专利名称：能抑制her2高表达肿瘤细胞增殖的稳定的小分子多肽的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学中生物治疗药物范围，特别涉及一种能抑制HER2高表达肿瘤细胞增殖的稳定的小分子多肽。
背景技术：
HER2(c-erbB2或HER2/neu，人表皮生长因子受体家族成员2)是I型跨膜酪氨酸激酶受体家族的成员。该家族通过与各种配体相互反应及家族成员间的相互作用介导细胞信号的转导。迄今为止，尚未发现能与HER2高亲和力结合的特异性配体，但HER受体家族其他成员及配体可与HER2形成复合物，介导细胞的信号转导。在文献“Wang S，Saboorian MH，Frenkel E，et al.Laboratoryassessment of the status of HER-2/neu protein and oncogene in breast cancerspecimenscomparison of immunohistochemistry assay with fluorescence insitu hybridisation assays[J].J Clin Pathol，2000，53(5)374-381”、“Scheurle D，Jahanzeb M，Aronsohn RS，et al.HER-2/neu expression inarchival non-small cell lung carcinomas using FDA-approved Hercep test[J].Anticancer Res，2000，20(6)2091-2096.”和“Seliger B，Rongcun Y，Atkins D，et al.HER-2/neu is expressed in human renal cell carcinoma atheterogeneous levels independently of tumor grading and staging and canbe recognized by HLA-A2.1-restricted cytotoxic T lymphocytes[J].Int JCancer，2000，87(3)349-359.”中报道，HER2在许多上皮来源的恶性肿瘤中过表达，如乳腺癌(25％～30％)、卵巢癌(25％～32％)、原发性肾细胞癌(30％～40％)等。免疫组化染色可见乳腺癌细胞的HER2水平较正常乳腺细胞高10～100倍，使HER2成为理想的抗肿瘤免疫治疗的靶标。1998年，美国Genentech公司开发的靶向HER2的治疗性抗体Herceptin(trastuzumab，人源化单克隆抗体)已被FDA批准上市，应用于HER2过表达的乳腺癌患者的临床治疗(Ross JS，Gray K，Gray GS，et al.Anticancer antibodies.Am J Clin Pathol，2003，119(4)472-485.)。临床试验结果表明，单独应用Herceptin的总反应率为11.6-16％，而与化疗药物联合治疗的总反应率可达50％。与单独化疗相比，抗体与化疗联合治疗使进展期复发乳腺癌患者的生存期延长，死亡率降低。目前，研究者正在拓展Herceptin的应用范围，尝试将其用于其他HER2过表达肿瘤的临床治疗，探索新的联合治疗方案(Schneider JW，Chang AY，Garratt A，et al.Trastuzumab cardio-toxicityspeculations regarding pathophysiology andtargets for further study.Semin Oncolr，2002，29(3 suppl 11)22-28.Jahanzeb M.Trastuzunab-based combinations in metastatic breast cancerhow to make a choice.Clin Breast Cancer.2003，4(1)28-38.)。
表1 应用Herceptin临床治疗的观察结果
但是，Herceptin为完整抗体，分子量高达150kDa，不能通过血脑屏障，更难以穿透肿瘤组织，深入瘤体内部发挥作用。因此，单独应用Herceptin治疗的有效率十分有限。此外，全抗体的生产必须采用哺乳动物细胞表达系统，而我国应用哺乳动物细胞表达重组蛋白的技术水平较低，因而生产成本高。目前，国内治疗性抗体的大规模生产正面临重重困难。
为克服大分子抗体组织渗透性差的缺陷，为绕开哺乳动物细胞表达的技术瓶颈，国内外正在开发各种靶向HER2的小分子多肽类抑制剂。这些小分子抑制剂虽然副作用小，但由于半寿期短，发挥有效作用的时间很短暂，因而需要重复给药，用药剂量较大，难免给患者带来经济上的负担。
本发明试图研制开发靶向HER2的新型小分子多肽。该多肽分子具有如下特点1、分子量小，穿透性能好；2、可在原核表达系统中表达，生产成本低；3、具有很好的稳定性，能在一定范围内耐受酸碱度及温度的变化。
发明内容
本发明的目的是提供一种能抑制HER2高表达肿瘤细胞增殖的稳定的小分子多肽。其特征在于所述小分子多肽是自行设计的靶向HER2受体分子的小分子拮抗肽，并采用人细胞中天然存在的跨膜蛋白为骨架，与拮抗肽相融合，应用原核表达体系表达；所述小分子多肽由自行设计的基因编码，经聚合酶链反应(PCR)合成后插入表达质粒pET-22b(Novagen公司)；同时将TrxA基因(编码硫氧还蛋白，Genebank)插入pET-22b，以辅助目的蛋白折叠，实现可溶性共表达。将表达载体转入大肠杆菌BL21/DE3(Novagen公司)，在含有1mmol·L-1IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)的LB培养基中培养，25-28℃下诱导表达。破菌取上清，应用Ni离子亲合层析柱纯化，咪唑缓冲液洗脱获得纯化的目的蛋白，命名为PL45；其序列为MNTSGDTGFDGYSGQNSGGGGSMDLAPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKEITFLKNTVMECDAC。
本发明的有益效果是通过体外实验证实1.采用人细胞中天然存在的跨膜结构域蛋白作为骨架，显著提高了小分子多肽的稳定性；2.所产生的小分子肽在骨架蛋白的作用下，可形成五聚体，与线性肽相比，抑制高表达HER2的肿瘤细胞生长的作用明显增强，其作用具有特异性。3.由于采用的是人源天然结构域蛋白作为骨架，该小分子肽将不会导致异源性；4.该小分子多肽可应用原核表达体系制备，可极大地提高表达量，从而大大降低成本。
图1为重叠PCR合成PL45基因。
图2为含有目的基因的表达载体的鉴定。
图3SDS-PAGE电泳分析见纯化蛋白为单一条带，还原条件下分子量为9kDa。
图4在不同温度及pH变化的条件下，PL45的性质十分稳定，不发生解聚。
图5在37℃下孵育，随时间的延长，PL45的聚合状态不变。
图6示PL45能特异性地抑制HER2过表达的SKBR3细胞增殖，而对低表达HER2的MCF7细胞则无明显抑制作用。
图7荧光标记的PL45与高表达HER2的SKBR3细胞结合活性较强，而与低表达HER2的MCF7细胞结合较弱。
图8为采用重迭延伸拼接法重叠PCR合成PL45基因示意图。
图9为经CR拼接而成目的基因的结构框图。
具体实施例方式
本发明提供一种能抑制HER2高表达肿瘤细胞增殖的稳定的小分子多肽。所述小分子多肽由自行设计的基因编码，经聚合酶链反应(PCR)合成后插入表达质粒pET-22b(Novagen公司)；同时将TrxA基因(编码硫氧还蛋白，Genebank)插入pET-22b，以辅助目的蛋白折叠，实现可溶性共表达。将表达载体转入大肠杆菌BL21/DE3(Novagen公司)，在含有1mmol·L-1IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)的LB培养基中培养，25-28℃下诱导表达。破菌取上清，应用Ni离子亲合层析柱纯化，咪唑缓冲液洗脱获得纯化的目的蛋白，命名为PL45；其序列为MNTSGDTGFDGYSGQNSGGGGSMDLAPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKEITFLKNTVMECDAC。
具体构建如下1.表达载体的构建目的基因分7段由赛百盛公司合成，经重叠PCR法拼接；通过限制性内切酶Sac I和HindIII双酶切后，插入pET-22b质粒(Novagen)，见图1。构建的表达载体经酶切鉴定正确(见图2)，基因序列送上海申能博彩生物技术公司测序鉴定。
2.在大肠杆菌中诱导表达转化大肠杆菌BL21/DE3，挑取单菌落接种于含100mg/L氨卞青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600约为0.4，加入IPTG 1mmol/L，在25-28℃下，130r/min，继续培养8h诱导表达。
3.纯化收集转化菌，重悬于磷酸盐缓冲液，超声破菌获取上清，应用Ni离子亲合层析柱(本元正阳公司)纯化蛋白，咪唑(北京化学试剂公司)缓冲液洗脱，经SDS-PAGE电泳分析，所获目的蛋白的纯度超过90％，分子量为9kDa，见图3。
4.纯化蛋白的鉴定委托国家生物医学分析测试中心色谱室完成纯化PL45的N端测序，证实氨基酸序列与设计的相符。
5.稳定性常规SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，PL45表现为分子量为9kDa的单一条带；而在不含SDS的条件下，分子量为45kDa，表明PL45在溶液中是以五聚体的形式存在。将样品分别置于pH 6.4、pH 7.4、pH 8.4的缓冲液中，36℃、39℃、42℃下孵育8小时以及37℃下孵育4小时、8小时、12小时、24小时、36小时、72小时、96小时后取出，PAGE电泳分析，可见PL45分子量仍为45kDa，表明其在温度及酸碱度变化的一定范围内，性质十分稳定，无解聚现象(见图4、图5)。
6.功能试验样品透析除去咪唑后，经孔径0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，BCA法定量。选用过表达HER2的乳腺癌细胞系SKBR3细胞作为靶细胞，用低表达HER2抗原的乳腺癌细胞系MCF7细胞作为对照细胞，接种于96孔培养板(每孔4×103个细胞)，接种的同时加入纯化的PL45(浓度分别为10和40μg/ml)，给药后分别于24小时、48小时、72小时、96小时加入MTT 10μl(5mg/ml)，孵育4小时后，加入120μl DMSO，振荡20分钟后，测A570。结果显示，PL45具有抑制HER2过表达的SKBR3细胞增殖的作用，而对低表达HER2的MCF7细胞则无明显的细胞毒性(见图6)。
7.与HER2分子的结合活性FITC标记纯化的PL45，应用流式细胞仪检测PL45与高表达HER2分子的SKBR3细胞的结合活性。图7显示，荧光标记的PL45可以与SKBR3细胞结合，而与低表达HER2的乳腺癌细胞系MDA231细胞的结合活性较弱。
本发明的重要意义在于1、采用人细胞中天然存在的跨膜结构域蛋白作为骨架，显著提高了小分子多肽的稳定性；2、所产生的小分子肽在骨架蛋白的作用下，可形成五聚体，与线性肽相比，抑瘤作用明显增强。3、由于采用的是人源天然结构域蛋白作为骨架，该小分子肽将不会导致异源性；4、该小分子多肽可应用原核表达体系制备，可极大地提高表达量，从而大大地降低成本。
实施例1材料E.coli JM109、E.coli BL21/DE3工程菌株为本室冻存；T4 DNA连接酶为Gibco BRL公司产品；限制性内切酶为Biolab公司产品；Taq DNA聚合酶、克隆载体pGEM-T Easy为Promega公司产品；Ex Taq DNA聚合酶为TaKaRa公司产品；表达载体pET-22b(Novagen公司)由军事医学科学院八所赵志虎博士惠赠；质粒提取试剂盒、DNA片段回收试剂盒购自北京博大泰克生物技术公司；IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)为Calbiochem公司产品；Ni离子亲合层析介质购自本元正阳公司；咪唑购自北京化学试剂公司；胎牛血清(FCS)、DMEM培养基、1640培养基为HyClone公司产品；MTT(四噻唑蓝)为Sigma公司产品。
2方法2.1表达载体的构建基因片段由赛百盛公司合成，七段序列如下[1]5’cgagctcatgaacacctctggtgacaccggtttcgac[2]5’gtgacaccggtttcgacggttactctggtcagaactc[3]5’tactctggtcagaactctggtggtggtggttctatggatctggctcct[4]5’ctgaaggctactctacaggctctggtggtccgatggatctggctcct caaatg[5]5’gctcctcaaatgcttcgtgagcttcaggaaaccaatgctgctctgca ggacgt[6]5’tctgcaggacgttcgtgaactgctgcgtcagcaggttaaagaaatca ccttcc[7]5’cccaagcttgcaagcgtcgcattccataacggtgtttttcaggaaggt gattt用H2O将各引物稀释至终浓度为20mM的工作液。各片段之间有部分重复序列，以引物[7]为3’端引物，采用重迭延伸拼接法(Splicing by overlap extension，SOE)，第一次PCR将[6]与[7]拼接起来，产物作为第二次PCR反应的模板；第二次PCR仍以[7]为3’端引物，将[5]加入，产物作为第三次PCR反应的模板，依次类推。使用保真性能好的Ex Taq DNA聚合酶，经六次PCR拼接而成目的基因(见图8)；经CR拼接而成目的基因的结构框图如图9所示。
PCR反应体系为 反应条件为H2O 37μl 95.5℃2’Ex Taq Buffer(10×)5μldNTP(2.5mM) 4μlprimer 5’2μlprimer 3’2μlEx TaqDNA聚合酶0.25μl终产物全长217bp，序列为cgagctcatgaacacctctggtgacaccggtttcgacggttactctggtcagaactctggtggtggtggttctatggacctggctccgcagatgctgcgtgaactgcaggaaaccaacgctgctctgcaggacgttcgtgaactgctgcgtcagcaggttaaagaaatcaccttcctgaaaaacaccgttatggaatgcgacgcttgcaagcttggg在基因片段两端设计了Sac I(gagctc)和HindIII(aagctt)两个限制性酶切位点，双酶切连入pET-22b质粒。
连接体系为H2O 3μlBuffer(2×)7.5μlFragment3μlpGEM-T Easy0.8μl连接酶0.7μl另设对照组，不加Fragment，以H2O补足体积。16℃水浴过夜。
用连接产物转化JM109感受态菌。转化步骤为1)100μl感受态菌置于冰水，加入DNA 0.5μl，静置30分钟；2)42℃水浴2分钟；3)冰浴5分钟；4)加入不含抗生素的LB培养基，37℃下，150rpm振荡培养50分钟。
5)将转化菌接种于含氨苄青霉素的LB琼脂平板，置37℃孵箱培养过夜。
6)挑选阳性克隆4个，分别接种于LB液体培养基，置37℃摇床震荡培养。
2.2载体的鉴定1)用试剂盒提取阳性克隆质粒DNA。
2)用Sac I和HindIII双酶切鉴定质粒DNA，送上海申能博彩生物技术公司测序。
双酶切体系为H2O 18μlBuffer(10×)4μlDNA 16μlSac I 1μlHindIII 0.9μl。
37℃水浴4小时。
2.3诱导表达将测序结果正确的菌株扩增，提取质粒DNA，转化BL21/DE3菌。在含氨苄青霉素的LB培养基中培养至OD600为0.4-0.6时，加入IPTG，将摇床转速降至约130rpm，诱导8小时。
2.4表达产物的鉴定将诱导后的菌液收集至离心管，4℃，6000rpm离心5分钟，弃上清。以原菌液15％体积的冷PBS(磷酸盐)缓冲液重悬沉淀，置于液氮中速冻，然后取出在室温下融化。反复冻融9次后，在4℃下、12000rpm离心10分钟，分别收集上清和沉淀。
在沉淀和上清中加入SDS-PAGE的上样缓冲液，煮沸10分钟后，15％SDS-PAGE电泳，常规考马斯亮蓝染色。
2.5纯化应用Ni离子亲合层析柱纯化，咪唑缓冲液洗脱。纯化中使用了平衡缓冲液(A)和系列浓度梯度的洗脱缓冲液(B)。
A液0.15mol/L NaCl
0.09mol/L Na2HPO40.01mol/L NaH2PO4在A液中加入不同浓度的咪唑即配成不同浓度的B液，系列为B20(20mmol/L咪唑)；B50(50mmol/L咪唑)；B100(100mmol/L咪唑)；B170(170mmol/L咪唑)；B300(300mmol/L咪唑)；B500(500mmol/L咪唑)。所有液体均用HCl/NaOH调至pH 7.8。
纯化步骤如下1).用A液重悬菌体沉淀，冻融破菌。
2).10000g×10min、4℃下离心，去除沉淀，用0.45μm微孔滤膜过滤。
3).用A液平衡亲和层析柱，以60ml/h速度上样；用A液充分洗柱再平衡至检测器指示平稳。
4).B液梯度洗脱结合蛋白，分别收集洗脱液。B20和B50洗下大量蛋白，B100和B170洗脱的蛋白很少，B300和B500再次洗下较多蛋白。各浓度B液均使用5倍柱床体积。
纯化产物经Tris-Tricine-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色检测，所获目的蛋白分子量正确，纯度超过90％。
2.6鉴定委托国家生物医学分析中心色谱室完成目的蛋白的N端测序，由N端11个氨基酸残基的测序结果知表达正确。完整表达的产物全长序列应为MELMNTSGDTGFDGYSGQNSGGGGSMDLAPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKEITFLKNTVMECDACKLAAALEHHHHHH2.7稳定性试验2.7.1聚合性1)非变性电泳可见表达产物为单一条带，分子量为45kDa，而常规SDS-聚丙烯酰胺变性凝胶电泳时亦为单一条带，其分子量为9kDa。
2)质谱分析委托国家生物医学分析中心质谱室完成。MALDI-TOF-MS结果显示，溶液中单体、二聚体、三聚体、四聚体和五聚体同时存在，但占优势的组分的分子量为45kDa，质谱分析时的电离过程可能影响蛋白的结构。
3)目的蛋白不能通过孔径为10kDa的超滤膜。
2.7.2热、酸、碱稳定性目的蛋白在含咪唑的磷酸盐溶液中表现出了极强的稳定性。在37℃水浴时，分别于4小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时、72小时及96小时后取出，电泳分析各组与对照组(4℃)几乎无差别，即蛋白不发生解聚。再设多个不同温度组，8小时后电泳分析发现，各组与对照组(4℃)几乎无差别。
耐酸、碱实验设不同pH组，8小时后电泳分析，各组蛋白仍以五聚体形式存在。
2.8功能实验纯化后的蛋白经透析除去咪唑，正压超滤浓缩后，经孔径0.22μm的HT微孔滤膜过滤除菌。BCA法定量。MTT法验证其抑制肿瘤细胞增殖的作用。
1)选用过表达HER2抗原的乳腺癌细胞系SKBR3细胞作为靶细胞，用低表达HER2抗原的乳腺癌细胞系MCF7细胞及低表达HER2抗原的鼠成纤维细胞系NIH3T3和L929作为对照细胞。
2)使用源自相同表达体系的TrxA作为阴性对照蛋白，治疗性抗体Herceptin作为阳性对照蛋白，实验组为PL45，设4μg·ml-1(五聚分子100nmol·L-1)和40μg·ml-1(1μmol·L-1)两个剂量组，另设不经处理的细胞对照组。
3)细胞生长状态良好时接种96孔培养板，每孔4-5×103个细胞，接种的同时给药，置于37℃孵箱，5％CO2条件下培养。
4)给药后分别于24小时、48小时、72小时、96小时加入MTT(5mg·ml-1)10μl，孵育7小时后拍干，加入120μl DMSO，振荡20分钟后测A570。
实验证实，PL45具有类似Herceptin的抑制过表达HER2的SKBR3细胞增殖的作用，且其作用特异，对于多种低表达或不表达HER2的细胞(MCF7、NIH3T3、L929)无明显的细胞毒性。
权利要求
1.一种能抑制HER2高表达肿瘤细胞增殖的稳定的小分子多肽，其特征在于所述小分子多肽是自行设计的靶向HER2受体分子的小分子拮抗肽，采用人细胞中天然存在的跨膜蛋白为骨架，与拮抗肽相融合，其编码基因经重叠PCR拼接合成，插入表达质粒pET-22b；应用Ni离子亲合层析柱纯化，咪唑缓冲液洗脱获得纯化蛋白，命名为PL45，其氨基酸序列为MNTSGDTGFDGYSGQNSGGGGSMDLAPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKEITFLKNTVMECDAC。
2.权利要求1的能抑制HER2高表达肿瘤细胞增殖的稳定的小分子多肽，其特征在于基因表达的全长氨基酸序列为MELMNTSGDTGFDGYSGQNSGGGGSMDLAPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKEITFLKNTVMECDACKLAAALE。
3.权利要求1的能抑制HER2高表达肿瘤细胞增殖的稳定的小分子多肽，其特征在于单体分子量为9kDa。
4.权利要求1的能抑制HER2高表达肿瘤细胞增殖的稳定的小分子多肽，其特征在于所述小分子多肽形成五聚体，分子量为45kDa。
5.权利要求1的能抑制HER2高表达肿瘤细胞增殖的稳定的小分子多肽，其特征在于目的基因分7段合成，经重叠PCR法拼接；通过限制性内切酶Sac I和Hind III双切后插入pET-22b质粒。
6.权利要求1的能抑制HER2高表达肿瘤细胞增殖的稳定的小分子多肽，其特征在于所述表达载体的转化细胞为大肠杆菌BL21/DE3。
7.权利要求1的能抑制HER2高表达肿瘤细胞增殖的稳定的小分子多肽，其特征在于通过原核表达系统表达。
全文摘要
本发明公开了属于生物医学中生物治疗范围的一种能抑制HER2高表达肿瘤细胞增殖的稳定的小分子多肽PL45。该小分子多肽PL45为自行设计的靶向HER2S1－L2功能域的拮抗分子，由全合成的基因编码，克隆入表达质粒pET－22b；同时将TrxA插入pET－22b，以辅助PL45折叠，实现可溶性共表达。用表达载体转化BL21/DE3宿主菌，在LB培养基中培养，1mmol·L
文档编号A61P35/00GK1908015SQ20061000752
公开日2007年2月7日 申请日期2006年2月14日 优先权日2005年10月18日
发明者郭宁, 王嘉宁, 冯健男, 沈倍奋 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所