多价禽流感疫苗的制作方法

专利名称：多价禽流感疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于接种面对疾病爆发的易感禽类的新颖多价禽流感疫苗。本发明亦涉及用于预防或减轻家禽中禽流感病毒性疾病的新颖方法。
背景技术：
禽流感，亦称为“AI”，为一急性且高触染性的皱鸡及其它家禽病毒性感染。作为一流感病毒，可基于血凝素(HA；亦可缩写为H)及神经氨酸酶(NA；亦可缩写为N)分子(随季节转换而重排或变异)的抗原差异将其分成多个亚型。因其不断地发生变异，故疫苗制备由于在随后季节中将会出现的病毒株种类的不确定性而难于实现。用于疫苗制备的病毒株通常不会在生产条件下以很快的速度复制，因此，等待一特定病毒株出现并随后生产恰当的疫苗来防止所述病毒株不能提供可行的选择。通常，特定病毒株的流行病将流行数月，并随后可能消失数年。
消灭法是控制禽类疾病的主要方法，且无显著的经济损失，但是若可生产一种具有快速的免疫性起始的疫苗，则此产品可为大批屠杀整个禽群提供一可能的替代方法。
已知流感病毒可根据病毒携带的群抗原以不同的A、B、C拓扑结构分类。A、B、C型的流感病毒可基于可在病毒核衣壳(NP)及基质(M)蛋白中发现的抗原差异而相互区别。具体而言，基于血凝素(HA)及神经氨酸酶(NA)分子中的抗原差异可将A型流感病毒分成多个亚型。当前，已经鉴别出9种亚型的神经氨酸酶NA蛋白，命名为NA 1至NA 9，及15种不同亚型的血清血凝素HA蛋白，命名为HA 1至HA 15。在鸟类中，携带任一所述不同HA(或H)及NA(或N)亚型的病毒皆已经分离出来。
HA为一包含约560个氨基酸并可代表总病毒蛋白的25的病毒表面糖蛋白。其在感染初期主要负责病毒颗粒与宿主细胞的粘附并负责其向后者中的侵入。在病毒蛋白质中，血凝素为最容易出现翻译后重排者。当其合成完成后，所述分子遵循宿主细胞的外释途径，在此期间，HA发生折叠，在三聚体中进行组装并进行糖基化。最后，其分离为两个亚单位H1及H2；此分离在所述分子的活化中及在病毒体的感染能力的获得中是关键步骤。
事实上，人们已熟知，分离位点的不同组合(关于基本的氨基酸残基)可转化成禽流感病毒产生定域的、或症状性的感染、或(反过来)对于许多禽类而言具有一致命结果的全身性感染的能力。因此，已有人建议，此事实可能影响所述病毒的器官取向性、宿主特异性、以及致病力。就所述病毒的致病性而言，具有多基位点HA的病毒株可发现分离HO分子的蛋白酶，在多个细胞类型中呈活性形式H1及H2，因此导致产生大量的感染性病毒颗粒的多个感染循环并导致感染在短期内扩大到所有区域(HPAI病毒株)。所述感染随后结果是具有一急性-超急性期，具有极高的死亡率。
神经氨酸酶(NA)代表流感A病毒的第二膜糖蛋白，其由一编码413个氨基酸肽的1413个核苷酸长的基因(病毒RNA的片段6)编码。此蛋白具有至少两种重要的功能通过在唾液酸分子与血凝素自身之间分开而破坏病毒血凝素的细胞受体。以此方式，猜想其可能通过防止新形成的病毒颗粒沿细胞膜积聚、以及促进所述病毒穿过粘膜表面上存在的粘液的转运而减轻病毒子代的释放作用。NA此外还代表一重要的易发生抗原变异的抗原决定簇。
当前业内需要可为消灭受感染禽群提供可用选择的禽流感疫苗。此类疫苗需要在经接种的禽类中引起一快速的免疫反应，且优选为可使经接种鸟能与受感染鸟区别开。人们已提出将双价或多价流感疫苗可在所谓的“DIVA”方法中使用，其中投与一具有一与接种所针对的病毒株不同的N的疫苗，以便提供一将经接种鸟与受感染鸟区别开的方法。公开的PCT WO 03/086453(其揭示内容以引用的方式全部并入本文中)阐述DIVA技术及在其方法中可利用的某些代表性疫苗。
组合的或多价的疫苗可提供许多为单价疫苗所不具有的明显益处。多价疫苗的一个益处是仅需要较少的疫苗接种。在单次接种中可投与单一制剂，且可有效地抑制多种疾病或单一疾病的多个病毒株。当可能病毒株的范围增加时，为最小化接种次数，疫苗的组合变得更加具有强制性。当对疫苗实施组合时所需减小次数的接种应最大可能地导致对接种程序表的增强的顺应性。此转而应最大可能地导致作为结果的疫苗覆盖度的增加，此情况应最终导致更佳的疾病控制。
对于组合疫苗未曾预料到的问题是近期确认的在组合疫苗中一种疫苗可能会对另一种疫苗具不利影响，所谓“抗原干扰效应”。已经发现，当简单地将两种现有疫苗混合时，一种或两种皆可能会失去其效力(Andre，F.E.，″Development of CombinedVaccinesManufacturers′Viewpoint，″Biologicals 22317-321(1994)；Hadler，S.C.，″Costbenefit of combining antigens，″Biologicals 22415-418(1994)；Goldenthal.K，L，等人，″Overview-Combination Vaccines and Simultaneous Administration.Past，Present，andFuture.″于Combined Vaccines and Simultaneous Administration，Current Issues andPerspectives(编辑Williams，J.C.，等人)The New York Academy of Sciences，New York，第1页XI-XV(1995)；Clemens，J.，等人，″Interactions between PRP-T Vaccine againstHemophilus influenzae Type b and Conventional Infant Vaccines Lessons for Future Studiesof Simultaneous Immunization and Combined Vaccines.″于Combined Vaccines andSimultaneous Administration.Current Issues and Perspectives(编辑Williams，J.C.，等人)The New York Academy of Sciences，New York，第255-266页(1995)；Insel，R.A.，″Potential Alterations in Immunogenicity by Combining or Simultaneously AdministeringVaccine Component，″.于Combined Vaccines and Simultaneous Administration.CurrentIssues and Perspectives(编辑Williams.J.C.，等人)The New York Academy of Sciences，New York，第35-47页(1995))。
不幸的是，在实验室中使用当前确定的效力测试法并不能总是预测出是否个别疫苗组份会保持其效力。举例而言，多种独立的研究报告，当将Hib疫苗与全细胞百日咳疫苗组合时在两种疫苗之间无干扰，但当将Hib疫苗与非细胞百日咳疫苗组合时则Hib免疫原性具有实质的损失。据显示，当将Hib与DTaP组合时，如果在分开的位点给出那么其可保持其免疫原性，然而当所用疫苗在相同位点组合投与时那么免疫原性低5至15倍。此未曾预料到的结果证实，组合两种现有的疫苗可能不是简单的或常规的过程，且此组合经常会得到在最初研究期间未检测到的极不可预知的结果。证明无干扰性所需要的研究经常会额外增加数月或数年研究来证明无干扰性及应用适合性。
双价禽流感疫苗已经可在市场上获得，例如由Merial销售的名为Fluvac的疫苗，但是当前仍需要经改良的双价或多价禽流感疫苗，其会引起快速的免疫反应及更高的滴度反应，且因此可利用其快速地保护面临疾病爆发的鸟类。

发明内容
一方面，本发明涉及一种有效预防或减轻禽流感的疫苗组合物，且其可在DIVA技术中使用，且其进一步具有可提供快速免疫反应起始的益处，其包括大于约200HA/剂、且最优选在约250至300HA/剂范围内的HA/剂范围。
因此，本发明提供一包含至少两种禽流感病毒株的疫苗组合物，其中组合的HA/剂大于约200HA/剂，且优选为为约250至300HA/剂。各禽流感病毒株的HA/剂的数量可变化，但通常至少约75HA/剂，且最优选为大于约128HA/剂。
所选择用于本发明双价或多价疫苗的特定禽流感病毒株视所述疫苗拟施用区域中所流行的特定病毒株而定。最优选为所述病毒株之一应具有一与流行病毒株或激发病毒株的HA亚型相同的HA亚型，及一不同的N组份，以便容许使用DIVA技术。另外的病毒株可选自在拟治疗区域中具有一发病率的其它HA亚型，优选为具有不同的N亚型。
在本发明另一部分中，提供有一可有效预防或减轻禽流感病毒感染的疫苗组合物，其包含至少两种灭活的禽流感病毒株，其中组合的血凝素(HA)总量为至少约200HA/剂所述疫苗组合物，且其中各所述病毒株为至少约128HA/剂，且另外其中所述病毒株之一具有与激发病毒的相同的HA亚型，且其中至少一所述病毒株具有一与激发病毒不同的NA亚型。
本发明亦提供一种预防或减轻禽流感病毒感染爆发的方法，其包括向家禽成员投与一包含至少两种灭活禽流感病毒株的疫苗组合物，其中组合的血凝素(HA)总量为至少约200HA/剂所述疫苗组合物，且其中各病毒株为至少约128HA/剂，且另外其中所述病毒株之一具有与一激发病毒相同的HA亚型，且其中至少一所述病毒株具有一与激发病毒不同的NA亚型。
亦提供一种可有效预防或减轻禽流感病毒感染的疫苗组合物，其包含至少两种灭活的禽流感病毒株，其中组合的血凝素(HA)总量为至少约250HA/剂所述疫苗组合物，且其中各病毒株为至少约150HA/剂，且另外其中所述病毒株之一具有与激发病毒相同的HA亚型，且其中至少一种所述病毒株具有与激发病毒不同的NA亚型，并且其中所述组合物包含两种主要由去水山梨糖醇油酸酯组成的表面活性剂。
自下文给出的具体实施方式
及随附权利要求书，可明确了解本发明此等及其它实施例、特征及益处。
具体实施例方式
一方面，本发明涉及新颖的具有大于约200HA/剂的总HA含量的多价禽流感疫苗。
可用于本发明疫苗的禽流感分离株可利用业内现有技术实施分离。举例而言，受感染皱鸡的组织或血清可自市售鸡群中获得。随后可将所述病毒转移至组织或其它适宜介质中以建立种源病毒。由熟练的技术人员实施的进一步特征分析亦可使用现有方法进行。举例而言，所述病毒可利用现有方法实施灭活，例如热处理法及化学处理法。
在本文另一方面中，本发明亦包含一种含有至少两种禽流感病毒株的疫苗组合物。
本发明疫苗组合物可利用现有技术、优选为使用药理学上可接受的载剂进行调配。举例而言，在一实施例中涵盖水性调配物。此等调配物利用水、盐水、或磷酯盐或其它适宜缓冲液。在另一实施例中，所述疫苗组合物优选为油包水或水包油乳液。亦涵盖双乳液，通常表征为水包油包水乳液。所述油可协助稳定调配物且可进一步起到佐剂或增强剂的作用。适合的油包括(但不限于)白油、Drakeoil、角鲨烷或角鲨烯、以及其他动物油、植物油、或矿物油，无论是天然来源的或是合成来源的。
并且，所述疫苗组合物可包含其它适宜的业内可用佐剂。举例而言，此等可包括氢氧化铝及磷酸铝，以及其它金属盐。
该疫苗组合物中亦可包含另外的赋形剂，例如表面活性剂或其它湿润剂或调配助剂。表面活性剂可包括去水山梨糖醇单油酸酯类(TWEEN系列)，以及氧化乙烯/氧化丙烯嵌段共聚物类(PLURONIC系列)、以及业内可用其它表面活性剂。在所述疫苗中亦可包含其它经确认为稳定剂或保存剂的化合物。举例而言，所述化合物包括(但不限于)糖类，例如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、糊精或葡萄糖及诸如此类，以及防腐剂福尔马林。
该疫苗组合物亦可调配成干燥粉剂，实质上不含外源的水，随后可由最终用户在施用前对其实施再构成。
所述疫苗组合物最优选为利用失效的或灭活的病毒进行调配。亦涵盖用于本文中者为重组疫苗，其可表达所需水平的HA蛋白，以便提供大于约200的总HA含量。
本发明疫苗组合物优选应包含来自其流感病毒组份的最少约200HA总量。在本发明一实施例中，所述疫苗包含来自每一病毒株的约128HA/剂，且甚至更优选为来自每一病毒株的约192HA/剂。
抑制其它疾病的其它家禽抗原亦可包括在内并随本发明疫苗组合物施用。举例而言，抑制雏鸡疱疹病毒、雏鸡贫血病毒(CAV)、新城疫病毒、及传染性支气管炎(IB)病毒的疫苗抗原以及呼肠病毒抗原可作为本发明疫苗组合物的部分包括在内。一或多种呼肠病毒抗原作为本发明疫苗组合物的部分尤其优选。
本发明亦涉及一种用于诱导可抑制禽流感病毒感染的防护作用的方法。所述方法涉及向家禽动物投与一包含至少两种禽流感病毒株的疫苗组合物，其中该疫苗组合物具有大于约200HA/剂、尤其优选为250至300HA/剂的组合HA含量。
投与方法可由熟练的技术人员进行选择。举例而言，所述疫苗组合物可经由饮用水、喷剂或眼滴剂投给孵化后的幼小(几天至数周大小)雏鸡。本文涵盖卵内投药。举例而言，通常可对胚胎实施接种，通常在约第18至19天实施。本发明亦涵盖如下其它方法——其中本发明疫苗组合物依照可根据预期可能暴露于致病禽流感病毒载体的时间确定的程序表以有效量通过非经肠的、皮下的、腹膜的、经口的、鼻内的方式或通过其它可用方式投与，优选为通过非经肠方式、更优选为通过肌内方式投与。
剂量通常为每只家禽动物约0.25mL至约2.0mL，更优选为每只动物为约0.5mL至约1.0mL。因此，本文涵盖一次、两次或更多次剂量，尽可能少的剂量次数尤其优选。
如上文给出，本发明涉及新颖的禽流感疫苗组合物及其用于家禽的方法。术语“家禽”欲涵盖(但不限于)所有商业繁殖的家禽动物，包括雏鸡、鸭、鹅、火鸡、孔雀、矮脚鸡、及诸如此类。
实例以下实例阐明本发明多个优选方面，但不应以任何方式将基理解为对本发明完整范围加以限制。
实例1产品组成(每剂)


研制制剂POULVACi-AI H5N9，H7N1中包含的病毒株基于区域中疾病流行情况选择用于POULVAC i-AI H5N9，H7N1的病毒株(禽流感病毒H5N9及禽流感病毒H7N1)。两病毒株皆由Instituto Zooprofilattico Sperimentaledelle Venezie(IZS)，Italy提供。其有效性已经雏鸡血清转化法证明。
POULVAC i-AI H5N9，H7N1包含的佐剂基于矿物油乳剂确定的免疫刺激影响对所述佐剂进行选择，调配为油包水(W/O)乳液。在调配物中使用一药物级的轻质矿物油(NF)Drakeol 5。
为获得稳定的油包水乳液(W/O)，需要使用表面活性剂。选择表面活性剂去水山梨糖醇倍半油酸酯(植物的)(一疏水性表面活性剂)及聚山梨醇酯80(植物的)(一亲水性表面活性剂)，因其具有乳化特性。现已显示，使用这些表面活性剂的组合可得到稳定的乳液。
Arlacel 83V＝去水山梨糖醇倍半油酸酯，等摩尔的单酯及二酯的混合物；CAS号＝8007-43-9。其在乳霜、乳液及软膏制剂中使用。
TWEEN80V＝聚山梨醇酯80＝聚氧乙烯(20)去水山梨糖醇单油酸酯；CAS号＝9005-65-6。其在稳定的水包油乳液制剂中使用。
脱水山梨糖醇酯(象Arlacel 83V)产生稳定的W/O乳液，但经常与变化比例的聚山梨糖醇酯(象TWEEN80V)组合使用以产生W/O乳液。
用于调配所述产品的Arlacel 83V及TWEEN80V皆为植物来源的。
剂量体积&接种程序表在养禽业中使用时通常为0.5ml的剂量体积。
POULVAC i-AI H5N9，H7N1基于血清学研究的效力1.探究性剂量反应研究实施一探究性剂量反应研究以测定针对变化的抗原HA水平的抗体反应。制备包含256、128、64或32HA单位的抗原浓度的四种实验疫苗，并对10只SPF雏鸡在两周龄及四周龄时用每一种疫苗经肌内实施接种。一组10只相似的雏鸡未实施接种，作为对照。在每次接种前及在第二次接种后两周、6周及10周时采集血样以监测血清情况。在室内使用血细胞凝集作用抑制剂对血清样品实施评估(HI测试)并亦在IstitutoZooprofilattico Sperimentale(IZS)通过HI测试实施评估。
血清学数据显示，所有鸟在接种前皆对两禽流感病毒株呈血清反应阴性，且所有未经接种鸟在研究期间始终皆保持了血清反应阴性。
H5N9血清学结果在我方实验室中所获得的结果普遍高于在IZS获得的结果，但处于2-4稀释度范围内(参见下表1)。用包含128或256HA单位的疫苗进行首次接种后两周时，所有10只经接种雏鸡皆具有至少16HI单位(我方数据)及4HI单位(IZS)的滴度。第二次剂量的疫苗在所有雏鸡中皆引起了对H5N9强烈的回忆反应，并且两周后在所有接受了较高滴度疫苗的鸟中皆观察到了至少64HI单位的滴度。
H7N1血清学结果在我方实验室中获得的结果再次普遍高于在IZS的结果，但3-8倍的差异较H5N9更大。在任一情况下，自IZS结果取更保守的滴度，显而易见的是，首次接种两周后所有接受了具有128或256HA单位的疫苗的雏鸡皆具有至少8HI单位的滴度。第二次剂量的疫苗在所有雏鸡中皆诱导了针对H7N1的极强的回忆反应，并且两周后在所有接受了较高滴度疫苗的鸟中皆观察到了至少512HI单位的滴度。
这些结果表明，POULVAC i-AI H5N9，H7N1可诱导高于1∶16的水平的抑制H5N9及H7N1的滴度——据European Council(Council Directive 92/40/EEC)认为其具有保护作用。
表1在Fort Dodge Veterinaria S.A.(FD)及Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie(IZSV)之间对HI滴度实施汇总比较HI几何平均滴度


FD在FORT DODGE VETERINARIA S.A.获得的HI滴度IZSV在ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLE VENEZIE获得的HI滴度2W首次接种及采血的周龄4W第二次接种及采血的周龄6W第二次接种及采血后两周、6周、10周或14周PR未确定的结果为计算目的，若血清未进行滴度测定，则认为其具有滴度1。
2.有效性研究通过以下程序对POULVAC i-AI H5N9，H7N1在雏鸡中的有效性进行评估。
110-A1-E-14-04。在两周龄时用两抗原皆以最小滴度(128HA单位)调配的0.5ml单次剂量以肌内方式对20只SPF雏鸡实施接种。3周后当这些鸟为5周龄时投与第二次剂量疫苗。20只相似雏鸡未实施接种，作为比较用的对照。在每次接种前及第二次接种3周后采集血样以便对血清情况进行监测。在室内用一血细胞凝集作用抑制剂(HI测试)对血清样品进行评估，并亦在Istituto Zooprofilattico Sperimentale(IZS)通过HI测试对其实施评估。
血清学数据显示，所有鸟在接种前皆对两禽流感病毒株呈血清反应阴性，且所有未经接种鸟在研究期间始终皆保持了血清反应阴性。
H5N9血清学结果在我方实验室中所获得的结果普遍高于在IZS获得的结果，但处于2-4稀释度范围内(参见下表2)。首次接种三周后，所有20只经接种雏鸡皆具有至少128HA单位(我方数据)及64HA单位(IZS)的滴度。此表明，一单剂量的POULVAC i-AI H5N9，H7N1可诱导高于1∶16的水平的抑制H5N9的滴度，据European Council(CouncilDirective 92/40/EEC)认为其具有保护作用。
第二次剂量的疫苗在所有雏鸡中皆诱导了针对H5N9的强烈的回忆反应，并再次预示将可观察到抑制激发的良好保护作用。
H7N1血清学结果在我方实验室中获得的结果再次普遍高于在IZS的结果，但3-8倍的差异较H5N9更大。当前仍未了解为何在测试中此差异如此之大。在任一情况下，自IZS结果取更保守的滴度，显而易见的是，首次接种三周后所有20只经接种雏鸡皆具有一至少128HA单位的滴度。此表明，一单剂量的POULVAC i-AI H5N9，H7N1可诱导显著高于1∶16的水平的抑制H7N1的滴度，据European Council(Council Directive 92/40/EEC)认为其具有保护作用。
第二次剂量的疫苗在所有雏鸡中皆诱导了对H7N1极强的回忆反应，并再次预示将可观察到抑制激发的良好保护作用。
表2在Fort Dodge Veterinaria S.A.(FD)及Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie(IZSV)之间对HI滴度的汇总比较将HI表示为几何平均滴度

为计算目的，若血清未进行滴度测定，则认为其具有滴度1。
比较实例2对于此实例，参考两篇公开文献参考文献1Capua等人，Developments of a DIVA(Differentiating Infected from Vaccinated Animals)Strategy Using a Vaccine Containing aHerterologous Neuraminidase for the Control of Avian Influenza；Avian Pathology 32，47-55(2003)；及参考文献2Ellis等人，Vacination of Chickens Against H5N1 AvianInfluenza in the Face of an Outbreak Interrupts Virus Transmission。参考文献1记录，在2周及4周龄时用2次剂量的竞争者的疫苗H7N3接种的鸟在第6周时血清几何平均滴度为45(由HI测得)，其中13只鸟中有11只鸟达到了大于1∶16HI的滴度(据认为具有保护作用)。在3周龄时经接种一次的鸟在第6周时实施血清学测试显示一值为19的滴度(由HI测得)。在此情况下，13只鸟中仅8只鸟达到了大于1∶16的HI滴度。相比较而言，本文所述H7N1部分的结果在单次剂量及双次剂量程序中皆显著高于此结果。参考文献2记录在56-99天龄的鸟中用1次剂量的另一竞争者的流感疫苗实施接种的鸟。接种后15天时，几何平均滴度为11.7(由HI测得)，其中60只鸟中有32只鸟显示1∶16或更大的HI滴度。接种后22天时，几何平均滴度为33.9(由HI测得)，其中60只鸟中有49只鸟显示1∶16或更大的HI滴度。然而本文所获得的结果似乎显示更大的有效性。
实例3在火鸡中实施预防性接种的POULVAC XXX有效性试验结果一般信息概述·在ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLE VENEZIE，PADOVA，ITALY实施，其为OIE AND NATIONAL REFERENCE LABORATORYFORAIAND ND·试验基于先前工作，但对其实施开发以测试POULVAC XXX作为一用于预防性接种抑制下述情况的工具的有效性-高度适应性病毒的重新出现(A/Ty/Italy/8000/H7N3/2002)-对家庭宿主具有低适应程度的新颖病毒株的引入(A/ty/Italy/H5N2/1980)-在雏鸡及火鸡中用不同的感染剂量实施的试验实验性试验火鸡·在8、34、60天龄时用POULVAC XX实施接种，0.5ml/SC·4个实验组，2组实施接种及2组未实施接种第三次接种后21天用104EID/50于100ul中/鼻内实施激发-LPAI A/ty/Italy/8000/2002/H7N3-LPAI A/ty/Italy/H5N2/1980·一未经接种的对照组·对泄出物(在第3、5、7、10、14、20天收集的气管及泄殖腔的试样)、血清学及临床征象进行评估方法·根据EU DIRECTIVE 92/40/EC实施病毒分离·根据EU DIRECTIVE 92/40/EC实施血细胞凝集作用抑制测试·根据CATTOLI等人，(2004)，AVIAN PATHOLOGY，33(4)，第432-437页实施实时RT-PCR·根据CAPUA等人，(2003)AVIAN PATHOLOGY 32(1)，47-55实施抗N抗体检测测试“DIVA”测试定义及统计学测试·感染通过RRT-PCR(气管或泄殖腔的)获得病毒学阳性率和对于“DIVA”的血清转化及阳性率的组合·血清转化至少4log的增加(激发前及激发后的滴度)·介于经接种组与未经接种组间的泄出物比较费希尔氏(FISHER′S)精确P值·激发前及激发后滴度比较非参数性征象测试(之前-之后，在同组内实施)及威尔科克森(wilcoxon)(MANN-WHITNEY)双样本测试(在不同组之间对滴度增加实施比较，DZ以确立在激发后于经接种组与未经接种组之间是否存在滴度增加差异)结果火鸡H5N2 104EID/50激发1.在经接种鸟与未经接种鸟之间对感染结果指标进行比较费希尔氏精确p值＝0.0005(＜0.01)显著经接种鸟与未经接种鸟相比较达成感染的鸟数之间存在统计学上显著的差异

2.在经接种鸟与未经接种鸟之间对泄出物(泄殖腔及气管的试样)水平实施比较费希尔氏精确p值＝0.0005(＜0.01)显著在经接种鸟中泄出物水平显著低于未经接种鸟

3.在经接种鸟与未经接种鸟之间对激发前及激发后HI滴度实施比较非参数性征象测试未经接种鸟H5N2P＝0.0039(＜0.01)；H5N9P＝0.0039(＜0.01)
经接种鸟H5N2P＝0.1797(＞0.05)；H5N9P＝0.0039(＜0.01)显著在经接种鸟中针对激发病毒的血清学滴度上升不显著。在未经接种鸟中存在一显著的滴度上升。

*log 2火鸡H7N3 104EID/50激发1.在经接种鸟与未经接种鸟之间对感染结果指标实施比较费希尔氏精确p值＝0.0001(＜0.01)显著在经接种鸟与未经接种鸟之间存在感染结果间的在统计学上显著的差异。

2.在经接种鸟与未经接种鸟之间对泄出物(泄殖腔及气管的试样)水平实施比较费希尔氏精确p值＝.0000(＜0.01)显著在经接种鸟中泄出物水平显著低于未经接种鸟

3.在经接种鸟与未经接种鸟之间对激发前及激发后的HI滴度实施比较非参数性征象测试未经接种鸟H7N1P＝0.0039(＜0.01)；H7N3P＝0.0039(＜0.01)经接种鸟H7N1P＝0.0020(＜0.01)；H7N3P＝0.0215(＜0.05)不显著在经接种鸟中存在一可与在未经接种鸟中观察到的结果相比较的针对激发病毒的显著的血清学滴度上升。

*log 2°欲将与H7N1病毒较高的血清学反应性归因于特定的病毒株。为评估显著性，必须考虑激发病毒的滴度。
结论-火鸡·一3次注射程序的POULVAC XXX能够
显著地减少用104EID/50的为意大利火鸡种群所特有的H7N3病毒株激发的受感染鸟数、泄出及临床征象显著地减小用104EID/50的经选择以模拟新引入H5N2病毒株激发的受感染鸟数及泄出·对火鸡实施预防性接种已导致群组对实验性感染的较低感病性及显著较低的泄出物水平实例4在火鸡中实施预防性接种的Poulvac XXX功效试验结果概述总说明·在ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLE VENEZIE，PADOVA，ITALY实施，其为OIE AND NATIONAL REFERENCE LABORATORYFORAIAND ND·试验基于先前工作，但对其实施开发以测试POULVAC XXX作为一用于预防性接种抑制下述情况的工具的功效-高度适应性病毒的重新出现(A/Ty/Italy/8000/H7N3/2002)-对家庭宿主具有低适应程度的新颖病毒株的引入(A/ty/Italy/H5N2/1980)-在雏鸡及火鸡中用不同的感染剂量实施的试验实验性试验火鸡·在2周龄及5周龄时用POULVAC XX(0.5ml/IM)实施接种。
·4个实验组，2个实施接种及2个未实施接种在实施第二次接种后21天后用106EID/50in 100ul/鼻内实施激发-LPAI A/ty/Italy/8000/2002/H7N3-LPAI A/ty/Italy/H5N2/1980·一未经接种的对照组·对泄出物(在第3、5、7、10、14、20天收集的气管及泄殖腔的试样)、血清学及临床征象进行评估方法·根据EU DIRECTIVE 92/40/EC实施病毒分离·根据EU DIRECTIVE 92/40/EC实施血细胞凝集作用抑制测试·根据CATTOLI等人，(2004)，AVIAN PATHOLOGY，33(4)，第432-437页实施实时RT-PCR。
·根据CAPUA等人，(2003)AVIAN PATHOLOGY 32(1)，47-55实施抗N抗体检测测试“DIVA”测试定义及统计学测试·感染通过RRT-PCR(气管或泄殖腔的)获得的病毒学阳性率及对于“DIVA”的血清转化及阳性率的组合·血清转化至少4log的增加(激发前及激发后的滴度)·介于经接种组与未经接种组间的泄出物比较费希尔氏精确P值·激发前及激发后滴度比较非参数性征象测试(之前-之后，在同组内实施)及威尔科克森(MANN-WHITNEY)双样本测试(在不同组之间对滴度增加实施比较，IE以确立在激发后于经接种组与未经接种组之间是否存在滴度增加差异)结果雏鸡H5N2 106EID/50激发1.在经接种鸟与未经接种鸟之间对感染结果指标进行比较费希尔氏精确p值＝0.0433(＜0.01)显著在经接种鸟中未达成感染

2.在经接种鸟与未经接种鸟之间对泄出物(泄殖腔及气管的试样)水平实施比较费希尔氏精确p值＝0.0008(＜0.01)显著在经接种鸟中泄出物水平显著低于未经接种鸟-(因为未达成感染)

3.在经接种鸟与未经接种鸟之间对激发前及激发后的HI滴度实施比较非参数性征象测试未经接种鸟H5N2P＝0.0039(＜0.01)；H5N9P＝0.0078(＜0.01)经接种鸟H5N2P＝0.4531(＞0.05)；H5N9P＝0.6875(＞0.05)显著在经接种鸟中针对激发病毒的血清学滴度上升不显著(因为未达成感染)。在未经接种鸟中存在一显著的滴度上升。

_*log 2火鸡H7N3 106EID/50激发1.在经接种鸟与未经接种鸟之间对感染结果指标实施比较费希尔氏精确p值＝0.0015(＜0.01)显著在经接种鸟中未达成感染

2.在经接种鸟与未经接种鸟之间对泄出物(泄殖腔及气管的试样)水平实施比较费希尔氏精确p值＝0.0000(＜0.01)显著在经接种鸟中泄出物水平显著低于未经接种鸟——(因为未达成感染)

3.在经接种鸟与未经接种鸟之间实施激发前及激发后HI滴度之间的比较非参数性征象测试未经接种鸟H7N1P＝0.0020(＜0.01)；H7N3P＝0.0020(＜0.01)经接种鸟H7N1P＝0.0020(＜0.01)；H7N3P＝1.0000(＞0.05)显著在经接种鸟中不存在针对激发病毒的血清学滴度显著上升(因为未达成感染)。在未经接种鸟中存在一显著的滴度上升。

*log 2°欲将与H7N1病毒较高的血清学反应性归因于特定的病毒株。为评估显著性，必须考虑激发病毒的滴度。
结论——火鸡·一两次注射程序的POULVAC XXX能够预防被106EID/50的为意大利火鸡种群所特有的H7N3病毒株感染预防被106EID/50的经选择以模拟新引入病毒的H5N2病毒株感染·对雏鸡的预防性接种已防止了雏鸡中活性感染的形成尽管在本发明多个实施例中对本发明进行了阐述，但预期业内熟练的技术人员可对其实施及完成某些修改而不背离如于先前阐述中所给出及如以下权利要求书中进一步体现的本发明真实精神及范围。
权利要求
1.一种可有效预防或减轻禽流感病毒感染的疫苗组合物，其包含至少两种灭活的禽流感病毒株，其中组合的血凝素(HA)总量为至少约200HA/剂所述疫苗组合物，且其中各所述病毒株为至少约128HA/剂，且另外其中所述病毒株之一具有与激发病毒相同的HA亚型，且其中至少一种所述病毒株具有与所述激发病毒不同的NA亚型。
2.如权利要求1所述的疫苗组合物，其进一步包含药理学上可接受的载剂。
3.如权利要求2所述的疫苗组合物，其进一步包含至少一种另外的家禽抗原。
4.如权利要求3所述的疫苗组合物，其中所述载剂为至少一种选自由水性载剂和乳剂组成的群组的成员。
5.如权利要求4所述的疫苗组合物，其中所述载剂为油包水乳剂。
6.如权利要求5所述的疫苗组合物，其中所述乳剂包含至少两种表面活性剂。
7.如权利要求6所述的疫苗组合物，其中所述表面活性剂选自由去水山梨糖醇油酸酯和氧化乙烯/氧化丙烯嵌段共聚物组成的群组。
8.如权利要求7所述的疫苗组合物，其中所述乳剂包含至少两种去水山梨糖醇油酸酯。
9.如权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述酯为TWEEN80和去水山梨糖醇倍半油酸酯。
10.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述抗原选自由在水浴中经灭活的病毒抗原组成的群组。
11.一种预防或减轻禽流感病毒感染爆发的方法，其包括向家禽成员投与包含至少两种灭活的禽流感病毒株的疫苗组合物，其中组合的血凝素(HA)总量为至少约200HA/剂所述疫苗组合物，且其中各所述病毒株为至少约128HA/剂，且另外其中所述病毒株之一具有与激发病毒相同的HA亚型，且其中至少一种所述病毒株具有与所述激发病毒不同的NA亚型。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述疫苗组合物经由饮用水或喷雾剂投与。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述剂量在每只家禽成员约0.25mL至2.0mL的范围内。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述疫苗仅以一次剂量投与。
15.一种可有效预防或减轻禽流感病毒感染的疫苗组合物，其包含至少两种灭活的禽流感病毒株，其中组合的血凝素(HA)总量为至少约250HA/剂所述疫苗组合物，且其中各所述病毒株为至少约150HA/剂，且另外其中所述病毒株之一具有与激发病毒相同的HA亚型，且其中至少一种所述病毒株具有与所述激发病毒不同的NA亚型，并且其中所述组合物包含两种主要由去水山梨糖醇油酸酯组成的表面活性剂。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述表面活性剂为TWEEN80和去水山梨糖醇倍半油酸酯。
17.如权利要求15所述的组合物，其中各所述病毒株为约192HA/剂。
18.如权利要求15所述的组合物，其中所述组合物在接种后约22天时产生大于约33.9的几何平均滴度，其中60只家禽成员中有超过约49只具有至少约1∶16的HI滴度。
19.如权利要求15所述的组合物，其中所述病毒株经鉴别分别为H5N9和H7N1。
20.如权利要求15所述的组合物，其中总HA/剂为至少约300。
全文摘要
本发明揭示一种能有效预防或减轻禽流感病毒感染的疫苗组合物和方法。所述疫苗包含至少两种灭活的禽流感病毒株，其中组合的血凝素(HA)总量为至少约200HA/剂疫苗组合物，且其中各所述病毒株为至少约128HA/剂，且另外其中所述病毒株之一具有与激发病毒相同的HA亚型，且其中至少一种所述病毒株具有与所述激发病毒不同的NA亚型。
文档编号A61K39/39GK101035559SQ200580033697
公开日2007年9月12日 申请日期2005年10月6日 优先权日2004年10月7日
发明者胡安·普拉纳-杜兰, 鲁特·比拉-金塔纳, 若尔迪·塔雷斯-考尔, 马埃什·库马尔 申请人:惠氏公司