针对淀粉质-beta肽的抗体以及使用它的方法

专利名称：针对淀粉质-beta肽的抗体以及使用它的方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求美国临时申请60/592,494(提交于2004年7月30口)、60/653,197(提交于2005年2月14日)以及60/676,093(提交于2005年4月29日)的优先权；所有上述文献通过引用整体并入本文。
发明领域 本发明涉及淀粉质beta(amyloid-beta)肽的抗体。本发明还涉及这些抗体在治疗和/或预防疾病(例如Alzheimer’s症)的用途。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
不适用
背景技术：
Alzheimer’s症(AD)是退化性脑紊乱，其特征在于进行性记忆力不足、意识错乱、逐步的生理恶化以及最终死亡。全世界大约有一千五百万人受到Alzheimer’s症的影响，并且该数字预期会随着寿命增加而惊人增长。历史上，该疾病特征在于主要在联合皮质、边缘系统和基底神经节中发现的神经炎性斑块。这些斑块的主要成分是淀粉质beta肽(Aβ)，其是beta淀粉质前体蛋白(βAPP或APP)的切割产物。APP是I型跨膜糖蛋白，其含有大的异位(ectopic)N末端结构域、跨膜结构域以及小的胞质C末端尾。对21号染色体上单一APP基因的转录本的其它切割导致产生氨基酸数量不同的异体(isoform)。
Aβ看起来在Alzheimer’s症的神经病理学中有着重要作用。该疾病为人熟悉的形式已与APP和早老蛋白(presenilin)基因中的突变联系起来人熟悉的形式已与APP和早老蛋白(presenilin)基因中的突变联系起来(Tanzi et al..1996，Neurobiol.Dis.3159-168；Hardy，1996，Ann.Med.28255-258)。这些基因中的疾病相关突变导致产生Aβ的42个氨基酸形式，这是在淀粉质斑块(amyloid plaque)中发现的主要的形式。此外，用人的Aβ来免疫过量表达疾病相关APP突变体形式的APP转基因小鼠，减少了斑块负荷以及相关的病理(schenk et al.，1999，Nature 400173-177；WO 99/27944)，周质施予针对Aβ的抗体还减少了脑中的斑块负荷(Bardet al.，2000，Nature Medicine 6(8)916-919；WO 2004/032868；WO00/72880)。
已经报道，小胶质细胞和/或巨噬细胞的Fc介导噬菌作用对于体内斑块清除过程来说是重要的。Bard et al.，Proc.Natl.Acdd.Sci.USA 100，2023-2028(2003)。但是，还已经报道，通过免疫疗法体内清除淀粉质β涉及非Fc介导的机制。Bacskai et al.，J.Neurosci._227873-7878(2002)；Das et al.，JNeurosci.238532-8538(2003)。
因此，抗体疗法对于治疗和预防Alzheimer’s症提供了有前途的手段。但是，因为一小组病人的脑膜炎，用包括Aβ1-42的疫苗进行的人类临床试验推迟了。Orgogozo et al.，Neruology617-8(2003)；Ferrer et al.，BrainPathol. 1411-20(2004)。已经报道，用N末端特异性抗Aβ抗体进行被动免疫导致主要弥散的淀粉质显著减少，但在下述转基因小鼠中会诱导脑部微量出血频率的增加，所述小鼠展示出年龄相关的淀粉质斑块发展以及神经退化和脑部淀粉质血管病(CAA)，这类似于在人类AD脑中所观察到的。Pfeifer et al.，Science 2981379(2002)。已有暗示，用针对beta淀粉质的抗体进行被动免疫导致的APP转基因小鼠中脑部淀粉质血管病(CAA)相关的微量出血的恶化依赖于抗体对淀粉质beta肽沉积形式的识别。Racke et al.，J.Neurosci.25629-636(2005)。已提出，用针对淀粉质沉积物肽组分的抗体进行被动免疫(所述抗体缺少Fc区域)来降低炎症风险。WO 03/086310。人们仍需要具有改进的疗效和安全性质且适用于人类患者的、针对Aβ的抗体和其它免疫治疗试剂。
本申请中提到了多份公开文献(包括专利和专利申请)。这些公开文献的公开内容通过引用整体并入本文。


发明内容
部分I 本发明提供了治疗下述疾病的方法，所述疾病特征是蛋白在个体(subject)脑中的异常沉积。所述方法包括向所述个体施予有效量的药物组合物，所述组合物包含特异结合所述蛋白或蛋白沉积物的抗体，或编码所述抗体的多核苷酸，其中所述抗体具有受损的效应器功能(effectorfunction)。
本发明还提供了用于治疗和预防个体中Aβ淀粉质沉积物(例如，脑组织和脑部血管系统)相关的疾病的方法，所述疾病例如Alzheimer′s症、Down′s综合征、多发梗塞性痴呆、轻度认知障碍以及脑部淀粉质血管病。所述方法包括向所述个体施予有效量的药物组合物，所述组合物包含特异结合beta淀粉质肽或beta淀粉质肽聚集形式的抗体，或编码所述抗体的多核苷酸，其中，所述抗体具有受损的效应器功能。
本发明还提供了延缓个体中与下述疾病相关症状发展的方法，所述疾病与Aβ淀粉质沉积物相关，例如Alzheimer’s症，所述方法包括向所述个体施予有效剂量的药物组合物，所述组合物包含特异结合beta淀粉质肽或beta淀粉质肽聚集形式的抗体，或编码所述抗体的多核苷酸，其中，所述抗体具有受损的效应器功能。
本发明还提供了遏制个体中淀粉质斑块形成和/或淀粉质积累的方法，所述方法包括向所述个体施予有效剂量的药物组合物，所述组合物包含特异结合beta淀粉质肽或beta淀粉质肽聚集形式的抗体，或编码所述抗体的多核苷酸，其中，所述抗体具有受损的效应器功能。在一些实施方式中，淀粉质斑块在个体的脑(脑组织)中。在一些实施方式中，淀粉质斑块在脑部血管系统中。在一些实施方式中，淀粉质积累在循环系统中。
本发明还提供了减少个体中淀粉质斑块和/或淀粉质积累的方法，所述方法包括向所述个体施予有效剂量的药物组合物，所述组合物包含特异结合beta淀粉质肽或beta淀粉质肽聚集形式的抗体，或编码所述抗体的多核苷酸，其中，所述抗体具有受损的效应器功能。在一些实施方式中，淀粉质斑块在个体的脑(脑组织)中。在一些实施方式中，淀粉质斑块在脑部血管系统中。在一些实施方式中，淀粉质积累在循环系统中。
本发明还提供了去除或清除个体中淀粉质斑块和/或淀粉质积累的方法，所述方法包括向所述个体施予有效剂量的药物组合物，所述组合物包含特异结合beta淀粉质肽或beta淀粉质肽聚集形式的抗体，或编码所述抗体的多核苷酸，其中，所述抗体具有受损的效应器功能。在一些实施方式中，淀粉质斑块在个体的脑(脑组织)中。在一些实施方式中，淀粉质斑块在脑部血管系统中。在一些实施方式中，淀粉质积累在循环系统中。
本发明还提供了抑制Aβ肽在组织中积累的方法，所述方法包括将所述组织与特异结合beta淀粉质肽或beta淀粉质肽聚集形式的抗体相接触，其中，所述抗体具有受损的效应器功能。
本发明还提供了减少个体中Aβ肽(例如可溶、寡聚以及沉积形式)的方法，所述方法包括向所述个体施予有效量的药物组合物，所述组合物包含特异结合beta淀粉质肽或beta淀粉质肽聚集形式的抗体，或编码所述抗体的多核苷酸，其中，所述抗体具有受损的效应器功能。在一些实施方式中，在脑中抑制和/或减少Aβ肽的积累。在一些实施方式中，抑制和/或减少Aβ肽的毒性作用。因此，本发明的方法可被用于治疗存在有或怀疑有Aβ肽积累的任何疾病，例如Alzheimer’s症、Down’s综合征、Parkinson’s症以及多发梗塞性痴呆。
本发明还提供了在个体中提高认知或逆转与下述疾病相关的认知衰退的方法，所述疾病是与Aβ的淀粉质沉积物相关的，例如Alzheimer’s症，所述方法包括向所述个体施予有效剂量的药物组合物，所述组合物包含特异结合beta淀粉质肽或beta淀粉质肽聚集形式的抗体，或编码所述抗体的多核苷酸，其中，所述抗体具有受损的效应器功能。
本发明还提供了用于治疗或预防与Aβ的淀粉质沉积物相关的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施予有效剂量的药物组合物，所述组合物包含特异结合beta淀粉质肽或beta淀粉质肽聚集形式的抗体，其中所述抗体包含与天然存在的Fc区域有变化的Fc区域，其中，所述变化导致受损的效应器功能。在一些实施方式中，施予所述抗体较之施予没有所述变化的抗体而言，能导致更少的脑部微量出血。
特异结合Aβ肽或Aβ肽聚集形式、并包含具有受损的效应器功能的重链恒定区域的多肽还可用于本文所述的任何方法。在一些实施方式中，所述多肽包含从抗体9TL或表3所示其变体获得的序列(例如，一种或多种CDR)。在一些实施方式中，所述多肽包含从抗体6G获得的序列(例如，一种或多种CDR)。
用于本发明方法的抗体和多肽能特异结合Aβ肽或Aβ肽的聚集形式，但具有受损的效应器功能。在一些实施方式中，抗体或多肽不是F(ab’)2片段。在一些实施方式中，抗体或多肽不是Fab片段。在一些实施方式中，抗体或多肽不是单链抗体scFv。
在一些实施方式中，抗体或多肽包含具有受损效应器功能的重链恒定区域，其中，所述重链恒定区包含Fc区域。在一些实施方式中，Fc区域中的N-糖基化被去除。在一些实施方式中，Fc区域在N-糖基化识别序列中包含突变，由此抗体或多肽的Fc区域并非N-糖基化的。在一些实施方式中，Fc区域是PEG化的。在一些实施方式中，抗体或多肽的重链恒定区域是包含下述突变的人重链IgG2a恒定区域A330P331至S330S331(参考野生型IgG2a序列的氨基酸编号)。在一些实施方式中，抗体或多肽包含含有下述突变的IgG4恒定区域E233F234L235至P233V234A235。
在一些实施方式中，抗体或多肽能特异结合Aβ肽1-16位残基中的抗原决定簇(epitope)。在一些实施方式中，抗体或多肽能特异结合Aβ肽的N末端。在一些实施方式中，抗体或多肽能特异结合Aβ肽16-28位残基中的抗原决定簇。在一些实施方式中，抗体能特异结合Aβ肽C末端侧的抗原决定簇，例如，从25位氨基酸或更后面起始的抗原决定簇。抗体可特异结合C末端被截短的Aβ肽的游离C末端氨基酸，例如Aβ1-37、1-38、1-39、140、1-41、1-42、1-43。在一些实施方式中，抗体或多肽能特异结合Aβ1-40肽28-40位残基中的抗原决定簇。在一些实施方式中，抗体或多肽能特异结合Aβ1-42肽28-42位残基中的抗原决定簇。在一些实施方式中，抗体或多肽能特异结合Aβ1-43肽28-43位残基中的抗原决定簇。在一些实施方式中，抗体或多肽能特异结合Aβ肽，而不结合全长淀粉质前体蛋白(APP)。在一些实施方式中，抗体或多肽能特异结合Aβ的聚集形式，而不结合其可溶形式。在一些实施方式中，抗体或多肽能特异结合Aβ的可溶形式，而不结合其聚集形式。在一些实施方式中，抗体或多肽能特异结合Aβ的聚集形式和可溶形式。
在一些实施方式中，抗体或多肽能特异结合Aβ1-40的C末端肽33-40。在一些实施方式中，抗体或多肽能特异结合Aβ1-40上包括35-40位氨基酸的抗原决定簇。在一些实施方式中，抗体或多肽能特异结合Aβ1-40上包括36-40位氨基酸的抗原决定簇。在一些实施方式中，抗体或多肽能特异结合Aβ1-40上包括第39和/或40位氨基酸的抗原决定簇。在一些实施方式中，抗体或多肽能特异结合Aβ1-40但不能特异结合Aβ1-42和/或Aβ1-43。在一些实施方式中，抗体包含抗体9TL或本文所述从9TL获得的抗体的可变区域。在一些实施方式中，抗体或多肽竞争性抑制抗体9TL和/或从9TL获得的抗体或多肽与Aβ1-40的结合。
在一些实施方式中，抗体或多肽以高于其与Aβ1-42和Aβ1-43结合的亲和性结合Aβ1-40。在一些实施方式中，抗体结合Aβ1-40上包括25-34和40位氨基酸的抗原决定簇。在一些实施方式中，抗体包含抗体6G或本文所述从6G获得的抗体的可变区域。在一些实施方式中，抗体或多肽竞争性抑制抗体6G和/或从6G获得的抗体或多肽与Aβ的结合。
特异结合Aβ肽且具有受损的效应器功能的抗体或多肽的施予可通过本领域已知的任何方法来进行，包括静脉内、皮下、通过吸入、动脉内、肌内、心脏内、心室内、非肠道、鞘内(intrathecally)和腹膜内施予。施予可以是全身性的(例如静脉内)或局部的。一般而言，这也适用于本发明的多肽和多核苷酸。
本发明还提供了药物组合物，其中包含有效量的、能与Aβ肽或Aβ肽的聚集形式特异结合并具有受损的效应器功能的任何抗体或多肽，或编码所述抗体或多肽的多核苷酸以及药学上可接受的赋形剂。
本发明还提供了包含下述组合物中任何一种或多种的试剂盒和组合物，所述组合物包含有效量的、能与Aβ肽或Aβ肽的聚集形式特异结合并具有受损的效应器功能的任何抗体或多肽，或编码所述抗体或多肽的多核苷酸。这些试剂盒通常被合适地包装，随同合适的说明书一起提供，它们可用于本文所述的任何方法。
本发明还提供了生产治疗用人化抗体的方法，所述抗体用于治疗与人类个体大脑中Aβ肽的淀粉质沉积物相关的疾病，所述方法包括，选出特异结合Aβ肽的第一种人化抗体，改变所述抗体的Fc区域，以提供相对第一种人化抗体而言具有受损的效应器功能的治疗用人化抗体。
部分II 本文公开的发明涉及结合Aβ1-40肽C末端的抗体(表4所示的SEQ IDNO15)。因此，在一个方面，本发明是具有ATCC编号PTA-6124和PTA-6125的表达载体产生的抗体9TL(可与术语“9TL”互换使用)。9TL的重链和轻链可变区域的氨基酸序列示于图1中。抗体9TL的互补性决定区域(CDR)部分(包括Chothia和Kabat CDR)也示于图1中。应当理解，提到9TL整个区域或任何部分，其都包括具有ATCC编号PTA-6124和PTA-6125的表达载体产生的序列和/或图1所示的序列。
在另一个方面，本发明还提供了具有表3所示氨基酸序列的9TL抗体变体。
在另一个方面，本发明是包含抗体9TL或表3所示其变体的片段或区域的抗体。在一种实施方式中，所述片段是抗体9TL的轻链。在另一种实施方式中，所述片段是抗体9TL的重链。在又一种实施方式中，所属片段含有来自抗体9TL轻链和/或重链的一种或多种可变区域。在又一种实施方式中，所述片段含有来自图1所示重链和/或轻链的一种或多种可变区域。在又一种实施方式中，所述片段含有来自抗体9TL的轻链和/或重链的一种或多种CDR。
在另一个方面，本发明提供了包含下述中任何一种或多种的多肽(其可以是也可以不是抗体)a)抗体9TL或表3所示其变体的一种或多种CDR；b)来自抗体9TL或表3所示其变体的重链的CDR H3；c)来自抗体9TL或表3所示其变体的轻链的CDR L3；d)来自抗体9TL或表3所示其变体的轻链的三种CDR；e)来自抗体9TL或表3所示其变体的重链的三种CDR；f)来自抗体9TL或表3所示其变体重链的三种CDR和轻链的三种CDR。本发明还提供了包含下述中任何一种或多种的多肽(其可以是也可以不是抗体)a)从抗体9TL或表3所示其变体获得的一种或多种(一种、两种、三种、四种、五种或六种)·CDR(s)；b)从抗体9TL重链的CDR H3获得的CDR；和/或c)从抗体9TL轻链的CDR L3获得的CDR。在一些实施方式中，CDR是如图1所示的CDR。在一些实施方式中，从抗体9TL或表3所示其变体获得的一种或多种CDR与9TL或其变体的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种CDR相比，至少大约85％、至少大约86％、至少大约87％、至少大约88％、至少大约89％、至少大约90％、至少大约91％、至少大约92％、至少大约93％、至少大约94％、至少大约95％、至少大约96％、至少大约97％、至少大约98％、或者至少大约99％相同。
在一些实施方式中，CDR是Kabat CDR。在其它实施方式中，CDR是Chothia CDR。在其它实施方式中，CDR是Kabat和Chothia CDR的组合(也称为“组合CDR”或“延伸的CDR”)。换句话说，对于含有超过一种CDR的任何给定实施方式而言，CDR可以是Kabat、Chothia和/或组合CDR中的任何种类。
在一些实施方式中，多肽(例如抗体)包含SEQ ID NO5示出的氨基酸序列，其中，L1是L、V或I；其中，Y2是Y或W；其中S3是S、T或G；其中，L4是L、R、A、V、S、T、Q或E；其中，V6是V、I、T、P、C、Q、S、N或F；以及其中Y7是Y、H、F、W、S、I、V或A。在一些实施方式中，氨基酸序列是重链可变区域中的CDR3。在本文中为方便而言，在这里的上下文中的“是”或提到氨基酸时的“是”表示对参照SEQ ID中位置给定的位置的氨基酸的选择。例如，“L1是L、V或I”表示在SEQ ID NO5的第1位的氨基酸L可被V或I取代。
在一些实施方式中，多肽(例如抗体)包含SEQ ID NO6所示的氨基酸序列，其中Y8是Y、A或H；以及其中A11是A或S；以及其中，K12是K或A。在一些实施方式中，氨基酸序列是轻链可变区域中的CDR1。
在一些实施方式中，多肽(例如抗体)包含SEQID NO8所示的氨基酸序列，其中L1是L、M、N、C、F、V、K、S、Q、G、S；其中，G3是G、S或T；其中，T4是T或S；其中，H5是H或L；其中，Y6是Y、P、A、W、Q、M、S或E；其中，V8是V、L、K、H、T、A、E或M；以及其中，L9是L、I、T、S或V。在一些实施方式中，氨基酸序列是轻链可变区域中的CDR3。
在一些实施方式中，多肽(例如抗体)包含重链可变区域，其中包含(a)SEQ ID NO3示出的CDR1区域；(b)SEQ ID NO4示出的CDR2区域；以及(c)SEQ ID NO5示出的CDR3区域；其中，L1是L、V或I；其中Y2是Y或W、其中S3是S、T或G；其中L4是L、R、A、V、S、T、Q或E；其中V6是V、I、T、P、C、Q、S、N或F；以及其中Y7是Y、H、F、W、S、I、V或A。
在一些实施方式中，多肽(例如抗体)包含轻链可变区域，其中包含(a)SEQ ID NO6示出的CDR1区域；其中Y8是Y、A或H；以及其中A11是A或S；以及其中K12是K或A；(b)SEQ ID NO7示出的CDR2区域；以及(c)SEQ ID NO8示出的CDR3区域；其中L1是L、M、N、C、F、V、K、S、Q、G、S；其中，G3是G、S或T；其中，T4是T或S；其中，H5是H或L；其中，Y6是Y、P、A、W、Q、M、S或E；其中，V8是V、L、K、H、T、A、E或M；以及其中，L9是L、I、T、S或V。
在一些实施方式中，本发明的抗体是人抗体。在其它实施方式中，本发明的抗体是人化抗体。在一些实施方式中，抗体是单克隆的。在一些实施方式中，抗体(或多肽)是经分离的。在一些实施方式中，抗体(或多肽)是实质上纯的。
抗体的重链恒定区域可以来自任何类型的恒定区域，例如IgG、IgM、IgD、IgA和IgE；以及任何异种类型(isotype)，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
在一些实施方式中，抗体包含经修饰的恒定区域，例如，免疫惰性的恒定区域(其包括部分免疫惰性，可与术语“具有受损的效应器功能”互换使用)，例如，不能诱发补体介导的裂解，不激发依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)，或者不激活小胶质细胞。在一些实施方式中，按照Eur.J.Immunol.(1999)292613-2624、PCT申请PCT/GB99/01441、和/或UK专利申请9809951.8所述对恒定区域进行修饰。在其它实施方式中，抗体包含人重链IgG2a恒定区域，其中包含下述突变A330P331至S330S331(氨基酸编号参照野生型IgG2a序列)。Eur.J.Immunol.(1999)292613-2624。在一些实施方式中，抗体包含IgG4的恒定区域，其中包含下述突变E233F234L235至P233V234A235。在还一种实施方式中，针对N连接的糖基化对恒定区域脱糖基化(aglycosylated)。在一些实施方式中，通过对寡糖附着残基(例如Asn297)和/或侧翼残基(是恒定区域中N-糖基化识别序列的一部分)进行突变，针对N连接的糖基化使恒定区域脱糖基化。在一些实施方式中，针对N连接的糖基化对恒定区域脱糖基化。可以通过酶促或者通过在糖基化缺陷型宿主细胞中表达，来针对N-连接的糖基化对恒定区域脱糖基化。
在另一个方面，本发明提供了一种多核苷酸(可以是经分离的)，其包含编码抗体9TL或表3所示其变体的片段或区域的多核苷酸。在一种实施方式中，所述片段是抗体9TL的轻链。在另一种实施方式中，所述片段是抗体9TL的重链。在又一种实施方式中，所述片段含有来自抗体9TL轻链和/或重链的一种或多种可变区域。在又一种实施方式中，所述片段含有来自抗体9TL轻链和/或重链的一种或多种(即，一种、两种、三种、四种、五种、六种)互补性决定区域(CDR)。
在另一个方面，本发明是一种多核苷酸(可以是经分离的)，其包含编码抗体9TL或表3所示其变体的多核苷酸。在一些实施方式中，多核苷酸包含SEQ ID NO9和SEQ ID NO10中所示的多核苷酸任一或两者。
在另一个方面，本发明提供了编码本文所述的任何抗体(包括抗体片段)或多肽的多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供了包含本文所述的任何多核苷酸的载体(包括表达载体和克隆载体)和宿主细胞。在一些实施方式中，载体是具有ATCC号PTA-6124的pDb.9TL.hFc2a。在其它实施方式中，载体是具有ATCC号PTA-6125的pEb.9TL.hK。
在另一个方面，本发明是一种宿主细胞，其中包含编码本文所述任何抗体的多核苷酸。
在另一个方面，本发明是与抗体9TL或表3所示其变体结合的Aβ1-40复合体。
在另一个方面，本发明是与本文所述任何抗体或多肽结合的Aβ1-40复合体。
在另一个方面，本发明是一种药物组合物，其中包含有效量的本文所述的任何多肽(包括抗体，例如包含抗体9TL一种或多种CDR的抗体)或多核苷酸，以及药学上可接受的赋形剂。
在另一个方面，本发明是产生抗体9TL的方法，所述方法包括在允许生产抗体9TL的条件下培养宿主细胞或其后代，其中，所述宿主细胞包含编码抗体9TL的表达载体；以及，在一些实施方式中，纯化抗体9TL。在一些实施方式中，表达载体包含SEQ ID NO9和SEQ ID NO10中所示的多核苷酸之一或两者。
在另一个方面，本发明提供了生产本文所述任何抗体或多肽的方法，所述方法通过在合适的细胞中表达一种或多种编码抗体(其可以作为轻链或重链单独表达，或者从一种载体表达轻链及重链)或多肽的多核苷酸来进行，通常接着回收和/或分离目标抗体或多肽。
本发明还提供了一种方法，用于预防、治疗、抑制或延缓Alzheimer’s症和与改变的Aβ或βAPP表达或Aβ肽的积累相关的其它疾病的发展，所述疾病例如Down’s综合征、Parkinson’s症、多发梗塞性痴呆、轻度认知障碍、脑部淀粉质血管病和AIDS。所述方法包括向个体施予有效剂量的药物组合物，所述组合物包含本发明的抗体、多肽或多核苷酸。
本发明还提供了一种方法，用于延缓个体中与Alzheimer’s症或Aβ肽积累相关的其它疾病相关症状发展的方法，所述方法包括向所述个体施予有效剂量的药物组合物，所述组合物包含本发明的抗体、多肽或多核苷酸。
本发明还提供了一种方法，用于抑制个体中淀粉质斑块形成和/或淀粉质积累，所述方法包括向所述个体施予有效剂量的药物组合物，所述组合物包含本发明的抗体、多肽或多核苷酸。在一些实施方式中，淀粉质斑块在个体的脑(脑组织)中。在一些实施方式中，淀粉质斑块在脑部血管系统中。在一些实施方式中，淀粉质积累在循环系统中。
本发明还提供了一种方法，用于减少个体中淀粉质斑块和/或淀粉质积累，所述方法包括向所述个体施予有效剂量的药物组合物，所述组合物包含本发明的抗体、多肽或多核苷酸。在一些实施方式中，淀粉质斑块在个体的脑(脑组织)中。在一些实施方式中，淀粉质斑块在脑部血管系统中。在一些实施方式中，淀粉质积累在循环系统中。
本发明还提供了一种方法，用于去除或清除个体中的淀粉质斑块和/或淀粉质积累，所述方法包括向所述个体施予有效剂量的药物组合物，所述组合物包含本发明的抗体、多肽或多核苷酸。在一些实施方式中，淀粉质斑块在个体的脑(脑组织)中。在一些实施方式中，淀粉质斑块在脑部血管系统中。在一些实施方式中，淀粉质积累在循环系统中。
此外，本发明提供了一种方法，用于抑制Aβ肽在组织中的积累，所述方法包括将所述组织与本发明的抗体或多肽接触。
本发明还提供了一种方法，用于减少个体脑中的Aβ肽(例如可溶、寡聚和沉积形式的)，所述方法包括向所述个体施予有效量的本发明抗体或多肽。在一些实施方式中，在脑中抑制和/或减少Aβ肽的积累。在一些实施方式中，抑制和/或减少Aβ肽的毒性作用。因此，本发明的方法可被用于治疗存在有或怀疑有Aβ肽积累的任何疾病，例如Alzheimer’s症、Down’s综合征、Parkinson’s症、多发梗塞性痴呆、轻度认知障碍和脑部淀粉质血管病。
本发明还提供了提高认知或改善与下述疾病相关的认知衰退的方法，所述疾病是与个体脑中Aβ的淀粉质沉积物相关的，例如Alzheimer’s症，所述方法包括向所述个体施予有效剂量的药物组合物，所述组合物包含包含本发明的抗体、多肽或多核苷酸。
本文所述的任何抗体、多肽或多核苷酸可用于本发明的方法。在一些实施方式中，抗体是抗体9TL。
本发明的抗体和多肽还可用于检测、诊断和监测Alzheimer’s症以及与改变的Aβ或βAPP表达相关的其它疾病，例如，Down’s综合征和AIDs。该方法包括将怀疑具有改变的Aβ或βAPP表达的患者的标本与本发明的抗体接触，测定Aβ或βAPP的水平是否不同于对照或比较用标本的水平。在一些实施方式中，在施予抗Aβ抗体之前和之后都测量Aβ血清水平；评估Aβ的血清水平的增加。
施予本发明的任何抗体或多肽可通过本领域已知的任何方法来进行，包括静脉内、皮下、通过吸入、动脉内、肌内、心脏内、心室内、非肠道、鞘内(intrathecally)和腹膜内施予。施予可以是全身性的(例如静脉内)或局部的。一般而言，这还适用于本发明的多肽和多核苷酸。
在另一个方面，本发明还提供了包含本文所述的组合物中任何一种或多种的试剂盒和组合物，这些试剂盒通常被合适地包装，随同合适的说明书一起提供，它们可用于本文所述的任何方法。



图1展示了9TL抗体重链可变区域(SEQ ID NO1)和轻链可变区域(SEQ ID NO2)的氨基酸序列。Kabat CDR以粗体表示，ChothiaCDR以下划线表示。重链和轻链可变区域的氨基酸残基按顺序编号。
图2展示了通过肽竞争做出的抗体9TL的抗原决定簇图谱。Aβ1-40肽被固定到SA芯片上。单克隆抗体2289和9TL Fab片段(每种50nM)每种与10μM的多种肽(Aβ的28-40、1-40、1-28、28-42、22-35、1-16、1-43、33-40、1-38或17-40位氨基酸)或者在不加入肽的情况下预先温育1小时，然后流注到芯片上。测量抗体Fab片段与固定的Aβ1-40肽的结合。
图3展示了通过肽竞争做出的抗体2H6的抗原决定簇图谱。Aβ1-40肽被固定到SA芯片上。单克隆抗体2289、2286或2H6(每种100nM)每种与16μM的多种肽(Aβ的1-16、1-28、1-38、1-40、1-42、1-43、17-40、17-42、22-35、25-35或33-40位氨基酸)或者在不加入肽的情况下预先温育1小时，然后流注到芯片上。测量抗体与固定的Aβ1-40肽的结合。
图4展示了抗体2H6、2286和2289与不同Aβ肽C末端变体的结合。
GST-Aβ变体(M35A、V36A、G37A、G38A、V39A或V40A)或GST-Aβ肽1-39、1-41、1-40、1-42被固定到ELISA板上。单克隆抗体2286、2H6或2289(每种mAb 0.3nM)与每种被固定的肽一起温育，通过与生物素化的抗小鼠IgG(H+L)进一步温育以及接着通过链亲合素-HRP来检测它们的结合。
图5展示了用2H6和去糖基化2H6进行16周的抗体处理之后，APP转基因小鼠的空间认知缺陷被逆转。以两天版本的放射臂水迷宫来对小鼠进行测试。Y轴代表2天试验期发生错误的平均数目。组号(blocknumber)1-5代表第1天的测试；组号6-10代表第2天的测试。“*”表示与抗AMN抗体处理的小鼠(A-AMN)相比较，对于2H6(A-2H6)和去糖基化的2H6(A-De-2H6)处理的小鼠而言，p＜0.05。“**”表示与抗AMN抗体处理的小鼠(A-AMN)相比较，对于2H6(A-2H6)和去糖基化的2H6(A-De-2H6)处理的小鼠而言，p＜0.01。
图6A和6B展示了用2H6、抗AMN(称作AMN)以及去糖基化2H6(称为D-2H6)抗体进行16周抗体处理之后海马体(图6B)和前皮质(图6A)中实质Congo红染色的淀粉质beta肽的降低。图6A和6B中的Y轴代表Congo红染色阳性的平均百分比面积。图6A和6B中的X轴代表施予的抗体的类型。
图7A和7B展示了用2H6、抗AMN(称作AMN)以及去糖基化2H6(称为D-2H6)抗体进行16周抗体处理之后海马体(图7A)和前皮质(图7B)中血管Congo红染色的淀粉质beta肽的增加。图7A和7B中的Y轴代表Congo红染色阳性的平均百分比面积。图7A和7B中的X轴代表施予的抗体的类型。
图8展示了用2H6、抗AMN(称作AMN)以及去糖基化2H6(称为D-2H6)抗体进行16周抗体处理之后Prussian蓝阳性情况的数量。Y轴代表每部分的阳性情况。X轴代表施予的抗体的种类。
图9展示了在APP Tg2576小鼠中施予2H6、抗AMN(称作AMN)以及去糖基化2H6(称为D-2H6)抗体之后，以及在野生型(WT)小鼠中施予抗AMN抗体和抗体2H6之后Aβ肽的血清水平。
图10展示了颅内施予2H6抗体(A)或去糖基化2H6抗体(B)之后小鼠海马体中CD45的免疫染色。靠下的图展示了颅内施予对照抗体、2H6抗体或去糖基化2H6抗体之后，前皮质和海马体中注射侧与未注射侧的CD45阳性染色平均面积之比。“*”表示较之对照抗体，P＜0.01。
图11展示了颅内施予2H6抗体(A)或去糖基化2H6抗体(B)之后小鼠海马体中Fcγ受体的免疫染色。靠下的图展示了颅内施予对照抗体、2H6抗体或去糖基化2H6抗体之后，前皮质和海马体中注射侧与未注射侧的Fcγ受体阳性染色平均面积之比。“**”表示较之对照抗体，P＜0.01。
图12展示了颅内施予2H6抗体(A)或去糖基化2H6抗体(B)之后小鼠海马体中Aβ肽的免疫染色。靠下的图展示了颅内施予对照抗体、2H6抗体或去糖基化2H6抗体之后，前皮质和海马体中注射侧与未注射侧的Aβ肽阳性染色平均面积之比。“**”表示较之对照抗体，P＜0.01。“*”表示较之对照抗体，P＜0.05。
图13显示了颅内施予2H6抗体(A)或去糖基化2H6抗体(B)之后小鼠海马体中的硫代黄素-S。靠下的图展示了颅内施予对照抗体、、2H6抗体或去糖基化2H6抗体之后，前皮质和海马体中注射侧与未注射侧的硫代黄素-S阳性染色所占平均面积之比。“*”表示较之对照抗体，P＜0.05。
图14展示了通过ELISA做出的抗体2294和6G的抗原决定簇图谱。多种Aβ肽被固定在ELISA板上。抗体与多种被固定的肽一起温育1小时。使用山羊抗人kappa HRP桥联的二抗来测量与被固定的Aβ肽结合的抗体6G。使用与重链和轻链结合且是HRP桥联二抗的山羊抗小鼠抗体来测量与被固定的Aβ肽结合的抗体2294。“NB”表示未检测到结合。“2294”和“6G”下，列中的数字代表450nm处的吸光率。
发明详述 本文公开的本发明提供了能与Aβ1-40的C末端结合的抗体和多肽。这些抚体或多肽从9TL或表3所示其变体获得。本发明还提供了制造和使用这些抗体的方法。在一些实施方式中，本发明提供了抗体9TL以及制造和使用该抗体的方法。本发明还提供了能结合Aβ1-40的9TL多肽(包括抗体)以及编码9TL抗体和/或多肽的多核苷酸。
本文公开的本发明提供了预防和/或治疗个体中Aβ相关疾病的方法，所述疾病例如Alzheimer’s症、Down’s综合征、Parkinson’s症、多发梗塞性痴呆、轻度认知障碍、脑部淀粉质血管病、血管中Aβ肽沉积物导致的血管紊乱(例如中风和HCHWAD)，所述方法通过施予治疗有效量的抗体9TL或从9TL获得的抗体或多肽来进行。
本发明还提供了预防和/或治疗个体中β淀粉质沉积物相关疾病的方法，所述疾病例如Alzheimer’s症、Down’s综合征、Parkinson’s症、多发梗塞性痴呆、轻度认知障碍和脑部淀粉质血管病，所述方法通过向所述个体施予有效量的药物组合物来进行，所述组合物包含特异结合β淀粉质肽或Aβ肽的聚集形式的抗体或多肽，或编码所述抗体或多肽的多核苷酸，其中，所述抗体或多肽具有受损的效应器功能。
普通技术 如无其它指明，对本发明的实践将使用本领域技术人员已知的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学传统技术来进行。此类技术在文献中有充分解释，例如Molecular CloningALaboratory Manual，second edition(Sambrook et al.，1989)Cold Spring HarborPress；Oligonucleotide Synthesis(MJ.Gait，ed.，1984)；Methods in MolecularBiology，Humana Press；Cell BiologyA Laboratory Notebook(J.E.Cellis，ed.，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，ed.，1987)；Introduction to Cell and Tissue.Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and Tissue CultureLaboratory Procedures(A.Doyle，J.B.Griffiths，and D.G.Newell，eds.，1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods inEnzymology(Academic Press，Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M. Weir and CC.Blackwell，eds.)；Gene Transfer Vectors for MammalianCells(J.M.Miller and M.P.Calos，eds.，1987)；Current Protocols in MolecularBiology(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987)；PCRThe Polymerase ChainReaction，(Mullis et al.，eds.，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.，eds.，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley andSons，1999)；Immunobiology(CA.Janeway and P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodiesa practical appproach(D.Catty.，ed.，IRL Press，1988-1989)；Monoclonal antibodiesapractical approach(P.Shepherd and C.Dean，eds.，Oxford University Press，2000)；Using antibodiesa laboratorymanual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra，eds.，Harwood Academic Publishers，1995)。
“抗体”是免疫球蛋白分子，其能通过至少一处抗原识别位点(位于免疫球蛋白分子的可变区域)与目标(例如，碳水化合物、多核苷酸、脂类、多肽等)特异结合。该术语在本文中使用时不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，还包括其片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白以及免疫球蛋白的包含抗原识别位点的任何其它经修饰构型。抗体包括任何组的抗体，例如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体无需是特定组的。取决于其重链恒定结构域的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可被分为不同的组别。免疫球蛋白有五个主要的组IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中数种可被进一步分为亚组(异种类型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应免疫球蛋白不同组别的重链恒定区域分别被称为alpha、delta、epsilon、gamma和mu。不同组别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。
本文中使用的“单克隆抗体”指从一群实质上同类的抗体获得的抗体，即，该群包含的个体抗体是相同的，只除了可能天然存在的突变，所述突变可能少量存在。单克隆抗体是高特异性的，针对单一抗原位点。此外，与多克隆抗体制剂(其典型包括针对不同决定子(抗原决定簇)的不同抗体)相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。修饰语“单克隆”表示从实质上同类的抗体群获得的抗体的特征，这并不将被解释为需要通过任何特殊方法来生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过杂交瘤方法来制造，该方法首先描述由Kohler and Milstein，1975，Nature，256495所描述，或者可以通过重组DNA方法来制造，例如美国专利4,816,567所述的方法。还可使用例如McCafferty et al.，1990，Nature，348552-554所述的技术，从产生的噬菌体文库分离出单克隆抗体。
本文中使用“人化”抗体指非人(例如，鼠的)抗体的下述形式，，所述形式是特异的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其它抗原结合亚序列)，其中含有从非人免疫球蛋白获得的最小程度的序列。就绝大部分而言，人化抗体是下述人免疫球蛋白(受体抗体)，其中，来自该受体的互补性决定区域(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(例如，小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基代替，所述非人物种的CDR具有想要的特异性、亲和性和能力。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区域(FR)残基被相应的非人残基所替换。此外，人化抗体可包含在受体抗体和输入的CDR或框架序列中都找不到的残基，但这些残基被包括进来以进一步提升和优化抗体性能。通常，人化抗体将包含实质上全部的至少一种以及通常地两种可变区域，其中，全部或实质上全部的CDR区域对应于非人免疫球蛋白的那些，并且，全部或实质上全部FR区域是人免疫球蛋白共有序列的那些。最优地，人化抗体还包含免疫球蛋白恒定区域或结构域(Fc)的至少一部分，典型地，人免疫球蛋白的一部分。抗体可具有按照WO 99/58572所述修饰的Fc区域。人化抗体的其它形式具有较之原始抗体有所改变的一种或多种CDR(一种、两种、三种、四种、五种、六种)，其还可被命名为从来自原始抗体的一种或多种CDR“获得的”一种或多种CDR。
本文中使用的“人抗体”指下述抗体，其具有对应于人产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列，和/或是使用本领域已知或本文公开的制造人抗体的任何技术生产的。人抗体的定义包括下述抗体，所述抗体包含至少一种人重链多肽或至少一种人轻链多肽。一个此类例子是包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生产。在一种实施方式中，人抗体是从噬菌体文库选出的，其中，该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan et al.，1996，Nature Biotechnology，14309-314；Sheets et al.，1998，PNAS，(USA)956157-6162；Hoogenboom and Winter，1991，J.MoI.Biol.，227381；Markset al.，1991，J.MoI. Biol.，222581)。人抗体还可通过将人免疫球蛋白基因座引入到转基因动物中来生产，例如，引入到其中内源免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠中。该手段在美国专利5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016中有所描述。或者，可以通过使产生针对目标抗原的抗体的人B淋巴细胞不灭(immortalizing)来制备人抗体(此类B淋巴细胞可从个体中回收，或者可以体外被免疫)。见，例如，Cole et al.，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner et al.，1991，J.Immumol.，147(1)86-95和U.S.专利No.5,750,373。
本文中使用的术语“9TL”和“抗体9TL”互换使用，以指代通过具有保藏号ATCC PTA-6124和ATCC PTA-6125的表达载体生产的抗体。重链和轻链可变区域的氨基酸序列示于图1中。抗体9TL的CDR部分(包括Chothia和Kabat CDR)在图1中用图表示出。编码重链和轻链可变区域的多核苷酸示于SEQ ID NO9和SEQ ID NO10中。实施例中描述了9TL的分析表征。
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用，以指代任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线性的或带分支的，其可包含经过修饰的氨基酸，并且其可被非氨基酸打断。这些术语还包括已被天然修饰或通过人为干涉修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或者任何其它操作或修饰，例如，与标记组分桥联。还包括在定义内的是，例如，含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽，以及本领域已知的其它修饰。应当理解，因为本发明的多肽基于抗体，多肽可以作为单一的链或相联系的链存在。
本文中的“多核苷酸”或“核酸”在本文中互换使用时指代任何长度的核苷酸聚合物，其包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或者可通过DNA或RNA聚合酶包括进聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和它们的类似物。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可在聚合物装配之前或之后进行。核苷酸序列可被非核苷酸组分打断。多核苷酸在聚合之后可被进一步修饰，例如通过与标记组分桥联来进行。修饰的其它类型包括，例如，“帽子”、用类似物取代一个或多个天然存在的氨基酸、核苷酸间修饰，例如具有未带电荷联接物(linkage)的(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、cabamate等)，和具有带电荷联接物的(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)，那些含有侧基的，例如，蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、ply-L-赖氨酸等)，那些具有嵌入剂的(例如，吖啶、补骨脂素等)，那些含有嵌合剂的(例如，金属、放射活性金属、硼、氧化金属等)，那些含有烷基化剂(alkylator)的，那些具有经修饰联接物的(例如，alpha异头核酸等)以及多核苷酸的未经修饰的形式。此外，通常存在于糖中的任何羟基可被例如膦酸酯基团、磷酸酯基团替换，被标准保护基团保护，或者被活化以制备向额外核苷酸的额外联接，或者可与固体支持物桥联。5’和3’末端的OH可被磷酸化或被1至20个碳原子的有机加帽基团部分或胺取代。其它羟基还可衍生化为标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似物，包括，例如，2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-氟-或2’-叠氮-或2’-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-异头糖，差向异构糖(例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)，呋喃糖、景天庚酮糖、无环脂族类似物以及脱碱基核苷类似物，例如甲基核糖甙。一种或多种磷酸二酯联接物可被其它联接基团替换。这些其它联接基团包括但不限于下述实施方式，其中，磷酸被P(O)S(“硫代酯”)、P(S)S(“二硫代酯”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲酰化物(formacetal)”)取代，其中，每个R或R’独立代表H，或取代的或未被取代的烷基(1-20C)，可选地，含有醚键(-O-)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或araldyl。多核苷酸中所有联接物无需都相同。前文描述适用于本文提到的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
抗体的“可变区域”指抗体轻链的可变区域或抗体重链的可变区域，单独或组合均可。重链和轻链的可变区域每种由被三个互补性决定区域(CDR)(也被称为高度可变区域)所连接的四个框架区域(FR)构成。
每条链中的CDR被放到一起，紧邻FR以及其它链的CDR，从而为抗体的抗原结合位点的形成做出贡献。有至少两种技术用于确定CDR(1)基于交叉物种序列可变性的手段(即Kabat et al.Sequences of Proteins ofImmunological Interest，(5th ed.，1991，National Institutes of Health，BethesdaMD))；(2)基于对抗原-抗体复合物的晶体学研究(Al-lazikani et al(1997)J.Molec.Biol.273927-948))。本文中使用的CDR可指上述两种手段任一或组合确定的CDR。
抗体的“恒定区域”指抗体轻链的恒定区域或抗体重链的恒定区域，单独的或组合的。
与抗体或多肽“优先结合”或“特异结合”(本文中互换使用)的抗原决定簇也是本领域公知的术语。如果一种分子与特定细胞或物质的反应或关联较之与其它细胞或底物更频繁、更迅速、更持续和/或具有更高的亲和性，那么这种分子就被说成是展示出了“特异结合”或“优先结合”。如果较之结合其它物质，抗体以更高的亲和性、更大的可能性、更容易地和/或更持续地结合目标，那么抗体与目标“特异结合”或“优先结合”。例如，特异或优先结合Aβ1-40抗原决定簇的抗体是下述抗体，其结合该抗原决定簇较之结合其它Aβ1-40抗原决定簇或非Aβ1-40抗原决定簇具有更高的亲和性、更大的可能性、更容易和/或更持续。通过阅读该定义，还将理解，例如，与第一种目标特异或优先结合的抗体(或部分或抗原决定簇)可以或可以不与第二种目标特异或优先结合。此外，“特异结合”或“优先结合”无需排斥性结合(虽然可以包括这种情况)。通常但并非必需，提到结合时表示优先结合。
本文中使用的“实质上纯”指至少50％纯(即，不含污染物)的物质，更优选地，至少90％纯，更优选地，至少95％纯，更优选地，至少98％纯，更优选地，至少99％纯。
“宿主细胞”包括下述个体细胞或细胞培养物，其可以或已经是用于将多核苷酸插入包括进来的载体的受体。宿主细胞包括单种宿主细胞的后代，由于天然的、偶然的或故意进行的突变，后代不必须与原始的亲本完全相同(形态上或基因组DNA)。宿主细胞包括用本发明的多核苷酸体内转染的细胞。
术语“Fc区域”被用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域。“Fc区域”可以是天然序列Fc区域或变体Fc区域。虽然免疫球蛋白重链的Fc区域可以变化，但是人IgG重链Fc区域通常被定义为，从Cys226或从Pro230位氨基酸残基延伸至其羧基末端。对Fc区域中残基的编号如Kabat中EU索引所示。Kabat et al.，Sequences of Proteins of Imunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1991。免疫球蛋白的Fc区域通常包含两种恒定区域，CH2和CH3。
本文中使用的“Fc受体”和“FcR”描述与抗体Fc区域结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是与IgG抗体结合的(gamma受体)，其包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚组的受体，包括等位基因变体以及这些受体的采用其它方式剪接的形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)以及FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，但其胞质结构域中基本不同。FcR综述参见Ravetch andKinet，1991，Ann.Rev.Immunol.，9457-92；Capel et al.，1994，Immunomethods，425-34；和de Haas et al.，1995，J.Lab.Clin.Med.，126330-41。“FcR”包括初生受体，FcRn，其负责将母体IgGs转至胎儿(Guyeret al.，1976，J.Immunol.，117587；and Kim et al.，1994，J.Immunol.，24249)。
“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”指存在补体时目标的裂解。补体活化途径由补体系统的第一种组分(Clq)与复合有同抗原的分子(例如抗体)的结合来诱发。为对补体活化做出评估，可以进行CDC检验，例如如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods，202163(1996)所述。
“功能性Fc结构域”具有天然序列Fc区域的至少一种效应器功能。示例性的“效应器功能”包括Clq结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；噬菌作用；对细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的负调(down-regulate)等。此类效应器功能通常需要Fc区域组合结合结构域(例如，抗体可变区域)，可使用本领域已知的多种检验方法对其进行评估，以评价此类抗体效应器功能。
“天然序列Fc区域”包含与自然界发现的Fc区域相同的氨基酸序列。“变体Fc区域”包含下述氨基酸序列，其依靠至少一处氨基酸修饰与天然序列Fc区域不同，但仍保留天然序列Fc区域的至少一种效应器功能。优选地，变体Fc区域较之天然序列Fc区域或较之亲本多肽的Fc区域具有至少一处氨基酸取代，例如，在天然序列Fc区域或亲本多肽的Fc区域中有大约一处至大约十处氨基酸取代，优选地，大约一处至大约五处氨基酸取代。本文中的变体Fc区域将优选与天然序列Fc区域和/或与亲本多肽的Fc区域具有至少大约80％的序列相同性，最优选地，与其具有至少大约90％的序列相同性，更优选地，与其具有至少大约95％，至少大约96％，至少大约97％，至少大约98％，至少大约99％的序列相同性。
本文中使用的“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指细胞介导的反应，其中，表达Fc受体(FcRs)的非特异细胞毒性细胞(例如，天然杀手(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别目标细胞上结合的抗体，随后导致目标细胞的裂解。可使用体外ADCC检验，例如美国专利5,500,362或5,821,337所述的方法来评估感兴趣的分子的ADCC活性。用于这些检验的有用的效应器细胞包括周质血单核细胞(PBMC)和NK细胞。或者，或另外，感兴趣的分子ADCC活性可在体内评估，例如，在动物模型内，例如Clynes et al.，1998，PNAS(USA)，95652-656所公开的。
本文中使用的“有效剂量”或“有效量”的药物、化合物或药物组合物是足以产生好的或想要的结果的量。对于预防用途而言，好的或想要的结果包括下述结果，例如，消除或降低了风险，减轻了严重性，或延缓了疾病的发病，这包括该疾病的生物化学、组织学和/或行为学症状，其并发症以及疾病发展期间表现出来的中间病理表型。就治疗用途而言，好的或想要的结果包括下述临床结果，例如，抑制、遏制或减少了淀粉质斑块的形成，减少、去除、清除了淀粉质斑块，提高了认知，逆转或减缓了认知衰退，隐蔽(sequestering)或增加了生物流体中循环的可溶Aβ肽，减少了疾病导致的一种或多种症状(生物化学的、组织学的和/或行为学的)，包括其并发症和疾病发展期间表现出来的中间病理表型，提高了遭受疾病的患者的生活质量，减少了用于治疗疾病的其它药物的剂量，增强了另外的药物的作用，延缓了疾病的病程，和/或延长了患者存活。有效剂量可以通过一次或多次施予来施予。就本发明的目的而言，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足以直接或间接完成预防或治疗处理的量。从临床角度理解，药物、组合物或药物组合物的有效剂量可联合另外的药物、化合物或药物组合物来获得。因此可结合施予一种或多种治疗试剂的情况来考虑“有效剂量”，如果联合一种或多种其它试剂可获得想要的结果的话，可认为以有效剂量提供了单种试剂。
本文中使用的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是获得好的或想要的结果(包括临床结果)的手段。就本发明的目的而言，好的或想要的临床结果包括但不限于下述中的一种或多种抑制、遏制或减少了淀粉质斑块的形成，减少、去除或清除了淀粉质斑块，提高了认知，逆转或减缓了认知衰退，隐蔽了生物流体中循环的可溶Aβ肽，减少了组织(例如脑)中的Aβ肽(包括可溶的、寡聚的和沉积的)，抑制、减缓和/或减少了脑中的Aβ肽积累，抑制、减缓和/或降低了组织(例如脑)中Aβ肽的毒性作用，减少了疾病导致的症状，提高了遭受疾病的患者的生活质量，减少了治疗疾病所需的其它药物的剂量，延缓了疾病的病程，和/或延长了患者存活。
本文中使用的“延缓”Alzheimer’s症的发展表示，推迟、阻止、减缓、延迟、稳定和/或延后该疾病的发展。该延缓的时间长度可以变动，这取决于疾病的历史和/或被处理的个体。足够或明显的延缓可有效包括预防，从而该个体不发展该疾病，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。“延缓”Alzheimer’s症发展的方法是较之未使用该方法的情况，在给定时间段内降低疾病发展的可能性和/或在给定时间段内减轻疾病程度的方法。此类比较通常基于统计学上大量个体的临床研究。
Alzheimer’s症的“发展”指个体中Alzheimer’s症的发病和/或病程。Alzheimer’s症的发展可使用本文所述的标准临床技术来探测。但是，发展也表示最初不可探测到的疾病病程。就本发明的目的而言，病程指疾病状态的生物学阶段，在该情况下，是由标准神经检查、与患者面谈确定的，或者可通过更多的专门检验来确定。大量的这些诊断检验包括但不限于，神经影响，探测血清或脑脊髓流体中特定蛋白(例如，淀粉质肽和Tau)的水平的改变，计算机辅助X射线断层摄影术(CT)以及磁共振影像(MRI)。“发展”包括发生、复发和发作。本文中使用的Alzheimer’s症的“发作”或“发生”包括最初的发作和/或复发。
本文中使用的“联合”施予包括同时施予和/或在不同时间施予。联合施予还包括作为共同制剂施予或作为单独组合物施予。本文中使用的联合施予表示包括任何下述情况其中，将抗Aβ抗体和其它试剂施予个体，它们可同时和/或分别进行。如本文进一步讨论的，应当理解，抗Aβ抗体和其它试剂可以以不同的剂量频率或间隔施予。例如，抗Aβ抗体可每周施予，而其它试剂可以以更少的频率施予。应当理解，可使用同样的施予途径或不同的施予途径来施予抗Aβ抗体和其它试剂。
“生物样品”包括从个体获得的多种样品类型，其可用于诊断或监测检验。该定义包括血液和生物来源的其它液体，固体组织样品，例如活组织切片标本或组织培养物或从其获得的细胞，及其后代。该定义还包括在获得之后用任何方法进行过操作的样品，例如通过下述来进行用试剂处理，溶液化或针对某种组分(例如蛋白或多核苷酸)进行富集，或嵌入到半固体或固体基质中用于切片目的。术语“生物样品”包括临床样品，其还包括培养物中的细胞、细胞悬浮液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体和组织样品。
“个体(individual)”(或者称为个体(“subject”))是哺乳动物，更优选地，人。哺乳动物还包括但不限于，畜牧动物(例如奶牛)、体育动物、宠物(例如猫、狗、马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。
本文中使用的“载体”表示能在宿主中运送(并优选地)表达一种或多种目标基因或序列的构建体。载体的例子包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合试剂相关的DNA或RNA表达载体、脂质体包裹的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，例如生产细胞。
本文中使用的“表达控制序列”表示指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，例如组成型或诱导型启动子或增强子。表达控制序列与待转录核酸序列可操作地相连。
本文中使用的“药学上可接受的载体”包括与活性成分组合时允许活性成分保持生物学功能并且不与个体免疫系统反应的任何物质。例子包括但不限于，任何标准药物载体，例如磷酸缓冲的盐溶液，水，乳液，例如油/水乳液，以及多种类型的润湿剂。用于气溶胶或非肠道施予的优选稀释剂是磷酸缓冲的盐水或生理(0.9％)盐水。包含此类载体的组合物是通过公知的传统方法配制的(见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th edition，A.Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990和Remington，The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing，2000)。
本文中使用的术语“Kon”被用于表示针对抗体与抗原的结合的on速率常数。
本文中使用的术语“Koff”被用于表示针对抗体从抗体/抗原复合物上解离的off速率常数。
本文中使用的术语“KD”被用于表示抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
本发明的组合物和生产方法 抗体9TL和从9TL获得的抗体和多肽 本发明包括组合物，包括下述药物组合物，其中包含抗体9TL以及表3所示其变体或从抗体9TL和表3所示其变体获得的多肽；以及包含编码9TL抗体及其变体或多肽的序列的多核苷酸。本文中使用的组合物包含与Aβ1-40的C末端结合的一种或多种抗体或多肽(可以是或可以不是抗体)，和/或一种或多种多核苷酸，其包含编码与Aβ1-40的C末端结合的一种或多种抗体或多肽的序列。这些组合物还可包括本领域公知的合适的赋形剂，例如药学上可接受的赋形剂，包括缓冲液。
本发明的抗体和多肽可被下述任何(一种或多种)特征所表征；(a)结合Aβ1-40的C末端肽28-40，但不明显结合Aβ1-42或Aβ1-43；(b)结合Aβ1-40的C末端肽33-40；(c)遏制个体中淀粉质斑块的形成；(d)减少个体中的淀粉质斑块；(e)治疗、预防、减轻Alzheimer’s症的一种或多种症状；(f)提高认知功能。本发明的抗体和多肽还可展示出与报道过的其它抗Aβ抗体相反的较理想的安全性。例如，本发明的组合物不会导致下述任何一种或多种情况达到显著或者不可接受的水平；脑血管系统出血(脑部微量出血)；脑膜脑炎(包括改变的磁共振扫描)；脑脊髓流体中升高的白血球计数；中枢神经系统炎症。
因此，本发明提供了下述任何物质，或者包含下述任何物质的组合物(包括药物组合物)(a)抗体9TL或表3所示其变体；(b)抗体9TL或表3所示其变体的片段或区域；(c)抗体9TL或表3所示其变体的轻链；(d)抗体9TL或表3所示其变体的重链；(e)来自抗体9TL或表3所示其变体的轻链和/或重链的一种或多种可变区域；(f)抗体9TL或表3所示其变体的一种或多种CDR(一种、两种、三种、四种、五种或六种CDR)；(g)抗体TL重链的CDR H3；(h)来自抗体TL或表3所示其变体的轻链的CDR L3；(i)来自抗体9TL或表3所示其变体的的轻链的三种CDR；(j)来自抗体9TL或表3所示其变体的重链的三种CDR；(k)来自抗体9TL或表3所示其变体的的重链的三种CDR和来自轻链的三种CDR，以及，(l)包含(b)到(k)中任何一种的抗体。本发明还提供了包含上述一种或多种的多肽。
抗体9TL的CDR部分(包括Chothia和Kabat CDR)在图1中有图示性描述。对CDR区域的确定是本领域技术人员公知的。应当理解，在一些实施方式中，CDR可以是Kabat和Chothia CDR的组合(也称为“组合的CDR”或“延伸的CDR”)。在一些实施方式中，CDR是KabatCDR。在其它实施方式中，CDR是Chothia CDR。换句话说，在具有超过一种CDR的实施方式中，CDR可以是Kabat、Chothia、CDR组合或其组合中的任何。
在一些实施方式中，本发明提供了一种多肽(可以是或可以不是抗体)，其包含与9TL或表3所示其变体的至少一种CDR、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或者全部六种CDR实质上相同的至少一种CDR、至少两种、至少三种或者至少四种、至少五种或者全部六种CDR。其它实施方式包括下述抗体，所述抗体具有与9TL的或从TL获得的至少两种、三种、四种、五种或六种CDR实质上相同的至少两种、三种、四种、五种或六种CDR(s)。在一些实施方式中，所述至少一种、两种、三种、四种、五种或六种CDR(s)与9TL或表3所示其变体的至少一种、两种、三种、四种、五种或六种CDR至少大约·85％、86％、87％、88％、89％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。应当理解，就本发明的目的而言，结合特异性和/或总活性通常会保留，虽然活性程度可能较之9TL或表3所示其变体有所改变(可能更高或更低)。
本发明还提供了一种多肽(可以是或可以不是抗体)，其包含9TL或表3所示其变体的、具有下述任何物质的氨基酸序列9TL或表3所示其变体序列的至少5个连续氨基酸、至少8个连续氨基酸、至少大约10个连续氨基酸、至少大约15个连续氨基酸、至少大约20个连续氨基酸、至少大约25个连续氨基酸、至少大约30个连续氨基酸，其中，至少三个氨基酸来自9TL(图1)或表3所示其变体的可变区域。在一种实施方式中，可变区域来自9TL的轻链。在另一种实施方式中，可变区域来自9TL的重链。示例性的多肽具有来自TL重链和轻链的连续氨基酸(长度如上所述)。在另一种实施方式中，5个(或更多个)连续氨基酸来自图1所示的9TL的互补性决定区域(CDR)。在一些实施方式中，连续氨基酸来自9TL的可变区域。
本发明的抗体和多肽的结合亲和性可变化，不需要(但可以)是特定的值或范围，如下述示例性实施方式所示。本发明的抗体和多肽与Aβ1-40的结合亲和性可以为大约0.10至大约0.80nM，大约0.15至大约0.75nM，以及大约0.18nM至大约0.72nM。在一些实施方式中，结合亲和性为大约2pM，大约5pM，大约10pM，大约15pM，大约20pM，大约40pM，或者高于大约40pM。在一种实施方式中，结合亲和性在大约2pM至22pM之间。在其它实施方式中，结合亲和性小于大约10nM，大约5nM，大约1nM，大约900pM，大约800pM，大约700pM，大约600pM，大约500pM，大约4400pM，大约300pM，大约200pM，大约150pM，大约100pM，大约90pM，大约80pM，大约70pM，大约60pM，大约50pM，大约40pM，大约30pM，大约10pM。在一些实施方式中，结合亲和性为大约10nM。在其它实施方式中，结合亲和性小于大约10nM。在其它实施方式中，结合亲和性小于大约10nM，小于大约50nM，小于大约100nM，小于大约150nM，小于大约200nM，小于大约250nM，小于大约500nM，或者小于大约1000nM。在其它实施方式中，结合亲和性小于大约5nM。在其它实施方式中，结合亲和性小于大约1nM。在其它实施方式中，结合亲和性为大约0.1nM或大约0.07nM。在其它实施方式中，结合亲和性为小于大约0.1nM或者小于大约0.07nM。在其它实施方式中，结合亲和性为从大约10nM、大约5nM、大约1nM、大约900pM、大约800pM、大约700pM、大约600pM、大约500pM、大约400pM、大约300pM、大约200pM、大约150pM、大约100pM、大约90pM、大约的pM、大约70pM、大约60pM、大约50pM、大约40pM、大约30pM、大约10pM中的任何数值到大约2pM、大约5pM、大约10pM、大约15pM、大约20pM或者大约40pM中的任何数值。在一些实施方式中，结合亲和性是大约10nM、大约5nM、大约1nM、大约900pM、大约800pM、大约700pM、大约600pM、大约500pM.大约400pM、大约300pM、大约200pM、大约150pM、大约100pM、大约90pM、大约80pM、大约70pM、大约60pM、大约50pM、大约40pM、大约30pM、大约10pM中的任何数值。在另外一些实施方式中，结合亲和性为大约2pM、大约5pM、大约10pM、大约15pM、大约20pM、大约40pM或者高于大约40pM。
本发明还提供了生产任何下述抗体或多肽的方法。本发明的抗体可通过本领域内已知的流程来生产。多肽可通过对抗体进行蛋白水解或其它降解，通过上文所述的重组方法(即，单或融合多肽)或通过化学合成来生产。抗体的多肽，特别是长度至多大约50个氨基酸的较短的多肽，可通过化学合成方便地生产。化学合成的方法是本领域已知的，并可通过商业途径获得。例如，可通过自动多肽合成仪利用固相方法来生产抗体。还见美国专利5,807,715、4,816,567和6,331,415。
在另一种替代性方法中，可使用本领域公知的方法来重组生产抗体。在其它实施方式中，多肽包含SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示的、编码抗体9TL重链和/或轻链可变区域的序列。在另一种实施方式中，包含SEQ ID NO9和SEQ ID NO10中所示的核苷酸序列的多核苷酸被克隆进一种或多种载体，以进行表达或增殖。编码目标抗体的序列可在宿主细胞保持于载体中，然后可扩增宿主细胞，冷冻起来以待进一步使用。载体(包括表达载体)和宿主细胞在本文中有进一步描述。
本发明还包括本发明抗体(例如9TL)的单链可变区域片段(“scFv”)。通过使用短的连接肽，连接轻链和/或重链可变区域，来生产单链可变区域序列。Bird et al.(1988)Science 242423-426。连接肽的例子是(GGGGS)3(SEQ ID NO40)，其在一种可变区域的羧基末端和另一种可变区域的氨基末端之间的大约3.5nm做出连接。可以设计和使用其它序列的连接子。Bird et al.(1988)。可对连接子进行修饰，以获得额外的功能，例如，附着到药物或附着到固体支持物上。单链变体可通过重组或合成方式来生产。为合成生产scFv，可以使用自动合成仪。为对scFv进行重组生产，可将含有编码scFv的多核苷酸的合适质粒引入到合适的宿主细胞中，真核的(例如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞)或原核的(例如E.coli)。可通过常规操作，例如连接多核苷酸来生产编码目标scFv的多核苷酸。可使用本领域已知的标准蛋白纯化技术来分离得到的scFv。
单链抗体的其它形式，例如双价双特异性抗体(diabodies)也包括在内。双价双特异性抗体是二价的、具有双特异性的抗体，其中，VH和VL结构域在单多肽链上表达，但是使用的连接子太短从而使同一条链上两个结构域之间无法配对，由此使结构域与另一条链上的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点(见，例如，Holliger，P.，et al.(1993)Proc.Natl.AcadSci.USA 906444-6448；Poljak，R.J.，et al.(1994)Structure21121-1123).。
例如，使用本文公开的抗体，可以制备双特异性抗体，这是具有针对至少两种不同抗原结合特异性的单克隆抗体。用于生产双特异性抗体的方法是本领域已知的(见，例如，Suresh et al.，1986，Methods in Enzymology121210)。传统地，对双特异性抗体的重组生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链对的共同表达，其中两条重链具有不同特异性(Millstein andCuello，1983，Nature 305，537-539)。
根据生产双特异性抗体的一种手段，具有想要的结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合体优选与包含hinge、CH2和CH3区域的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定结构域一起进行。优选地，令含有轻链结合所必需位点的第一条重链恒定区域(CH1)存在于至少一种融合体中。编码免疫球蛋白重链融合体以及如果需要的话免疫球蛋白轻链的DNA，被插入到单独的表达载体中，并被共转染进合适的宿主生物。这在下述实施方式中为调节三种多肽片段相互比例提供了高灵活性，所述实施方式中，最佳产量是用于构建的三种多肽链的不相等的比例提供的。但是，当至少两种多肽链的等比例表达导致高产量时，或者当该比例没有特别意义时，将针对两种或全部三种多肽链的编码序列插入到一种表达载体中也是可能的。
在一种手段中，双特异性抗体由一条臂上的、具有第一种结合特异性的杂交免疫球蛋白重链，以及另一条臂上的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二种结合特异性)构成。该不对称结构仅在双特异性分子的一半中具有免疫球蛋白轻链，这有助于将想要的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分离开。该手段描述于1994年3月3日公开的PCT公开文献WO 94/04690中。
包含两种共价连接的抗体的杂桥联抗体也在本发明的范围内。此类抗体已被用于将免疫系统细胞靶向至不想要的细胞(美国专利4,676,980)以及用于治疗HIV感染(PCT申请公开文本WO 91/00360和WO92/200373、EP 03089)。杂桥联抗体可使用任何方便的交联方法来生产。合适的交联剂和技术是本领域公知的，其被描述于美国专利4,676,980中。
还可使用合成蛋白化学领域的已知方法(包括涉及交联剂的那些)来制备嵌合或杂交抗体。例如，可使用二硫化物交换反应，或者通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于该目的的合适的例子包括亚氨基硫醇盐/酯和甲基-4-巯基丁酰亚氨酸盐/酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
包含抗体9TL的一种或多种CDR或从抗体9TL获得的一种或多种CDR的人化抗体可使用本领域已知的任何方法来制备。例如，四个普通步骤可用于人化单克隆抗体。它们是(1)确定起始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸以及预计的氨基酸序列，(2)设计人化抗体，即，决定在人化过程中使用何种抗体框架区域，(3)实际的人化方法/技术以及(4)转染和表达人化抗体。见，例如，美国专利4,816,567、5,807,715、5,866,692、6,331,415、5,530,101、5,693,761、5,693,762、5,585,089、6,180,370、5,225,539、6,548,640。
在重组人化抗体中，可对Fc部分加以修饰，以避免Fcγ受体和补体免疫系统之间的相互作用。这种类型的修饰是Cambridge University，Department of Pathology的Dr.Mike Clark设计的，用于制备此类抗体的方法描述于1999年11月18日公开的WO99/58572中。
例如，如果抗体用于在人类中进行的临床试验和治疗，可通过功能改造使恒定区域更像人的恒定区域，以避免免疫应答。见，例如，美国专利5,997,867和5,866,692。
本发明包括对抗体9TL的修饰，包括不显著影响其性质的功能等价抗体，以及具有提高的或降低的活性和/或亲和性的变体。例如，可对抗体9TL的氨基酸序列加以突变，以获得具有想要的对Aβ1-40肽的结合亲和性的抗体。对多肽的修饰是本领域内的常规操作，无须在此详细描述。对多肽的修饰在实施例中有例子。经修饰的多肽的例子包括具有不显著负面改变功能活性的氨基酸残基保守取代、一处或多处缺失或氨基酸添加的多肽，或者使用化学类似物。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端融合(其长度范围从一个残基到含有上百或更多残基的多肽不等)，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰(methionyl)残基的抗体或与抗原决定簇标签融合的抗体。抗体分子的其它插入形式包括向酶或多肽的抗体的N或C末端的融合，其增加了抗体的血清半衰期。
取代变体在抗体分子中具有至少一处被去除的氨基酸残基，在该位置插入不同的残基。对于取代突变来说最令人感兴趣的位点包括高度可变的区域，但是FR改变也包括在内。保守取代示于表1中“保守取代”的小标题下。如果此类取代导致生物活性的改变，那么更多实质性改变(在表1中被称为“示例性取代”，或下文提到氨基酸分组时进一步描述的)可被引入，产物被筛选。
表1氨基酸取代 对抗体生物学性质的实质性修饰是通过选择对于维持下述性质来说作用明显不同的取代来完成的，(a)取代区域多肽主链的结构，例如作为片状或螺旋构象，(b)目标位点上分子的电荷或疏水性，或者(c)侧链大小。基于共有的侧链性质，天然存在的残基被分为下述组 (1)非极性正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)极性无电荷Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3)酸性(负电荷)Asp、Glu； (4)碱性(正电荷)Lys、Arg； (5)影响链定向的残基Gly、Pro以及 (6)芳香族的Trp、Tyr、Phe、His。
非保守取代是通过上述某一组的成员与另一组交换来产生的。
不涉及保持抗体正确构象的任何半胱氨酸残基也可被取代，通过用丝氨酸取代，以提高分子的氧化稳定性，以及防止异常交联。反过来，半胱氨酸键可被加入到抗体中，以提高其稳定性，特别是当抗体是抗体片段时，例如Fv片段。
氨基酸修饰可由改变或修饰一个或多个氨基酸至完全重新设计区域，例如，可变区域。可变区域中的改变可改变结合亲和性和/或特异性。在些实施方式中，在CDR结构域中进行不超过1至5处保守氨基酸取代。在其它实施方式中，在CDR结构域中进行不超过1至3处保守氨基酸取代。在另外一些实施方式中，CDR结构域是CDR H3和/或CDR L3。
修饰还包括糖基化和非糖基化多肽，以及具有其它翻译后修饰的多肽，例如，用不同糖进行的糖基化、乙酰化和磷酸化。抗体在其恒定区域的保守位点被糖基化(Jefferis and Lund，1997，Chem.Immunol.65111-128；Wright and Morrison，1997，TibTECH 1526-32)。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白功能(Boyd et al.，1996，Mol.Immunol.321311-1318；Wittwe andHoward，1990，Biochem.294175-4180)和糖蛋白部分间的分子内相互作用(其能影响构象)，并且展示出糖蛋白的三维表面(上文所述的Hefferisand Lund；Wyss and Wagner，1996，Current Opin.Biotech.7409-416)。寡糖还可用于基于特定识别结构将给定的糖蛋白靶定到某些分子上。抗体糖基化还被报道为会影响抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。特别地，具有受四环素调控的β(1，4)-N-乙酰氨基葡糖转移酶III(Gn TIII)(催化二等分GlcNAc形成的糖基转移酶)的CHO细胞被报道为具有提高的ADCC活性(Umana et al，1999，Mature Biotech.17176-180)。
抗体的糖基化典型地是N-连接的或O-连接的。N-连接的表示碳水化合物部分附着到天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸以及天冬酰胺-X-半胱氨酸(其中X是除了脯氨酸之外的氨基酸)是碳水化合物基团向天冬酰胺侧链酶促附着的识别序列。因此，这些三肽序列在多肽中的存在制造了可能的糖基化位点。O-连接的糖基化指下述糖之一向羟基氨基酸，更常见地，丝氨酸或苏氨酸的附着，虽然5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸也可使用，所述糖是N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖。
将糖基化位点加入到抗体中可通过下述方法方便地完成改变氨基酸序列使得其含有上述三肽中一种或多种(用于N-连接的糖基化位点)。还可通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基加入到原始抗体的序列中，或者用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基去取代来制造改变(对于O-连接的糖基化位点)。
还可在不改变下面的核苷酸序列的条件下改变抗体的糖基化情况。糖基化很依赖于用于表达抗体的宿主细胞。因为用于表达重组糖蛋白(例如抗体)作为可能的治疗药物的细胞类型很少是天然的细胞，因此可预期到抗体糖基化情况的变化(见，例如，Hse et al.，1997，J.Biol.Chem.2729062-9070)。
除了对宿主细胞的选择之外，在抗体重组生产期间影响糖基化的因素包括生长模式、培养基配方、培养密度、氧化、pH、纯化方案等。已提出了多种方法，用于改变在特定宿主生物中获得的糖基化情况，所述方法包括引入引入或过量表达寡糖生产所涉及的某些酶(美国专利5,047,335、5,510,261和5.278,299)。糖基化或某些类型的糖基化可通过酶促从糖蛋白上去除，例如使用内切糖苷酶H(Endo H)、实施例3描述的N-糖苷酶F、内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶F3。此外，还可对重组宿主细胞进行遗传改造，使其在加工某些类型的多糖方面有缺陷。这些技术以及类似技术是本领域公知的。
修饰的其它方法包括使用本领域已知的偶联技术，其包括但不限于酶促方法、氧化取代和螯合。修饰可例如用于附着上标记，以进行免疫检验。可使用本领域内已建立的流程来生产经修饰的9TL多肽，可是用本领域已知的标准检验来对其进行筛选，所述检验中有一些在下文和实施例中有所描述。
在本发明的一些实施方式中，抗体包含经修饰的恒定区域，例如免疫惰性或部分惰性的恒定区域，例如，不诱发补体介导的裂解，不激发依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)，或者不激活小胶质细胞，或者具有降低的下述任何一种或多种活性诱发补体介导的裂解，激发依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)，或者激活小胶质细胞。对恒定区域的不同修饰可被用于获得效应器功能的最优水平和/或组合。见，例如，Morgan et al.，Immunology 86319-324(1995)、Lund et al.，J.Immunology1574963-91574963-4969(1996)、Idusogie et al.，J.Immunology 1644178-4184(2000)、Tao et al.，J.Immunology 1432595-2601(1989)和Jefferis et al..Immunological Reviews 16359-76(1998)。在一些实施方式中，按照Eur.J.Immunol.(1999)292613-2624、PCT申请PCT/GB99/01441和/或英国专利申请9809951.8所述对恒定区域进行修饰。在其它实施方式中，抗体包含人重链IgG2a恒定区域，其中包含突变A330P331到S330S331(氨基酸编号参考野生型IgG2a序列)。Eur.J.Immunol.(1999)292613-2624。在另外一些实施方式中，针对N-连接的糖基化对恒定区域脱糖基化。在一些实施方式中，通过对糖基化氨基酸残基或是恒定区域中N-糖基化识别序列一部分的侧翼残基进行突变，针对N-连接的糖基化对恒定区域进行脱糖基化。例如，N-糖基化位点N297可被突变为A、Q、K或H。见，Tao et al.，J.Immunology 1432595-2601(1989)和Jefferis et al.，Immunological Reviews16359-76(1998)。在一些实施方式中，针对N-连接的糖基化对恒定区域进行脱糖基化。可通过酶促(例如通过酶PNGase去除碳水化合物)方法或通过在糖基化缺陷型宿主细胞中表达来针对N-连接的糖基化对恒定区域进行脱糖基化。
其它抗体修饰包括按照PCT公开文献WO 99/58572(199年11月18日公开的)所述修饰的抗体。除针对目标分子的结合结构域之外，这些抗体还包括效应器结构域，其具有与人免疫球蛋白重链恒定结构域的全部或部分实质上同源的氨基酸序列。这些抗体能在不诱发补体依赖性裂解或细胞介导的目标破裂的情况下与目标分子结合。在一些实施方式中，效应器结构域能特异性结合FcRn和/或FcγRIIb。典型地，这基于从两种或多种人免疫球蛋白重链CH2结构域获得的嵌合结构域。按照这种方式修饰的抗体特别适合用于慢性抗体疗法，以避免炎症和传统抗体疗法的其它不良反应。
本发明包括亲和性成熟的(affinity matured)实施方式。例如，可通过本领域已知的流程来生产亲和性成熟的抗体(Marks et al.，1992，Bio/Technology，10779-783；Barbas et al.，1994，Proc Nat.Acad.Sci，USA913809-3813；Schier et al.，1995，Gene 169147-155；Yeltron et al.，1995，J.Immunol.，1551994-2004；Jackson et al.，1995，J.Immunol.，154(7)3310-9；Hawkins et al，1992，J.MoI.Biol.，226889-896和WO2004/058184)。
下述方法可被用于调节抗体的亲和性以及用于分析CDR。分析抗体CDR和/或改变(例如提高)多肽(例如抗体)结合亲和性的一种方法被称为“文库扫描诱变”。通常，文库扫描诱变按照下述原理来工作。使用本领域认可的方法，用两个或多个(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)氨基酸替换CDR中的一个或多个氨基酸位置。这产生小的克隆文库(在一些情况下，针对被分析的每个氨基酸位置一个)，每个都具有两个或多个成员的复杂程度(如果每个位置上进行了两种或多种氨基酸取代的话)。通常，该文库还包括包含天然(未取代的)氨基酸的克隆。针对与目标多肽(或其它结合目标)的结合亲和性，对来自每个文库的小量克隆，例如，大约20-80个克隆(取决于文库复杂程度)进行筛选，具有增加的、同样的、减少的或者不结合的候选者被鉴定出来。用于确定结合亲和性的方法是本领域公知的。可是用BIAcore表面等离子共振分析(其能探测大约2倍或更高的结合亲和性改变)来测定结合亲和性。当起始抗体已能以相对较高的亲和性，例如，大约10nM或更低的KD结合时，BIAcore特别有用。使用BIAcore表面等离子共振进行的筛选在本文实施例中有所描述。
可以用Kinexa Biocensor、闪烁接近(scintillation proximity)检验、ELISA、ORIGEN免疫检验(IGEN)、荧光淬灭、荧光转移和/或酵母展示来测定结合亲和性。还可使用合适的生物检验来筛选结合亲和性。
在一些实施方式中，使用本领域认可的诱变方法(其中有些在本文中有所描述)，用全部20种天然氨基酸对CDR中的几乎每个氨基酸位置都进行替换(在一些实施方式中，一次一个)。这产生了小的克隆文库(在一些实施方式中，针对被分析的每个氨基酸位置一个)，每个都具有20个成员的复杂程度(如果在每个位置上都进行全部20种氨基酸的取代的话)。
在一些实施方式中，待筛选文库包含两个或多个位置上的取代，其可以在同样的CDR或在两个或多个CDR中。因此，该文库可包含一种CDR中两个或多个位置上的取代。文库可包含两种或多种CDR中两个或多个位置上的取代。文库可包含3、4、5或更多位置上的取代，所述位置是在两种、三种、四种、五种或六种CDR中发现的。取代可使用低冗余度的密码子来制备。见，例如，Balint et al.，(1993)Gene 137(1)109-18)的表2。
CDR可以是CDRH3和/或CDRL3。CDR可以是CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2和/或CDRH3中的一种或多种。CDR可以是Kabat CDR、Chothia CDR或延伸的CDR。
具有改进的结合的候选者可被测序，由此鉴定出导致提高的亲和性(也称为“改进的”取代)的CDR取代突变体。还可对结合的候选者进行测序，由此鉴定出保持结合的CDR取代。
可进行多种途径的筛选。例如，具有改进的结合的候选者(每种包含一种或多种CDR的一个或多个位置上的氨基酸取代)还可用于设计第二种文库，其中至少含有在每个改进的CDR位置上(即，在取代突变体展示出改进的结合的CDR氨基酸位置上)的原始氨基酸和取代的氨基酸。对该文库的制备、筛选和选择在下文中进一步描述。
文库筛选诱变还提供了一种方法，用于分析CDR，至于具有改进的结合、同样的结合、降低的结合或者没有结合的克隆的频率，还提供了关于每个氨基酸位置对抗体-抗原复合体稳定性的重要性的信息。例如，如果CDR的位置改变为全部20种氨基酸时都能保持结合，该位置就被鉴定为不可能是抗原结合所必需的。相反，如果CDR的位置仅在少数百分比的取代时才能保持结合，那么该位置就被鉴定为对于CDR功能来说重要的位置。因此，文库扫描诱变方法产生了关于CDR中可被改变为不同氨基酸(包括全部20种氨基酸)的位置，以及CDR中不能被改变或仅能改变为几种氨基酸的位置的信息。
具有提高的亲和性的候选者可组合进第二种文库，其包括改进的氨基酸、该位置上的原始氨基酸，并且还包括该位置上的额外取代，这取决于想要的文库的复杂程度，或者可使用想要的筛选或选择方法来对所述候选者加以许可。此外，如果需要的话，可将相邻的氨基酸位置随机化为至少两种或多种氨基酸。对相邻氨基酸的随机化可允许CDR突变体中的额外构象灵活性，其随之允许或促进大量改进型突变的引入。文库还可包含在第一轮筛选中没有显示出提高的亲和性的位置上的取代。
使用本领域已知的任何方法，包括使用BIAcore表面等离子共振分析，以及使用本领域已知用于选择的任何方法，包括噬菌体展示、酵母展示和核糖体展示进行选择，用提高的和/或改变的结合亲和性，针对文库成员，对第二种文库进行筛选或选择。
本发明还包括融合蛋白，其中包括来自本发明抗体(例如9TL)或多肽的一种或多种片段或区域。在一种实施方式中，提供了下述融合多肽，其中包含SEQ ID NO2(图1)所示可变轻链区域的至少10个连续氨基酸和/或SEQ ID NO1(图1)所示可变重链区域的至少10个连续氨基酸。在其它实施方式中，提供了下述融合多肽，其中包含SEQ ID NO2(图1)所示可变轻链区域的至少大约10个，至少大约15个，至少大约20个，至少大约25个或者至少大约30个连续氨基酸和/或SEQ ID NO1(图1)所示可变重链区域的至少大约10个，至少大约15个，至少大约20个，至少大约25个或者至少大约30个连续氨基酸。在另一种实施方式中，融合多肽包含如图1的SEQ ID NO2和SEQ ID NO1所示的9TL轻链可变区域和/或重链可变区域。在另一种实施方式中，融合多肽包含9TL的一种或多种CDR(s)。在另外一些实施方式中，融合蛋白包含抗体9TL的CDR H3和/或CDR L3。就本发明的目的而言，9TL融合蛋白含有一种或多种9TL抗体以及其天然并不附着的另一段氨基酸序列，例如，异源序列或者来自另一区域的同源序列。示例性异源序列包括但不限于“标签”例如，FLAG标签或6His标签。标签是本领域公知的。
可通过本领域已知的方法来生产9TL融合多肽，例如，合成或重组方法。典型地，本发明的9TL融合蛋白是通过下述方法生产的使用本文所述的重组方法，制备编码它们的多核苷酸的表达，虽然它们还可能通过本领域中已知的其它方法来制备，包括，例如，化学合成。
本发明还提供了下述组合物，其中包含与促进偶联到固体支持物(例如生物素或亲和性)上的试剂桥联(例如，连接)的9TL抗体或多肽。为简单起见，通常提到9TL或抗体时应理解为，这些方法适用于本文所述的任何Aβ1-40结合实施方式。桥联通常指连接本文所述的这些组分。连接(通常，是将这些组分以最接近相连的方式固定，至少用于施予)可通过大量方式获得。例如，当它们每种都具有能与另一种反应的取代基时，试剂和抗体间的直接反应是可能的。例如，亲核基团，例如氨基或氢巯基(sulfhydryl)一方面可与含羰基的化合物(例如，酸酐或酸卤化物)反应，或者另一方面与含有好的离去基团(例如，卤化物)的烷基反应。
本发明的抗体或多肽可与标记试剂(或者称为“标记”，例如，荧光分子、放射活性分子或者本领域已知的任何其它标记)相连。标记是本领域已知的，其通常(直接或间接)提供信号。
本发明还提供了包含抗体9TL，以及，本文所述的任何或全部抗体和/或多肽(本文公开使其清楚)的组合物(包括药物组合物)和试剂盒。
具有受损效应器功能的抗Aβ抗体和多肽 本发明的方法使用能与beta淀粉质肽特异结合并且具有受损的效应器功能的抗体或多肽(包括包含所述抗体或多肽的药物组合物)。通过下述任何(一种或多种)特征来表征抗体和多肽(a)遏制个体中淀粉质斑块的形成；(b)减少个体中的淀粉质斑块；(c)治疗、预防、减轻Alzheimer’s症的一种或多种症状；(d)提高认知功能。本文所述的抗体和多肽可展示出想要的安全性质，例如，本发明的组合物不会导致下述任何一种或多种情况达到显著或者不可接受的水平脑血管系统出血(脑部微量出血)；脑膜脑炎(包括改变的磁共振扫描)；脑脊髓流体中升高的白血球计数；中枢神经系统炎症。如实施例4所示，在用于Alzheimer’s症的动物模型中，Fc区域中被去除N-连接的糖基化的抗Aβ抗体可有效地去除脑中的淀粉质斑块，以及提高认知功能，并且较之完整抗体具有明显更少的微量出血。
本文中使用的具有“受损的效应器功能”(与“免疫惰性”或“部分免疫惰性”互换使用)的抗体或多肽指，不具有任何效应器功能或者具有降低活性的效应器功能(较之具有未经修饰的或天然存在的恒定区域的抗体或多肽而言)的抗体或多肽，例如，不具有下述任何一种或多种活性或仅具有降低的活性a)诱发补体介导的裂解；b)激发依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)，以及c)激活小胶质细胞。效应器功能活性可减少了大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％和100％中的任何百分比。在一些实施方式中，抗体与beta淀粉质肽结合，但是不诱发显著的补体依赖性裂解或细胞介导的目标破裂。例如，恒定区域上的Fc受体结合位点可被修饰或突变，以去除或降低与某些Fc受体(例如，FcγRI、FcγRII和/或 FcγRIII)的结合亲和性。为简单起见，提到抗体时应理解为实施方式还适用于多肽。EU编号系统(Kabatet al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest；5th ed.Public HealthService，National Institutes of Healthy，Bethesda，Md.，1991)用于表明恒定区域(例如，IgG抗体)的哪个(些)氨基酸残基被改变或突变。该编号可用于特定种类的抗体(例如IgG1)或物种(例如人类)，此时应当理解为可对抗体和物种的类型进行相似的改变。
在一些实施方式中，特异结合Aβ肽的抗体包含具有受损效应器功能的重链恒定区域。该重链恒定区域可具有天然存在的序列或是变体。在一些实施方式中，天然存在的重链恒定区域的氨基酸序列被突变，例如通过氨基酸取代、插入和/或缺失来进行，由此导致恒定区域的效应器功能受损。在一些实施方式中，重链恒定区域的Fc区域的N-糖基化也可被改变，例如可被完全或部分去除，由此导致恒定区域的效应器功能受损。
在一些实施方式中，通过去除抗Aβ肽的Fc区域(例如，在IgG的CH2结构域)的N-糖基化来使效应器功能受损。在一些实施方式中，通过突变糖基化的氨基酸残基以及是恒定区域中糖基化识别序列一部分的侧翼残基来去除Fc区域的N-糖基化。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸(N-X-S)、天冬酰胺-X-苏氨酸(N-X-T)以及天冬酰胺-X-半胱氨酸(N-X-C)(其中X是除了脯氨酸之外的氨基酸)是针对N-糖基化的碳水化合物基团向天冬酰胺侧链酶促附着的识别序列。恒定区域中，所述三肽中任何氨基酸的突变产生脱糖基化的IgG。例如，人IgG1和IgG3的N-糖基化位点N297可被突变为A、D、Q、K或H。见，Tao et al.，J.Immunology1432595-2601(1989)和Jefferis et al.，Immunological Reviews 16359-76(1998)。已经报道，用Gln、His或Lys对Asn-297进行过取代的人IgG1和IgG3不与人FcγRI结合，并且对IgG1而言，不激活Clq结合能力完全丢失的补体，对IgG3而言，不激活Clq结合能力大幅降低的补体。在一些实施方式中，三肽序列中的氨基酸N被突变为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y中的任何一种氨基酸。在一些实施方式中，三肽序列中的氨基酸N被突变为保守取代。在一些实施方式中，三肽序列中的氨基酸X被突变为脯氨酸。在一些实施方式中，三肽序列中的氨基酸S被突变为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W、Y。在一些实施方式中，三肽序列中的氨基酸T被突变为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W、Y。在一些实施方式中，三肽序列中的氨基酸C被突变为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W、Y。在一些实施方式中，三肽之后的氨基酸被突变为P。在一些实施方式中，恒定区域中的N-糖基化被酶促(例如，实施例3中所述的N-糖苷酶F、内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶F3和内切糖苷酶H)去除。去除N-糖基化还可通过在具有N-糖基化缺陷型的细胞系中生产抗体来获得。Wright et al.J Immunol.160(7)3393-402(1998)。
在一些实施方式中，与附着到恒定区域N-糖基化位点的寡糖相互作用的氨基酸残基被突变，以降低与FcγRI的结合亲和性。例如，人IgG3的F241、V264、D265可被突变。见，Lund et al.，J.Immunology 1574963-4969(1996)。
在一些实施方式中，通过按照PCT WO 99/58572和Armour et al.，Molecular Immunology 40585-593(2003)、Reddy et al.，J.Immunology1641925-1933(2000)所述，修饰例如人IgG的233-236、297和/或327-331来导致效应器功能受损。PCT WO 99/58572和Armour et al.中描述的抗体除针对目标分子的结合结构域之外，还包含效应器结构域，其具有与人免疫球蛋白重链恒定区域的全部或一部分实质上同源的氨基酸序列。这些抗体能结合目标分子，而不诱发显著的补体依赖性裂解，或者细胞介导的目标破裂。在一些实施方式中，效应器结构域具有降低的针对FcγRI、FcγRIIa和FcγRIII的亲和性。在一些实施方式中，效应器结构域能特异结合FcRn和/或FcγRIIb。典型地，这些基于从两种或多种人免疫球蛋白重链CH2结构域获得的嵌合结构域。以这种方式修饰的抗体特别适用于慢性抗体疗法，以避免炎症和传统抗体疗法的其它不良反应。在一些实施方式中，抗体的重链恒定区域是具有任何下述突变的人重链IgG1)A327A330P331至G327S330S331；2)E233L234L235G236至P233V234A235以及G236缺失；3)E233L234L235至P233V234A235；4)E233L234L235G236A327A330P331至P233V234A235G327S330S331以及G236缺失5)E233L234L235A327A330P331至P233V234A235G327S330S331和6)N297至A297或除N之外的任何其它氨基酸。在一些实施方式中，抗体的重链恒定区域是具有下述突变的人重链IgG2A330P331至S330S331。在一些实施方式中，抗体的重链恒定区域是具有任何下述突变的人重链IgG4E233F234L235G236至P233V234A235以及G236缺失E233F234L235至P233V234A235以及S228L235至P228E235。 还可对抗体的恒定区域加以修饰，以使补体激活受损。例如，补体的C1组分结合之后，IgG抗体的补体激活可被突变C1结合基元(例如Clq结合基元)中恒定区域中的氨基酸残基降低。已经报道，针对人IgG1的D270、K322、P329、P331中每个的Ala突变都显著降低抗体结合Clq以及激活补体的能力。对于鼠IgG2b而言，Clq结合基元包括残基E318、K320和K322。Idusogie et al，J.Immunology 1644178-4184(2000)；Duncanet al.，Nature 322738-740(1988)。
人们相信，针对鼠IgG2b鉴定出来的Clq结合基元E318、K320和K322是其它抗体异种类型共有的。Duncan et al.，Nature 322738-740(1988)。针对IgG2b的Clq结合活性可通过下述方法去除用在其侧链具有不恰当功能性的残基替换三个特定残基中的任何一个。并不必需用Ala来替换离子性残基，以去除Clq结合。还可能使用其它烷基取代的非离子性残基，例如Gly、Ile、Leu或Val或芳香族非极性残基例如Phe、Tyr、Trp和Pro替换三个特定残基中的任何一个来去除Clq结合。此外，还可能使用极性非离子残基，例如Ser、Thr、Cys和Met替换残基320和322而非318来去除Clq结合活性。
本发明还提供了具有受损的效应器功能的抗体，其中，所述抗体具有经修饰的hinge区域。可通过修饰hinge区域来调节人IgG对其Fc受体的结合。Canfield et al.，J.Exp.Med.1731483-1491(1991)、Hezareh et al.，JVirol.7512161-12168(2001)；Redpath et al.，Human Immunology59720-727(1998)。特定氨基酸残基可被突变或缺失。经修饰的hinge区域可包含从不同抗体组或亚组的抗体获得的完全hinge区域，其来自GH1结构域。例如，IgG抗体组的恒定结构域(CH1)可附着到IgG4抗体的hinge区域上。或者，新的hinge区域可包含天然hinge或重复单元(其中，重复中的每个单元从天然hinge区域获得)的一部分。在一些实施方式中，可通过将一个或多个半胱氨酸残基转化为中性残基，例如丙氨酸，或者通过将合适位置的残基转化为半胱氨酸残基来改变天然hinge区域。美国专利5,677,425。用本领域认可的蛋白化学以及(优选的)遗传功能技术，以及按照本文所述来进行此类改变。
特异结合Aβ肽并融合到具有受损的效应器功能的重链恒定区域上的多肽也可用于本文所述的方法。在一些实施方式中，多肽包含从抗体9TL或表3所示其娈体获得的序列。在一些实施方式中，多肽从与Aβ肽结合的单结构域抗体获得。可使用本领域已知的方法来产生单结构域抗体。Omidfar et al.，Tumour Biol.25296-305(2004)；Herring et al.，Trends inBiotechnology21484-489(2003)。
在一些实施方式中，抗体或多肽并非F(ab’)2片段。在一些实施方式中，抗体或多肽并非Fab片段。在一些实施方式中，抗体或多肽并非单链抗体scFv。在一些实施方式中，抗体或多肽是PEG化的F(ab’)2片段。在一些实施方式中，抗体或多肽是PEG化的Fab片段。在一些实施方式中，抗体或多肽是PEG化的单链抗体scFv。
本领域中已知的用于制造具有受损的效应器功能的其它方法也可使用。
可在一种或多种检验中对具有经修饰的恒定区域的抗体和多肽加以测试，以评估较之起始抗体而言生物活性中效应器功能降低的水平。例如，可使用本文公开的检验以及本领域任何认可的检验，评估具有改变的Fc区域的抗体或多肽结合补体或Fc受体(例如，小胶质细胞上的Fc受体)或改变的hinge区域的能力。PCT WO 99/58572；Armour et al.，MolecularImmunology 40585-593(2003)；Reddy et al.，J.Immunology 1641925-1933(2000)；Song et al.，Infection and Immunity 705177-5184(2002)。
在一些实施方式中，特异结合beta淀粉质肽的抗体是多克隆抗体。在一些实施方式中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，抗体是人抗体。在一些实施方式中，抗体是嵌合抗体。在一些实施方式中，抗体是人化抗体。在一些实施方式中，抗体是灵长类抗体。见，例如，Yocum et al.，J.Rheumatol.251257-62(1998)；Bugelski et al.，Human & ExperimentalToxicoloy 19230-243(2000)。在一些实施方式中，通过突变对抗体去免疫，使得抗体不能激活人类免疫系统。见，例如，Nanus，et al.，J.Urology170S84-S89(2003)。
本文中使用的Aβ肽包括对淀粉质前体蛋白的酶促切割产物的任何片段。例如，Aβ肽包括Aβ1-40、Aβ1-42或Aβ1-43的任何片段；以及在Aβ1-40、Aβ1-42或Aβ1-43的C末端或N末端截短了数个氨基酸的肽。本文中使用的氨基酸编号基于Aβ1-43的编号(SEQ ID NO17)。
在一些实施方式中，抗体或多肽特异结合Aβ肽1-16位残基中的抗原决定簇。在一些实施方式中，抗体或多肽特异结合Aβ肽16-28位残基中的抗原决定簇。在一些实施方式中，抗体或多肽特异结合Aβ1-40肽28-40位残基中的抗原决定簇。在一些实施方式中，抗体或多肽特异结合Aβ1-42肽28-42位残基中的抗原决定簇。在一些实施方式中，抗体或多肽特异结合Aβ1-43肽28-43位残基中的抗原决定簇。在一些实施方式中，抗体或多肽特异结合Aβ肽，而不结合全长淀粉质前体蛋白(APP)。在一些实施方式中，抗体或多肽特异结合Aβ的聚集形式，而不结合其可溶形式。在一些实施方式中，抗体或多肽特异结合Aβ的可溶形式，而不结合聚集形式。在一些实施方式中，抗体或多肽结合Aβ的聚集形式和可溶形式。结合Aβ的数种聚集形式的抗体是本领域已知的，例如，结合淀粉质beta衍生的可扩散配体(ADDL)的抗体；结合淀粉质纤维和/或沉积物的抗体。WO 03/104437、美国专利申请公开文本2003/0147887、美国专利申请公开文本2004/0219146。
在一些实施方式中，抗体或多肽包含来自3D6免疫球蛋白轻链(美国专利申请公开文本2003/0165496或2004/0087777中的SEQ ID NO2)的一种、两种或三种CDR，和/或来自3D6免疫球蛋白重链(美国专利申请公开文本2003/0165496或2004/0087777中的SEQ ID NO4)的一种、两种或三种CDR。在一些实施方式中，抗体或多肽包含美国专利申请公开文本2003/0165496中SEQ ID NO8示出的可变重链区域，以及美国专利申请公开文本2003/0165496中SEQ ID NO5示出的可变轻链区域。在一些实施方式中，抗体或多肽包含美国专利申请公开文本2003/0165496中SEQID NO12示出的可变重链区域以及美国专利申请公开文本2003/0165496中SEQ ID NO11示出的可变轻链区域。在一些实施方式中，抗体或多肽包含来自10D5免疫球蛋白轻链(美国专利申请公开文本2003/0165496或2004/0087777中的SEQ ID NO14)的一种、两种或三种CDR，和/或来自10D5免疫球蛋白重链(美国专利申请公开文本2003/0165496或2004/0087777中的SEQ ID NO16)的一种、两种或三种CDR。
在一些实施方式中，抗体或多肽特异性结合Aβ1-40的33-40位残基中的抗原决定簇。在一些实施方式中，抗体或多肽能特异结合Aβ1-40上包括35-40位氨基酸的抗原决定簇。在一些实施方式中，抗体或多肽能特异结合Aβ1-40上包括36-40位氨基酸的抗原决定簇。在一些实施方式中，抗体或多肽能特异结合Aβ1-40上包括第39和/或40位氨基酸的抗原决定簇。在一些实施方式中，抗体或多肽能特异结合Aβ1-40但不能特异结合Aβ1-42和/或Aβ1-43。在一些实施方式中，抗体或多肽是抗体9TL或本文所述从9TL获得的抗体或多肽。在一些实施方式中，抗体或多肽竞争性抑制抗体9TL和/或从9TL获得的抗体或多肽与Aβ1-40的结合。在一些实施方式中，抗体不是PCT WO 2004/032868所述的抗体2286。
本发明的抗体和多肽的结合亲和性可变化，不需要(但可以)是特定的值或范围，如下述示例性实施方式所示。本发明的抗体和多肽与Aβ1-40、Aβ1-40或Aβ1-40的结合亲和性可以为大约0.10至大约0.80nM，大约0.15至大约0.75nM，以及大约0.18nM至大约0.72nM。在一些实施方式中，结合亲和性为大约2pM，大约5pM，大约10pM，大约15pM，大约20pM，大约40pM，或者高于大约40pM。在一种实施方式中，结合亲和性在大约2pM至22pM之间。在其它实施方式中，结合亲和性小于大约10nM，大约5nM，大约1nM，大约900pM，大约800pM，大约700pM，大约600pM，大约500pM，大约400pM，大约300pM，大约200pM，大约150pM，大约100pM，大约90pM，大约80pM，大约70pM，大约60pM，大约50pM，大约40pM，大约30pM，大约10pM。在一些实施方式中，结合亲和性为大约10nM。在其它实施方式中，结合亲和性小于大约10nM。在其它实施方式中，结合亲和性小于大约10nM，小于大约50nM，小于大约100nM，小于大约150nM，小于大约200nM，小于大约250nM，小于大约500nM，或者小于大约1000nM。在其它实施方式中，结合亲和性小于大约5nM。在其它实施方式中，结合亲和性小于大约1nM。在其它实施方式中，结合亲和性为大约0.1nM或大约0.07nM。在其它实施方式中，结合亲和性为小于大约0.1nM或者小于大约0.07nM。在其它实施方式中，结合亲和性为从大约10nM、大约5nM、大约1nM、大约900pM、大约800pM、大约700pM、大约600pM、大约500pM、大约400pM、大约300pM、大约200pM、大约150pM、大约100pM、大约90pM、大约80pM、大约70pM、大约60pM、大约50pM、大约40pM、大约30pM、大约10pM中的任何数值到大约2pM、大约5pM、大约10pM、大约15pM、大约20pM或者大约40pM中的任何数值。在一些实施方式中，结合亲和性是大约10nM、大约5nM、大约1nM、大约900pM、大约800pM、大约700pM、大约600pM、大约500pM、大约400pM、大约300pM、大约200pM、大约150pM、大约100pM、大约90pM、大约80pM、大约70pM、大约60pM、大约50pM、大约40pM、大约30pM、大约10pM中的任何数值。在另外一些实施方式中，结合亲和性为大约2pM、大约5pM、大约10pM、大约15pM、大约20pM、大约40pM或者高于大约40pM。
制造抗体和多肽的方法是本领域内已知的和本文所描述的。
竞争试验可用于测定两种多肽是否能通过识别相同的或空间上重叠的抗原决定簇来结合同样的抗原决定簇，或者一种抗体是否能竞争性抑制另一种抗体与抗原的结合。这些试验室本领域中已知的。典型地，抗原被同定于多孔平板上，测量未标记抗体封闭标记抗体的结合的能力。用于此类竞争试验的通用标记是放射活性标记或酶标记。
可针对去除淀粉质沉积物的效果和其它有益作用(例如提高认知)对特异结合Aβ的抗体和多肽加以筛选。例如，可将抗体或多肽施予具有Alzheimer’s病理的动物。多种针对Alzheimer’s症的动物模型是本领域已知的。施予之后，使用本领域已知的以及实施例2中详细描述的方法来测试密实型和扩散型淀粉质斑块水平、认知行为分析以及小胶质细胞作用和微量出血。PCT WO 2004/032868；Wilcock et al.，J.Neurosci.233745-3751(2003)；Wilcock et al.，J.Neuroinflammation 124(2004)。
多核苷酸、载体和宿主细胞 本发明还提供了编码本发明的抗体和多肽(包括下述抗体，其中包含图1显示的轻链和重链可变区域的多肽序列)的分离的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞。
因此，本发明提供了下述多核苷酸(或组合物，包括药物组合物)，其包含编码下述任何物质的多核苷酸(a)抗体9TL或表3所示其变体；(b)抗体9TL或表3所示其变体的片段或区域；(c)抗体9TL或表3所示其变体的轻链；(d)抗体9TL或表3所示其变体的重链；(e)来自抗体9TL或表3所示其变体的轻链和/或重链的一种或多种可变区域；(f)抗体9TL或表3所示其变体的一种或多种CDR(一种、两种、三种、四种、五种或六种CDR)；(g)抗体TL重链的CDR H3(h)来自抗体9TL或表3所示其变体的轻链的CDR L3；(i)来自抗体9TL或表3所示其变体的的轻链的三种CDR；(j)来自抗体9TL或表3所示其变体的重链的三种CDR；(k)来自抗体9TL或表3所示其变体的的重链的三种CDR和来自轻链的三种CDR，以及，(l)包含(b)到(k)中任何一种的抗体。在一些实施方式中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示的任一多核苷酸或两者都包含。
在另一个方面，本发明提供了编码本文所述的任何抗体(包括抗体片段)和多肽的多核苷酸，例如具有受损的效应器功能的抗体和多肽。可通过本领域已知的流程来生产多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供了包含本发明任何多核苷酸的组合物(例如药物组合物)。在一些实施方式中，组合物包含表达载体，所述表达载体饱含编码本文所述9TL抗体的多核苷酸。在另一种实施方式中，组合物包含表达载体，所述表达载体包含编码本文所述任何抗体或多肽的多核苷酸。在又一种实施方式中，组合物包含SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示的任一多核苷酸或两者都包含。表达载体和多核苷酸组合物的施予在本文中有进一步描述。
在另一个方面，本发明提供了生产本文所述任何多核苷酸的方法。
与上述任何序列互补的多核苷酸也由本发明所包括。多核苷酸可以是单链的(编码或反义)或者双链的，其可以是DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子(其含有内含子，以一一对应方式对应于DNA分子)和mRNA分子(其不含内含子)。额外编码或非编码序列可以但不必须存在于本发明的多核苷酸中，多核苷酸可以但不必须与其它分子和/或持材料相连。
多核苷酸可包含天然序列(即，编码抗体或其部分的内源序列)或可包含此类序列的变体。多核苷酸变体含有一处或多处使得被编码多肽的免疫反应活性相对天然免疫反应活性的分子而言不减少的取代、添加、缺失和/或插入。对于被编码多肽的免疫反应的影响通常可按照本文所述来测定。变体优选展示出与编码天然抗体或其部分的多核苷酸序列至少大约70％的相同性，更优选至少大约80％的相同性以及最优选至少大约90％的相同性。
如果按照下文所述针对最大对应性进行对齐时两条序列中核苷酸或氨基酸是一样的，那么两条多核苷酸或多肽序列就被说成是“相同的”。典型地，对两条序列间的比较通过在比较窗上比较序列以鉴定和比较序列相似性的局部区域来进行。本文中使用的“比较窗”指至少大约20个连续位置的片断，通常30至大约75，40至大约50个，其中，两条序列最优对齐之后，序列可与通常数量的连续位置的对照序列相比较。
可使用生物信息学软件Lasergene套装中的Megalign程序(DNASATAR，Inc.，Madison，WI)，使用缺省参数来进行用于比较的序列最优对齐。该程序包含下述文献中描述的数种对齐方案Dayhoff，M.O.(1978)A mmodel of evolutionary change in proteins-Matrices for detectingdistant relationships.In Dayhoff，M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence andStructure、National Biomedical Research Foundation，Washington DC Vol.5，Suppl.3，pp.345-358；Hein J.，1990，Unifed Approach，to Alignment andPhylogenes pp.626-645Methods in Enzymology vol.183，Academic Press，Inc.，San Diego，CA；Higgins，D.G.and Sharp，P.M.，1989，CABIOS 5151-153Myers，KW.and Muller W.，1988，CABIOS411-17；Robinson，E.D.，1971，Comb.Theor.11105；Santou，N.，Nes，M.，1987，MoI. Biol.Evol.4406-425；Sneath，P.H.A.and Sbkal，R.R.，1973，Numericatl Taxonomy the Principles andPractice of Numerical Taxonomy，Freeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，WJ.and Lipman，D.J.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80726-730。
优选地，通过在至少20个位置的比较窗上对两条经过最优对齐的序列进行比较来确定“百分比序列相同性”，其中，比较窗中的多核苷酸或多肽序列的部分较之用于对两条序列进行最优对齐的参照序列(其不包含添加或缺失)而言可包含百分之二十或更少的添加或缺失(即，缺口)，通常百分之五至十五，或者百分之十至十二。该百分比是这样计算出来的确定两条序列中存在的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量，产生匹配位置数，将匹配位置数除以对照序列中位置总数(即，窗口大小)，以及将结果乘以100，产生序列相同性的百分比。
变体也可以，或者替代性地与天然基因或其片段或其互补序列实质上同源。此类多核苷酸变体能在中等严谨条件下与天然存在的编码天然抗体的DNA序列(或其互补序列)杂交。
合适的“中等严谨条件”包括在5X SSC、0.5％ SDS、1.0mMEDTA(pH 8.0)的溶液中预先洗涤；在50℃-65℃，5X SSC中杂交过夜；接着在65℃用2X、0.5X和0.2X SSC(含0.1％SDS)洗两次。
本文中使用的“高度严谨条件”或“高严谨度条件”是下述这些(1)使用低离子强度和高温用于洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠在5℃进行；(2)杂交期间使用变性剂，例如甲酰胺，例如，50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，在pH 6.5，与750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠，42℃进行；或(3)使用50％甲酰胺、5XSSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt’s溶液、超声波处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，在42℃进行，于42℃在0.2xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)洗，以及于55℃在50％甲酰胺中洗，接着是高严谨度洗涤，由含有0.1x SSC的EDTA在55℃进行构成。技术人员将知道如何调节适合探针长度等因素所必需的温度、离子强度等。
本领域普通技术人员将知道，作为遗传密码简并性的结果有很多核苷酸序列编码本文所述的多肽。这些多肽中的一些具有与任何天然基因核苷酸序列最小程度的同源性。但是，由于密码子使用中的差异而发生变化的多核苷酸也被本发明特别包括。此外，包含本文提供的多核苷酸序列的等位基因也在本发明的范围内。等位基因是内源基因，其是作为一种或多种突变(例如核苷酸的缺失、添加和/或取代)的结果被改变的。得到的mRNA和蛋白可以但不必需具有改变的结构或功能。可使用标准技术(例如杂交、扩增和/或数据库序列比较)来鉴定等位基因。
可使用化学合成、重组方法或PCR来获得本发明的多核苷酸。化学多核苷酸合成方法是本领域公知的，无须在此详细描述。本领域技术人员可使用本文提供的序列和商业DNA合成仪来生产想要的DNA序列。
为使用重组方法制备多核苷酸，如本文中进一步讨论的，可将包含想要的序列的多核苷酸插入到合适的载体中，随后可将载体引入合适的宿主细胞，用于复制和扩增。可通过本领域已知的任何方法将多核苷酸插入宿主细胞。通过直接摄取、内吞作用、转染、F-接合或电穿孔引入外来多核苷酸，对细胞进行转化。一旦引入后，可将外来多核苷酸在细胞中保持为非整合载体(例如质粒)或整合进宿主细胞基因组。可通过本领域公知的方法从宿主细胞分离出由此扩增的多核苷酸。见，例如，Sambrook et al.(1989)。
或者，PCR允许复制DNA序列。PCR技术是本领域公知的，其被描述于美国专利4,683,195、4,800,159、4,754,065和4,683,202以及PCRThePolymerase Chain Reaction，Mullis et al.eds.，Birkauswer Press，Boston(1994)中。
可通过在合适的载体中使用经分离的DNA并将其插入到合适的宿主细胞中来获得RNA。当细胞复制且DNA转录为RNA时，接着可使用本领域技术人员公知的方法来分离RNA，例如Sambrook et al.，(1989)所述。
可根据标准技术来构建合适的克隆载体，或者从本领域可获得的大量克隆载体来选择。虽然选出的克隆载体可根据即将使用的宿主细胞有所变动，但是有用的克隆载体通常具有自主复制的能力，并可具有针对特定限制性内切酶的单一目标位点和/或可携带用作为标记的基因(其可用于筛选含有载体的克隆)。合适的例子包括质粒和细菌病毒，例如，pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA以及穿梭载体，例如pSA3和pAT28。上述和其它很多克隆载体可从商业供货商获得，例如，从BioRad、Strategene和Invitrogen获得。
表达载体通常是可复制的多核苷酸构建体，其含有根据本发明的多核苷酸。已指出，表达载体应可在宿主细胞中作为游离体或作为染色体DNA的整合部分复制。合适的表达载体包括但不限于质粒、病毒载体(包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒)、粘粒和PCT公开文本WO87/04462中公开的表达载体。载体组分通常可包括但不限于下述物质中的一种或多种信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、合适的转录控制元件(例如启动子、增强子和终止子)。为进行表达(即，翻译)，通常还需要一种或多种转录控制元件，例如核糖体结合位点、翻译起始位点和终止密码子。
含有目标多核苷酸的载体可通过多种合适方法中的任何方法被引入到宿主细胞中，所述方法包括电穿孔，使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质进行转染，微注射轰击，脂质体转染(lipofection)和感染(例如，其中载体是感染试剂，例如牛痘病毒)。对引入载体或多核苷酸的选择通常将取决于宿主细胞的特征。
本发明还提供了包含本文所述任何多核苷酸的宿主细胞。能过量表达异源DNA的宿主细胞可被用于分离编码抗体、多肽或目标蛋白的基因的目的。关于哺乳动物细胞的非限制性例子包括但不限于COS、HeLa和CHO细胞。还见PCT公开文本WO 87/04462。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(例如E.coli或B.subtilis)和酵母(例如S.cerevisae、S.pombe或K.lactis)。优选地，宿主细胞以是宿主细胞中相应内源的目标抗体或蛋白(如果存在的话)表达水平的大约5倍高，更优选10倍高，进一步更优选20倍高的水平表达cDNAs。针对与Aβ1-40的特异结合对宿主细胞的筛选可由免疫检验或FACS来进行。过量表达目标抗体或蛋白的细胞可被鉴定出。
具有受损的效应器功能的从9TL获得的抗体和抗Aβ抗体的诊断用途 与AAβ1-40的C末端结合的抗体9TL可用于鉴定或检测Aβ1-40的存在与否。为简单起见，通常提到9TL或抗体，此时应理解为这些方法适用于本文所述的任何Aβ1-40结合实施方式(例如多肽)。检测通常涉及将生物样品与本文所述的结合Aβ1-40的抗体接触，以及在Aβ1-40和特异结合Aβ1-40的抗体(例如9TL)之间形成复合体。此类复合体的形成可以是体内或体外的。本文中使用的术语“检测”包括在有或没有对照的情况下进行的定性和/或定量检测(测量水平)。
已知的大量方法中的任何都可用于检测，它们包括但不限于，免疫试验，使用结合多肽的抗体，例如通过酶联免疫吸附检验(ELISA)，放射免疫检验(RIA)等；以及针对被编码多肽的功能性检验，例如结合活性或酶检验。在一些实施方式中，抗体被加上可检测的标记。其它实施方式是本领域已知的以及本文描述的。
本发明的抗体和多肽可用于检测、诊断和监测与改变的或异常Aβ或βAPP表达相关的疾病、状态或紊乱，例如Alzheimer’s症和Down’s综合征。因此，在一些实施方式中，本发明提供了下述方法，所述方法包括将怀疑具有改变的或异常的Aβ表达的个体的标本(样品)与本发明的抗体或多肽相接触，以及测定Aβ1-40的水平是否不同于对照或比较标本的水平。在其它实施方式中，本发明提供了下述方法，所述方法包括接触个体的标本(样品)以及测定Aβ1-40的表达水平。
就诊断应用而言，可用可检测的片断(包括但不限于，放射性同位素、荧光标记以及多种酶-底物标记)对抗体进行标记。将标记与抗体桥联的方法是本领域已知的。在本发明的其它实施方式中，本发明的抗体无需被标记，可使用与本发明抗体结合的被标记抗体来检测其存在。
本发明的抗体可用于任何已知的检验方法，例如，竞争性结合检验、直接或间接三明治检验和免疫沉淀检验。Zola，Monoclonal AntibodiesAManual of Techniques，pp.147-158(CRC Press，Inc.1987)。
抗体还可用于体内诊断检验，例如体内影像。通常，用放射性核(例如111In、99Tc、14C、131I、125I或3H)标记抗体，使得可使用免疫闪烁照相来定位目标细胞或组织。
抗体还可在病理学中按照本领域公知的技术用作为染色试剂。
具有受损的效应器功能的抗Aβ抗体可用于针对对有AD风险或被诊断为有AD的个体的诊断来测量脑淀粉质负荷，以及评估任何处理的进程和疾病阶段。已有报道，周质施予单克隆抗Aβ抗体导致Aβ在血浆中增加，这种增加的倍数与海马体和皮质中的淀粉质负荷高度相关。DeMattoset al，Science 2952264-2267(2002)。在一些实施方式中，具有受损的效应器功能的抗Aβ抗体被施予个体，测量血浆中Aβ的水平，其中，血浆Aβ的增加表明了个体中脑淀粉质负荷的存在和/或水平。这些方法可被用于监测治疗的效果以及疾病阶段，以及确定未来的剂量和频率。具有受损的效应器功能的抗体可以具有更好的安全性质，对这些诊断用途提供好处。
使用抗Aβ抗体用于治疗目的的方法 本文所述的抗体(包括多肽)、多核苷酸和药物组合物可用于治疗、预防和抑制下述疾病发展的方法，所述疾病特征在于蛋白在个体脑中的异常沉积。所述方法包括向所述个体施予有效量的、特异结合所述蛋白或蛋白沉积物的抗体，或编码所述抗体的多核苷酸，其中，所述抗体具有受损的效应器功能。例如，特异结合朊病毒蛋白或朊病毒蛋白聚集形式并且具有受损的效应器功能的抗体可被施予个体，用于对朊病毒疾病进行预防和/或治疗处理；特异结合突触核蛋白(例如alpha突触核蛋白)或突触核蛋白聚集形式并且具有受损的效应器功能的抗体可被用于个体，用于对Parkinson’s症进行预防和/或治疗处理。
本文所述的抗体(包括多肽)、多核苷酸和药物组合物可用于治疗、预防和抑制Alzheimer’s症和下述其它疾病发展的方法，所述疾病与改变的Aβ或βAPP表达或者Aβ肽的积累或沉积相关(统称为“Aβ相关疾病”)，例如Down’s综合征、Parkinson’s症、多发梗塞性痴呆、轻度认知障碍、脑部淀粉质血管病、Aβ肽在脑血管中沉积导致的血管紊乱(例如中风和HCHWA-D)。此类方法向所述个体施予抗体、多肽或多核苷酸或药物组合物。在预防应用，药物组合物或药物可被施予怀疑有Alzheimer’s症(或其它Aβ相关疾病)或有其风险的个体，施予的量足以消除或降低风险、减轻严重性，或延缓疾病的发病，这包括该疾病的生物化学、组织学和/或行为学症状，其并发症以及疾病发展期间表现出来的中间病理表型。在治疗应用中，组合物或药物被施予怀疑有，或者已经遭遇到此类疾病的患者，施予的量足以治愈或者至少部分抑制疾病症状(生物化学的、组织学的和/或行为学的)，包括其并发症以及疾病发展期间表现出来的中间病理表型。
本发明还提供了延缓个体中与Alzheimer’s症(或其它Aβ相关疾病)相关的症状发展的方法，所述方法包括向所述个体施予有效剂量的包含本发明所述抗体、多肽或多核苷酸的药物组合物。与Alzheimer症相关的症状包括但不限于记忆力、问题解决能力、语言、计算、视觉空间感知力、判断和行为的异常。
本发明还提供了抑制或遏制个体中淀粉质斑块形成和/或Aβ积累的方法，所述方法包括向所述个体施予有效剂量的包含本发明所述抗体、多肽或多核苷酸的药物组合物。在一些实施方式中，淀粉质斑块在个体的脑中。在一些实施方式中，淀粉质斑块在个体的脑部血管系统中。在其它实施方式中，Aβ积累在个体的循环系统中。
本发明还提供了在个体中减少淀粉质斑块和/或减少或减缓Aβ积累的方法，所述方法包括向所述个体施予有效剂量的包含本发明所述抗体、多肽或多核苷酸的药物组合物。在一些实施方式中，淀粉质斑块在个体的脑中。在一些实施方式中，淀粉质斑块在个体的脑部血管系统中。在其它实施方式中，Aβ积累在个体的循环系统中。
本发明还提供了去除或清除个体中淀粉质斑块和/或Aβ积累的方法，所述方法包括向所述个体施予有效剂量的包含本发明所述抗体、多肽或多核苷酸的药物组合物。在一些实施方式中，淀粉质斑块在个体的脑中。在一些实施方式中，淀粉质斑块在个体的脑部血管系统中。在其它实施方式中，Aβ积累在个体的循环系统中。
本发明还提供了在个体中减少组织(例如脑)中Aβ肽、抑制和/或减少Aβ肽在组织(例如脑)中的积累以及抑制和/或降低Aβ肽在组织(例如脑)中的毒性作用的方法，所述方法包括向所述个体施予有效剂量的包含本发明所述抗体、多肽或多核苷酸的药物组合物。Aβ肽可以是可溶、寡聚或沉积形式的。Aβ的寡聚形式可由2-50个Aβ多肽构成，其可以是全长1-40和1-42肽和/或这些肽的任何截短版本的混合物。
本发明还提供了在个体中提高认知或逆转Aβ淀粉质沉积物相关疾病相关的认知衰退的方法，所述方法包括向所述个体施予有效剂量的包含本发明所述抗体、多肽或多核苷酸的药物组合物。
本发明还提供了治疗或预防与Aβ淀粉质沉积物相关的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施予有效剂量的药物组合物，所述药物组合物包含特异结合beta淀粉质肽或beta淀粉质肽聚集形式的抗体，其中所述抗体包含与天然存在的Fc区域有变化的Fc区域，其中，所述变化导致受损的效应器功能，由此施予所述抗体较之施予没有变化的抗体而言导致更少的脑部微量出血。
蛋白在脑中的异常沉积与大量紊乱相关，其中一些还可表征为由于淀粉质形成蛋白的同时沉积导致的淀粉质疾病或淀粉样变性病(amyloidose)。
淀粉样变性病是特征为蛋白纤维细胞外沉积(其形成淀粉质沉积)的紊乱。虽然这些状况的大部分都与外周中淀粉质沉积相关，但有很多淀粉样变性病中是中枢神经系统纤维沉积占据主要部分。WO 00/72876描述了多种中枢和外周淀粉样变性病。
Alzheimer’s症是最为人们熟知的并且可能是最常见的中枢神经系统淀粉质疾病。如其它地方总结的，该状况特征在于含A-beta的斑块以及神经元纤维缠结。老年痴呆的多种形式与类似但更少进展性的A-beta斑块形成相关，如Down’s综合征一样。
内皮抑素(endostatin，20kDa的胶原蛋白XVIII C末端片段)异常沉积已在Alzheimer’s患者脑中被观察到，其中，其与淀粉质beta(1-40)定位在一起。Deininger，M.H.，et al.，(2003)J.Neurosci 22(24)10621-10626。
淀粉样蛋白胱抑素(cystatin)C的变体(L68Q胱抑素C)与大量脑部淀粉样变性病相关，其以淀粉质血管病的遗传形式(遗传性胱抑素C淀粉质血管病)导致脑微量出血以及英年早逝。胱抑素C的正常变体(wt1胱抑素C)被发现与Alzheimer’s症中作为淀粉质斑块组分的A-beta肽相关。
在确定外来试剂能否遏制胱抑素C(L68Q或wt1胱抑素C)二体形成的研究中，Nilsson和同事将针对wt1胱抑素C的抗体和两种变体蛋白的单体形式在溶液中一起温育，观察到了蛋白二体形成的降低。Nilsson，M.etal.(2004)J.Biol.Chem.279(3)24236-45。
Down综合征特征在于A-beta斑块的沉积、凋亡性细胞死亡以及异常树突状分支，这部分地是由于下述基因的组成性增加的表达导致的，所述基因包括淀粉质前体蛋白(APP)和其它蛋白(超氧化物歧化酶I以及S100-beta)，它们都定位于Down基因座。还有些与Down基因座(在21染色体号片断上的基因)不相连的基因的异常表达——GAP-43、氧化氮合成酶3、神经丝蛋白、前凋亡基因(例如p53、Bax和LI-1 beta转化酶)。这些非Down基因座基因的表达与凋亡性细胞死亡和营养障碍性神经炎的增殖相关。de la Monte，S.M.1999.，J.Neural Transm.Suppl.571-19。
A-beta肽形成的淀粉质斑块在脑中的沉积也是HIV-AIDS患者中常见的病理学特征。Green，D.A.，et al.(2005)AIDS 19(4)407-11。类似地，含A-beta肽的斑块的沉积也已在人类外伤性脑损伤之后立即观察到，其中，A-beta与APP和神经纤维蛋白共同定位于肿胀的轴突中。Smith，D.H.，et al.(2003)98(5)1072-7。具有末期获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的患者脑部也显示出具有增加水平的泛素染色点状沉积物。Gelman，B.B，，andSchuenke，K.(2004)J.Neurovirol 10(2)98-108。
淀粉样瘤是CNS淀粉样变性病的相对稀少的形式，其表现为淀粉质肿瘤的形式，通常在脉络丛中出现，具有向白质的次级延伸。脑实质的初级淀粉样瘤包含由淀粉质AL lambda轻链构成的损伤。Tabatbai，G.，et al.(2005)Arch Neurol. 62(3)477-80。
已在携带有针对家族性淀粉质多发性神经病(FAP)的转甲状腺素蛋白Tyr77(Tyr77FAP)变体的基因的患者中的脑MRI中观察到了多焦点白质损伤。Lossos，A.，et al.Eur.Neurol.2005.53(2)55-9。
家族性软脑膜淀粉质变性病与转甲状腺素蛋白(TTR)变体Asp18Gly(D18G)的遗传异常相关。Jin，K.，et al J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry(2004)75(10)1463-66。TTR的D18G变体形式还显示出导致了匈牙利患者中的CNS淀粉样变性病。根据一份报道，该蛋白的四聚体形式的小分子稳定剂可预防淀粉质形成。Hammarstrom，P.et al.(2003)Biochemistry42(22)6656-63。
编码alpha-突触核蛋白的基因中的突变已被发现可导致Parkinson’s症的至少一些家族形式，其中，alpha-突触核蛋白已显示出异常衍生化以及形成了神经元和胶质内含物。Alpha突触核蛋白还能在体外形成纤维，使得Parkinson’s症被归类为脑淀粉样变性病。Trojanowski，J.Q.and Lee，V.M.(2003)AnnNY Acad.Sci. 991107-110。
少突神经胶质细胞中内含alpha-突触核蛋白表征出多系统萎缩(MSA)。Kahle，P.M.，et al.2002.EMBO rep.3(6)583-8。
PrPSc是细胞朊病毒蛋白(PrPC)的异常形式，这是附着到神经元和其它细胞细胞膜上的铜结合糖蛋白。PrP淀粉质积累通常与PrP脑部淀粉质血管病(PrP-CAA)相关，其中，积累在神经元纤维缠结以及血管淀粉质中，以及在Gerstmann-Straussler-Scheinker症中发生，其中，实质淀粉样变性病可以以与神经元纤维缠结的海绵状变性相关的形式存在。Ghetti，B.，et al.Clin.Lab.Med.(2003)23(1)65-85。还发现PrPSc的沉积与人的海绵状脑病(变体Creutzfeld-Jacob症)相关。通过抗PrP单链微型抗体对朊病毒蛋白增殖的旁分泌抑制已被报道。Heppner et al.，J.Viol.798330-8；2005。
下表提供了对下述疾病例子的总结，所述疾病与异常脑蛋白沉积和用于沉积物的蛋白组分相关。使用本领域已知的方法和本文所述的方法，或本领域已知的抗体，可产生针对这些组分的抗体。
本文所述的方法(包括预防和治疗)可通过在单一时间点或或多个时间点向单一位点或多个位点进行单次直接注射来完成。施予还可对多个位点近乎同时地进行。可在治疗过程中确定和调节施予的频率，该频率基于完成想要的结果。在一些情况下，本发明抗体(包括多肽)、多核苷酸和药物组合物的缓释配方可能是合适的。用于获得缓释效果的多种配方和设备是本领域已知的。
“患者”或“个体”包括哺乳动物，例如人、牛、马、犬、猫、猪和羊类动物。个体优选是人，其可以是或可以不是受疾病或本文展示的症状折磨的。在Alzheimer’s症的情况下，事实上，任何人如果活得足够长，他或她都会处于遭遇Alzheimer’s症的风险中。因此，本发明的方法可预防性地施予普通人群，而无需对个体患者风险进行任何评估。本发明的方法可用于确实具有已知的Alzheimer’s症遗传风险的个体。此类个体包括有已经历过该疾病的亲戚的那些，以及通过遗传或生物化学标记分析确定了其风险的那些。Alzheimer’s症风险的遗传标记包括APP基因的突变，特别是分别被称为Hardy和Swedish突变的717位和670以及671位的突变(见Hardy(1997)Trends Neurosci.20154-9)。风险的其它标记是早老蛋白基因，PS1和PS2以及ApoE4，AD家族病史，高胆固醇血或动脉硬化。正遭受Alzheimer’s症的个体可通过特征性痴呆以及上述风险因子的存在的来识别。此外，用于鉴定具有AD的个体的大量诊断测试是现成可用的。这些包括对CSF tau和Aβ42水平的测量。升高tau和降低的Aβ42水平表明了AD的存在。还可通过ADRDA(Alzheimer’s Disease and RelatedDisorders Association)标准来诊断遭受Alzheimer’s症的个体。在没症状的患者中，治疗可在任何年龄开始(例如，10、20、30)。但是通常，在患者达到40、50、60或70岁之前不必开始治疗。典型地，治疗在一段时间施予多种剂量。可通过本领域已知的多种方式在一段时间对治疗加以监测。在可能的Down’s综合征患者的情况下，可通过向母亲施予治疗试剂在出生前即开始治疗或者出生之后立即开始。
可用于上述方法的药物组合物包括本文所述的任何抗体、多肽和/或多核苷酸。在一些实施方式中，抗体是抗体9TL或表3所示其变体。在一些实施方式中，抗体是特异结合Aβ肽且包含具有受损效应器功能的恒定区域的抗体。
施予和剂量 优选地，通过载体向哺乳动物施予抗体；优选地，通过药学上可接受的载体。合适的载体及其配方描述于Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th edition，A.Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easto，PA，1990和Remington，The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing，2000中。典型地，合适的量的药学上可接受的盐被用于配方，以使配方等渗。载体的例子包括盐水、Ringer’溶液以及葡萄糖溶液。溶液的pH优选为大约5至大约8，更优选为大约7至大约7.5。其它载体包括缓释制剂，例如含有抗体的固体疏水聚合物的半透基质，所述基质为有形状物体(例如，薄膜、脂质体或微粒)的形式。取决于例如施予途径和被施予抗体的浓度，某些载体更为优选，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
抗体可通过注射(例如全身性、静脉内、腹膜内、皮下、肌内、门静脉内、脑部内、脑部血管内以及鼻内)或通过能确保有效剂量到血流的其它方法，例如，输注(infusion)施予哺乳动物。还可通过分离灌注技术，例如分离组织灌注来施予抗体，以施加局部治疗作用。静脉内注射是优选的。
施予抗体的有效剂量和时间表可根据经验确定，如何做出此类决定是本领域技术人员已知的。本领域技术人员将理解，应被施予的抗体的剂量将根据例如将获得抗体的哺乳动物、施予途径、所用的抗体的特定类型以及施予哺乳动物的其它药物而有所变动。选择抗体合适剂量的指导可在关于抗体治疗用途的文献，例如Handbook of Monoclonal Antibodies，Ferroneet al.，eds.，Noges Publications，Park Ridge，N.J.，1985，ch.22and pp.303-357；Smith et al.，Antibodies in Human Diagnosis and Therapy，Haber et al.，eds.，Raven Press，New York，1977，pp.365-389中找到。单独使用的抗体的典型剂量可在每天大约1μg/kg至高达100mg/kg体重或更大的剂量范围内变动，这取决于上文提到的因素。通常，下述任何剂量都可以使用至少大约50mg/kg体重；至少大约10mg/kg体重；至少大约3mg/kg体重；至少大约1mg/kg体重；至少大约750μg/kg体重；至少大约500μg/kg体重；至少大约250μg/kg体重；至少大约100μg/kg体重；至少大约50μg/kg体重；至少大约10μg/kg体重；至少大约1μg/kg体重或更多的剂量被施予。在治疗开始可以以较低剂量或较小频率施予抗体，以避免可能的副作用，例如暂时的脑部淀粉质血管病(CAA)。
在一些实施方式中，可存在超过一种抗体。此类组合物可含有本发明的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同抗体(包括多肽)。
抗体可组合有效量的一种或多种其它治疗试剂施予哺乳动物。抗体可与一种或多种其它治疗试剂顺序或同时施予。抗体和治疗试剂的量取决于，例如，使用何种类型的药物、被处理的病理状况以及施予的时间安排和途径，但通常会少于每种单独施予的量。
将抗体施予哺乳动物之后，可通过本领域技术人员公知的多种方式监测哺乳动物的生理状况。
上述关于施予和剂量的原则可针对本文所述的多肽有所改动。
编码本文所述的抗体或多肽的多核苷酸还可用于在目标细胞中运送和表达抗体或多肽。明显地，表达载体可用于指导抗体的表达。表达载体可通过全身性、腹膜内、静脉内、肌内、皮下、胸内、心室内、口服、肠道、非肠道、鼻内、通过皮肤方式或通过吸入施予。例如，表达载体的施予包括局部或全身性施予，包括注射、口服、微粒枪或导管插入施予以及局部(topical)施予。本领域技术人员熟悉表达载体的施予，以获得外源蛋白在体内的表达。见，例如，美国专利6,436,908、6,413,942和6,376,471。
包含编码本发明抗体的多核苷酸的治疗组合物的定向运送也可使用。在例如Findeis et al.，Trends Biotechnol.(1993)11202；Chiou et al.，GeneTherapeuticsMethods And Applications Of Direct Gene Transfer(J.A.Wolff，ed.)(1994)；Wu et al.，J.Biol Chem.(1988)263621；Wu et al.，J.Biol Chem.(1994)269542；Zenke et al，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1990)873655；Wu et al.，J.Biol.Chem.(1991)266338中描述了受体介导的DNA运送技术。就基因疗法方案的局部施予而言，含有多核苷酸的治疗组合物以大约100ng至大约200mg DNA的范围施予。在基因疗法方案中，大约500ng至大约50mg、大约1μg至大约2mg、大约5μg至大约500μg，以及大约20μg至大约100μgDNA的浓度范围也可使用。本发明的治疗多核苷酸和多肽可使用基因运送载体运送。基因运送载体可以是病毒或非病毒来源的(一般而言，见Jolly，Cancer Gene Therapy(1994)151；Kirnura，Human Gene Therapy(1994)5845；Connelly，Human Gene Therapy(1995)1185和Kaplitt，Nature Genetics(1994)6148)。可使用内源哺乳动物的或异源的启动子来诱导此类编码序列的表达。编码序列的表达可以是组成型的或受调控的。
用于运送想要的多核苷酸以及在目标细胞中表达的基于病毒的载体是本领域公知的。示例性的基于病毒的介体包括但不限于，重组逆转录病毒(PCT公开文本WO 90/07936、WO 94/03622、WO 93/25698、WO93/25234、WO 93/11230、WO 93/10218、WO 91/02805，美国专利5,219,740、4,777,127，英国专利2,200,651和EP0345242)、基于alpha病毒的载体(例如，Sindbis病毒载体、Semliki森林病毒(ATCC VR-67、ATCC VR-1247)、Ross River病毒(ATCC VR-373、ATCC VR-1246)和Venezuelan马脑炎病毒(ATCC VR-923、ATCC VR-1250、ATCC VR1249、ATCC VR-532))以及腺相关病毒(AAV)载体(见，例如PCT公开文本WO 94/12649、WO 93/03769、WO 93/19191、WO 94/28938、WO 95/11984和WO 95/00655)。Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3147中描述的与灭活腺病毒相连的DNA的施予也可使用。
还可使用非病毒运送介体和方法，其包括但不限于，连接或未连接灭活腺病毒的聚阳离子缩合DNA单独使用(见，例如Curiel，Hum.GeneTher.(1992)3147)；连接有配体的DNA(见，例如Wu，J.Biol.Chem.(1989)26416985)；真核细胞运送介体细胞(见，例如美国专利5,814,482，PCT公开文本WO 95/07994、WO 96/17072、WO 95/30763和WO 97/42338)以及核酸电荷中和或与细胞膜融合。裸DNA也可使用。示例性裸DNA引入方法描述于PCT公开文本WO 90/11092和美国专利5,580,859中。可用作为基因运送介体的脂质体描述于美国专利5,422,120，PCT公开文本WO 95/13796、WO 94/23697、WO91/14445和EP 0524968中。其它手段描述于Philip，Mol Cell Biol(1994)142411和Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)911581中。
试剂盒 本发明还提供了含有用于治疗本文描述的病理性状况或者用于检测或纯化Aβ或βAPP的材料的产品(articles of manufacture)和试剂盒，所述状况例如Alzheimer’s症或与Aβ相关的其它疾病(例如Down’s综合征、Parkinson’s症、多发梗塞性痴呆、轻度认知障碍、脑部淀粉质血管病、血管中Aβ肽沉积物导致的血管紊乱(例如中风和HCHWA-D))。所述产品包含带标签的容器。合适的容器包括，例如，瓶子、小管和试管。容器可以用多种材料(例如玻璃或塑料)制成。容器中装纳有下述组合物，其中具有有效于治疗病理性状况或者有效于检测或纯化Aβ或βAPP的活性试剂。组合物中的活性试剂是抗体，优选包含特异于Aβ或βAPP的单克隆抗体。在一些实施方式中，活性试剂包含抗体9TL或从抗体9TL获得的任何抗体或多肽。在一些实施方式中，活性试剂包含具有受损效应器功能的抗Aβ抗体或多肽。在一些实施方式中，抗Aβ抗体或多肽包含重链恒定区域，其中，所述恒定区域具有受损的效应器功能。容器上的标签标明，该组合物用于治疗病理性状况，例如Alzheimer’s症，或用于检测或纯化Aβ或βAPP，其还可标明对体内或体外使用的指导，例如上文所述的那些。
本发明还提供了试剂盒，其中包含本文所述的任何抗体(例如9TL)、多肽、多核苷酸。在一些实施方式中，本发明的试剂盒包含上文所述的容器。在其它实施方式中，本发明的试剂盒包含上文所述的容器以及包含缓冲液的第二容器。其还可包括从商业和用户角度来说需要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和包装塞入物以及用于进行本文所述任何方法(例如用于治疗Alzheimer’s症的方法以及用于抑制或减少Aβ肽在脑中积累的方法)的说明书。在待用于检测或纯化Aβ或βAPP的试剂盒中，典型地，用可检测到的标记来标记抗体，例如，用放射性同位素、荧光化合物、生物法光化合物、化学法光化合物、金属螯合剂或酶。
在一些实施方式中，本发明提供了用于本文所述的任何方法的组合物(本文中描述的)，其中，上下文中用作为药物或用于生产药物。
下述实施例提供来阐述本发明，而非加以限制。
实施例 实施例1抗体9TL及其变体的结合亲和性测定 A.通用方法 本实施例中使用了下述通用方法。
用于克隆分析的表达载体 抗体Fab片段的表达在IPTG可诱导的lacZ启动子的控制下进行，这类似于Barbas(2001)Phage displaya laboratory manual，Cold Spring Harbor，NY，Cold Spring Harbor Laboratory Press pg2.10.Vector pComb3X所述，但是，修饰包括增加和表达下述额外结构域人Kappa轻链恒定结构域以及IgG2a人免疫球蛋白的CHI恒定结构域，Ig gamma-2链C区域，蛋白编号为P01859；免疫球蛋白kappa轻链(人)，蛋白编号为CAA09181。
小规模Fab制备 按照下文所述在96孔板中进行小规模的Fab表达。从经过Fab文库转化的E.coli起始，捡出菌落，接种主板(琼脂LB+氨苄青霉素(50μg/ml)+2％葡萄糖)和工作板(2ml/孔，96孔板，其中含有1.5mL LB+氨苄青霉素(50μg/ml)+2％葡萄糖)。两种板都在30℃培养8-12小时。将主板贮藏在4℃，在5000rpm沉淀来自工作板的细胞，重新悬浮于1mL LB+氨苄青霉素(50μg/ml)+1mM IPTG中，以诱导Fab表达。30℃5小时的表达时间后，通过离心收获细胞，然后重新悬浮于500μL缓冲液HBS-P(10mM HEPES缓冲液pH7.4，150mM NaCl，0.005％P20)中。通过冷冻(-80℃)接着37℃解冻的一个循环，获得对HBS-P重新悬浮细胞的裂解。以5000rpm对细胞裂解物离心30分钟，将细胞残骸与含有Fab的上清液分开。然后将上清液注射进BIAcore等离子共振装置，获得针对每种Fab的亲和性信息。从主板补救出(rescue)表达Fab的克隆克隆，对DNA进行测序，用于下文所述的大规模Fab生产和详细分析。
大规模Fab制备 为获得详细的动力学参数，从大量培养物表达和纯化Fab。用来自选出的Fab表达E.coli克隆的5mL过夜培养物去接种含有200mL LB+氨苄青霉素(50μg/ml)+2％葡萄糖的Erlenmeyer瓶。在30℃培养克隆，直到获得1.0的OD550nm，然后通过将培养基替换为200mL LB+氨苄青霉素(50μg/ml)+1mM IPTG来诱导。30℃，5小时表达时间后，通过离心沉淀细胞，然后重新悬浮于10mLPBS(pH 8)中。通过两个冷冻/解冻(分别在-80℃和37℃进行)循环来获得对细胞的裂解。细胞裂解物上清液被上样至用PBS(pH 8)平衡过的Ni-NTA超流琼脂糖凝胶(Qiagen，Valencia，CA)柱，然后用5倍柱体积的PBS(pH 8)去洗。各个Fab用PBS(pH 8)+300mM Imiazol洗脱成不同的部分。收集含有Fab的部分，在PBS中透析，然后在亲和性分析之前通过ELISA进行定量。
全抗体制备 为表达全抗体，在哺乳动物表达载体中克隆重链和轻链可变区域，用脂质体转染剂(lipofectamine)将其转染进HEK 293细胞，用于短暂表达。使用标准方法，用蛋白A来纯化抗体。
载体pDb.9TL.hFc2a是包含9TL抗体重链的表达载体，其适用于重链的短暂或稳定表达。载体pDb.gTL.hFc2a具有对应于下述区域的核苷酸序列鼠细胞巨化病毒启动子区域(核苷酸1-612)；合成内含子(核苷酸619-1507)；DHFR编码区域(核苷酸707-1267)；人生长激素信号肽(核苷酸1525-1602)；9TL的重链可变区域(核苷酸1603-1951)；含有下述突变的人重链IgG2a恒定区域A330P331至S330S331(氨基酸编号参照野生型IgG2a序列；见，Eur.J.Immunol.(1999)292613-2624))SV40晚期聚腺苷化信号(核苷酸2960-3203)；SV40增强子区域(核苷酸3204-3449)；噬菌体fl区域(核苷酸3537-4992)和beta内酰胺酶(AmpR)编码区域(核苷酸4429-5286)。载体pDb.9TL.hFc2a于2004年7月20日保藏于ATCC，被指定了ATCC编号PTA-6124。
载体pEb.9TL.hK是包含9TL抗体轻链的表达载体，其适用于短暂表达轻链。载体PEb.9TL.hK具有对应于下述区域的核苷酸序列鼠细胞巨化病毒启动子区域(核苷酸1412)；人EF-1内含子(核苷酸619-1142)；人生长激素信号肽(核苷酸1173-1150)；抗体9TL轻链可变区域(核苷酸1251-1593)；人kappa链恒定区域(核苷酸1594-1914)SV40晚期聚腺苷化信号(核苷酸1932-2175)；SV40增强子区域(核苷酸2176-2421)；噬菌体fl区域(核苷酸2509-2964)和beta内酰胺酶(AmpR)编码区域(核苷酸3401-4258)。载体pEb.9TL.hK于2004年7月20日保藏于ATCC，被指定了ATCC编号PTA-6125。
Biacore检验 使用BIAcore3000TM表面等离子共振(SPR)系统(BIAcore，INC，Piscaway NJ)来测定9TL单克隆抗体的亲和性。测定亲和性的一种方式是将9TL固定在CM5芯片上，测量Aβ1-40肽与抗体的结合动力学。用N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺氢氯酸(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按照厂商说明书来活化CM5芯片。将抗体9TL或其变体稀释进10mM乙酸钠(pH 4.0或5.0)，以0.005mg/mL的浓度注射到经活化的芯片上。在各个芯片通道使用可变的流动时间，获得下述范围的抗体密度1000-2000或2000-3000个应答单位(RU)。用乙醇胺封闭芯片。再生研究表明，含有2倍体积的PIERCE洗脱缓冲液和1倍体积4M NaCl的溶液能有效去除结合的Aβ1-40肽，同时在超过200次注射中保持在芯片上的9TL的活性。HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES，pH 7.4，0.15MNaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20)被用作为针对所有BIAcore检验的运行缓冲液。将纯化的Aβ1-40合成肽样品的系列稀释液(0.1-10x估计的KD)以100μL/分钟注射1分钟，允许10分钟的解离时间。通过将数据用1∶1 Langmuir结合模型(Karlsson，R.Roos，H.Fagerstam，L.Petersson，B.(1994).Methods Enzymology 6.99-110)拟合，使用BIA评估程序，同时获得动力学结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)值被计算为koff/kon。
或者，通过下述方法来测定亲和性将Aβ1-40肽固定到SA芯片上，测量9TL Fab和9TL变体Fab对被固定的Aβ1-40肽的结合动力学。通过表面等离子共振(SPR)系统(BIAcore3000TM，BIAcore，Inc.，Piscaway，NJ)来测定9TL Fab片段及其变体Fab片段的亲和性。按照厂商说明书，使用SA芯片(链亲和素)。将生物素化的Aβ肽1-40稀释进HBS-EP(0.01MHEPES，pH7.4，0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20)，以0.005mg/mL的浓度注射到芯片上。在各个芯片通道使用可变的流动时间，获得两种范围的抗原密度对于详细的动力学研究而言10-200个应答单位(RU)，对于浓度研究和筛选而言500-600RU。再生研究表明，10mM磷酸(可以接着使用含有2倍体积50mMNaOH和1倍体积70％乙醇的溶液)能有效去除结合的Fab，同时在超过200次注射中保持在芯片上的Aβ肽的活性。HBS-EP缓冲液被用作为针对所有BIAcore检验的运行缓冲液。将纯化的Fab样品的系列稀释液(0.1-10x估计的KD)以100μL/分钟注射2分钟，允许10分钟的解离时间。使用已知浓度的标准Fab(通过氨基酸分析测定的)，通过ELISA和/或SDS-PAGE来测定Fab蛋白的浓度。通过将数据用1∶1 Langmuir结合模型(Karlsson，R.Roos，H.Fegerstam，L.Petersson，B.(1994).Methods Enzymology 6.99-110)拟合，使用BIA评估程序，同时获得动力学结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)值被计算为koff/kon。
B.抗体9TL及其变体与Aβ1-40的结合亲和性 抗体9TL的重链和轻链可变区域的氨基酸序列显示于图1中。用上述两种Biacore方法测定的9TL抗体与Aβ1-40的结合亲和性示于下表2中。
表2.抗体9TL和Fab片段的结合亲和性 下表3展示了9TL变体的氨基酸序列。表3中展示出的变体的所有氨基酸取代都是相对9TL的序列描述的。表3中还显示了9TL变体的Fab片段的结合亲和性。通过上文所述的BIAcore分析，用SA芯片上固定的Aβ1-40来测定KD和其它动力学参数 表3.抗体9TL变体的氨基酸序列和动力学数据 1＝所有CDR都是延伸CDR，包括Kabat和ChothiaCDR。氨基酸残基按照顺序编号。
2＝下划线kon是实验测定的。其它被估计与9TL一样。
3＝KD值被计算为KD＝koff/kon。
实施例2分析Aβ1-40TL的抗原决定簇 为确定Aβ多肽上被抗体9TL识别的的抗原决定簇，使用表面等离子共振(SPR，Biacore 3000)结合分析。将偶联生物素(Glocal PeptideServices，CO)Aβ1-40多肽固定到涂有链亲和素的芯片(SA芯片)上。在存在或不存在Aβ肽的不同可溶片段(10μM，来自American PeptideCompany Inc.，CA)的情况下，Aβ抗体Fab片段(50nM)与被固定的Aβ1-40的结合。Aβ1-40、Aβ1-42和Aβ1-43的氨基酸序列示于表4中。展示出抗体9TL Fab片段与Aβ1-40结合的Aβ肽分别是Aβ28-40、Aβ1-40、Aβ33-40和Aβ17-40(图2)。因此，抗体9TL与Aβ1-40的C末端肽(33-40)结合。如图2所示，Aβ1-28、Aβ28-42、Aβ28-35、Aβ1-16、Aβ1-43和Aβ1-38肽不会抑制抗体9TL Fab片段的结合，这表明抗体9TL与Aβ1-40肽的C末端结合。
此外，Aβ28-42和Aβ1-43肽不抑制抗体9TL与Aβ1-40的结合，虽然它们容易抑制Aβ1-40与结合到Aβ1-40的16-28上的对照抗体(抗体2289，该抗体在美国申请公开文本2004/0146512和WO 04/032868中有所描述)的结合。这些结果显示，抗体9TL优先结合Aβ1-40，但不优先结合Aβ1-42和Aβ1-43。
表4.beta淀粉质肽的氨基酸序列 实施例3生产单克隆抗体2H6和去糖基化的2H6 A.生产和分析单克隆抗体2H6 用赋形剂(每脚50μl，每只小鼠总共100μl)中与KLH桥联的25-100μg肽(Aβ1-40的氨基酸28-40)，以大约16个连续周的间隔去免疫小鼠，如Geerligs HJ et al.，1989，J.Immunol.Methods 12495-102、Kenney JSet al.，1989，J.Immunol.Methods 121157-166和Wicher K et al.，1989，Int.Arch.Alergy Appl.Immunol.89128-135所述。首先用CFA(完全Freud’s赋形剂)中的50μg肽去免疫小鼠。21天后，用IFA(不完全Freud’s赋形剂)中的25μg肽第二次免疫小鼠。第二次免疫后二十三天，用IFA中的25μg肽进行第三次免疫。第三次免疫后34天，用IFA中的25μg肽进行第四次免疫。第四次免疫后32天，用100μg可溶的肽进行最后一次加强。
从经免疫的小鼠获得脾细胞，用聚乙二醇1500将其与NSO骨髓瘤细胞以10∶1的比例融合。将杂交体涂布进96孔板中含有20％马血清和2-草酰乙酸盐/丙酮酸盐/胰岛素(Sigma)的DMEM中，开始进行次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶选择。第8天，将100μl含有20％马血清的DMEM加入到所有孔中。通过使用抗体捕获免疫检验来筛选杂交体的上清液。对抗体组的确定通过组特异性二抗来进行。
选出一组生产单克隆抗体的细胞系用于分析。选出的一种细胞系生产被命名为2H6的抗体。该抗体被测定为具有IgG2b重链。 测定抗体2H6与Aβ1-40的亲和性。使用蛋白A亲和性色谱，从杂交癌培养物的上清液纯化出单克隆抗体2H6。将上清液平衡至pH 8。然后将上清液上样至用PBS平衡至pH 8的蛋白A柱MabSelect(AmershamBiosciences #17-5299-02)。用5倍柱体积的PBS(pH 8)去洗柱。用50mM柠檬酸磷酸缓冲液(pH 3)洗脱抗体。用1M磷酸缓冲液(pH 8)中和洗脱的抗体。用PBS渗析经纯化的抗体。使用鼠mAb标准曲线，用SDS-PAGE测定抗体浓度。
通过使用Immunopure Fab试剂盒(pierce #44885)用木瓜蛋白酶对2H6全抗体进行蛋白水解来制备2H6Fab，通过按照厂商说明书流经蛋白A色谱来对其进行纯化。使用10D＝0.6mg/ml，通过SDS-PAGE和A280来测定浓度。
使用BIAcore 3000TM表面等离子共振(SPR)系统(BIAcore，INC，Piscaway NJ)来测定2H6单克隆抗体的亲和性。测定亲和性的一种方式是将2H6抗体固定在CM5芯片上，测量Aβ1-40肽与抗体的结合动力学。用N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺氢氯酸(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按照厂商说明书来活化CM5芯片。将单克隆抗体2H6稀释进10mM乙酸钠(pH 4.0或5.0)，以0.005mg/mL的浓度注射到经活化的芯片上。在各个芯片通道使用可变的流动时间，获得下述范围的抗体密度1000-2000或2000-3000个应答单位(RU)。用乙醇胺封闭芯片。再生研究表明，Pierce洗脱缓冲液(Product No.21004，PierceBiotechnology，Rockford，IL)和4M NaCl(2∶1)的混合物能有效去除结合的Aβ1-40肽，同时在超过200次注射中保持在芯片上的2H6的活性。HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES，pH 7.4，0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20)被用作为针对所有BIAcore检验的运行缓冲液。将纯化的Aβ1-40合成肽样品的系列稀释液(0.1-10x估计的KD)以100μL/分钟注射1分钟，允许10分钟的解离时间。通过将数据用1∶1Langmuir结合模型(Karlsson，R.Roos，H.Fagersram，L.Petersson，B.(1994).MethodsEnzymology 6.99-110)拟合，使用BIA评估程序，同时获得动力学结合速率(kon)和解高速率(koff)。平衡解离常数(KD)值被计算为koff/kon。
或者，通过下述方法来测定亲和性将Aβ1-40肽固定到SA芯片上，测量2H6Fab对被固定的Aβ1-40肽的结合动力学。通过表面等离子共振(SPR)系统(BJAcore 3000TM，BIAcore，Inc.，Piscaway，NJ)来测定2H6Fab片段的亲和性。按照厂商说明书，使用SA芯片(链亲和素)。将生物素化的Aβ肽1-40(SEQ ID NO15)稀释进HBS-EP(0.01MHEPES，pH7.4，0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20)，以0.005mg/mL的浓度注射到芯片上。在各个芯片通道使用可变的流动时间，获得两种范围的抗原密度对于详细的动力学研究而言10-200个应答单位(RU)，对于浓度研究而言500-600RU。再生研究表明，Pierce洗脱缓冲液和4M NaCl(2∶1)的混合物能有效去除结合的Fab，同时在超过200次注射中保持在芯片上的Aβ肽的活性。HBS-EP缓冲液被用作为针对所有BIAcore检验的运行缓冲液。将纯化的Fab样品的系列稀释液(0.1-10x估计的KD)以100μL/分钟注射2分钟，允许10分钟的解离时间。使用已知浓度的标准Fab(通过氨基酸分析测定的)，通过ELISA和/或SDS-PAGE来测定Fab蛋白的浓度。通过将数据用1∶1 Langmuir结合模型(Karlsson，R.Roos，H.Fagerstam，L.Petersson，B.(1994).MethodsEnzymology 6.99-110)拟合，使用BIA评估程序，同时获得动力学结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)值被计算为koff/kon。用上述两种方法测定的2H6抗体的亲和性示于下表5中。
按照上文所述，测定与Aβ1-40的氨基酸28-40结合的鼠抗体2286的亲和性。抗体2286被描述于美国申请10/683,815和PCT/US03/32080中。
表5.抗体9TL和Fab片段的结合亲和性 为确定Aβ多肽上被抗体2H6识别的的抗原决定簇，使用表面等离子共振(SPR，Biacore3000)结合分析。将偶联生物素(Glocal PeptideServices，CO)的Aβ1-40多肽固定到涂有链亲和素的芯片(SA芯片)上。在存在或不存在Aβ肽的不同可溶片段(16μM，来自American PeptideCompany Inc.，CA)的情况下，Aβ抗体(100nM)与被固定的Aβ1-40的结合。展示出抗体2H6片段与Aβ1-40结合的Aβ肽分别是Aβ17-40、Aβ33-40和Aβ1-40(图3)。因此，抗体2H6与Aβ1-40的C末端肽(33-40)结合。如图3所示，Aβ1-38肽不会抑制抗体2H6或抗体2286与Aβ1-40的结合，这表明类似于抗体2286，抗体2H6结合的抗原决定簇包括Aβ1-40肽的氨基酸39和/或40(图3)。
此外，Aβ28-42和Aβ1-43肽不抑制抗体2H6与Aβ1-40的结合，虽然它们容易抑制Aβ1-40与结合到Aβ1-40的16-28上的对照抗体(抗体2289，该抗体在美国申请公开文本2004/0146512和WO 04/032868中有所描述)的结合。这些结果显示，抗体2H6优先结合Aβ1-40，但不优先结合Aβ1-42和Aβ1-43。
为进一步评估抗体2H6结合的β淀粉质肽的离散氨基酸残基的受牵连程度，通过定点诱变产生不同的Aβ1-40变体，其中最后6个氨基酸(Aβ1-40氨基酸残基35-40)中的每个各自被丙氨酸替换(丙氨酸扫描诱变)。这些Aβ1-40变体(序列示于表6中)在E.coli中作为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ USA)表达，接着在谷胱甘肽-琼脂糖珠粒(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO，USA)上进行亲和纯化。作为对照，野生型(WT)Aβ1-40以及Aβ1-41、Aβ1-42以及Aβ1-39也作为GST融合蛋白表达。然后将Aβ1-40、Aβ1-41、Aβ1-42、Aβ1-39以及六种不同的变体(表6中示出的M35A(1-40)、V36A(1-40)、G37A(1-40)、G38A(1-40)、V39A(1-40)、V40A(1-40))固定(每孔100μl0.025μg/μl的GST-肽)到ELISA检验平板上，与mAb2286、2289和2H6中任何一种的从0.3nM往下的系列稀释液(使用0.3·nM·Mab的数据示于表4中)一起温育。10次连续洗涤后，将检验平板与每孔100μl 0.3μg/ml桥联生物素的山羊抗小鼠(H+L)抗体(Vector Laboratories，vector#BA-9200，Burllingame CA，USA)一起温育，接着与每孔100μl 0.025μg/μl的HRP桥联的链亲和素(Amersham Biosciences Corp.，#RPN4401V，NJ，USA)一起温育。在450nm处读取平板吸光率。
表6.beta淀粉质肽及变体的氨基酸序列 如图4所示，针对Aβ的16至28位氨基酸的Mab2289能识别出具有相同强度的所有抗体，其在平板上用作为蛋白浓度和蛋白完整性的内部阳性对照。抗体2H6不识别Aβ1-41、Aβ1-39或Aβ1-42，如图4所示。Aβ1-40变体V40A、V39A、G38A、G37A、V36A和M35A显示出与抗体2H6降低的结合，这表明抗体2H6的抗原决定簇在Aβ1-40的C末端延伸了至少6个氨基酸。V和G向A的突变非常保守，看起来不会产生蛋白中重要的构象变化，因此，这些突变对抗体2H6结合的较大影响可能是由于抗体区分在Aβ上下文中提到的氨基酸的能力导致的，这些数据表明了针对该抗体的非常高程度的特异性。
为确定2H6和9TL是否竞争结合Aβ1-40，使用Biacore检验来进行竞争性实验。将抗体2H6、9TL以及2289固定在CM5芯片不同的通道内。用N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺氢氯酸(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按照厂商说明书来活化CM5芯片通道。抗体2H6、9TL以及2289每种都稀释进10mM乙酸钠(pH 4.0)，以0.005mg/mL的浓度注射到经活化的芯片上。抗体密度为2H6，1625应答单位(RU)；9TL，4000RU；以及2289，2200RU。用乙醇胺封闭每个通道。将Aβ1-40肽(150μM)流入到芯片上，2分钟。然后将抗体2H6(将要进行竞争性结合测试)以0.6μM流入到芯片上，1分钟。HBS-EP缓冲液(0.01MHEPES，pH 7.4，0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20)被用作为针对所有BIAcore检验的运行缓冲液。测量Aβ1-40的结合之后，通过用Pierce洗脱缓冲液(Product No.2104，Pierce Biotechnology，Rockford，IL)和4M NaCl(2∶1)的混合物洗两次，每次6秒，来使芯片的所有通道再生。然后针对抗体9TL进行竞争性结合，接着对抗体2289进行竞争性结合。观察到了9TL和2H6之间针对结合Aβ1-40的竞争，但是在9TL和2289或2H6和2289之间没有观察到竞争。对固定的抗体与流入到芯片上的同样的抗体之间的竞争的观察被用作为阳性对照。
B.抗体2H6不结合APP 为确定2H6是否结合淀粉质前体蛋白(APP)，测定2H6与经过野生型APP转染的细胞的结合。用编码野生型人淀粉质前体蛋白的cDNA转染293个细胞。转染后48小时，将细胞与单克隆抗体抗Aβ1-16、抗Aβ16-28或2H6(5μg/ml，在具有10％FCS的DMEM中)在冰上放置5分钟。然后在PBS中对细胞洗三次，每次5分钟，用4％PFA固定。在PBS中对细胞洗三次，用来自Jackson Immunoresearch的Cy3桥联的山羊抗小鼠二抗(1∶500稀释)在荧光显微镜下检测抗体结合。
识别Aβ中N末端或中央抗原决定簇的抗Aβ1-16和抗Aβ16-28抗体都显示出与细胞上表达的APP前体蛋白有显著的结合。相反，2H6不结合表达APP的细胞。
C.产生去糖基化的抗体2H6 为产生去糖基化的抗体2H6，将经纯化的抗体2H6与肽-N-糖苷酶F(Prozyme，每mg抗体0.05U)在20mM Tris HCl(pH 8.0)一起在37℃温育7天。通过MALDI-TOF-MS和蛋白凝胶电泳来验证去糖基化的完成。通过蛋白A色谱来纯化去糖基化的抗体，通过Q-琼脂糖凝胶来去除内毒素。使用上文所述的Biacore检验来测试去糖基化的2H6对Aβ1-40的结合亲和性，发现去糖基化的2H6对Aβ1-40的结合亲和性与完整抗体2H6相同。
实施例4通过施予去糖基化的2H6在Alzheimer’s症的动物模型中逆转认知缺陷以及组织学症状，且微量出血较少 A.实验方案 施予抗体。过量表达“Swidish”突变体淀粉质前体蛋白(APP Tg2576with K670N/M671；Hsiao et al.，Science27499-102(1996))的转基因小鼠被用于实验。这些小鼠中存在的类似Alzheimer’s表型已被很好地分析。Holcomb et al.，Nat.Med.4497-100(1998)、Holcomb et al.，Behav.Gen.29177-185(1999)和McGowan E，Neurobiol.Dis.6231-244(1999)。为进行十六周的治疗研究，将20月龄的APP转基因小鼠分入四组之一。第一组每周获得腹膜内注射的抗Aβ抗体2H6(实施例3所述的小鼠单克隆抗人Aβ28-40IgG2b)，持续16周的时间(n＝4)。第二组每周获得腹膜内注射的去糖基化抗Aβ抗体2H6(按照实施例3所述生产的)，持续16周的时间(n＝5)。第三组每周获得腹膜内注射的抗AMN抗体(2906；小鼠单克隆抗Drosophila失忆蛋白IgG1)，持续16周的时间(n＝6)。用抗AMN抗体(n＝4)或2H6(n＝2)对非转基因同窝出生小鼠进行处理。
行为学分析。16周抗体处理之后，按照前文所述，对研究中的小鼠进行两天的放射臂水迷宫模型(paradigm)。Wilcock et al.，J.Neuroinflammation 124(2004)。装置为前述的6臂迷宫。Gordon et al.，Neurobiol.Aging 22377-385(2001)。第一天，15次试验分为三组进行，每组5次。对每一组试验而言，一群4只小鼠顺序进行(即，四只小鼠中的每只获得试验1，接着同样的小鼠获得试验2，等等)。每5次试验的组之后，第二群小鼠进行试验，这允许在小鼠被暴露给第二组5次试验之前获得延长的休息时间。目标臂对于群中每只小鼠来说都是不同的，以使气味的暗示最小化。每次试验的起始臂也都不同，目标臂对于两天中给定的个体而言保持恒定。对前11次试验而言，平台交替呈现可见然后隐藏的状态(后4次试验都隐藏)。第二天，除了平台对所有试验都隐藏之外，按照与第一天完全相同的方法，来处理小鼠。测量一分钟时间段内的错误(不正确的臂进入)数量。不能在20秒内作出臂选择的小鼠被定是一次错误，但是在该研究中，这种方式没有使任何小鼠被定为错误。由于研究中小鼠的数量，测试者不知道每只小鼠的实验组号。因为放射臂水迷宫任务中依赖性的测量是定量而非估计的，测试者误差的可能性能被减小。为使得个体试验可变性的影响最小，每只小鼠三次连续试验的错误被平均，每天产生5个数据，通过使用StatView(SAS Institute Inc.，NC)来对其进行统计分析。
组织学分析。在处死当天，对小鼠进行称重，过量施予100mg/kg的Nembutal(Abbott laboratories，North Chicago，IL)，然后心内灌注25mL0.9％的氯化钠。迅速取出脑，脑的左半边在新鲜制备的用于组织病理学的100mM KPO4(pH 7.2)中的4％多聚甲醛中被浸入固定24小时。然后对半边脑进行24小时温育，这在10％、20％和30％蔗糖中顺序进行，用于低温保护(cyroprotection)。使用滑动切片机收集25μ厚度的横切片，将其在4℃冷冻于Dulibecco’s磷酸缓冲的盐水(含有叠氮化钠，pH 7.2)中，以防止微生物生长。随机选出跨越整个脑的一系列8等分组织切片，相隔600μ，使用针对总Aβ的自由飘浮免疫组织化学方法，按照前文所述(rabbit polyclonal anti-pan Aβ；Biosource，Camarillo，CA，1∶10,000)进行染色。Gordon et al.，Exp.Neurol.173183-195(2002)、Wilcock et al.，J.Neurosci.246144-6151(2004)。使用NaCl饱和的80％乙醇中的0.2％Congo红对隔600μm的第二个系列组织切片进行染色。制作另一组切片，用2％氢氯酸中的2％氰亚铁酸钾针对血铁质(hemosiderin)进行15分钟的染色，接着在1％中性红溶液中复染色10分钟。使用Image-ProPlus(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)进行对Congo红染色和Aβ免疫组织化学的定量分析，以分析被阳性染色占据的百分比面积。分析了前皮质的一个区域和海马体的三个区域(以确保在海马体值中没有区域性偏差)。进行对Congo红的初始分析，以给出总的值。手工编辑删除所有实质淀粉质沉积物后进行第二次分析，产生被限制为血管Congo红染色的百分比面积。为评价Congo红的实质面积，从总的百分比中减去血管淀粉质的值。对于血铁质染色而言，在所有切片上对Prussian蓝阳性位点的数量进行计数，计算每个切片的平均位点数。在切片中观察到低倍数的动物间定量差异。检查八等分切片，测定阳性情况的数量，将其平均为针对每个切片的值。为评估可能的与处理相关的差异，通过一步法ANOVA接着进行Fisher’s LSD均值比较来分析每个处理组的值。
使用ELISA测量Aβ肽的血清水平。对最后施予抗体一天后收集的血清加以稀释，在预先涂布位于PBS缓冲液(pH 7.4)中的5μg/ml的抗体6E10(结合Aβ1-17的抗beta淀粉质抗体；Signet，Dedham，MA)的96孔微滴定板(MaxiSorp；Nunc，Rosklide，Denmark)中进行温育。二抗是生物素化的4G8(结合Aβ17-24的抗beta淀粉质抗体；Signet)，其经过1∶5000稀释。使用链亲和素-辣根过氧化物酶桥联物(Amersham Biosciences)，接着通过TMB底物(KPL，Gaithersburg，MD)进行检测。6-400pM的Aβ1-40(American Peptide)被用作为标准曲线。
B.结果 通过施予去糖基化的抗体逆转认知缺陷。放射臂水迷宫任务检测到了转基因小鼠的空间学习和记忆力缺陷。Gordon et al.，Neurobiol.Aging.22377-385(2001)；Morgan et al.，Nature 408982-985(2000)。在两天版本的放射臂水迷宫中，对用抗体2H6、去糖基化的2H6或抗AMN处理16周的动物进行针对空间导航学习的测试。在两天版本的放射臂水迷宫中对非转基因正常小鼠(包括用2H6抗体处理的2只小鼠以及用抗AMN抗体处理的4只小鼠；这两组组合起来，因为没有观察到行为差异)也进行了测试。如图5所示，用对照抗体(抗AMN)处理的APP转基因小鼠在两天的测试中不能识别平台位置，较之前述非转基因小鼠显然受损。Wilcock etal.，J.Neuroinflammation 124(2004)。但是，施予抗Aβ抗体2H6和去糖基化2H6的APP转基因小鼠展示出在对照处理的APP转基因小鼠中观察到的损伤被显著逆转，第二天结束时的平均表现接近每次试验1次错误(图5)。而对照处理的APP转基因小鼠在第二天结束时的平均表现为每次试验接近3次错误(图5)。图5示出的数据表明，对于逆转APP转基因小鼠中的认知缺陷而言，去糖基化抗体与完整抗体工作得一样好。
减少Aβ沉积物，而不增加微量出血。如下表7所示，在用抗体2H6(大约56％的降低，p＝0.0001)和去糖基化2H6(大约58％的降低，p＜0.0001)进行16周免疫治疗之后，海马体中的总Aβ免疫染色较之对照抗体处理的组(抗AMN)明显降低。如下表8所示，在用抗体2H6(大约50％的降低，p＜0.0001)和去糖基化2H6(大约51％的降低，p＜0.0001)进行16周免疫治疗之后，前皮质中的总Aβ免疫染色较之对照抗体处理的组(抗AMN)明显降低。
表7.16周抗体处理之后海马体的总Aβ负荷。显示了针对Aβ的阳性免疫组织化学染色占据的平均百分比面积，以及针对海马体的均值的标准偏差(standard deviation)和标准误差(standard error)。
表8.16周抗体处理之后前皮质的总Aβ负荷。显示了针对Aβ的阳性免疫组织化学染色占据的平均百分比面积，以及针对前皮质的均值的标准偏差和标准误差。
如表9所示，在用抗体2H6(大约77％的降低，p＜0.0001)和去糖基化2H6(大约53％的降低，p＜0.0001)进行16周免疫治疗之后，海马体中的总Congo红染色较之对照抗体处理的组(抗AMN)明显降低。如表10所示，在用抗体2H6(大约79％的降低，p＜0.0001)和去糖基化2H6(大约68％的降低，p＜0.0001)进行16周免疫治疗之后，前皮质中的总Congo红染色较之对照抗体处理的组(抗AMN)明显降低。
表9.16周抗体处理之后海马体的总Congo红染色。显示了针对Aβ的阳性Congo红染色占据的平均百分比面积，以及针对海马体的均值的标准偏差和标准误差。
表10.16周抗体处理之后前皮质的总Congo红染色。显示了针对Aβ的阳性Congo红染色占据的平均百分比面积，以及针对前皮质的均值的标准偏差和标准误差。
针对前皮质和海马体对实质(表11和12，以及图6)和血管(表13和14，图7)Congo红染色进行分别的分析。如表11和图6A所示，在用抗体2H6(大约98％的降低，p＜0.0004)和去糖基化2H6(大约76％的降低，p＜0.0001)进行16周免疫治疗之后，前皮质中实质Congo红染色较之对照抗体处理的组(抗AMN)明显降低。如表12和图6B所示，在用抗体2H6(大约96％的降低，p＜0.0001)和去糖基化2H6(大约63％的降低，p＜0.0001)进行16周免疫治疗之后，海马体中实质Congo红染色较之对照抗体处理的组(抗AMN)明显降低。在降低前皮质和海马体中的Congo红负载方面，去糖基化2H6的有效性比完整的抗体2H6要差一些。
表11.16周抗体处理之后前皮质的实质Congo红染色。显示了针对Aβ的阳性Congo红染色占据的平均百分比面积，以及针对前皮质的均值的标准偏差和标准误差。
表12.16周抗体处理之后海马体的实质Congo红染色。显示了针对Aβ的阳性Congo红染色占据的平均百分比面积，以及针对海马体的均值的标准偏差和标准误差。
如表13和图7A所示，在用抗体2H6(大约2.7倍，p＜0.0001)和去糖基化2H6(大约1.7倍，p＝0.0185)进行16周免疫治疗之后，海马体中血管Congo红染色较之对照抗体处理的组(抗AMN)明显增加。如表14和图7B所示，在用抗体2H6(大约3.5倍，p＜0.0001)和去糖基化2H6(大约1.8倍，p＝0.0048)进行16周免疫治疗之后，前皮质中血管Congo红染色较之对照抗体处理的组(抗AMN)明显增加。去糖基化2H6处理组的血管Congo红染色的增加比完整的抗体2H6处理组要低一些，对前皮质(p＜0.0001)和海马体(p＝0.0025)都是如此。
表13.16周抗体处理之后海马体血管Congo红染色。显示了针对Aβ的阳性Congo红染色占据的平均百分比面积，以及针对海马体的均值的标准偏差和标准误差。
表14.16周抗体处理之后前皮质血管Congo红染色。显示了针对Aβ的阳性Congo红染色占据的平均百分比面积，以及针对前皮质的均值的标准偏差和标准误差。
Prussian蓝组织学染色被用于标记血铁质(血红蛋白破裂中产生的氧化铁物质)。脑中的静脉外血导致红血球被小胶质细胞吞噬，以及血红蛋白在其中破裂。因此，含有氧化铁的小胶质细胞就是过去发生的微量出血的标志。对经抗体处理的动物中Prussian蓝的阳性情况加以计数。如表15和图8所示，较之对照抗体处理的组(抗AMN)，用抗体2H6进行的处理导致Prussian蓝染色显著(p＜0.0001)增加了大约5.5倍。用去糖基化2H6抗体进行的处理较之对照抗体处理的组而言Prussian蓝染色仅增加了大约1.8倍(p＝0.0364)。
表15.16周抗体处理之后整个切片的Prussian蓝染色。显示了阳性Prussian蓝染色占据的平均百分比面积，以及针对整个切片均值的标准偏差和标准误差。
施予去糖基化2H6抗体之后Aβ的血清水平。如图9所示，向APPTg2576小鼠施予抗体2H6和去糖基化2H6显著增加了beta淀粉质肽的血清水平。但是，施予抗AMN抗体之后在APP Tg2576小鼠中没有观察到beta淀粉质肽血清水平的显著增加，在施予抗AMN抗体或抗体2H6之后野生型小鼠中也没有观察到。这表明，beta淀粉质肽血清水平的增加可用于辅助对AD的诊断以及监测AD治疗(例如免疫治疗)的应答。
C.结论 上述数据表明，1)在APP Tg2576小鼠中逆转学习和记忆力缺陷的方面，去糖基化2H6和完整抗体2H6一样有效；2)在Congo红染色测量时，在海马体和前皮质中消除Aβ沉积物的方面，去糖基化抗体2H6较完整抗体2H6的效果略差，但通过Aβ免疫染色测量时，在消除海马体和前皮质中Aβ负荷方面去糖基化抗体与完整抗体一样有效；3)去糖基化抗体2H6在增加海马体和前皮质血管系统中Aβ沉积物方面(Congo红染色测量的情况下)远少于完整2H6抗体；以及4)在用去糖基化2H6抗体处理过的APP Tg2576小鼠中，通过Prussian蓝染色测量的微量出血远少于用完整2H6抗体处理的小鼠。这些数据表明，在APP Tg2576小鼠中，去糖基化抗体在改善Alzheimer’s症的指标方面一样有效，但微量出血风险更低。
实施例5 多种抗体Fc区域与鼠和人Fcγ受体和补体的结合亲和性 使用上述BIAcore来测量抗体Fc区域与Fcγ受体或补体的结合亲和性。简言之，通过胺化学物质，将经纯化的人或鼠Fcγ受体(来自R&DSystems)和人C1q(来自Quidel)固定到BIAcore CM5芯片上。注射单克隆抗体的系列稀释液(范围从2nM到表16和17所示的最大浓度)。HBS-EP(0.01M HEPES，pH 7.4，0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20)作为运行缓冲液和样品缓冲液。对高亲和性相互作用，使用1∶1 langmuir相互作用模型对结合数据加以分析，对低亲和性相互作用使用稳态亲和性模型。
下表16显示了通过KD(nM)测量的抗β淀粉质抗体与鼠FcγRI、FcγRIIb、FcγRIII以及人C1q(hC1q)的结合亲和性。去糖基化抗体具有去除了N-糖基化的恒定区域。9TL(hIgG1)和9TL(hIgG2Δa)具有相同的可变区域(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)，但具有不同的恒定区域。9TL(hIgG1)具有人IgG1恒定区域9TL(hIgG2Δa)具有人IgG2a，其中有A330P331向S330S331的突变(参照野生型IgG2a序列进行的Kabat氨基酸编号)。如表16所示，去糖基化2H6、2294和2286较之没有去除N-糖基化的每种对应抗体而言，对于测试的所有鼠Fcγ受体的亲和性都降低。去糖基化2H6较之2H6还具有降低的对人补体的亲和性。9TL(hIgG1)对mFcγRIIb或mFcγRIII没有显著结合；而9TL(hIgG2Δa)对鼠FcγRI、FcγRIIb、FcγRIII或hC1q中任何一种都没有显著结合。
下表17显示了KD(nM)测量的抗β淀粉质抗体对人FcγRI、FcγRIIb/c、RcγRIIIb和hC1q的结合亲和性。如表17所示，9TL(hIgG2Δa)对人FcγRI或hC1q没有显著结合；对人FcγRIIb/c和RcγRIIIb的亲和性较之具有人IgG1恒定区域的抗体对这些分子的亲和性显著更低。
表16.通过KD(nM)测量的抗体对鼠Fcγ受体和人补体的结合亲和性 NB当抗体以测试的最大浓度使用时也没有探测到显著结合。
针对于hC1q结合的测试最大抗体浓度为30000nM。
表17.通过KD(nM)测量的抗体与人Fcγ受体和人补体的结合亲和性 NB当抗体以测试的最大浓度使用时也没有探测到显著结合。
测试的用于结合的最大抗体浓度为30000nM。
实施例6颅内施予后去糖基化2H6抗体对小胶质细胞活化、Fcγ受体结合以及淀粉质清除的影响 手术流程以及颅内施予抗体。19.5月龄的Tg2576转基因小鼠被分配进三组之一，所有组都获得向前皮质和海马体的颅内注射。第一组获得浓度为每个区域中2μg/2μl的抗Aβ抗体2H6。第二组获得浓度为每个区域中2μg/2μl的去糖基化抗体2H6。第三组获得针对果蝇失忆蛋白的IgG，其作为完整IgG注射非特异性方面的对照。手术后所有小鼠都存活72小时。
在手术当天，对小鼠(Tg2576转基因小鼠)进行称重，用异氟醚进行麻醉，放置在立体定位器中(51603双人操作实验室标准，Stoelting，WoodDale，IL)。产生正中切伤口，以暴露头盖骨，用牙医钻头在右前皮质和海马体上钻出两个孔，其符合下述坐标皮质AP+1.5mm，L-2.0mm，海马体AP-2.7mm，L-2.5mm，都从前囱进行。将附有10μl Hamilton(Reno，NV)注射器的26号针头降低3mm，对着前囱腹(ventral tobregma)，在2分钟的时间注射2μl。用盐水清洁伤口，用手术钉(surgical staple)令其闭合。
组织制备。在处死当天，对小鼠进行称重，过量施予100mg/kg的戊巴比妥(Nembutal钠溶液，Abbott laboratories，North Chicago，IL)，然后心内灌注25mL 0.9％的氯化钠，接着灌注50ml新鲜制备的4％多聚甲醛(pH 7.4)。迅速取出脑，在新鲜制备的4％多聚甲醛中浸入固定24小时。然后对脑进行24小时温育，这在10％、20％和30％蔗糖中顺序进行，用于低温保护。然后使用滑动切片机收集25μm厚的横切片，将其在4℃冷冻于DPBS缓冲液(含有叠氮化钠)中，以防止微生物生长。
收集跨越注射位点的间隔大约100μm的六至八个切片，使用自由飘浮的免疫组织化学方法进行染色，染色针对总Aβ(与Aβ1-40和Aβ1-42进行兔抗血清反应；使用1∶10000稀释)、抗CD45抗体(目录号MCA1031G，Serotec，Raleigh NC；使用1∶5000稀释)以及抗Fcγ受体(CD16/CD32)抗体(目录号553141，来自BD Biosciences；使用1∶1000的稀释)进行。以1∶3000稀释的生物素化山羊抗兔被用作为二抗，用于抗Aβ抗体染色。以1∶3000稀释的生物素化山羊抗小鼠被用作为二抗，用于抗CD45和Fcγ受体抗体染色。为进行免疫染色，一些切片不用一抗处理，用于评价非特异性免疫组织化学反应。在玻片上放置相邻切片，用4％硫代黄素-S(Sigma-Aldrich，St Louis MO)染色10分钟。应当注意，存在有限数量的、包括有注射体积的切片。
数据分析。在皮质和海马体的注射区域以及脑对侧的相应区域，使用影像测定V150图像分析系统(Oncor，San Diego，CA)来测量所有被染色切片上的免疫组织化学反应产物。数据表示为针对Aβ染色、硫代黄素-S染色、CD45染色以及Fcγ受体染色的注射侧相对于未注射侧的比例。将每个注射位点标准化为相应的对侧位点使得动物间可变性的影响减小，并且允许用较少数量的小鼠获得可信赖的药物效果测量结果。为评估可能的处理相关差异，使用StatView软件版本5.0.1(SAS Institute Inc.，NC)进行ANOVA接着通过Fischer’s LSD均值比较来分析针对每个处理组的比例值。
结果 如图10所示，颅内施予去糖基化2H6抗体之后，前皮质和海马体中的CD45染色与对照抗体一样。相反，颅内施予2H6抗体之后，前皮质中的CD45染色较之对照抗体显著更高(p＜0.01)，海马体中CD染色也适当更高一些。这表明，与抗体2H6不同，施予后72小时，去糖基化2H6的施予不能活化前皮质和海马体中的小胶质细胞。
如图11所示，颅内施予去糖基化2H6抗体之后，前皮质和海马体中的FcγII和FcγIII受体染色与对照抗体基本相同。而相反，颅内施予2H6抗体之后，前皮质和海马体中的Fcγ受体染色都较对照抗体显著更高(p＜0.01)。这表明，与抗体2H6不同，施予后72小时，去糖基化2H6的施予不能活化前皮质和海马体中的小胶质细胞。
如图12所示，颅内施予2H6抗体或去糖基化2H6抗体之后72小时，前皮质和海马体中Aβ染色较之对照抗体更低。如图13所示，颅内施予2H6抗体或去糖基化2H6抗体之后72小时，前皮质和海马体中硫代黄素-S染色的密实型斑块较之对照抗体减少。
这些数据显示，去糖基化2H6抗体能减少前皮质和海马体中的Aβ和密实型斑块，而不会诱导小胶质细胞的活化和炎症应答。
实施例7抗体2294结合的Aβ肽上的抗原决定簇的分析 抗体2294是通过用Aβ1-40免疫小鼠产生的鼠抗体。该抗体在US2004/0146512和WO 04/032868中有所描述。
使用上文所述的Biacore来测量抗体2294与Aβ1-40、Aβ1-42或Aβ22-37的结合亲和性。下表18展示了抗体2294Fab片段与多种Aβ肽的亲和性。
表18.抗体2294Fab片段的结合亲和性 通过ELISA检验来绘制抗体2294的抗原决定簇图谱。将多种Aβ肽的生物素化的15肽或10肽(这些肽具有加到C末端的甘氨酸)固定到涂布有链亲合素的平板上。用PBS(pH 7.4)中6μg/ml的链亲合素(Pierce，21122)涂布NUNC maxisorp平板，在4℃进行超过1小时。用PBS缓冲液(pH 7.4)中的1％BSA封闭平板。洗涤之后，在室温下对PBS(pH7.4)中的生物素化Aβ肽进行一小时温育。在室温下对抗体2294(从2.5μg/ml到10μg/ml)与固定的Aβ肽进行一小时温育。洗涤之后，将平板与二抗(以1∶5000稀释得HRP桥联的山羊抗人kappa链抗体，MPBiomedicals，55233)一起温育。洗涤之后，通过加入TMB底物(KPL，50-76-02，50-65-02)来测量结合的二抗。通过加入1M磷酸终止HRP反应，测量450nm的吸光率。如图14所示，抗体2294与具有20-34、21-35、22-36、23-37、24-38、25-39、26-40以及25-34位氨基酸的Aβ肽(在C末端具有甘氨酸)结合；但不与具有19-33、27-41、24-33以及27-35位氨基酸的Aβ肽(在这些肽的C末端具有甘氨酸)结合。这表明，抗体2294的抗原决定簇包括26至34位氨基酸。
为进一步确定Aβ肽上被抗体2294识别的抗原决定簇，使用ELISA结合分析。将多种Aβ肽(Global Peptide Services，CO)固定到ELISA板上。通过上文所述的ELISA，测定2294全抗体(20nM)与被固定的Aβ肽的结合。抗体2294结合Aβ肽17-40、17-42、28-40、1-38、1-40、1-42以及1-43结合。抗体2294与Aβ肽1-16、1-28、28-42、22-35以及33-40不结合。因此，抗体2294结合多种截短Aβ肽的C末端，例如1-38、1-40、1-42以及1-43。
下表19显示了通过Biacore检验测量的2294与Aβ1-40的结合和2294与其它Aβ肽的结合的比较。较之与其它肽的结合，抗体2294(全抗体)与Aβ1-40具有最强的结合，其与截短的Aβ1-40(例如1-36、1-37、1-38以及1-39)、Aβ1-42以及Aβ1-43具有显著更低的结合。这表明，Aβ的氨基酸40(缬氨酸)的侧链或主链涉及2294与Aβ1-40的结合；没有该氨基酸时，结合显著降低。
表19. “-”表示没有结合；“+”表示非常低的结合；“++”表示中度结合；“+++”表示强的结合；“++++”表示非常强的结合。
基于上述数据，看起来抗体2294结合的抗原决定簇包括26-34和40。抗体2294结合与美国临时申请60/676,093所述的抗体6G非常相似的抗原决定簇(该抗体的氨基酸和核酸序列在SEQ ID NOS36-39中示出；编码6G的载体于2005年6月15日保藏于American Type CultureCollection，保藏号为PTA-6786及PTA-6787)。抗体6G结合的抗原决定簇包括25至34位以及第40位氨基酸。抗体2294和6G的抗原决定簇比较示于图14中。
使用Biacore来测量抗体6G Fab片段与Aβ1-40、Aβ1-42或Aβ22-37的结合。将生物素化的Aβ1-40、Aβ1-42或Aβ22-37固定到链亲合素芯片上，将6GFab流注到其上。抗体6G Fab片段以3.0×105的kon(1/Ms)、7.0×10-4的koff(1/s)以及2nM的KD结合Aβ1-40。抗体6G Fab片段以1.8×104的kon(1/Ms)、1.6×10-3的koff(1/s)以及80nM的KD结合Aβ1-42。抗体6G Fab片段以3.6×105的kon(1/Ms)、3.9×10-3的koff(1/s)以及11nM的KD结合Aβ22-37。抗体6G较之抗体2294具有显著更高的与Aβ1-42和Aβ22-37的亲合性。数据表明，较之抗体2294，抗体6G的结合较少依赖于第40位氨基酸。
按照实施例3所述，使用Biacore检验来进行2294、6G、2H6和2289之间的抗体竞争性实验。将抗体2294、6G、2H6以及2289固定在CM5芯片的通道上。用N-乙基N’-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺氢氯酸(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按照厂商说明书来活化CM5芯片的通道。抗体2294、6G、2H6以及2289每种都稀释进10mM乙酸钠(pH 4.0)，以0.005mg/mL的浓度注射到经活化的芯片上。用乙醇胺封闭每个通道。将Aβ1-40肽(150μM)流入到芯片上，2分钟。然后将抗体2294(将针对结合竞争性加以测试)以0.6μM流入到芯片上，1分钟。HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES，pH 7.4，0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20)被用作为针对所有BIAcore检验的运行缓冲液。测量Aβ1-40的结合之后，通过用Pierce洗脱缓冲液(Product No.21004，PierceBiotechnology，Rockford，IL)和4M NaCl(2∶1)的混合物洗两次，每次6秒，来使芯片的所有通道再生。然后针对抗体6G、2H6接着对抗体2289进行竞争性结合。观察到了2294和6G之间以及2294和2H6之间针对结合Aβ1-40的竞争，但是在2294和2289或者6G和2289之间没有观察到竞争。对固定的抗体与流入到芯片上的同样的抗体之间的竞争的观察被用作为阳性对照。数据表明抗体2294与2H6和6G在结合Aβ1-40方面存在竞争。
实施例8抗体2294和去糖基化抗体2294在Alzheimer’s症动物模型中减少Aβ沉积物方面以及认知方面的影响 通过在37℃将经纯化的抗体2294与肽-N-糖苷酶F(Prozyme，每mg抗体0.05U)在20mM Tris-HCl pH 8.0中温育7天来制备去糖基化的抗体2294。通过MALDI-TOF-MS和蛋白凝胶电泳来验证去糖基化的完成。通过蛋白A色谱来纯化去糖基化的抗体且通过Q-琼脂糖来去除内毒素。使用上述Biacore检验来测试去糖基化2294与Aβ1-40的结合亲和性，发现去糖基化2294与Aβ1-40的结合亲和性与完整抗体2294一样。
按照实施例4所述，在转基因小鼠APP Tg2576中，针对对认知缺陷的逆转、组织学症状以及微量出血的影响，对抗体2294和去糖基化2294进行测试。为进行十六周的治疗研究，将20月龄的APP转基因小鼠分入四组之一。第一组每周获得腹膜内注射的抗Aβ抗体2294，持续16周的时间(n＝4)。第二组每周获得腹膜内注射的去糖基化抗Aβ抗体2294，持续16周的时间(n＝5)。第三组每周获得腹膜内注射的抗AMN抗体(2906；小鼠单克隆抗Drosophila失忆蛋白IgG1)，持续16周的时间(n＝6)。用抗AMN抗体(n＝4)或2294(n＝2)对非转基因同窝出生小鼠进行处理。
组织学和行为学分析按照实施例4所述来进行。
应当理解，本文描述的实施例和实施方式仅用于阐述的目的，本领域技术人员将知道可以对其进行多种小改良或改动，这些也包括在本申请的宗旨和范围内。为了所有目的，本文提到的所有公开文本、专利和专利申请都通过引用整体并入本文，其程度与特别地、单独地通过引用将每份单独的公开文本、专利或专利申请包括进来是相同的。
生物材料的保藏 下述材料已保藏至American Type Culture Collection，10801 UniversityBoulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，USA(ATCC) 材料抗体号ATCC编号 保藏日期 pDb.9TL.hFc2a 9TL重链 PTA-6124 2004年7月20日 pEb.9TL.hK 9TL轻链 PTA-6125 2004年7月20日 pDb.6G.hFc2a6G重链PTA-6786 2005年6月15日 pEb.6G.hK 6G轻链PTA-6787 2005年6月15日 载体pEb.9TL.hK是编码9TL轻链可变区域和轻链kappa恒定区域的多核苷酸；载体pDb.9TL.hFc2a是编码9TL重链可变区域和重链IgG2a恒定区域的多核苷酸，并含有下述突变A330P331至S330S331(氨基酸编号参照野生型IgG2a序列；见Eur.J.Immunol.(1999)292613-2624)。
载体pEb.6G.hK是编码6G轻链可变区域和轻链kappa恒定区域的多核苷酸；载体pDb.6G.hFc2a是编码6G重链可变区域和重链IgG2a恒定区域的多核苷酸，并含有下述突变A330P331至S330S331(氨基酸编号参照野生型igG2a序列；见Eur.J.Immunol.(1999)292613-2624)。
这些保藏是按照Budapest Treaty on the International Recognition of theDeposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure及其条例(Budapest Treaty)的规定保藏的。这确保了保藏物的存活培养物从保藏之日起能被保持30年。根据Budapest Treaty的规定，该保藏物是可通过ATCC获得的，该保藏物受Rinat Neuroscience Corp.和ATCC之间的协议约束，该协议确保了相关美国专利授权后或任何美国或外国专利申请对公众公开后(以先公开者为准)保藏物的培养物的后代对于公众的永久且无限制的可获得性，还确保了所述后代对于U.S.Commissioner of Patentsand Trademarks根据35USC Section 122及其规定Commissioner′s rules(包括37CFR Section 1.14，特别参照886 OG 638)授权的个体的可获得性。
本申请的权利人同意如果在合适条件下培养期间保藏的材料死亡或丢失或被毁坏，在收到通知后将迅速用另一同样的材料来代替该材料。被保藏材料的可获得性不应被解释为违反任何政府机构根据其专利法授予的权利实施本发明的许可。
抗体序列
9TL重链可变区域氨基酸序列(SEQ ID NO1)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYYTEAYYIHWVRQAPGQGLEWMGRIDPAT
GNTKYAPRLQDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASLYSLPVYWGQGTT
VTVSS
9TL轻链可变区域氨基酸序列(SEQ ID NO2)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDAKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQISRL
DPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHYPVLFGQGTRLEIKRT
9TLCDRH1(延伸的CDR)(SEO ID NO3)
GYYTEAYYIH
9TL CDR H2(延伸的CDR)(SEO ID NO4)
RIDPATGNTKYAPRLQD
9TLCDRH3(延伸的CDR)(SEO ID NO5)
LYSLPVY
9TLCDRL1(延伸的CDR)(SEO ID NO6)
KSSQSILYSDAKTYLN
9TLCDRL2(延伸的CDR)(SEO ID NO7)
QISRLDP
9TLCDRL3(延伸的CDR)(SEO ID NO8)
LQGTHYPVL
9TL重链可变区域核苷酸序列(SEQ ID NO9)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCTTCCGTGA
AGGTTTCCTGCAAAGCATCTGGTTACTATACGGAGGCTTATATATCCACTGGGTG
CGCCAAGCCCCTGGTCAAGGCCTGGAGTGGATGGGCAGGATTGATCCTGCGACTG
GTTAATACTAAATATGCCCCGAGGTTACAGGACCGGGTGACCATGACTCGCGATAC
CTCCACCAGCACTGTCTACATGGAACTGAGCTCTCTGCGCTCTGAGGACACTGCTG
TGTATTACTGTGCCTCCCTTTATAGTCTCCCTGTCTACTGGGGCCAGGGTACCACT
GTTACCGTGTCCTCT
9TL轻链可变区域核苷酸序列(SEQ ID NO10)
GATGTTGTGATGACCCAGTCCCCACTGTCTTTGCCAGTTACCCTGGGACAACCAG
CCTCCATATCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTGATGCCAAGACATA
TTTGAATTGGTTCCAACAGAGGCCTGGCCAGTCTCCACGCCGCCTAATCTATCAG
ATTTCCCGGCTGGACCCTGGCGTGCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCA
CAGATTTTACACTTAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGTGGGAGTTTATTA
CTGCTTACAAGGTACACATTATCCGGTGCTCTTCGGTCAAGGGACCCGCCTGGAG
ATCAAACGCACT
9TL重链全抗体氨基酸序列(包括本文描述的经修饰的IgG2a)(SEQ ID NO11)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYYTEAYYIHWVRQAPGQGLEWMGRIDDPAT
GNTKYAPRLQDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASLYSLPVYWGQGTT
VTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP
AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPAP
PVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTTSKTKGQPREPQV
YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFL
YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
9TL轻链全抗体氨基酸序列(SEQ ID NO12)
LDPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHYPVLFGQGTRLEIKRTV
AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTFQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
9TL重链全抗体核苷酸序列(包括本文所述的经修饰的IgG2a)(SEG ID NO13)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCTTCCGTGA
AGGTTTCCTGCAAAGCATCTGGTTACTATACGGAGGCTTACTATATCCACTGGT
GCGCCAAGCCCCTGGTCAAGGCCTGGAGTGGATGGGCAGGATTGATCCTGCGACT
GGTAATACTAAATATGCCCCGAGGTTACAGGACCGGGTGACCATGACTCGCGATA
CCTCCACCAGCACTGTCTACATGGAACTGAGCTCTCTGCGCTCTGAGGACACTGC
TGTGTATTACTGTGCCTCCCTTTATAGTCTCCCTGTCTACTGGGGCCAGGGTACCA
CTGTTACCGTGTCCTCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCTGTCTTCCCACTGGCCCCA
TGCTCCCGCATGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTTGGGCTGCCTGGTCAAGGACT
ACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCAGCGGCGT
GCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGG
TGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCA
CAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGGTGGA
GTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCTGTTCCCTC
CAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGT
GGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGG
AGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCAC
CTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAA
GGAGTAAGGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGGACTGCCATCCAGGCATCGAGAAGAC
CATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTGCCCCC
ACCTAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGG
ATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCAGAGAAC
AACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTATTC
CAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTTCC
GTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTC
CAGGAAAGTAATTCTAGA
9TL轻链全抗体核苷酸序列(SEQ ID NO14)
GATGTTGTGATGACCCAGTCCCCACTGTCTTTGCCAGTTACCCTGGGACAACCAG
CCTCCATATCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTGATGCCAAGACATA
TTTGAATTGGTTCCAACAGAGGCCTGGCCAGTCTCCACGCCGCCTAATCTATCAG
ATTTCCCGGCTGGACCCTGGCGTGCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCA
CAGATTTTACACTTAAAATCAGCCAGAGTGGAGGCTGAAGATGTGGGAGTTTATTA
CTGCTTACAAGGTACACATTATCCGGTGCTCTTCGGTCAAGGGACCCGCCTGGAG
ATCAAACGCACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCA
GTTGAAATCCGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCACGCG
AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCAGG
AGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCC
TGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCA
CCCATCAGGGCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGCTA
ATTCTAG
6G重链可变区域氨基酸序列(SEQ ID NO26)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYAIHWVRQ
APGQGLEWMGFTSPYSGVSNYNQKFKGRVTMTRDTSTST
VYMELSSLRSEDTAVYYCARFDNYDRGYVRDYWGQGTLV
TVS
6G轻链可变区域氨基酸序列(SEQ ID NO27)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNDRISFLNW
YQQKPGQPPKLLIYAATKQGTGVPDRFSGSGSGTDFTLT
ISSLQAEDVAVYYCQQSKEFPWSFGGGTKVEIKRTV
6G CDR H1(延伸的CDR)(SEQ ID NO28)
GYTFTTYAIH
6G CDR H2(延伸的CDR)(SEQ ID NO29)
FTSPYSGVSNYNQKFKG
6G CDR H3(延伸的CDR)(SEQ ID NO30)
FDNYDRGYVRDY
6G CDR L1(延伸的CDR)(SEQ ID NO31)
RASESVDNDRISFLN
6G CDRL2(延伸的CDR)(SEQ ID NO32)
AATKQGT
6G重链可变区域核苷酸序列(SEQ ID NO34)
CAGGTGCAACTGGTGCAATCCGGTGCCGAGGTGAAAAAGCCAGGCGCCTCCGTGA
AAGTGTCCTGCAAAGCCTCCGGTTACACCTTTACCACCTATGCCATCCATTGGGTG
CGCCAGGCCCCAGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTTTACTTCCCCCTACTCCG
GGGTGTCGAATTACAATCAGAAGTTCAAAGGCCGCGTCACCATGACCCGCGACAC
CTCCACCTCCACAGTGTATATGGAGCTGTCCTCTCTGCGCTCCGAAGACACCGCCG
TGTATTACTGTGCCCGCTTCGACAATTACGATCGCGGCTATGTGCGTGACTATTGG
GGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCCTCC
6G轻链可变区域核苷酸序列(SEQ ID NO35)
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGCGCG
CCACCATCAACTGCCGCGCCAGCGAATCCGTGGATAACGATCGTATTTCCTTTCT
GAACTGGTACCAGCAGAAACCAGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACGCCGC
CACCAAACAGGGTACCGGCGTGCCTGACCGCTTCCGGCAGCGGTTCCGGCAC
CGATTTCACTCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAAGATGTGGCAGTGTATTAC
TGTCAGCAGTCCAAAGAGTTTCCCTGGTCCTTTGGCGGTGGCACCAAGGTGGAGA
TCAAACGCACTGTG
6G重链全抗体氨基酸序列(包括本文所述的经修饰的IgG2a)(SEQ ID NO36)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYAIHWVRQAPGQGLEWMGFTSPYSG
VSNYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARFDNYDRGYVRDYW
GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS
GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVE
CPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEV
HNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTTSKTKG
QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPML
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
6G轻链全抗体氨基酸序列(SEQ ID NO37)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNDRISFLNWYQQKPGQPPKLLIYAATK
QGTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEFPWSFGGGTKVEIKRTV
AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
6G重链全抗体核苷酸序列(包括本文所述的经修饰的IgG2a)(SEQ ID NO38)
CAGGTGCAACTGGTGCAATCCGGTGCCGAGGTGAAAAAGCCAGGCGCCTCCGTG
AAAGTGTCCTGCAAAGCCTCCGGTTACACCTTTACCACCTATGCCATCCATTGGGT
GCGCCAGGCCCCAGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTTTACTTCCCCCTACTCC
GGGGTGTCGAATTACAATCAGAAGTTCAAAGGCCGCGTCACCATGACCCGCGAC
ACCTCCACCTCCACAGTGTATATGGAGCTGTCCTCTCTGCGCTCCGAAGACACCG
CCGTGTATTAACTGTGCCCGCTTCGACAATTACGATCGCGGCTATGTGCGTGACTAT
TGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCTG
TCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGG
CTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGC
GCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTA
CTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCAGACCTAC
ACCTGCAACGTAGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAG
AGAAAGTGTTGTGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCAT
CCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCC
AGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTC
AACTGGTATGTGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAGACCAAGCCAAGAGAG
GAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGG
ACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCAT
CCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGG
TGTACCCTGCCCCCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGAC
CTGTCTGGTGAAGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAAC
GGACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGA
TCCTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAA
ACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAA
GAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAG
6G轻链全抗体核苷酸序列(SEQ ID NO39)
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGCGCG
CCACCATCAACTGCCGCGCCAGCGAATCCGTGGATAACGATCGTATTTCCTTTCTG
AACTGGTACCAGCAGAAACCAGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACGCCGCCA
CCAAACAGGGTACCGGCGTGCCTGACCGCTTCTCCGGCAGCGGTTCCGGCACCGA
TTTCACTCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAAGATGTGGCAGTGTATTACTGTC
AGCAGTCCAAAGAGTTTCCCTGGTCCTTTGGCGGTGGCACCAAGGTGGAGATCAA
ACGCACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCTCCATCTGATGAGCAGTTGA
AATCCGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCACGCGAGGCC
AAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGT
GTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACC
CTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCAT
CAGGGCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGC
权利要求
1.治疗下述疾病的方法，所述疾病特征是β-淀粉质在个体中的异常沉积，所述方法包括向所述个体施予有效量的下述抗体，所述抗体能特异结合β-淀粉质肽或β-淀粉质肽的聚集形式，其中所述抗体包含具有受损的效应器功能的Fc区域。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述个体是人。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述疾病是Alzheimner’s症。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述疾病是Down’s综合征。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述疾病是脑部淀粉质血管病。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体是单克隆抗体。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体是人化抗体。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体是人抗体。
9.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体能以大约100nM或更小的KD结合Aβ肽。
10.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体能以大约20nM或更小的KD结合Aβ肽。
11.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体能以大约2nM或更小的KD结合Aβ肽。
12.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体能结合Aβ肽的C末端。
13.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体能特异结合Aβ1-40的28-40位残基、Aβ1-42的28-42位残基或Aβ1-43的28-43位残基中的抗原决定簇。
14.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体能特异结合选自Aβ1-36、Aβ1-37、Aβ1-38、Aβ1-39、Aβ1-40、Aβ1-42和Aβ1-43构成的组的Aβ肽的C末端。
15.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体能特异结合包括第39和/或40位氨基酸的Aβ1-40上的抗原决定簇。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述抗体包含包括SEQ IDNO1示出的氨基酸序列的重链可变区域，以及包括SEQ ID NO2示出的氨基酸序列的轻链可变区域。
17.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体与Aβ1-40结合的亲和性高于它与Aβ1-42或Aβ1-43结合的亲和性。
18.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体能结合包括第25-34位和第40位氨基酸的Aβ1-40上的抗原决定簇。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述抗体包含包括SEQ IDNO26示出的氨基酸序列的重链可变区域，以及包括SEQ ID NO27示出的氨基酸序列的轻链可变区域。
20.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体能特异结合Aβ肽1-16位残基内的抗原决定簇。
21.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体能特异结合Aβ肽的N末端。
22.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体能特异结合Aβ肽16-28位残基中的抗原决定簇。
23.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体的Fc区域不是N糖基化的，或者具有相对于天然Fc区域而言N-糖基化情况有所改变的。
24.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体的Fc区域包含N-糖基化识别序列中的突变，由此所述Fc区域是非糖基化的。
25.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体的Fc区域是其中包含有下述氨基酸突变的人重链IgG2a的Fc区域，所述突变为330位上的丙氨酸变为丝氨酸以及331位上的脯氨酸变为丝氨酸，其中，所述氨基酸位置基于参照人野生型IgG2a序列的Kabat编号。
26.治疗下述疾病的方法，所述疾病与β-淀粉质在个体中的异常沉积相关，所述方法包括向所述个体施予有效量的下述抗体，所述抗体能特异结合β-淀粉质肽或β-淀粉质肽的聚集形式，其中所述抗体包含与天然存在的Fc区域相比有变化的Fc区域，其中，所述变化导致受损的效应器功能。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述在Fc区域具有所述变化的抗体的施予较之施予不具有所述变化的抗体而言导致更少的脑部微量出血。
28.如权利要求26所述的方法，其中，所述个体是人。
29.如权利要求26所述的方法，其中，所述疾病是Alzheimcr’s症。
30.如权利要求26所述的方法，其中，所述抗体是单克隆抗体。
31.如权利要求26所述的方法，其中，所述抗体是人化抗体。
32.如权利要求26所述的方法，其中，所述抗体的人抗体。
33.如权利要求26所述的方法，其中，所述抗体能以大约100nM或更小的KD结合Aβ肽。
34.如权利要求26所述的方法，其中，所述抗体能以大约20nM或更小的KD结合Aβ肽。
35.如权利要求26所述的方法，其中，所述抗体能以大约2nM或更小的KD结合Aβ肽。
36.如权利要求26所述的方法，其中，所述抗体能特异结合Aβ1-40的28-40位残基、Aβ1-42的28-42位残基或Aβ1-43的28-43位残基中的抗原决定簇。
37.如权利要求26所述的方法，其中，所述抗体能特异结合选自Aβ1-36、Aβ1-37、Aβ1-38、Aβ1-39、Aβ1-40、Aβ1-42和Aβ1-43构成的组的Aβ肽的C末端。
38.如权利要求26所述的方法，其中，所述抗体能特异结合包括第39和/或40位氨基酸的Aβ1-40上的抗原决定簇。
39.如权利要求38所述的方法，其中，所述抗体包含包括SEQ IDNO1示出的氨基酸序列的重链可变区域，以及包括SEQ ID NO2示出的氨基酸序列的轻链可变区域。
40.如权利要求26所述的方法，其中，所述抗体与Aβ1-40结合的亲和性结合高于它与Aβ1-42或Aβ1-43结合的亲和性。
41.如权利要求26所述的方法，其中，所述抗体能结合包括第25-34位和第40位氨基酸的Aβ1-40上的抗原决定簇。
42.如权利要求41所述的方法，其中，所述抗体包含包括SEQ IDNO26示出的氨基酸序列的重链可变区域，以及包括SEQ ID NO27示出的氨基酸序列的轻链可变区域。
43.如权利要求26所述的方法，其中，所述抗体能特异结合Aβ肽1-16位残基内的抗原决定簇。
44.如权利要求26所述的方法，其中，所述抗体能特异结合Aβ肽的N末端。
45.如权利要求26所述的方法，其中，所述抗体能特异结合Aβ肽16-28位残基中的抗原决定簇。
46.如权利要求26所述的方法，其中，所述抗体的Fc区域不是N糖基化的，或者具有相对于天然Fc区域而言N-糖基化情况有所改变的。
47.如权利要求26所述的方法，其中，所述抗体的Fc区域包含N-糖基化识别序列中的突变，由此所述Fc区域是非糖基化的。
48.如权利要求26所述的方法，其中，所述抗体的Fc区域是其中包含有下述氨基酸突变的人重链IgG2a的Fc区域，所述突变为330位上的丙氨酸变为丝氨酸以及331位上的脯氨酸变为丝氨酸，其中，所述氨基酸位置基于参照人野生型IgG2a序列的Kabat编号。
49.一种抗体，包含重链可变区域，所述区域包含
(a)SEQ ID NO3示出的CDR1区域；
(b)SEQ ID NO4示出的CDR2区域；以及
(c)SEQ ID NO5示出的CDR3区域，其中，L1是L、V或I其中，Y2是Y或W；其中S3是S、T或G；其中，L4是L、R、A、V、S、T、Q或E；其中，V6是V、I、T、P、C、Q、S、N或F以及其中Y7是Y、H、F、W、S、I、V或A；
其中，所述抗体能特异结合Aβ肽。
50.如权利要求49所述的抗体，其中，所述重链可变区域包含
(a)SFQ ID NO3示出的CDR1区域；
(b)SEQ ID NO4示出的CDR2区域；以及
(c)SEQ ID NO5示出的CDR3区域。
51.如权利要求49所述的抗体，其中，所述抗体还包含轻链可变区域。
52.如权利要求49所述的抗体，其中，所述抗体是人化抗体。
53.一种抗体，其包含轻链可变区域，所述区域包含
(a)SEQ ID NO6示出的CDR1区域；其中Y8是Y、A或H；以及其中A11是A或S；以及其中K12是K或A；
(b)SEQ ID NO7示出的CDR2区域；以及
(c)SEQ ID NO8示出的CDR3区域；其中L1是L、M、N、C、F、V、K、S、Q、G、S；其中，G3是G、S或T；其中，T4是T或S；其中，H5是H或L；其中，Y6是Y、P、A、W、Q、M、S或E；其中，V8是V、L、K、H、T、A、E或M；以及其中，L9是L、I、T、S或V；
其中，所述抗体能特异结合Aβ肽。
54.如权利要求53所述的抗体，其中所述抗体是人化抗体。
55.如权利要求53所述的抗体，其中所述轻链可变区域包含
(a)SEQ ID NO6示出的CDR1区域；
(b)SEQ ID NO7示出的CDR2区域；以及
(c)SEQ ID NO8示出的CDR3区域。
56.如权利要求53所述的抗体，其中所述抗体还包含重链可变区域。
57.如权利要求55所述的抗体，其中所述抗体还包含重链可变区域，所述重链可变区域包含
(a)SEQ ID NO3示出的CDR1区域；
(b)SEQ ID NO4示出的CDR2区域；以及
(c)SEQ ID NO5示出的CDR3区域。
58.如权利要求57所述的抗体，其中，所述重链可变区域包含SEQ IDNO1示出的氨基酸序列。
59.如权利要求57所述的抗体，其中，所述轻链可变区域包含SEQ IDNO2示出的氨基酸序列。
60.如权利要求59所述的抗体，其中，所述重链可变区域包含SEQ IDNO1示出的氨基酸序列。
61.如权利要求60所述的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO11示出的氨基酸序列；所述轻链包含SEQ ID NO12示出的氨基酸序列。
62.如权利要求49所述的抗体，其中所述抗体包含具有受损的效应器功能的Fc区域。
63.如权利要求62所述的抗体，其中所述抗体的Fc区域不是N糖基化的，或者具有相对于天然Fc区域而言N-糖基化情况有所改变的。
64.如权利要求62所述的抗体，其中所述抗体的Fc区域包含N-糖基化识别序列中的突变，由此所述Fc区域是非糖基化的。
65.如权利要求62所述的抗体，其中所述抗体的Fc区域是其中包含有下述氨基酸突变的人重链IgG2a的Fc区域，所述突变为330位上的丙氨酸变为丝氨酸以及331位上的脯氨酸变为丝氨酸，其中，所述氨基酸位置基于参照人野生型IgG2a序列的Kabat编号。
66.如权利要求53所述的抗体，其中所述抗体包含具有受损的效应器功能的Fc区域。
67.如权利要求66所述的抗体，其中所述抗体的Fc区域不是N糖基化的，或者具有相对于天然Fc区域而言N-糖基化情况有所改变的。
68.如权利要求66所述的抗体，其中所述抗体的Fc区域包含N-糖基化识别序列中的突变，由此所述Fc区域是非糖基化的。
69.如权利要求66所述的抗体，其中其中所述抗体的Fc区域是其中包含有下述氨基酸突变的人重链IgG2a的Fc区域，所述突变为330位上的丙氨酸变为丝氨酸以及331位上的脯氨酸变为丝氨酸，其中，所述氨基酸位置基于参照人野生型IgG2a序列的Kabat编号。
70.一种多核苷酸，包含编码权利要求49-69中任何一项所述的抗体的序列。
71.一种载体，包含权利要求70所述的多核苷酸。
72.一种宿主细胞，包含权利要求70所述的多核苷酸。
73.一种药物组合物，包含(a)权利要求49-69中任何一项所述的抗体以及(b)药学上可接受的赋形剂。
74.一种试剂盒，包含权利要求49-69中任何一项所述的抗体。
75.一种用于生产能特异结合Aβ肽的抗体的方法，所述方法包括在能生产所述抗体的条件下培养包含权利要求70所述的多核苷酸的宿主细胞。
76.如权利要求75所述的方法，所述方法还包括分离产生的抗体。
全文摘要
本发明描述了单克隆抗体9TL和从9TL获得的、针对淀粉质beta肽的抗体以及使用上述抗体诊断和治疗Alzheimer’s症以及Aβ肽相关的疾病的方法。还描述了使用具有受损效应器功能的、针对淀粉质beta肽的抗体来治疗Alzheimer’s症以及Aβ肽相关的疾病的方法。
文档编号A61P25/00GK101124247SQ200580025690
公开日2008年2月13日 申请日期2005年8月1日 优先权日2004年7月30日
发明者安侬·露森达尔, 尧姆·庞斯, 伟-彦·胡, 简·马耳库斯·格瑞姆 申请人:礼纳特神经系统科学公司