产生羧基端酰胺化肽的方法

专利名称：产生羧基端酰胺化肽的方法
技术领域：
本发明涉及羧基端(C端)酰胺化肽的产生，所述羧基端(C端)酰胺化肽具有C端酰胺化了的赖氨酸，特别是具有GLP-1的生物学活性；涉及其化学或生物技术学前体和中间体；涉及其产生方法以及其用于产生药品的用途。
患有糖尿病或肥胖症人群的数量正在全世界以高增长速率增加。因此期望在这一疾病领域显示高疗效的药物必须能以提高的质量和数量获得。
专利申请US2004/0106547 A1描述了来自胰高血糖素样肽抑制剂的肽，由于它们的血糖降低作用，在治疗糖尿病或其它例如能导致肥胖症的代谢性疾病中作为可能药物而具有重要性。特别地，由于它们作用的生理学机制，目前期望糖尿病后遗症将较不显著或大大延迟。
发现在US2004/0106547 A1中描述的肽由于引入一个或多个C端赖氨酸残基(末端的赖氨酸残基被C端酰胺化)而特别有活性。
为了产生这些肽，在US2004/0106547 A1中提到了多种产生方法。一种方法涉及生物技术学方法，其中在酵母中细胞内表达后，从细胞分解产物分离靶标蛋白质。然而，微生物仅微量形成C端酰胺化的肽，因此如US2004/0106547 A1提出的生物技术学产生仅仅能非常费力地或高费用地实现。
作为备选，该申请描述了所讨论肽的化学全合成。为此提出改进的Merryfield合成法，然而其依然是非常费力的并且具有高成本。其中的原因是这样的事实，即用于合成的氨基酸必须首先产生和纯化，然后在化学修饰后特异地在肽合成中用作反应物。在合成的最后，必须除去保护基且在将其配制为药物前纯化靶标肽或产物。因此化学全合成在巨大花费时可行，并且有极低的生态效益。
能够在C端酰胺化肽的酶已知道很久。将这些酶称作(Eipper等人，Mol.Endocrinol.1987 Nov；1(11)1987)肽基甘氨酸α-酰胺化酶(PAM)。此类PAM酶的产生和纯化是本领域技术人员所熟悉的且已详细描述；而且许多此类酶制品是可商购的(例如K Ohsuye等人，Cytotechnology 31，199985-94，US4708934、US5789234、US6255067、US6319685以及JP0177184)。
Bradbury等人(Biochem.Biophys.Res.Commun.(1983)112(2)372-377)显示PAM“在体外”优选地识别其C端由氨基酸甘氨酸组成的肽作为底物。他们还说明在相邻甘氨酸的N端位置的碱性氨基酸强烈地减缓PAM的反应速率。
现已发现PAM令人惊讶地很好地识别具有碱性氨基酸C端序列(特别是寡赖氨酸或聚赖氨酸序列)且还具有C端甘氨酸残基的胰高血糖素样肽的抑制剂衍生物作为底物。
因此令人惊讶地，根据本发明使得以相当低的成本来生物技术学产生酰胺化的肽，特别是如US2004/0106547 A1描述的此类酰胺化肽成为可能，由此可以通过单个酶步骤从其C端甘氨酸延伸的前体肽/蛋白质制备所需的产物。
在根据本发明的方法中，产生具有C端赖氨酸残基的包含一个或多个碱性氨基酸的生物学活性肽，所述碱性氨基酸优选为赖氨酸、组氨酸和/或精氨酸残基，特别是赖氨酸残基，其中最后的C端赖氨酸残基是C端酰胺化的。通过根据本发明的方法产生的肽优选地表现出GLP-1、胰高血糖素样肽抑制剂4或其生物学活性类似物或其衍生物的生物学活性。
因此本发明特别使来自US2004/0106547的2号化合物的生物技术学产生成为可能。所述的2号化合物具有以下序列(Seq.ID No.1)NH2-HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKK-NH2因此式I的肽是本发明的目标(AS)n-XmYp(式I)，其中
AS为基因可编码的一个或多个氨基酸；n为5-2000，优选地为10-1000，特别地为15-500，十分特别优选地为20-400；X为一个或多个碱性氨基酸或其衍生物，优选地为赖氨酸、组氨酸和/或精氨酸，特别地为赖氨酸；m为1-15，优选地为3-10，特别地为6-8；Y为一个或多个中性电荷氨基酸，优选地为甘氨酸；且p为1-10，优选地为1-5，特别地为1；其中n、m和p为整数且(AS)n和/或(AS)nXm优选地为生物学活性肽或蛋白质。
十分特别优选地是根据Seq ID No.2的式I的化合物NH2-HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKKG (SeqID No.2)和具有至少60％，优选地为80％，特别地为90％同源性的其生物学活性衍生物。
同样地，本发明另外的目标是a)编码本发明肽的核酸分子，优选地为DNA、cDNA或RNA分子；b)包含本发明核酸分子的表达盒；c)包含本发明核酸分子或表达盒的载体，优选地为表达载体，特别地为用于在酵母和/或细菌细胞中表达的表达载体；d)包含本发明核酸分子、表达盒或载体的宿主细胞，优选地为细菌或酵母细胞，任选地还共表达酶PAM；e)能够将RNA分子翻译成蛋白质的体外表达系统。
同样地本发明还有另一个目标是用于产生通式II的C端酰胺化肽的方法(AS)n-Xm-NH2(式II)其中AS为基因可编码的一个或多个氨基酸；n为5-2000，优选地为10-1000，特别地为15-500，十分特别优选地为20-400；并且(AS)n和/或(AS)n-Xm是生物学活性肽或蛋白质，X为一个或多个碱性氨基酸或其衍生物，优选地为赖氨酸、组氨酸和/或精氨酸，特别地为赖氨酸；m为1-15，优选地为3-10，特别地为6-8；且n和m是整数并且其中a)在适宜的营养培养基中培养本发明的宿主细胞，b)表达本发明的肽，c)任选地通过酶切割从适宜的前体肽中释放本发明的肽；d)来自步骤b)的表达产物或来自步骤c)的中间体产物，任选地在纯化后与α-酰胺化酶反应以提供通式II的化合物；且e)以适宜的方式纯化通式II的化合物，优选地通过制备层析方法。
但是本领域的技术人员知道已知的生物化学或生物物理学分离方法的组合同样能得到所需的纯化结果。
优选地，根据本发明的方法用于产生C端酰胺化肽，其(用于)产生SeqID No.1的化合物。
首先，在本发明方法的上下文中，开发了微生物产生异源肽/蛋白质的能力。为此，将所需的肽/蛋白质序列翻译成与宿主特异性启动子序列偶联的相应的DNA序列。根据表达策略，在此可以以这样的方式表达靶标肽，即其是通过细胞直接或间接地作为融合蛋白质形成的，同时仍存在于细胞内。融合蛋白质可以在化学或酶加工成所需靶标蛋白质前直接地与PAM反应，或可以以相反的顺序在通过与PAM反应而酰胺化前首先切割成融合片段。如果选择了融合策略，则对于本领域技术人员来说很清楚的是融合配偶体必须通过桥连成员连接到一起，所述桥连成员允许以这样的方式切割配偶体，即Lys-Xm-Gly延长的靶标肽N端在加工后正确存在。存在多种选择用于设计桥连成员。如果例如选择氨基酸甲硫氨酸，则能够用卤化氰化学切割。如果例如选择序列为DDDDK的五肽作为桥连成员，则能够用肠激酶切割。如果例如选择序列为IEGR的四肽，则可通过因子Xa实现切割。通过适宜的设计，Genenase可以用作其N端以组氨酸起始的蛋白质的底物结合酶。在以下的实施例部分中描述了使用肠激酶的切割。
然而可选地，如果靶标肽是适合输出的，则可以将它以融合蛋白质的形式或直接以天然形式释放到培养基中。为此，可以使用通过基因工程修饰的细胞，特别是微生物的，优选地为细菌的或酵母的。如果选择细菌细胞作为表达系统，还可选择将靶标蛋白质直接释放或将包含靶标蛋白质的相应的融合蛋白质释放到周质或培养基中。
原则上能够用于此的宿主微生物和方法是本领域技术人员已知的。在很大程度上这些还能够从许多供应商处商购。作为典型的例子，提及NewEngland Biolabs、Invitrogen和Roche公司。在此类公司的目录说明书中有提供技术概况的文献参考。
而且对本领域的技术人员来说还清楚，与生物技术学方法的技能一样，得到使用的微生物的范围在不断扩展。本发明的目标还包括在这一方面专门的实施方案。
一般地，通过举例，提及下列宿主/载体系统大肠杆菌(E.coli)、肉葡萄球菌(S.carnosus)、沙门氏菌属(Salmonella)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubeilis)或假单胞菌属(Pseudomonas)型的细菌及乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和酿酒酵母(S.cerevisiae)型的酵母。
下面通过举例，描述基于大肠杆菌K12和大肠杆菌B的系统的用途。而且本领域技术人员知晓通过举例提到的这些系统提供了多种变化的可能性，例如它们源自选择适宜的启动子或其它调节核酸序列、所使用的宿主细胞和载体的遗传特性(如DNA拷贝数、选择培养基等)。对本领域的技术人员来说更加清楚文中所描述的实践实施例仅仅代表与实际可行的可能性相关的很少的选择。
当PAM酶与待酰胺化的前体蛋白质在同一个宿主细胞中共表达时出现了用PAM“体外”酰胺化的一种备选。这是通过在宿主特异性调节序列的控制下向宿主细胞中引入编码PAM活性的基因序列实现的。这一表达序列既可以被稳定地掺入到所讨论的染色体DNA序列上，也可以与靶标蛋白质的表达质粒平行地存在于另一个质粒上，或者可以作为另一表达盒被整合到同一载体中，或者甚至可以在同一启动子序列的调控下被克隆到与编码靶标蛋白质的基因序列同相的多顺反子表达单元中。
因此本发明包括用于产生式I的肽或其衍生物的生物技术学方法，所述的衍生物表现出与式I至少60％，优选地至少80％，特别地至少90％的同源性。
根据本发明方法的特征在于产生合成肽前体的重组微生物，随后可在酶存在下直接地或通过与一个或多个碱性氨基酸或其衍生物顺序连接将所述肽前体转化为与对应于式I的肽，所述碱性氨基酸按顺序优选地为赖氨酸、组氨酸和/或精氨酸残基，特别地为赖氨酸，其中序列是C端酰胺化的。
本发明的另一目标还有根据本发明方法已经产生的本发明式I的化合物或式II的C端酰胺化肽，特别是Seq ID No.1或2的化合物的用途，其用于产生药品或药物制剂，优选地用于治疗碳水化合物代谢紊乱，特别优选地用于治疗糖尿病。
实施例实施例1.编码AVE1-44-Gly的大肠杆菌特异性DNA序列的合成首先制备编码肽AVE1-44-Gly(Seq ID No.2)的基因序列Seq ID No.3Seq ID No.3TTTTTTAAGCTTG CACGGTGAAG GTACCTTCAC CTCCGACCTG TCCAAACAGATGGAAGAAGA AGCTGTTCGT CTGTTCATCG AATGGCTGAA AAACGGTGGTCCGTCCTCCG GTGCTCCGCC TTCGAAAAAG AAGAAAAAGA AAGGT TGATAATAGCATGCA CGTGCGGCCG CACCTGGTCGA CGAATTCAAA AAAA使用PCR技术实现基因序列的合成。为此，通过化学DNA合成法合成下列5个引物。使用ExpediteTMDNA合成系统实现这一合成。
a)引物zp5u具有序列(Seq ID No.4)5′-TTTTTTAAGC TTGCACGGTG AAG-3′
Seq ID No.4包含有义链的区域1-23。
b)引物zp3a具有序列(Seq ID No.5)5′-CTTCCATCTG TTTGGACAGG TCGGAGGTGA AGGTACCTTCACCGTGCAAG CTTAAAAAA-3′Seq ID No.5包含反义链的区域1-59。
c)引物zp3b具有序列(Seq ID No.6)5′-GGACGGACCA CCGTTTTTCA GCCATTCGAT GAACAGACGAACAGCTTCTT CTTCCATCTG TTTGGACAG-3′Seq ID No.6包含反义链的区域40-108。
d)引物zp3c具有序列(Seq ID No.7)5-GTGCATGCTA TTATCAACCT TTCTTTTTCT TCTTTTTCGAAGGCGGAGCACCGGAGGACG GACCACCGTT TTTC-3′Seq ID No.7包含反义链的区域91-164。
e)引物zp3d具有序列(Seq ID No.8)5′-TTTTTTGAAT TCGTCGACCA GGTGCGGCCG CACGTGCATGCTATTATCAA CCTT-3′Seq ID No.8包含反义链的区域144-197。
使用这些引物在54℃标准条件下连续进行4个PCR发应，在反应1中使用引物zp3a与zp5u每种各100ng。PCR循环数为5。在第二个反应中，在10个循环中用引物zp5u与zp3b每种各100ng处理1/40的反应物。在反应3中，在另外10个循环中用引物zp5u和zp3c每种各100ng处理1/40反应2的产物。最后，在25个PCR循环中用从反应3得到的1/40的产物与引物zp5u和zp3d合成所需的DNA片段，并通过凝胶电泳检验其长度。将所需的DNA片段纯化并且按照制造商的说明书(New EnglandBiolabs)先后与限制性酶EcoR1和Hind3反应。
平行地，用酶EcoR1与Hind3处理质粒pUC19(New England Biolabs)的DNA。用1.2％的琼脂糖凝胶分离来自切割混合物的片段并且之后分离pUC19的残留载体片段和从反应4得到的所需产物。在T4连接酶反应中16℃过夜将纯化片段连接到一起。接下来用连接混合物转化感受态大肠杆菌细胞(Stratagene，菌株大肠杆菌XL10 Gold)并涂到含25mg/l的氨苄青霉素的琼脂平板上。将质粒DNA从单个克隆中分离并通过DNA序列分析进行表征。
将所需片段的质粒DNA命名为pSCHPUCZP10。将它用作原材料用于产生表达载体，其用于在大肠杆菌K12细胞中合成根据本发明的前体肽。
实施例2编码前体肽AVE1-44-Gly的表达载体的构建为了产生肽AVE1-44-Gly，将编码序列引入来自Invitrogen公司(目录号K360-01)的载体pThioHisA中。形成包含通过肠激酶识别序列DDDDK与前体肽AVE1-44-Gly连接的硫氧还蛋白的融合蛋白质。在PAM(WakoPure Chemicals Ind.Ltd.)存在时按照实施例7(下列)通过用肠激酶处理，将AVE1-44-Gly释放并可随后转化为靶标蛋白质AVE1-44-NH2。
合成有下列序列的两个引物有BamH1切割位点的引物Zp_thiohisf(Seq ID No.9)5′-TTTTTTGGAT CCGGTGATGA CGATGACAAG CACGGTGAAG GTACCTTC-3′有EcoR1切割位点的引物ZP_thiohisrev(Seq ID No.10)5′-TTTTTTGAAT TCGTCGACCA GGTGC-3′在标准条件下，用pSCHPUCZP10 DNA作为模板，在PCR反应中使用引物Zp_thiohisf与ZP_thiohisrev。产生PCR片段，其在用酶BamH1和EcoR1切割后在T4连接酶反应中直接被插入到相应地用BamH1和EcoR1打开的pTHIOHisA载体中。将感受态大肠杆菌BL21细胞用连接混合物转化并涂到含25mg/l氨苄青霉素的选择性琼脂上。将质粒DNA从一些克隆中再分离并用PCR和随后的DNA序列分析来分析。根据专利US5496924的实施例14，类似地检测所需的命名为pTHIOHisAZP10-Gly的阳性克隆的融合蛋白质表达。以阳性表达分析为基础，选出一个克隆并发酵以产生更大量的材料。形成的融合蛋白质包含通过肠激酶识别序列与AVE1-44-Gly连接的硫氧还蛋白(Seq ID No.12)。
其内容在此清楚地引用到本申请中作为参考的US5496924提出了原则上能够产生适应需要的(made-to-measure)融合蛋白质的表达系统。系统的优点在于可产生具有少量压载含量(small ballast content)的融合蛋白质的事实。如果序列区段A-B通过肠激酶识别序列DDDDK与AVE1-44-Gly融合，则可得到有下列基因和氨基酸序列(Seq ID No.11和12)的融合蛋白质Seq ID No.11GGAAACAGAATTC ATGGCGCCGA CCTCTTCTTC TACCAAAAAG CTCAACTGCAACTGGAACA CCTGCTGCTG GACCTGCAGA TGATCCTGAA CGGTATCAACAACTACAAAA ACCCGAAACT GACGCGTATC GACGATGACG ATAAACACGGTGAAGGTACC TTCACCTCCG ACCTGTCCAA ACAGATGGAA GAAGAAGCTGTTCGTCTGTT CATCGAATGG CTGAAAAACG GTGGTCCGTC CTCCGGTGCTCCGCCTTCGA AAAAGAAGAA AAAGAAAGGT TGATAATAGC ATGCACGTGCGGCCGCAAGC TTAAAAAASeq ID No.12MAPTSSSTKK TQLQLEHLLL DLQMILNGIN NYKNPKLTRI DDDDKHGEGTFTSDLSKQME EEAVRLFIEW LKNGGPSSGA PPSKKKKKKG通过PCR技术实现编码基因序列的制备。为此合成下列引物1)引物psw3_zpcolf(Seq ID No.13)5′-CGTATCGACG ATGACGATAA ACACGGTGAA GGTACCTTC-3′因此引物的序列包含了肠激酶识别位点和AVE1-44-Gly编码序列的起始。
2)引物psw3_zpcolrev(Seq ID No.14)5′-GTGTTTATCG TCATCGTCGA TACGCGTCAG TTTCGG -3′因此序列对应于合成的白介素-2序列，根据US5496924的表1其包含氨基酸34-38和2/3的氨基酸甲硫氨酸的密码子。其余的引物序列与引物psw3_zpcolf重叠。
3)pBprimef1(Seq ID No.15)5′-TGAGCGGATA ACAATTTCAC AC-3′引物与在质粒pK50(US5496924的图33)中包含的EcoR1切割位点上游杂交。
4)有Hind3切割位点的psw3_zp10colrev(Seq ID No.16)5′-TTTTTTAAGC TTGCGGCCGC ACGTGCATGC TATTATCAAC CTTC-3′两个PCR平行进行。一个在50℃时用引物对pBprimef1和psw3_zpcolrev在质粒pK50的DNA上进行，并且另一个反应在54℃用引物对psw3_zpcolf和psw3_zp10colrev在质粒pTHIOHisAZP10-Gly的DNA上进行。在凝胶电泳分离后纯化PCR产物，将每一整分试样以1∶1的比例混合并且之后在第三次PCR中用引物对pBprimef1和psw3_zp10colrev反应。将PCR产物用酶EcoR1和Hind3处理并在T4连接酶反应中插入到平行地用这些酶打开的质粒pK50中。将感受态大肠杆菌BL21细胞用连接混合物转化并涂到含25mg/l氨苄青霉素的选择性琼脂上。从一些克隆中再分离质粒DNA并用PCR和随后的DNA序列分析法分析。将阳性克隆命名为pBZP100且用于融合蛋白质表达的检测。
通过质谱并且通过SDS-PAGE分析表达产物并通过蛋白质序列分析确定N端。选择适宜的克隆用于大量材料的发酵。
实施例3在实施例2中构建的菌株的发酵在发酵罐中，在无机盐培养基中或复杂培养基中(见实施例1)在30℃或37℃且在pH为7.0时培养用不同的编码靶标肽衍生物(融合蛋白质)的质粒载体转化的大肠杆菌BL21细胞。用NH4+溶液(在水中26％)实现pH调节。通过将培养物肉汤中的溶解氧保持在30％不变的调控策略来确保培养物的通气。对于在无机盐培养基中的进料分批过程，在分批阶段完成后装入葡萄糖溶液(60％w/v)(8g/L/hr到26g/L/hr)。通过加入IPTG(1-4mM终浓度(f.c.))实现蛋白质表达的诱导。诱导持续6-8小时。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测靶标蛋白质的表达。
按照下列描述的实施在大肠杆菌BL21/pBZP100中AVE1-44-Gly(-融合蛋白质)的表达从储存在-80℃的大肠杆菌BL21细胞的永久培养物中取100μl细胞悬液并在0.5L预培养基中在37℃振荡孵育10-16小时。用适宜量的预培养物接种发酵罐中的主培养物到OD600为0.01到0.05的接种密度。
预培养基5g/L细菌用胰蛋白胨10g/L酵母提取物
5g/L NaCl主培养基基于葡萄糖作为碳源的确定成分的无机盐培养基(基本培养基)(JeffreyH MillerExperiments in Molecular Genetics，Cold Sprmg HarborLaboratory(1972))在消耗完最初存在于主培养基中的葡萄糖后，补入葡萄糖溶液。观察到通过加入IPTG(1mM终浓度)诱导的蛋白质表达和在诱导后融合蛋白质的最大表达。
使用例如来自Novex公司的SDS-PAGE分析系统(NuPageNovex12％凝胶系统，InvitrogenTM)，根据制造商的说明书分析在不同培养时间点从发酵罐中回收的细胞悬液的OD600nm为0.02的部分。
实施例4融合蛋白质的纯化BZP-AVE1-44-Gly融合蛋白质的分离将生物量200g的重组大肠杆菌菌株重悬在300ml Tris缓冲液(50mMTris/HCl，pH 7.4；1mM EDTA)中。用两倍高压匀浆(Rannie高压匀浆器，1000bar)进行细胞分解。通过离心除去匀浆物中的不溶成分。将上清液在压力下过滤(Sartorius 0.22μm过滤器，111型)并且应用到预先用缓冲液(50mM Tris/HCl pH 7.3；1mM EDTA)平衡的层析柱上(Source S，Amersham Biosciences)。在上样后用平衡缓冲液(2倍柱体积)实现洗涤步骤，接着是用10％高盐缓冲液(50mM Tris/HCl pH 7.3；1M NaCl，1mMEDTA)的另外的洗涤步骤。通过用超过5倍柱体积的高盐缓冲液来应用盐梯度实现分级分离。通过SDS凝胶电泳(NuPageNovex 12％凝胶系统，Invitrogen)检测单独级分的融合蛋白质含量。将含有融合蛋白质的级分合并在5-10倍之间浓缩(Millipore超滤器，10kDa截留膜)。通过将缓冲液转换为肠激酶缓冲液(50mM Tris/HCl pH 7.4；50mM NaCl，2mM CaCl2)直接将浓缩液用于蛋白酶切割反应，或在切割反应前通过凝胶过滤(Superdex 75，Amersham Biosciences)进一步纯化浓缩液。
按照制造商的说明书，用溶于肠激酶缓冲液(20mM Tris/HCl，50mMNaCl，2mM CaCl2pH 7.4)中的肠激酶(Invitrogen)实现融合蛋白质的切割。
实施例5含有Seq ID No.3的硫氧还蛋白融合蛋白质的纯化将生物量200g的重组大肠杆菌菌株重悬在50mM Tris缓冲液(pH 7.4；1mM EDTA)中。用两倍高压匀浆(Rannie高压匀浆器，1000bar)进行细胞分解。通过离心除去匀浆物中的不溶成分。将上清夜在压力下过滤(Sartorius 0.22μm过滤器，111型)并且应用到预先用缓冲液(50mMTris/HCl pH 7.4；1mM EDTA)平衡的层析柱上(Source Q，AmershamBiosciences)。在上样后用平衡缓冲液(2倍柱体积)实现洗涤步骤，并且通过用超过6倍柱体积的高盐缓冲液(50mM Tris/HCl pH 7.4；0.3M NaCl，1mM EDTA)应用盐梯度来实现分级分离。通过SDS凝胶电泳(NuPageNovex 12％凝胶系统，Invitrogen)检测单独级分的融合蛋白质含量。将含有融合蛋白质的级分合并并且5到10倍浓缩(Millipore超滤器，10kDa截留膜)。通过凝胶过滤层析(gel filtration chromatography，Superdex 75，Amersham Biosciences)进一步分级分离浓缩液。用浓缩的融合蛋白质溶液将预先平衡的柱子(50mM Tris/HCl pH 7.4；200mM NaCl)充填到最多5％的柱体积。通过用平衡缓冲液漂洗实现洗脱。通过SDS凝胶电泳(NuPageNovex 12％凝胶系统，Invitrogen)再次检测单独级分的融合蛋白质含量。合并相关级分，浓缩到大约5mg/ml(具有10kD截留的Vivaspin浓缩器，Vivascience)，并通过渗滤单元(Vivascience)实现将缓冲液转换为肠激酶缓冲液(20mM Tris/HCl pH 7.4；50mM NaCl)。
然后类似于实施例4，用肠激酶实现AVE1-44-Gly前体阶段的加工。
实施例6肠激酶切割反应的切割产物的分离在用肠激酶切割融合蛋白质后，通过离子交换层析(Source 30S，Amersham Biosciences)将切割产物彼此分离。通过加入氯化钠将溶液的离子强度调节到大约10mS/cm。在将蛋白质溶液应用到预先平衡的柱子(20mM Tris/HCl，pH 7.4；用NaCl调节到电导率为大约10mS/cm)上后，将未结合的物质用缓冲液(20mM Tris/HCl，pH 7.4；用NaCl调节到电导率为大约10mS/cm)洗出。通过应用超过10倍柱体积的梯度到500mM NaCl实现AVE1-44-Gly肽的洗脱。
通过SDS凝胶电泳、HPLC和质谱实现含有AVE1-44的级分或AVE1-44的前体阶段的鉴定。将适当的级分合并并且在去除有机溶剂后冻干。
最后，为了确认氨基酸序列，通过Edman法全测序分离的AVE1-44-Gly。
实施例7AVE1-44-Gly到AVE1-44-NH2的转化按照制造商关于反应条件的说明书用PAM酶(肽基甘氨酸酰胺化酶，Wako Pure Chemicals Ind.，Ltd.(订货号161-16971))进行反应。
配制下列溶液1μM CuSO45mM KI3mM抗坏血酸钠230U/ml过氧化氢酶(牛，Fluka)600U/ml PAM(Wako Chemicals)具0.001％Triton X-100的0.1M Tris/HCl pH 7.0将溶液在37℃预孵育1小时并随后加入AVE1-44Gly蛋白质溶液(Tris/HCl pH 7.0，，终浓度80μg/ml)。然后在37℃进一步孵育反应混合物。通过在不同时间取样追随反应过程。在最大转化时通过加入50mM EDTA溶液终止反应。
然后通过离子交换层析(Shodex Co.，柱型号IEC CM-825(8×75mm))分离反应混合物。对此柱应用下列梯度洗脱液A-40mMol磷酸盐缓冲液pH 7+20％乙腈洗脱液B-50mMol磷酸盐缓冲液pH 7+1M NaCL以2ml/min或1ml/min的流过速率在室温操作柱子。
收集洗脱的级分(在280nm处检测)并通过MALDI-MS确定相关肽的质量。用BRUKER Reflex IV型仪器进行质谱分析。将样品直接用于MALDI-MS分析，或用50％TAaq([1+1]0.1％TFA+50％乙腈)稀释到大约50pmol/μl的浓度。
确定预期的AVE1-44-NH2的质量。可以将得到的产物应用于进一步的药物用途。
此后可以按照本领域技术人员己知的方式，通过向生物学活性肽或肽衍生物中加入适宜的药物制剂添加剂来产生药物制剂。
序列表序列表<110>塞诺菲-安万特德国有限公司<120>产生羧基端酰胺化肽的方法<130>DEAV2004/0076<140>
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<160>16<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>44<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽；MOD_RES K44酰胺化<400>1His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys35 40<210>2<211>45<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>2His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly35 40 45<210>3<211>198<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的DNA<400>3ttttttaagc ttgcacggtg aaggtacctt cacctccgac ctgtccaaac agatggaaga60agaagctgtt cgtctgttca tcgaatggct gaaaaacggt ggtccgtcct ccggtgctcc120gccttcgaaa aagaagaaaa agaaaggttg ataatagcat gcacgtgcgg ccgcacctgg180tcgacgaatt caaaaaaa 198<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>4ttttttaagc ttgcacggtg aag23<210>5<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>5cttccatctg tttggacagg tcggaggtga aggtaccttc accgtgcaag cttaaaaaa 59<210>6<211>69<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6ggacggacca ccgtttttca gccattcgat gaacagacga acagcttctt cttccatctg60tttggacag69<210>7<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>7gtgcatgcta ttatcaacct ttctttttct tctttttcga aggcggagca ccggaggacg60gaccaccgtt tttc 74<210>8<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8ttttttgaat tcgtcgacca ggtgcggccg cacgtgcatg ctattatcaa cctt 54<210>9<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>9ttttttggat ccggtgatga cgatgacaag cacggtgaag gtaccttc 48<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>10ttttttgaat tcgtcgacca ggtgc 25<210>11<211>321<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的DNA<400>11ggaaacagaa ttcatggcgc cgacctcttc ttctaccaaa aagactcaac tgcaactgga60acacctgctg ctggacctgc agatgatcct gaacggtatc aacaactaca aaaacccgaa120actgacgcgt atcgacgatg acgataaaca cggtgaaggt accttcacct ccgacctgtc180caaacagatg gaagaagaag ctgttcgtct gttcatcgaa tggctgaaaa acggtggtcc240gtcctccggt gctccgcctt cgaaaaagaa gaaaaagaaa ggttgataat agcatgcacg300tgcggccgca agcttaaaaa a 321<210>12<211>90<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>12Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu1 5 10 15His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr20 25 30Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Ile Asp Asp Asp Asp Lys His Gly Glu35 40 45Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val50 55 60Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala65 70 75 80Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly85 90
<210>13<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>13cgtatcgacg atgacgataa acacggtgaa ggtaccttc 39<210>14<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>14gtgtttatcg tcatcgtcga tacgcgtcag tttcgg 36<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>15tgagcggata acaatttcac ac 22<210>16<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>16ttttttaagc ttgcggccgc acgtgcatgc tattatcaac cttc 4权利要求
1.通式I的化合物(AS)n-XmYp(式I)，其中AS为基因可编码的一个或多个氨基酸；n为5-2000，优选地为10-1000，特别地为15-500，十分特别优选地为20-400；X为一个或多个碱性氨基酸或其衍生物，优选地为赖氨酸、组氨酸和/或精氨酸，特别地为赖氨酸；m为1-15，优选地为3-10，特别地为6-8；Y为一个或多个中性电荷氨基酸，优选地为甘氨酸；p为1-10，优选地为1-5，特别地为1；其中n、m和p为整数且(AS)n和/或(AS)nXm优选地为生物学活性肽或蛋白质。
2.如权利要求1所述的化合物，其通过Seq ID No.2定义以及与Seq IDNO.2具有至少60％同源性的生物学活性衍生物。
3.核酸分子，其编码如权利要求1-2定义的化合物。
4.如权利要求3所述的核酸分子，其为DNA或RNA。
5.如权利要求3-4中的一项或多项所述的核酸分子，其为cDNA。
6.表达盒，其包含如权利要求3-5的一项或多项所述的核酸分子。
7.载体，其包含如权利要求3-5中的一项或多项所述的核酸分子或如权利要求6所述的表达盒，其中所述载体任选地包含调节序列。
8.如权利要求7所述的表达载体。
9.用于在细菌或酵母中表达的如权利要求7-8中的一项或多项所述的载体。
10.宿主细胞，其包含a)如权利要求3-5中的一项或多项所述的核酸分子，b)如权利要求6所述的表达盒，或c)如权利要求7-9中的一项或多项所述的载体。
11.如权利要求10所述的宿主细胞，其为细菌或酵母细胞。
12.如权利要求10到11中的一项或多项所述的宿主细胞，其还共表达PAM酶。
13.体外表达系统，其包含如权利要求2-3中的一项或多项所述的核酸分子。
14.如权利要求13所述的体外表达系统，其还共表达PAM酶。
15.用于产生通式II的C端酰胺化肽的方法(AS)n-Xm-NH2(式II)其中AS为基因可编码的一个或多个氨基酸；n为5-2000，优选地为10-1000，特别地为15-500，十分特别优选地为20-400；且(AS)n和/或(AS)n-Xm优选地是生物学活性肽或蛋白质，X为一个或多个碱性氨基酸或其衍生物，优选地为赖氨酸、组氨酸和/或精氨酸，特别地为赖氨酸；m为1-15，优选地为3-10，特别地为6-8；且n和m是整数且其中a)在适宜的营养培养基中培养如权利要求10-12中所定义的宿主细胞或如权利要求13-14中所定义的表达系统，b)表达权利要求1中定义的化合物，c)任选地通过酶或化学切割从适宜的前体肽释放权利要求1中所定义的化合物；d)来自步骤b)的表达产物或来自步骤c)的中间体产物任选地在纯化步骤后与α-酰胺化酶反应；和e)以适宜的方式纯化通式II的C端酰胺化的肽，优选地通过制备色谱法。
16.如权利要求15所述的方法，用于产生如权利要求2中定义的化合物，优选地为根据Seq ID No.2的化合物。
17.如权利要求15-16中的一项或多项所述的方法，其中通过酶切割从适宜的前体肽释放根据权利要求1所定义的化合物。
18.如权利要求17所述的方法，其中通过酶肠激酶从适宜的前体肽释放根据权利要求1所定义的化合物。
19.根据权利要求15-18中的一项或多项得到的C端酰胺化肽的用途，用于产生药品或药物制剂。
20.如权利要求1-2中的一项或多项所述的化合物的用途，用于产生药品或药物制剂。
21.如权利要求20-21中的一项或多项所述的用途，用于产生治疗糖代谢紊乱的药物。
22.如权利要求21所述的用途，用于产生治疗糖尿病的药物。
全文摘要
本发明涉及羧基端(C端)酰胺化肽的产生，所述羧基端(C端)酰胺化肽具有C端酰胺化了的赖氨酸，特别是具有GLP－1的生物学活性，涉及其化学和/或生物技术学前体和中间体产物。本发明还涉及其产生方法以及其用于产生药品的用途。
文档编号A61K38/26GK101068833SQ200580041283
公开日2007年11月7日 申请日期2005年11月18日 优先权日2004年12月1日
发明者P·哈伯曼, H·德克尔, C·拉特曼, O·马内戈, C·萨拉格纳德, F·措赫尔 申请人:塞诺菲-安万特德国有限公司