(PGCL)溶解于氯仿中，然后小心倾倒入过量石油醚中以沉淀产物。沉淀用蒸馏水洗涤4次，室温下在P2O5上干燥直至获得恒定重量。
合成双键官能化的三臂聚(ε-己内酯马来酸)(PGCLM)，包括在干燥N2环境下将PGCL和5倍当量羟基官能化的马来酸酐置于三颈烧瓶中，加热该烧瓶至130℃1天。然后冷却反应混合物至室温，溶解于氯仿中。将该氯仿溶液倾倒入过量石油醚中以沉淀PGCLM。在500mL蒸馏水中搅拌该粉末沉淀物4小时以除去全部的过量马来酸酐。过滤后，沉淀用蒸馏水洗涤4次，室温下在P2O5上真空干燥直至获得恒定重量。
用相同方法也可以合成线性高分子量的(聚(ε-己内酯)，Mn＝56.9kg/mol)，但不用多元醇或其他任何的醇作为引发剂，辛酸亚锡的量也减小到CL的0.05wt％。可以使用该高分子量PCL作为PGCL和PGCLM表征、微球制备和蛋白质包封的对照。
在另一种情况中，制备交联PGCLM(NPGCLM)，包括将0.1％(w/w)DMPA加入到反应混合物中以形成PGCLM，在形成PGCLM后用较长波长的UV灯(365nm，16瓦特)照射，以使得在双键上发生交联。
在另一种情况中，得到的是如Tarvainen，T.，等人，J.Control.Release，86(2-3)，213-222(2003)所述的2，2′-二(2-唑啉)连接的聚(ε-己内酯)(PCL-O)。
上述的PGCL，PGCLM，NPGCLM，PCL和PCL-O的生理化学性质如下表1所列
表1
a.用聚苯乙烯标准品通过GPC确定；b.结晶度＝(ΔHm，样品/ΔH°m，100％晶体)×100％；c.CL单体和多元醇的羟基的摩尔比是20/1；d.PGCL和5倍当量的马来酸酐作为进料摩尔比。
附图1显示的是PGCL和PGCLM的化学结构和NPGCLM的代表性结构。
制备不负载药物的PGCLM和NPGCLM微球对于不负载药物的微球，将PGCL-Ma-3溶解于二氯甲烷(4％，6％，8％w/v)中。通过混合和以900rpm搅拌30分钟，在50mL含水的1％(w/v)聚乙烯醇(PVA)(分子量12,000-23,000，87-89％水解)中将该溶液乳化。通过磁力搅拌器将所得到的溶液在室温下(22℃)搅拌过夜，以蒸发掉二氯甲烷。在22℃离心(800rpm 6小时)来收集样品，用蒸馏水至少洗涤4次除去PVA。在45℃真空下在Virtis冷冻干燥器中将样品冷冻干燥3天，得到微球产品，并将其贮存在真空干燥器中。
为制备具有交联表面网状(水凝胶)结构的微球，将含PGCLM的0.1％(w/w)水平的DMPA加入到PGCLM溶液中，其依次乳化形成水包油包水型乳剂。然后在室温下用较长波长的UV灯(365nm，16瓦特)照射该乳剂，以促使表面交联，在室温下小心搅拌过夜蒸发掉二氯甲烷。收集所得到的微球的方法与上一段相同。
FIGS.2A，2B和2C显示的分别是所得到PGCLM65微球、PGCLM81微球和PGCLM61微球的粒径分布。
对于药物负载，选择卵白蛋白(白蛋白，鸡蛋，V级)，即OVA作为负载的代表性药物。其在诱导抗体细胞介导的免疫应答中作为抗原，以及用作口服递送的疫苗。
可以通过水包油包水(w/o/w)乳剂技术来制备负载OVA的PGCLM和NPGCLM微球。
对于负载OVA的PGCLM微球，如下所示进行负载在强搅拌下(用磁力搅拌器以900rpm搅拌15分钟)将1mL OVA水溶液(包含40，80或170mg OVA)分散于10mL PGCLM溶液(在二氯甲烷中4％，6％或8％w/v)，以形成油包水型乳剂，其中OVA的水溶液是分散相，PGCLM是连续相。通过用磁力搅拌器以900rpm混合30分钟将所得到的w/o乳剂在50mL 1％PVA(Mn＝12,000-23,009，87-89％水解)溶液(w/v)中乳化，形成w/o/w型乳剂。在室温下(22℃)用磁力搅拌器(EYELA磁力搅拌器RC-2)将所得到的w/o/w型乳剂小心搅拌过夜，蒸发掉有机溶剂而留下负载OVA的硬微球，其不溶于含水的连续相。通过22℃离心(International Centrifuge，ClinicalModel，International Equipment Co.，Needham Hts，Mass 02194USA)收集微球，用蒸馏水至少洗涤4次以除去PVA乳化剂。然后在45℃真空下在Virtis冷冻干燥器中将样品冷冻干燥3天，得到微球产品，并在表征和使用前将其贮存在40℃的真空干燥器中。
在另一种情况中，使用相同的方法，除了在用OVA的水溶液形成w/o乳剂前向PGCLM的溶液中加入0.1％(w/w的PGCLM)的DMPA，其中将w/o乳剂与PVA水溶液混合，形成w/o/w乳剂，然后在室温下用较长波长的UV灯(365nm，16瓦特)照射，并小心搅拌过夜。然后，使用与上述相同的方法收集微球。结果得到了具有交联表面网状结构的微球，即NPGCLM，其负载有OVA。
负载OVA的PGCLM和NPGCLM微球的性质如下表2所示
表2
a.二氯甲烷(DCM)作为溶剂，PGCL Mn＝15.4kDa；PGCLM Mn＝13.3kDa；NPGCLM Mn＝13.3kDa；b.水作为溶剂；c.OVA负载(％)＝实际负载的OVA(g)/微球重量(g)×200％；d.负载效力＝实际负载的OVA(g)/进料的OVA(g)×100％。
在上表2和下文中，PGCLM41是指用4％w/v PGCLM聚合物和1％w/v PVA制成的微球，PGCLM61是指用6％w/v PGCLM聚合物和1％w/v PVA制成的PGCLM微球，PGCLM81是指用8％w/vPGCLM聚合物和1％w/v PVA制成的PGCLM微球。NPGCLM61是指用6％w/v PGCLM聚合物和1％w/v PVA制成的NPGCLM微球。
根据下列的方法来确定平均直径。首先将干燥的微球粉末样品悬浮于HPLC级水(5-10％vol.)中，然后进行轻度的声处理，得到均匀的混悬液。用激光散射法(Brinkman粒度分析器2010，BrinkmanInstruments，Inc.，Westbury，NY)进行粒径测定。
表2显示的是在DCM/H2O溶剂中，取决于PGCLM浓度的平均直径变化。在DCM的混合体积中，PGCLM浓度从4％w/v增加到8％w/v同时PVA浓度恒定(1％w/v)，会导致微球的平均粒径增加。交联的NPGCLM的平均直径小于未交联的NPGCLM。
表2中的负载效力表明了在聚合物浓度和负载药物之间存在的关系。PGCLM和NPGCL M微球的OVA负载效力范围是41％到45％(w/w)。相应的负载水平范围是4.1到7.6％(w/w)。表2表明，OVA和PVA浓度恒定时，增加聚合物的浓度会使负载效力稍微提高，尽管事实上平均直径更小，但光致交联情况改善了负载效力。
在一定的微球制剂中(保持聚合物浓度和其与PVA稳定剂的比例不变)，卵白蛋白(OVA)浓度对OVA负载效力的影响如下表3所示。
表3
a.二氯甲烷(DCM)作为溶剂，PGCLM Mn＝13.3kDa；b.水作为溶剂；c.OVA负载(％)＝实际负载的OVA(g)/微球重量(g)×100％；d.负载效力＝实际负载的OVA(g)/进料的OVA(g)×100％。
在上表3中，PGCLM61是指用6％w/v PGCLM聚合物和1％w/vPVA制成的微球。该数据显示，在水相中OVA浓度的增加(从10到40到85mg)导致了OVA负载效力从43％降低到28％，同时微球的平均直径则没有显著的变化。
在从6％到8％PGCLM浓度形成的微球中，PVA浓度(范围从0.5％w/v到5％w/v)对OVA负载效力的影响如下表4所示。
表4
a.二氯甲烷(DCM)作为溶剂，PGCLM Mn＝13.3kDa；b.水作为溶剂；c.OVA负载(％)＝实际负载的OVA(g)/微球重量(g)×100％；d.负载效力＝实际负载的OVA(g)/进料的OVA(g)×100％。
表4的PGCLM61和PGCLM81如表2所示。在表4和下文中，PGCLM605是指用6％(w/v)PGCLM聚合物和0.5％(w/v)PVA制成的微球；PGCLM65是指用6％(w/v)PGCLM聚合物和5％(w/v)PVA制成的微球；PGCLM805是指用8％(w/v)PGCLM聚合物和0.5％(w/v)PVA制成的微球；PGCLM85是指用8％(w/v)PGCLM聚合物和5％w/v PVA制成的微球。
在上表4中，该数据表明对于6％PGCLM和8％PGCLM，PVA稳定剂的浓度越低(0.5％)导致了OVA负载水平和负载效力越低，而PVA稳定剂的浓度越高(1％，5％)，负载水平和负载效力就越高，PVA浓度增加导致了微球的尺寸减小。
负载OVA的PGCLM微球的扫描电子显微术(SEM)表明，其是呈近球形的，非聚集的，平滑面的，非多孔状表面的微球。
当暴露于37℃pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中时微球的SEM像表明，随着时间的延长发展出了从平滑表面延伸到内部的小孔，而随着时间的延长相邻的孔会合并形成较大的孔。在相同的测定中，NPGCLM微球显示了粗糙表面，由于NPGCLM表面的水凝胶的溶胀性质，其具有更互联的和不规则的孔。
在PGCLM微球的表面存在的不饱和的官能化键(＞C＝C＜)可以通过反向散射电子影像(BSE)和X-射线元素分析光谱来确认。
37℃下在PBS中进行的确定OVA从PGCLM微球中的累积释放的体外实验表明，不论微球的形成情况如何，OVA释放的特征是，开始时突然释放，然后缓慢和逐渐地释放。结果在附图3A中显示。如附图3A所示，对于负载OVA的PGCLM微球，PGCLM41，PGCLM61，PGCLM81，和PGCLM85在第一天开始时的突然累积释放％分别是23，26，27，和28％。而在10天结束后，OVA相应的累积释放％是28，32，32，和35％。在此段时间后，OVA的释放是缓慢的。在50天结束后，OVA从PGCLM中的累积释放达到45-49％，其中PGCLM85具有最高的OVA释放％。观测到的释放曲线表明，较小粒径和较低负载效力的PGCLM微球显示了较快的突然释放和较高的总累积释放百分比。
比较PGCL61，PGCLM61和NPGCLM61的累积释放曲线。结果在附图3B中显示。PGCL61微球不同于PGCLM61，在PGCL61中没有马来酸单酯链末端；而PGCLM61和NPGCLM61也互不相同，其区别在于NPGCLM61微球是网状的(即，光致交联的)，而PGCLM61微球则不是。对于PGCL61，PGCLM61和NPGCLM61，OVA的累积释放分别是20，26，和16％。与非网状的PGCLM61微球相比，NPGCLM61微球的OVA突然释放降低了40％。因此，在微球中网状结构的存在降低了开始时突然释放的大小。在50天的研究期结束时，观测到的PGCL61，PGCLM61和NPGCLM61的OVA累积释放分别是43，47和40％。因此，OVA释放程度的排序是PGCLM61＞PGCL61＞NPGCLM61。
凝胶电泳数据表明，尽管组成和体外释放测定不同，但聚合物并不会使OVA断裂。释放的OVA显示了与新鲜OVA样品相同的分子量。
在该实验中，浓度低于0.5％w/v的PVA不能阻止微球的凝固和随后较大凝聚物形成，不能完全地形成PGCLM小于4％的微球，其中OVA的包封也不完全。
由于PGCLM较高的亲水性，与PGCL微球和NPGCLM微球相比，OVA从PGCLM微球中的释放较快，这是因为不具有交联网状结构的PCL臂的末端-COOH基限制了水合和蛋白质释放的水平。
OVA从微球中较长时间的持续释放足以表明药物是连续递送，药物浓度不会随时间而循环变化，因此可以在较长的时间里提供良好的药理学效力。
变更本发明的上述说明已经描述了一些可操作的和优选的实施方案。但不能认为本发明应当受到这样的限制，因为其变更和改变对于本领域的技术人员将是显而易见的，所有这些都在本发明的精神和范围内。
权利要求
1.一种形成负载药物/生物活性剂的可注射微球的方法，包括下列步骤(a)将聚酯的不饱和官能化的多元醇酯溶解于疏水性有机溶剂中，(b)将药物和/或其他的生物活性剂溶解于水中，(c)将在步骤(a)和步骤(b)中形成的溶液混合形成乳剂，其中在步骤(a)中形成的溶液构成连续相，在步骤(b)中形成的溶液构成分散相，(d)将稳定剂溶解于水中，(e)将在步骤(d)中形成的溶液与在步骤(c)中形成的乳剂混合，形成水包油包水型乳剂，其中步骤(d)的溶液构成连续相，在步骤(c)中形成的乳剂构成分散相，(f)从步骤(e)形成的水包油包水型乳剂中蒸发有机溶剂，以从聚酯的不饱和官能化的多元醇酯来形成硬化微球，其包封所述药物和/或其他生物活性剂，(g)回收负载药物/其他生物活性剂的微球。
2.权利要求1的方法，其中聚酯的不饱和官能化的多元醇酯通过如下方法制备在包含3到6个羟基的多元醇存在下，聚合ε-己内酯单体或者ε-己内酯单体和丙交酯单体或乙交酯单体的混合物，形成聚酯的多元醇酯，其中酰基在其末端包含游离的羟基，并与马来酸酐反应，从而将一些或每个游离的羟基转换成包含1-羧基-2羧基乙烯基的部分。
3.权利要求2的方法，其中聚酯的双键官能化的多元醇酯通过如下方法得到在甘油存在下，聚合ε-己内酯单体，形成聚酯的多元醇酯，其中酰基在其末端包含游离的羟基，并与马来酸酐反应，从而将一些或每个游离的羟基转换成包含1-羧基-2羧基乙烯基的部分。
4.权利要求3的方法，其中聚酯的双键官能化的多元醇酯的平均分子量，Mn，范围是1,000到50,000。
5.权利要求4的方法，其中步骤(a)的溶剂是在室温下溶解该聚酯的不饱和官能化的多元醇酯并且沸点范围是30-45℃的溶剂。
6.权利要求5的方法，其中该溶剂是二氯甲烷。
7.权利要求4的方法，其中稳定剂以稳定有效浓度溶解在水中，而在步骤(a)的溶剂中不溶，其可以通过用水洗涤来除去，而且在日光和人工光下是稳定的。
8.权利要求7的方法，其中稳定剂是平均分子量范围10,000到30,000并且85-90％水解的聚乙烯醇，其在步骤(d)形成的溶液中的存在量是0.5％到5％w/v。
9.权利要求4的方法，其中在步骤(c)中混合的步骤(b)中形成的溶液和步骤(a)中形成的溶液的体积比范围是3∶1到10∶1。
10.权利要求4的方法，其中在步骤(a)形成的溶液中包含光敏引发剂，照射在步骤(e)中形成的混合物获得光致交联，以在分散相颗粒上提供水凝胶表面。
11.一种形成负载药物/生物活性剂的可注射微球的方法，包括下列步骤(a)将聚酯的不饱和官能化的多元醇酯溶解于疏水性有机溶剂中，(b)将药物和/或其他的生物活性剂溶解于水中，(c)将在步骤(a)和步骤(b)中形成的溶液混合形成乳剂，其中在步骤(a)中形成的溶液构成连续相，在步骤(b)中形成的溶液构成分散相，(d)将稳定剂溶解于水中，(e)将在步骤(d)中形成的溶液与在步骤(c)中形成的乳剂混合，形成水包油包水型乳剂，其中步骤(d)的溶液构成连续相，在步骤(c)中形成的乳剂构成分散相，(f)从水包油包水型乳剂中蒸发有机溶剂，以形成硬化微球，其中药物/生物活性剂与聚酯的多元醇酯的不饱和官能团共价结合形成该微球，(g)回收负载药物/生物活性剂的硬化微球。
12.可注射微球，平均横向大小范围是10到60μm，由硬的聚酯的不饱和官能化的多元醇酯形成，负载1到10％微球重量的药物或其他生物活性剂，用于注射微球后的持续释放。
13.权利要求12的可注射微球，其中聚酯的不饱和官能化的多元醇酯通过如下方式制备在甘油存在下，聚合ε-己内酯单体，形成聚酯的多元醇酯，其中酰基在其末端包含游离的羟基，并与马来酸酐反应，从而将一些或每个游离的羟基转换成1-羧基-2羧基乙烯基。
14.权利要求13的可注射微球，其中微球的表面转化成了水凝胶。
15.权利要求12的可注射微球，其中药物/生物活性剂包封在微球中。
16.权利要求12的可注射微球，其中药物/生物活性剂与聚酯的多元醇酯的不饱和官能团共价结合形成该微球。
全文摘要
从聚酯的不饱和官能化的多元醇酯获得可注射的负载药物的微球，其方法包括，将不饱和官能化酯溶解在疏水性有机溶剂中，将药物和/或生物活性极溶解在水中，混合这两种溶液以形成油包水型乳剂，制备稳定剂的水溶液，混合油包水型乳剂和稳定剂的溶液以形成水包油包水型乳剂，并蒸发有机溶剂。
文档编号A61K9/127GK1976680SQ200580021507
公开日2007年6月6日 申请日期2005年6月16日 优先权日2004年6月28日
发明者朱知章, 吴大庆 申请人:康乃尔研究基金会有限公司