专利名称：抑制BCL11A表达和肿瘤性B细胞增殖的Bcl11a siRNA-585及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及SiRNA及其应用领域，具体涉及一种抑制BCLllA表达和肿瘤性B细胞增殖的Bcllla siRNA-585及其在制备治疗和/或预防B细胞肿瘤药物中的应用。
背景技术：
RNAi技术是一种高效的高特异性抑制基因表达的新途径。体内外的研究已显示了 RNAi技术在癌症基因治疗方面比反义核酸具有更好的应用前景。大量的研究表明，体外通过RNAi抑制肿瘤相关基因的表达可抑制肿瘤细胞的增殖、生长，诱导细胞凋亡，增加肿瘤细胞对药物的敏感性。Bcllla(B-cell lymphoma/leukemia 11A)基因定位于 2ρ16· 1，是一个 kriippel 样锌指基因，属于BCLll家族(包括BCLllA和BCL11B)。Bcllla基因共有5个外显子， 主要有4种转录本可产生相应的4种主要蛋白(XL, 5. 9kb/125kD ；L,3. 8kb/100kD ；S, 2. 4kb/35KD ；XS, 1. 5kb/25KD)，外显子1和2是4种表型所共有的，即BCLllA所有的表型有共同的 N 末端[Liu H, Ippolito GC, Wall JK, et al. Functional studies of BCLllA characterization of the conserved BCLlIA-XL splice variant and its interaction with BCL6 in nuclear paraspeckles of germinal center B cells. Mol Cancer. 2006 ； 5:18]。无论在正常的淋巴组织还是在淋巴瘤，BCL11A-XL为主要的表达蛋白。目前研究显示，BCLllA在人类多种B细胞肿瘤呈现高表达[Weniger MA, Pulford K，Gesk S，et al.Gains of the proto-oncogeneBCLllA and nuclear accumulation of BCL IlA(XL) protein are frequent in primary mediastinal B—cell lymphoma. Leukemia. 2006 ； 20(10) :1880-1882]，在人体正常淋巴结、骨髓、脾脏内仅有微弱表达，并且主要表达于生发中心B细胞，而在大部分人体正常组织中都不表达，提示BCLllA可能与B细胞肿瘤的生物学特性有关。事实上，已经表明BCLllA在人类多种B细胞肿瘤中可通过基因扩增、染色体易位或基因活化出现异常，充当一个原癌基因的作用[Yin B, Delwel R，Valk PJ, et al. A retroviral mutagenesis screen reveals strong cooperation betweenBcllla overexpression and loss of the Nfl tumor suppressor gene. Blood. 2009 ； 113(5) 1075-1085]。现有的研究表明BCLllA可能与B细胞肿瘤的发生相关，但目前还没有Bcllla siRNA可用于肿瘤，尤其是B细胞肿瘤治疗和/或预防的证据。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抑制BCLllA表达和肿瘤性B细胞增殖的Bcllla siRNA-585。本发明的另一目的在于提供所述的抑制BCLllA表达和肿瘤性B细胞增殖的 Bcllla siRNA-585 的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现一种抑制BCLl IA表达和肿瘤性B细胞增殖的Bcllla siRNA-585，序列如下所示正义链的序列为5，-GAAUCUACUUAGAAAGCGAUU-3，；反义链的序列为5，-UCGCUUUCUAAGUAGAUUCUU-3，； 所述抑制BCLllA表达和肿瘤性B细胞增殖的Bcllla siRNA-585在制备治疗和/ 或预防B细胞肿瘤药物中的应用；所述的B细胞肿瘤包括B细胞白血病和B细胞淋巴瘤。一种治疗和/或预防B细胞肿瘤药物，包含所述抑制BCLllA表达和肿瘤性B细胞增殖的Bcllla siRNA-585夕卜，还可包含Bcl_2siRNA ；所述的Bcl_2siRNA的序列如下所示正义链的序列为5，-GUACAUCCAUUAUAAGCUGUU-3，；反义链的序列为5，-CAGCUUAUAAUGGAUGUACUU-3，；本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(1)本发明所述的抑制8仏1认表达和肿瘤性8细胞增殖的此111￡1&1 離-585能高效抑制BCLllA表达。(2)本发明所述的抑制8仏1认表达和肿瘤性8细胞增殖的此111￡1&1 離-585能有效抑制肿瘤性B细胞的增殖以及促进其凋亡。(3)本发明所述的抑制BCLllA表达和肿瘤性B细胞增殖的BclllasiRNA-585对于开发新的抗B细胞肿瘤基因药物和提高B细胞肿瘤的治疗效果有重要意义。人类生存环境日益恶化，B细胞肿瘤(包括B细胞白血病和B细胞淋巴瘤)发病率和死亡率越来越高，已经成为影响人们健康和寿命的主要肿瘤性疾病之一。绝大多数的B细胞肿瘤均有BCLllA 表达增加，因而靶向BCLllA的治疗将具有比较普遍的意义，适用于绝大多数B细胞肿瘤，将具有巨大的市场潜力。(4)本发明证实所述的抑制BCLllA表达和肿瘤性B细胞增殖的BclllasiRNA-585 和Bcl-2 siRNA结合，更有效抑制肿瘤性B细胞的增殖和促进其凋亡。
图1是转染细胞6h后流式细胞仪检测细胞转染效率(X 100)，其中A为未转染的SUDHL6细胞；B为转染荧光标记的阴性siRNA的SUDHL6细胞；C为未转染的EBl细胞；D为转染荧光标记的阴性siRNA的EBl细胞。图 2 是转染 Bcllla siRNA-585 48h 后 SUDHL6 细胞中的 Bcllla mRNA 表达量图。图3是转染Bcllla siRNA-585 48h后EBl细胞中的Bcllla mRNA表达量图。图4是Bcllla siRNA-585对SUDHL6细胞BCLllA蛋白表达的影响图，其中泳道 1为无关序列组；泳道2为空转组；泳道3为细胞组；泳道4为BclllasiRNA-585组。图5是Bcllla siRNA-585对EBl细胞BCLlla蛋白表达的影响图，其中泳道1为 Bcllla siRNA-585组；泳道2为无关序列组；泳道3为空转组；泳道4为细胞组。图6是SUDHL细胞凋亡的形态学图(Hoechst，X 200)。图7是EBl细胞凋亡的形态学图(Hoechst，X200)。图8是转染Bcllla siRNA-585 72h后SUDHL细胞凋亡率图。
图9是转染Bcllla siRN A-585 72h后EBl细胞凋亡率图。
图 10 是流式细胞仪 AnnexinV/PI 法检测转染 Bcllla siRNA-585 72h 后 SUDHL6 细胞凋亡图，其中A为细胞组；B为空转组；C为无关序列组；D为siRNA-585组。图11是流式细胞仪AnnexinV/PI法检测转染Bcllla siRNA-585 72h后EBl细胞凋亡图，其中A为细胞组；B为空转组；C为无关序列组；D为siRNA-585组。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1一、实验材料和方法(I)Bcllla siRNA 的设计和合成依据Ambion公司在网上提供的设计工具软件(参见www. ambion. com/techlib/ misc/siRNA finder, html)针对Bcllla基因设计3条siRNA序列，分别命名为Bcllla siRNA-585、Bcllla siRNA-475 和 Bcllla siRNA-319，同时设计正义链 5，端绿色荧光 FAM 标记的阴性siRNA及无关序列siRNA作为对照，由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。Bcllla siRNA-585 的序列如下正义链5，-GAAUCUACUUAGAAAGCGAUU-3，；反义链5，-UCGCUUUCUAAGUAGAUUCUU-3，；Bcllla siRNA-475 的序列如下正义链5，-GCAGGGUAUUUGUAAAGAUUU-3，；反义链5，-AUCUUUACAAAUACCCUGCGG-3，；Bcllla siRNA-319 的序列如下正义链5，-AGAAGAUGACGAUUGUUUAUU-3，；反义链5，-UAAACAAUC⑶CAUCUUCUGG-3，；荧光标记的阴性siRNA的序列如下正义链5，-UUCUCCGAAC⑶⑶CACGUUU-3，；反义链5，-AC⑶GACACGUUCGGAGAAUU-3，；无关序列siRNA的序列如下正义链5，-GUAUGACAACAGCCUCAA⑶U-3，；反义链5，-CUUGAGGCUGUU⑶CAUACUU-3，。(2)细胞培养将弥漫性大B淋巴瘤细胞系SUDHL6(美国ATCC细胞库)和伯基特淋巴瘤(Burkitt 淋巴瘤)细胞系EBl (美国ATCC细胞库)分别接种于含体积分数10%新生牛血清、100U/mL 青霉素和100U/mL链霉素的RPMI1640培养基中，在含体积分数5% CO2的培养箱37°C连续培养。(3)细胞转染①转染前一天，将细胞密度调至2X 105/ml，然后重悬在24孔板中，每孔加入 0. 5ml的细胞悬液，37°C、5% CO2培养箱中培养。
②转染当天，将24孔板中每孔的细胞重悬在100 μ 1含有体积分数10%新生牛血清的RPMI1640培养基中。③用100 μ 1不含血清的RPMI1640培养基稀释siRNA，siRNA的终浓度为ΙΟΟηΜ。 再加入6 μ 1 Hiperfect转染试剂，混勻。室温孵育混合液5 10分钟。以上混合液为24 孔板每孔的量。④将以上准备好的混合液分别加入 到细胞悬液中，摇动培养板，轻混勻。37°C、5% CO2培养箱中培养。⑤6h后，每孔加入400 μ 1含有体积分数10%新生牛血清的RPMI1640培养基， 37°C>5% CO2培养箱中培养。转染效率的检测转染6h，在荧光显微镜下观察细胞的转染情况，并通过流式细胞仪定量检测细胞转染效率(转染效率是以转染荧光标记的阴性siRNA进行检测)。(4)荧光定量RT-PCR检测转染细胞Bcllla mRNA表达水平将空白组、单纯转染试剂组即空转组、无关序列组、Bcllla siRNA-475组、Bcllla siRNA-319组和Bcllla siRNA-585组细胞以(4 8) X 105/mL起始浓度接种于6孔板，每孔接种lmL，按HiPerfect转染试剂盒说明进行转染后继续培养48h，离心收集细胞。RNA提取应用RNAzol试剂盒(Gibco，BRL)并应用随机引物和反转录酶试剂盒(Superscript II Kit, Invitrogen，USA)反转录合成cDNA第一链。并经GAPDH基因的RT-PCR确定所合成 cDNA的质量。均按常规方法进行，具体抽提过程如下所述。1)细胞总RNA的提取和纯化①收集离心细胞，去其上清，用PBS(0. OlM :NaCl 8g、KCl 0. 2g、Na2HPO4L 44g、 KH2PO4 0. 24g，pH7. 4)洗两次后，将细胞转移入1. 5mL离心管中，每管加Trizol试剂lmL，摇勻，室温下静置15min后，反复吹打裂解细胞；②将各管内消化好的细胞裂解液吸到DEPC处理过的1.5mL EP管中，加氯仿 0. 2mL (Trizol 氯仿约为5 1)，轻摇15s，并在冰上孵育15min ；③4°C、12，OOOrpm离心15min。然后取上清无色水相到DEPC处理过的EP管，力口 0. 5mL异丙醇，室温下静置IOmin ；④4°C、12，OOOrpm离心lOmin。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清；⑤加入用DEPC水新配制的经预冷的体积百分比75%的乙醇溶液1. OmL，轻轻洗涤沉淀，4°C、12，OOOrpm 离心 5min ；⑥去上清，瞬时离心，用小Tip吸干液体；使沉淀自然干燥，DEPC处理水20 30 μ L加入，混勻，55 60°C水浴IOmin溶解总RNA ；⑦用紫外分光光度仪测总RNA纯度和浓度，用琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA是否水解， 鉴定后于_70°C保存备用。2)细胞总RNA的鉴定浓度分析和纯度鉴定从提取的RNA中吸取1 μ L，以DEPC水稀释至100 μ L，用紫外分光光度仪分别测总RNA的浓度，光吸收度Α260和Α280的比值(Α260/Α280)。3)逆转录反应取上述RNA样品，将其稀释成1 μ g/ μ L，在PCR管中加入下列试剂的混合物RNase Free H2OIOpL
5 xRT Buffer4μΙ
dNTP Mixture(各 1 OmM)2μL
RNase inhibitor(10U/pL)IpL Random Primer(25pmol/pL:1 pL
RNAIpL(Ipg)
M-MLVIpL在PCR 仪上按照下列条件反应30°C 10min,42°C 20min,99°C 5min，4°C 5min，瞬时离心，-20°C保存备用。4) PCR 扩增实时定量PCR试剂盒购于北京天根生物公司。实时定量PCR反应管和反应仪器为美国BIO-RAD公司产品。Bcllla引物序列如下上游引物5’-AACCCCAGCACTTAAGCAAA-3’ ； 下游引物5’ -GGAGGTCATGATCCCCTTCT-3’。 以GAPDH为内参照，上游引物为 5，-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3，，下游引物为 5，-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3，。利用SYBR Green I染料检测细胞Bcllla表达情况，并将GAPDH作为内参照。总反应体积为20 μ L0反应条件95°C IOmin变性后，共进行40个循环扩增，每一循环包括 950C 15s，60°C 30s和80°C 5s，并在80°C读板1次。随后，以0. 17°C /s变化速度从65°C到 95°C，每隔2s记录1次荧光值，获得熔解曲线。将所扩增的PCR产物熔解曲线分析，同时随机进行质量体积比2%琼脂糖凝胶电泳，以确定产物是否为所扩增的目的片段。采用相对定量公式:2-ACtX100%, ACt = Ct(Bcllla)-Ct(GAPDH)，计算细胞 Bcl Ila 的相对量。5) Western blot 检测 BCLllA 蛋白的表达收集经转染48h的细胞，离心收集细胞样品于1. 5ml离心管内，采用细胞质和核蛋白提取试剂盒，提取细胞总蛋白，BCA法进行定量。取IOOyg蛋白与加样缓冲液(1.0M pH6. 8 Tris-Hcl 1. Oml,10% SDS 6.0ml、β -巯基乙醇 0. 2ml，双蒸水 2. 8ml)混合，100°C 变性5min，质量百分比12% SDS-PAGE胶电泳分离，电转移至硝纤膜，GAPDH 一抗作为内对照，膜在一抗中4°C孵育过夜，二抗孵育2h，ECL显色检测。具体过程如下①裂解细胞提取总蛋白A、取IO6个细胞加入ImL蛋白裂解液RIPA和IOmL苯甲基磺酰氟(PMSF)，冰浴 30min, 4°C，13000g 离心 30min。B、将上清小心转移到干净无菌的离心管中，-20°C保存。②电泳及杂交A、配制质量百分比12% Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液，灌注丙烯酰胺溶液，分离胶聚合完全后倾出覆盖水层，将质量百分比5%浓缩胶倒入之后，取干净的梳子插入到浓缩胶内，将凝胶置于室温。B、取适量样品加入到等体积2 X SDS凝胶加样缓冲液中，沸水中煮沸5min使蛋白变性，混勻后上样。C、将梳子小心的移出，把凝胶固定在电泳装置，上样。接通电源，电压为60V。
D、电泳结束后，将分离胶切下，做成滤纸_凝胶-膜-滤纸的结构，进行转膜。转移时电压300mA，转移时间lh。Ε、转移结束后，把PVDF膜放入盛有质量百分比5%的脱脂奶粉封闭液中，封闭2h 或过夜。F、封闭完毕后用含 lg/L Tween20 的 pH7. 4、50mmol/L 的 Tris 盐酸缓冲液(TBST) 洗膜5次，每次5分钟，加一抗(BCL11A，1 500按质量体积比mg/ml稀释；GAPDH 1 1000 按质量体积比mg/ml稀释)。4°C孵育过夜，洗膜5次，每次5min。G、加辣根过氧化物酶标记二抗(1 1000按质量体积比mg/ml稀释)，反应lh，洗膜5次，每次5min。
H、将PVDF膜浸泡ECL荧光底物中，室温孵育3 5min后，将其置于暗室，取X光底片，曝光Imin后，依次显影、定影、拍照。6) CCK8法测细胞生长抑制率将对数生长期的SUDHL6细胞和EBl细胞分别接种于96孔培养板中，按照上述步骤(步骤(3))进行转染，置于37°C、饱和湿度、5% CO2条件下常规培养24、48和72h后，向每孔内加入30yL CCK8，再置于37°C孵育4h。然后直接在酶联检测仪上450nm波长处测 A450值，以A450间接反映细胞存活数量。实验重复3次，据此可推算Bcllla siRNA转染后各时间点对细胞的抑制率。7) Hoechst染色观察凋亡细胞形态收集经转染72h的细胞，离心收集细胞样品于1. 5ml离心管内，加入0. 5ml固定液，混勻，固定10分钟。离心去固定液，0.01M、pH 7. 2的PBS洗两遍。最后一次离心后吸去大部分液体保留约50 μ 1液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，晾干，均勻滴上0. 5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟，晾干，PBS洗两遍。滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净盖玻片，避免气泡。荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。8)AnnexinV/PI双染法和流式细胞仪检测细胞凋亡率离心收集转染后48h的各组细胞，0. 01M、pH 7. 2的PBS洗涤2次，离心去上清， 195 μ L Annexin V-FITC结合液重悬细胞，加入Annexin V-FITC 5 μ L，避光孵育lOmin，离心去上清，190 μ L Annexin V-FITC结合液重悬细胞，加入10 μ L碘化丙啶(PI)染色液，冰浴避光放置，随即进行流式细胞仪检测，用MULTCYCLE软件分析处理结果。9)统计学处理采用SPSS13. O软件进行数据的统计学分析。实验数据以均值士标准差表示，多组间数据比较采用完全随即区组设计的单因素方差分析，组间的比较选用可进行多个样本均数间两两均数比较的S-N-K检验。二、实验结果(一)Bcl Ila siRNA 抑制 SUDHL6 和 EBl 肿瘤细胞生长(1)细胞转染效率将转染荧光标记的阴性siRNA 6h的细胞置于倒置荧光显微镜下观察，可见到部分细胞呈现绿色荧光现象，流式细胞仪检测SUDHL6细胞转染效率为46. 2%, EBl细胞转染效率为51. 4% (如图1所示)。后面的实验均按该转染条件进行转染。(2)荧光定量RT-PCR检测细胞Bcllla mRNA表达水平
提取的总RNA经紫外分光光度计检测其吸光度A260/A280的比值，都在1. 8 2. 0，说明提取的RNA纯度较高。首先，在3 条Bcllla siRNA 中筛选出 siRNA_585转染 SUDHL6 细胞48h下调Bcllla mRNA的表达，其值显著低于空白组(即指未经任何处理的细胞组)、空转组(即指单纯转染试剂处理组)和无关序列组(P < 0. 05)，而其它的2条siRNA (Bel Ila siRNA-475和 Bcllla siRNA-319)、空转组及无关序列siRNA组分别与空白组细胞的Bcllla mRNA表达量间无显著差异(P > 0. 05)。同样，siRNA-585转染EBl细胞48h下调Bcllla mRNA的表达， 可见，BclIla siRNA-585可特异性抑制SUDHL6细胞和EBl细胞中Bcllla基因的表达(结果如图2和3所示)。(3)BCLllA蛋白表达的检测SUDHL6细胞和EBl细胞经转染Bclll a siRNA-585后48h细胞的BCLllA蛋白表达量降低，并显著低于对照组(即空转组、无关序列组与空白组)，而空转组及无关序列组分别与空白组间未见明显差别。显示，Bcllla siRNA-585可特异性抑制SUDHL6和EBl细胞中BCLllA蛋白的表达(结果如图4和5所示)。(4)Bcllla siRNA-585 对 SUDHL6 和 EBl 细胞生长的影响CCK8结果显示Bcllla siRNA-585转染组细胞的增殖活性较低，并显著低于其它对照组(即空转组、无关序列组与空白组)(P < 0. 05)，而空转组及无关序列组分别与空白组细胞的增殖能力间差异无显著性(P > 0. 05)(见表1和2)。可见Bcllla siRNA-585可抑制SUDHL6和EBl细胞的生长。表1转染BCLlla siRNA后各时间点CCK8法检测SUDHL6细胞吸光度A值(〒土 ^， η = 6)
24h48h72h
siRNA-585 组1. 77士0. 152. 21 士0.11*3. 26士0. 36*
无关序列组1.87士0.143. 31 士0.225. 72士0. 23
空转组1.89 士 0.093. 55 士 0.155. 36 士 0.08
细胞组1.96 士0.173. 67 士0.185. 91 士0.28与其他组相比，*P < 0. 05表2转染Bcllla siRNA后各时间点CCK8法检测EBl细胞吸光度A值(〒土 s，n =6)
权利要求
1.一种抑制BCLllA表达和肿瘤性B细胞增殖的Bcllla siRNA_585，其特征在于序列如下所示正义链的序列为5，-GAAUCUACUUAGAAAGCGAUU-3，； 反义链的序列为5，-UCGCUUUCUAAGUAGAUUCUU-3，。
2.权利要求1所述抑制8仏1认表达和肿瘤性8细胞增殖的此111￡1&1 離-585的应用， 其特征在于所述的Bcllla siRNA-585用于制备治疗和/或预防B细胞肿瘤药物。
3.根据权利要求2所抑制BCLllA表达和肿瘤性B细胞增殖的BclllasiRNA-585的应用，其特征在于所述的B细胞肿瘤药物为B细胞白血病和/或B细胞淋巴瘤。
4.一种治疗和/或预防B细胞肿瘤药物，其特征在于包含权利要求1所述的抑制 BCLllA表达和肿瘤性B细胞增殖的Bcllla siRNA-585。
5.根据权利要求4所述的治疗和/或预防B细胞肿瘤药物，其特征在于还包含 Bcl-2siRNA ；所述的Bcl-2siRNA的序列如下所示 正义链的序列为5，-GUACAUCCAUUAUAAGCUGUU-3，； 反义链的序列为5，-CAGCUUAUAAUGGAUGUACUU-3，。
全文摘要
本发明公开了一种抑制BCL11A表达和肿瘤性B细胞增殖的Bcl11asiRNA-585，其正义链的序列为5’-GAAUCUACUUAGAAAGCGATT-3’；反义链的序列为5’-UCGCUUUCUAAGUAGAUUCTT-3’。该Bcl11a siRNA-585能高效抑制BCL11A表达，有效抑制肿瘤性B细胞的增殖以及促进其凋亡。本发明还证实该Bcl11a siRNA-585和Bcl-2siRNA结合更有效抑制肿瘤性B细胞的增殖和促进其凋亡。本发明所述的抑制BCL11A表达和肿瘤性B细胞增殖的Bcl11 asiRNA-585对于开发新的抗B细胞肿瘤基因药物和提高B细胞肿瘤的治疗效果有重要意义。
文档编号A61K48/00GK102329794SQ20111030173
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者何冬梅, 李扬秋, 高杨军 申请人:暨南大学