日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR功能抑制肽及其应用的制作方法

专利名称：日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR功能抑制肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及采用噬菌体展示技术从噬菌体展示肽库中筛选能抑制日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)酶活性的抑制肽，可破坏血吸虫生化代谢过程中的氧化还原平衡，导致血吸虫死亡，适用于新的血吸虫病治疗药物的研究。属于生物技术的分子生物学与生物化学等技术领域。
背景技术：
血吸虫病是一种严重危害人类健康的人畜共患病，全球有76个国家有血吸虫病流行，有约6亿人口受到血吸虫感染的威胁，血吸虫病人有2000多万。经过60年不懈努力，我国仍有约2. 4亿人口受血吸虫感染威胁，有血吸虫病人36万余人，血吸虫病流行的自然条件依然存在。由于仍没有可用的血吸虫病疫苗，血吸虫病的防治目前主要依靠药物治疗。吡喹酮是当前唯一的血吸虫病治疗药物，由于长期大规模的反复使用，曼氏血吸虫已出现了抗吡喹酮的耐药株，而在我国流行的日本血吸虫亦出现了对吡喹酮敏感性下降的现象，给未来血吸虫病的防治工作带来了严重的挑战。因此，开发新血吸虫病治疗药物，应对吡喹酮抗药性的出现是当前血吸虫病防治科研的紧迫任务。生命过程是由一系列的生化代谢过程所组成，在这个过程中，生物体产生维持生命过程所必须的物质，并排除生物体内的毒性物质，从而保持体内平衡，一旦这种平衡被破坏就会导致生物死亡。因此，干扰血吸虫生命过程中一些重要蛋白分子的功能，使其失去活性，则可能破坏血吸虫的某一重要生化代谢过程，导致血吸虫死亡，达到治疗血吸虫病的目的，是新药开发的有效策略。生命过程中的这些重要蛋白分子(亦称为生命过程必须的蛋白分子，essential molecule)是新药开发重要的潜在靶标分子。已有的研究成果显示血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)是血吸虫氧化还原平衡代谢过程中的一个必须蛋白分子，抑制血吸虫SjTGR的表达或功能，虫体因不能抵抗氧化损伤而死亡，是一个非常有潜力的抗血吸虫感染新药开发靶标，开发抗血吸虫SjTGR 分子酶活性的抑制剂已成为血吸虫治疗新药研究的热点。蛋白酶抑制剂包括了化学抑制剂，多肽抑制剂和抗体抑制剂。Sayed等筛选到能有效抑制曼氏血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SmTGR)蛋白活性的化学抑制剂，如噁二唑、 磷酰胺、金诺芬。宋丽君等筛选到能抑制日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)的化学抑制剂金诺芬、化合物4N等。这些化学抑制剂都具有一定的治疗血吸虫病疗效，但其副作用大，目前还没有进入临床研究阶段。除了化学抑制剂外，肽类和抗体是蛋白酶的另一类重要的功能抑制剂，已成为许多重要疾病的有效治疗药物，肽类与抗体类药物是近十年全球成长最快的医药产品。抗体由于其分子量大，不能进入细胞与目标靶分子直接作用，且易引起免疫中和与排异反应，限制了其应用价值。肽类药物因其分子量小，能直接进入靶细胞中直接抑制目标靶分子的功能，使用剂量小，疗效明确，具有广泛的应用前景。噬菌体展示肽库是将一组人工设计合成的编码由7-12个氨基酸组成的短肽的基因序列与噬菌体M13的外壳蛋白ρ III基因的N未端融合，使人工设计的短肽表达、展示在噬菌体外壳蛋白表面，并保持其空间构象。这种肽展示库包涵了 IO9种以上的短肽，可以模拟自然界可能存在各种蛋白结构，包括各种蛋白酶的底物结构。利用酶与底物亲和结合的特性，可以从噬菌体展示肽库中筛选到与蛋白酶特异性结合的短肽，为新药的开发奠定基础。 噬菌体展示技术将基因型与表型，分子结合活性与噬菌体的可扩增性结合起来，实现了基因型到表型的转换，是肽类药物开发的一项革命性新技术。

发明内容
本发明目的是利用噬菌体展示技术筛选能与日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)特异性结合，抑制其酶活性，破坏血吸虫氧化还原代谢平衡的抑制肽，可用于血吸虫病治疗新药的研究。本发明的技术方案抑制日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)活性的抑制肽，所述的抑制肽其名称与氨基酸序列分别为
JIPDysl =WPHNWffPHFKVK ；BP SEQ NO. 1: Trp Pro His Asn Trp Trp Pro His Phe Lys Val Lys ；
JIPDys2 :LHAETRSAMHRT ；即 SEQ NO. 2: Leu His Ala Glu Thr Arg Ser Ala Met His Arg Thr ；
JIPDys3 :YTMPSLTLYAMG ；BP SEQ NO. 3: Tyr Thr Met Pro Ser Leu Thr Leu Tyr Ala Met Gly ；
所述SjTGR活性抑制肽的氨基酸序列演变而产生的其它具有抑制SjTGR活性的肽段。所述的SjTGR活性抑制肽在制备治疗血吸虫病新药或治疗用药物靶向载体制备方面的应用。本发明用于筛选上述三种抑制肽的结合蛋白为重组日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)硒蛋白。所述的SjTGR蛋白分子的氨基酸序列SEQ ID NO :4，保持有至少90%的同源性。所述的SjTGR蛋白分子，其基因核苷酸序列编码为SEQ ID NO :5。所述的重组SjTGR硒蛋白分子(SjTGRsec)的表达，在于首先将编码SjTGR蛋白分子核苷酸片段SEQ ID NO :5的3’未端与与大肠杆菌中的硒代半胱氨酸插入序列SEQ ID NO 6的5，未端通过PCR的方法连接在一起形成一个嵌合基因序列SEQ ID NO :7。然后通过插入到一种表达载体pET-41a中形成重组表达质粒SjTGRsec/pET-41a，然后将重组表达载体SjTGRsec/pET-41a转化入一种宿主细胞大肠杆菌BL21 (DE3)中表达重组SjTGR硒蛋白。所述的重组SjTGR硒蛋白的制备方法，包括转录、翻译、蛋白分离和纯化，以及鉴
定步骤。本发明为了获得纯化的重组SjTGR硒蛋白，根据SjTGR硒蛋白中含有ADP结合域的结构特征，采用ADP-s印harose 4B胶亲和层析的方法进行纯化制备。所述重组SjTGR硒蛋白应用包括但不限于1)通过蛋白酶活性抑制的方法筛选、 鉴定该蛋白酶抑制剂，用于血吸虫病的治疗。包括但不局限于化学抑制剂，多肽抑制剂和抗体抑制剂。2)制备血吸虫感染疫苗。
本发明优选的表达质粒是pET_41a (美国Novagen公司产品)，适合在大肠杆菌工程菌中表达。但是，本发明中的SjTGR硒蛋白也可选择利用其它质粒来表达，这些表达质粒包括但是不局限于原核、真核表达系统常用的质粒。具体地，该表达质粒含有适当的启动子，用以控制融合蛋白的表达。这些启动子包括但是不局限于以下所述的tac启动子，优选的启动子为T7。本发明在表达SjTGR硒蛋白时使用质粒pSU ABC为硒蛋白表达的辅助质粒，为 SjTGR硒蛋白中硒代半胱氨酸的掺入提供k、Sel B和C等辅助因子。本发明提供构建SjTGR硒蛋白的表达质粒的构建方法及工程菌构建方法。首先克隆获得编码SjTGR的核苷酸序列。编码SjTGR蛋白氨基酸序列的核苷酸序列与序列SEQ ID NO 2保持有至少90%的同源性。具体地，通过RT-PCR技术，从血吸虫mRNA中反转录合成编码SjTGR蛋白核苷酸片段。将SjTGR基因片段克隆到TA克隆载体pGEM-T中构建重组质粒SjTGR/pGEM_T进行DNA 序列分析，确定其基因序列的正确性。然后SjTGR基因片段为模板，使用SjTGR基因的5’端引物与另一个带有大肠杆菌硒代半胱氨酸插入序列(SEQ ID NO :6)的3’引物进行PCR扩增，获得表达SjTGR硒蛋白的嵌合基因(SEQ ID NO :7)，并使该基因的5'端带有Mfe I的酶切位点，3'端带有5 / I 的酶切位点。通过Mfe I , Sal I酶切位点插入到表达质粒pET-41a中构建重组表达质粒 SjTGRSeC/pET-41a。将该重组表达质粒转化到大肠杆菌DH5 α，再转种到含有氨苄青霉素 (AMP)的LB平板(1%的蛋白胨，0. 5%的酵母抽提物，1%氯化钠，琼脂粉1. 2%，氨苄青霉素100 mg/mL)上进行繁殖和保种。本发明表达SjTGR硒蛋白的重组质粒SjTGRSeC/pET-41a可在多种大肠杆菌中表达，其优选的菌株是大肠杆菌BL21 (DE3)。本发明提供一种工程菌大规模表达SjTGR硒蛋白的方法。具体地，将含有重组表达质粒SjTGRsec/pET-41a的单个菌落再转化质粒pSU ABC,形成含有SjTGRsec/pET_41a和 pSU ABC两种质粒的转化子细菌。再接种到选择性培养基LB (1%的蛋白胨，0.5%的酵母抽提物，1%氯化钠，卡那霉素50 mg/mL和氯霉素34 mg/mL)中，37° C振摇过夜。第二天按 1 10稀释接种到新鲜的LB培养基中，37° C振摇培养4 h (OD600 0. 4)，加入亚硒酸盐与半胱氨酸，继续培养至静止生长期，加入0. 1 mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达 SjTGR硒蛋白。重组SjTGR硒蛋白的表达，可以通过一般的蛋白生化手段检测，包括但不局限于 酶学分析，SDS-PAGE, Western Blotting 等。本发明也提供一种SjTGR硒蛋白的分离纯化方法。具体地，通过阿糖胞苷_2’， 5’ - 二磷酸琼脂糖凝胶亲和层析从表达产物中制备出纯化的重组SjTGR蛋白。本发明提供一种筛选与SjTGR蛋白特异性结合噬菌体展示肽的方法。具体地，以纯化的重组SjTGR蛋白包被酶标板，再用噬菌体展示肽库(P. h. D-12)噬菌体进行反应，洗出未结合噬菌体后再用NADPH洗脱与重组SjTGR特异性结合的噬菌体。将洗脱噬菌体感染大肠杆菌ER2538中进行扩增，再以上述方法重新进行筛选，如此重复筛选三次，最后获得能表达与重组SjTGR蛋白特异性结合肽的噬菌体。本发明还提供一种鉴定能与重组SjTGR蛋白特异性结合的噬菌体表达外源模拟肽的基因序列与氨基酸序列的鉴定方法。具体地，制备能与重组SjTGR蛋白特异性结合噬菌体DNA，以DNA序列分析，确定噬菌体中外源性插入肽段的基因序列，再演绎成肽氨基酸序列。通过与Genbank中已经存在的蛋白质或多肽的氨基酸序列进行比对，确定该噬菌体模拟展示肽的性质。本研究提供一种鉴定噬菌体展示肽与重组SjTGR蛋白结合特异性的方法。具体地，通过SDS-PAGE及电转移方法将SjTGR蛋白条带转移到硝酸纤维素(NC)膜上，再将含有SjTGR蛋白条带的NC膜与筛选到的噬菌体反应，去除未结合的噬菌体后再与酶标记抗M13噬菌体二抗反应，用底物3' ,3' -二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)显色，观察选到的噬菌体与重组SjTGR的反应情况，以判断此噬菌体与SjTGR蛋白结合的特异性。本研究提供一种测定重组SjTGR蛋白的硫氧还蛋白还原酶、谷胱甘肽还原酶及谷氧还蛋白活性的测定方法及筛选到的噬菌体对SjTGR活性抑制效果的分析方法。具体地，硫氧还蛋白还原酶(TrxR)活性的测定方法是将5_联硫代-双_2_硝基苯甲酸(DTNB)与还原型辅酶I (NADPH)混合，在有SjTGR存在的情况下，DTNB可被还原为 5-巯基-2-硝基苯甲酸(TNB)，通过测定反应体系中TNB在波长为412nm处吸收值的增加值来确定SjTGR的TrxR的活性。在上述体系中加入一定数量的噬菌体，观察对其酶活性的抑制作用。谷胱甘肽还原酶(GR)的活性测定的方法是将氧化型的谷胱甘肽(GSSG)与NADPH 混合，在有TGR存在的情况下，氧化型谷胱甘肽被还原成还原型谷胱甘肽(GSH)，随着NADPH 被消耗，反应体系在340nm处的吸收峰值逐渐下降，通过测定反应体系在340nm处吸光度的变化来确定SjTGR的GR活性。在上述体系中加入一定数量的噬菌体，观察其对酶活性的抑制作用。谷氧还蛋白(Grx)的活性测定方法是在NADPH提供还原物的情况下，Grx依赖于 GSH还原β -羟乙基二硫化物(HED)，生成HED还原形式的同时，形成了 Grx-GSSG反应中间体。这个中间体被第2个分子的GSH还原，产物为Grx-GSH和氧化型谷胱甘肽(GSSG)。 GSSG在酵母谷光甘肽还原酶(Yeast GR)的作用下生成GSH，继续参与Grx的巯基-二硫化物转换的反应。Grx酶活性同样是测定NADPH消耗量来计算。在上述体系中加入一定数量的噬菌体，观察其对酶活性的抑制作用。本发明的有益效果本发明筛选到的三条噬菌体展示肽对日本血吸虫生存必须蛋白分子-硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)的硫氧还蛋白还原酶、谷胱甘肽还原酶及谷氧还蛋白活性均具有抑制作用。为开发新的血吸虫病治疗药物奠定了良好的基础，对控制血吸虫病流行有重要的意义。


图1日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)的基因扩增 M 核酸标准分子量大小；1、PCR扩增得到的SjTGR基因片段。图2 SjTGR-SECIS嵌合基因的制备；M :DNA标准分子量标准；1 =SjTGRsec嵌合基因片段。图3重组质粒SjTGRsec/pET-41a酶切分析；1、DNA分子量标志物；2、日本血吸虫 TGR基因纯化产物；3、重组的SjTGRsec/pET-41a质粒经Mfe I/Sal I双酶切产物；4、质粒pET-41a 经Mfe I/Sal I 双酶切产物；5、质粒 pET_41a ;6、重组质粒 SjTGRsec/pET_41a。
图4重组日本血吸虫TGR蛋白的表达产物电泳图；M蛋白分子量标准；1、含质粒 SjTGRsec/pE-T41a的大肠杆菌BL21表达产物的沉淀；2、含质粒SjTGRsec/pET-41a的大肠杆菌BL21表达产物的上清；3、含质粒pET-41a的大肠杆菌BL21表达产物；4、大肠杆菌BL21 的表达产物。图5 SjTGR硒蛋白表达量分析；A、SjTGR蛋白表达产物SDS-PAGE图；B、SjTGR 蛋白表达产物SDS-PAGE凝胶的放射性自显影；M、蛋白分子量标准；1、含质粒SjTGRsec/ pET-41a的大肠杆菌BL21表达产物；2含质粒SjTGRsec/pET-41a和pSU ABC的大肠杆菌 BL21表达产物；*电泳后在SDS-PAGE凝胶上点上的表达产物的样品。图6纯化的重组SjTGR蛋白；1、蛋白质分子量标志物；2、纯化的重组SjTGR蛋白。图7不同的噬菌体克隆与SjTGR结合强度的比较。a、lX1012，b、2. 5X1011，C、 6X101Q，d、1.5X101Q，e、3. 75X IO9 ;a，为 a 的对照，b，为 b 的对照，c，为 c 的对照，d，为 d 的对照，e’为e的对照。图8 Western Blotting鉴定噬菌体；Μ、蛋白标准分子量标准；1、JIPDysl ;2、 JIPDys2 ；3、JIPDys3 ；4、JIPDys4。图9不同的噬菌体对SjTGR酶活性的抑制作用。a、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)，b、 谷胱甘肽还原酶(GR)，C、谷氧还蛋白(Grx)。图10噬菌体对重组SjTGR酶活性的抑制作用。
具体实施例方式下面提供的实施例可以详细地解释本发明的主要内容，但不局限于以下这些内容。实施例1 日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)基因克隆
日本血吸虫SjTGR基因通过RT-PCR技术，从血吸虫成虫组织的mRNA中反转录合成而来，具体制备方法如下
1、血吸虫成虫mRNA的制备
取新鲜分离的血吸虫成虫0.5 g，在液氮中冷冻后，在陶瓷研钵中粉碎，再用GE Healthcare 公司的 mRNA 纯化试剂盒(Illustra QuickPrep mRNA purification kit)制备纯化mRNA，操作方法严格按试剂盒的操作说明书。用紫外分光光度计测mRNA的纯度与含量。2、SjTGR 基因扩增 2.1引物设计
SjTGRl 5’ -AACATATGCCTCCGATTGATGGAACA-3’
单划线为Mfe I位点； SjTGR2: 5' -TCAGCAACCGGTTACCGCTGCAGAGCCCCCA-3'
2.2第一链cDNA合成
采用Phusion RT-PCR Kit (购自NEB北京分公司)在一0. 2 mL的PCR管中，加入mRNA 2 μ L(约 IOng)，10 mM dNTP 混合物 1 yL，01igo(dT) primer 1 μ L，加无离子水至 10 UL0混勻，离心收集于管底。65° C，水浴预变性5 min，置冰上冷却。加入IOX反转录缓冲液2 μ L，反转录酶混合物2 PL，无核糖核酸酶水(无foiase水)6 μ L，混勻，离心收集于管底。25° C保温10 min，再在40° C保温30 min以合成cDNA。80° C保温5min以中
止反应。2.3目的基因扩增
在一个 0.2 mL 的 PCR 管中，加入 2 XPhusiona Master Mix 25 μ ，第一链 cDNA 3 μ , 引物SjTGIil 0.5 μ (25 PM)、SjTGR2 0.5 μ (25 μΜ)，加无核糖核酸酶水到终体积50 μ 0 PCR 条件98 ° C 30 Sec;然后 98° C 变性 10 Sec ；56° C,30 Sec,72° C,90 kc，一共 30个循环；最后，72° C、保温5 min。采用低融点琼脂糖凝胶电泳方法回收纯的SjTGR基因片段。具体是用1%的低融点agarose胶电泳PCR扩增产物，切下分子量约ISOObp左右的目的DNA条带，再用Promega公司的PCR产物回收试剂盒纯化SjTGR基因DNA片段。如图1所示。TA克隆与序列分析
SjTGR的3'端加腺嘌呤(A)尾巴将纯化的SjTGR片段置于PCR反应管中，加入 IOXTaq DNA 聚合酶链反应缓冲液 10 μ , MgCl2 10 μ (25 mmol/L), dATPl μ (10 mmol/ L)，Taq DNA聚合酶1 μ (5 U/μ ，加灭菌无离子水至100 μ ,在PCR仪上72° C保温30 min，使SjTGR基因片段的3'端加上“A”尾巴。用!Iomega公司的酶切产物纯化试剂盒纯化加A尾后的SjTGR基因DNA片段。再用!Iomega公司的PCR产物回收试剂盒纯化SjTGR 基因DNA片段。将SjTGR DNA片段与TA clone载体pGEM_T (美国PR0MEGA公司产品)按照3 1的比例混合，在T4 DNA连接酶的作用下连接，反应体系如下2X ligase buffer 5 mL, pGEM-T vector 1 μ (50 ng)，SjTGR DNA 片段 3 μ , Τ4 DNA ligase 1 μ ，总体积 10 μ 。混勻后，短暂离心，16° C水浴连接过夜，形成重组质粒SjTGR/pGEM-T。电转化1)取5 PL连接产物加入到50 PL感受态细胞Ε. coli Dffia中，小心混勻， 勿使有气泡产生，放置冰浴上30 min。2)将连接产物与Ε. coli Dffia的混合物转移到冰上预冷的狭缝为0. Icm的电击杯中，勿使有气泡产生，小心拭去电击杯外的冷凝水。3)设置电脉冲仪(BIO-RAD)脉冲参数电压2. 5 kV，电容25 PF，电阻200 Ω。将电击杯插入电脉冲仪电击槽内，同时按住两个脉冲电极保持至放电为止。4)取出电击杯，加入0.5 mL 37° C预热的SOC培养基，混勻后将电击后的菌液转移到一无菌玻璃试管中，37° C、200 rpm振荡培养40 min。5)取200 PL菌液均勻涂布于表面预先涂有40 μ X_gal (40 mg/mL)的LB 平板上(含Amp 100 Pg/mL)。室温下放置待平板上的菌液完全吸收后，倒置平板于37° C 培养箱过夜。在LB平板上出现白色菌落可初步判定为阳性克隆，蓝色菌落为阴性克隆。将白色菌落细菌送到上海英俊公司进行DNA序列分析。实施例2 表达SjTGR硒蛋白嵌合基因的构建
1、引物设计根据大肠杆菌硒代半胱氨酸插入序列，设计一个下游引物TGR3，使这包括SjTGR的3’端序列与大肠杆菌硒代半胱氨酸插入序列。SjTGR3: 5’ -GTCGACGGGCGCATAGGTTAACGATTGGTGCAGACCTGCAACCGA TTATTAACCTCAGCAACCGGTTACCGC-3，，单划线为 Sal I 位点。引物的合成由上海英俊公司完成。2、日本血吸虫SjTGR硒蛋白表达基因的制备
在一个 0.2 mL 的 PCR 管中，加入 5XPhusion HF buffer 10 μ , IOmM dNTP 1 μ ，引物SjTGRl 1 μ (25 μΜ),SjTGR3 1 μ (25 μΜ)，SjTGR/pGEM-T 1 μ (50 ng)， Phusion Hot Start DNA Polymerase 0.5 μ ，加无核糖核酸酶水到终体积50 μ 。PCR条件98 ° C、 30 Sec;然后 98° C 变性 10 Sec ；70. 6° C,30 Sec,72° C,90 kc，一共；35 个循环。采用低融点琼脂糖凝胶电泳方法回收纯的SjTGR基因片段。具体是用1%的低融点agarose胶电泳PCR扩增产物，切下分子量约1800bp左右的目的DNA条带，再用Promega公司的PCR 产物回收试剂盒纯化SjTGRsec基因DNA片段。如图2所示。TA克隆与序列分析
SjTGRsec的3'端加腺嘌呤(A)尾巴将纯化的SjTGRsec片段置于PCR反应管中， 加入 IOXTaq DNA 聚合酶链反应缓冲液 10 μ , MgCl2 10 μ (25 mmol/L), dATPl μ (10 mmol/L), Taq DNA聚合酶1 μ (5 U/^L)，加灭菌无离子水至100 μ ，在PCR仪上72° C 保温30 min，使SjTGR基因片段的3'端加上“A”尾巴。用!Iomega公司的酶切产物纯化试剂盒纯化加A尾后的SjTGRsec基因DNA片段。再用Promega公司的PCR产物回收试剂盒纯化SjTGRsec基因DNA片段。将SjTGRsec DNA片段与TA clone载体pGEM-T(美国 PR0MEGA公司产品)按照3 1的比例混合，在T4 DNA连接酶的作用下连接，反应体系如下2X ligase buffer 5 mL, pGEM-T vector 1 μ (50 ng)，SjTGR DNA 片段 3 μ , Τ4 DNA ligase 1 μ ，总体积10 μ 。混勻后，短暂离心，16° C水浴连接过夜，形成重组质粒 SjTGRsec/pGEM-T。电转化1)取5 μ 连接产物加入到50 μ 感受态细胞E. coli DH5a中，小心混勻，勿使有气泡产生，放置冰浴上30 min. 2)将连接产物与E. coli Dffia的混合物转移到冰上预冷的狭缝为0. Icm的电击杯中，勿使有气泡产生，小心拭去电击杯外的冷凝水。3) 设置电脉冲仪(BIO-RAD)脉冲参数电压2. 5 kV，电容25 PF，电阻200Ω。将电击杯插入电脉冲仪电击槽内，同时按住两个脉冲电极保持至放电为止。4)取出电击杯，加入0.5 mL 37° C预热的SOC培养基，混勻后将电击后的菌液转移到一无菌玻璃试管中，37° C、200 rpm振荡培养40 min。5)取200 PL菌液均勻涂布于表面预先涂有40 μ X_gal (40 mg/ mL)的LB平板上(含Amp 100 Pg/mL)。室温下放置待平板上的菌液完全吸收后，倒置平板于37° C培养箱过夜。在LB平板上出现白色菌落可初步判定为阳性克隆，蓝色菌落为阴性克隆。将白色菌落细菌送到上海英俊公司进行DNA序列分析，以确定构建的SjTGR硒蛋白表达基因序列的正确性。实施例3 =SjTGR硒蛋白表达质粒的构建
本发明采用pET-41a为表达载体质粒，其制备方法为常用分子生物学方法。即通过培养含有表达载体的菌种，提取获得该质粒。制备质粒后-20° C保存待用。
具体如下，对表达载体质粒pET_41a及重组质粒S jTGRsec/pGEM-T分别进行 Nde I、Sal I双酶切。具体条件如下。质粒DNA 30 VL,Nde I 2VL,Sal I 2μ ,10Χ酶切缓冲液5 PLJaddH2O至总体积为50 μ 。37° C温浴3小时，通过低琼脂糖凝胶电泳回收线性化的pET-41a质粒DNA和SjTGRsec DNA片段。将回收的SjTGRsec DNA片段与表达质粒pET-41a DNA片段连接，构建SjTGR硒蛋白表达质粒SjTGRsec/pET-41a。连接体系为 10 mL，双酶切的pET-41a质粒与双酶切SjTGRsec DNA的摩尔比为1 2_10，10XT4 DNA ligase缓冲液1 μ ，Τ4 DNA ligase 1 μ ，加无菌水至总体积为10 μ 。连接反应16° C 恒温水浴内温浴16小时。连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞。阳性克隆的鉴定是通过含卡那霉素的LB平板挑选阳性克隆，抽提质粒，并通过Mfe I和5 / I双酶切分析确定目的基因是否被插入到表达载体中(图3所示)。实施例4 =SjTGR硒蛋白表达工程菌的构建具体方法如下。首先挑选含有SjTGRSeC/pET-41a组质粒的细菌克隆，提取质粒DNA。然后，用电转化的方法把质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中。质粒DNA提取方法按Promega公司质粒DNA纯化试剂盒操作说明进行。电转化方法转化大肠杆菌具体如下。先进行感受态细胞的准备。挑取新鲜的BL21 (DE3)单菌落，接种至含有3 mL LB 液体培养基的试管中，37° C、200 r/min培养过夜。然后取1 mL的培养物接种至含有500 mL新鲜LB培养基的2 L三角摇瓶中，37° C、250_300 r/min培养过夜，至OD6tltl小于0. 4， 将细菌培养物置于冰上冷却，2500 g离心20 min，去上清，用500 mL的冰预冷的ddH20将菌体沉淀重悬。离心后，再用250 mL的冰预冷的10%的甘油溶液将菌体沉淀重悬。再离心， 用10 mL的冰预冷的10%的甘油溶液将菌体沉淀重悬。再离心，用冰预冷的10%的甘油溶液将菌体沉淀重悬，调节菌液OD6tltlnm=IO. 0。以每管100 mL的体积分装感受态细胞，-70° C 保存备用。电击转化，具体如下。将SjTGRsec/pET_41a重组质粒DNA溶解在5 10 μ TE溶液中，与80 PL的上述感受态菌体混勻，转至0. Icm狭缝的预冷电转化杯中，冰浴10 min。然用1. 8 kv电压、25 PF电容；200 Ω电阻的条件进行电击。电击完毕后，加入1 mL 37° C预温的LB液体培养基悬浮，并转至无菌的玻璃试管中，37° C.250-300 r/min培养40 min。将菌液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，置于37° C培养过夜。挑取过夜生长平板上的单个菌落，接种3 mL LB液体培养基中(含卡那霉素50 Pg/mL)，37° C振荡培养过夜。次日以1 100比例将过夜培养菌液转接入3 mL LB培养液中，37° C、200 rpm振荡培养2-3小时。取1 mL的LB培养液到1. 5 mL的离心管中，离心沉淀细菌，将上清倒掉。将1 μ LWpSU ABC质粒加在细菌沉淀表面。加入100 mL预冷的TSS缓冲液(TSS 缓冲液在 50 mL 的 TSS 缓冲液中含有 5 g 的 PEG 6000/8000，2. 5 mL 的 DMS0，2. 5 mL 1 M 的MgCl2和32. 5 mL的LB培养基，小心混勻)。4° C冰箱静置30 min。加入1 mL的LB培养基，37° C温育1小时。离心5 min，去掉上清，用100 mL的 LB培养基重悬沉淀，悬浮液均勻涂布于LB平板上(含卡那霉素50 mg/mL和氯霉素34 mg/ mL)，37° C培养过夜。通过卡那霉素和氯霉素筛选含重组表达质粒SjTGRsec/pET-41a和 pSU ABC的菌株。实施例5 =SjTGR硒蛋白的表达
挑取单个菌落接种3 mL LB液体培养基中(含卡那霉素50 Pg/mL和氯霉素；34 mg/mL), 37° C振荡培养过夜。次日以1 100比例将过夜培养菌液转接入1 L LB培养液中(含卡那霉素50 Pg/mL和氯霉素34 mg/mL)，37° C，200 rpm继续振荡培养。当菌液OD6tltlnm达到1. 8左右时，加入L-半胱氨酸(100 mg/mL)和硒酸盐(5 mM)。当菌液OD600nm达到2. 4时 (即静止生长期)，将培养物冷却到室温，加入IPTG至终浓度为0.5 mM，在C振荡培养过夜。离心收集细菌(菌液的OD6tltlnm大概在4-5)，去上清，用25 mL的PBS重悬浮细菌沉淀。加入溶菌酶至终浓度为1 mg/mL，在冰上放置1小时。反复冻融2_3次，直到菌液变为粘稠。在细菌裂解物中加MgCl2溶液至终浓度8 mM,DNase I至终浓度10 U/mL,低温下孵育消化细菌DNA至菌液变为液体。以16 000 rpm离心30 min，收集上清，用PBS重悬沉淀。取上述表达产物200 mL加等体积2X蛋白电泳上样缓冲液，混勻，室温作用30 min, 煮沸10 min，取20 mL表达产物进行12 % SDS-PAG电泳。120 V电压使样品进入分离胶后，180 V电压继续电泳70 min。电泳结束后，取出凝胶，室温下考马斯亮蓝染色30 min，再用脱色液脱色至背景清晰为止，表达产物中有一条分子量约65kDa的蛋白条带(图4所示)。实施例6 =SjTGR硒蛋白表达量分析
分别将含有重组质粒SjTGRsec/pET-41a和质粒pSU ABC的转化子细菌、含有重组质粒 SjTGRsec/pET-41a的转化子细菌的BL21单个菌落接种于3 mL LB液体培养基中，37° C振荡培养过夜。次日，培养过夜的菌液按1 100分别接种于1 mL的LB培养基中，各加入1 mL的7Se半胱氨酸。37° C，200 rpm振摇3小时，加入5 mM的硒酸盐，100 mg/mL的L-半胱氨酸，继续振摇培养。约1小时后，加入IPTG至终浓度为0.1 mM，继续振摇培养4小时。 取20 μ L的菌液加入等体积的2X上样缓冲液，混勻，室温作用30 min，煮沸10 min，取 20 PL表达产物进行12 % SDS-PAG电泳。电泳结束后，取出凝胶，室温下考马斯亮蓝染色 30 min，再用脱色液脱色至背景清晰为止。将凝胶放入感光屏上，用图像扫描仪器扫描观察是否有7Se放射性的显影条带。从显影照片上可以发现含有重组质粒SjTGRsec/pET-41a 和质粒pSU ABC的转化子细菌表达的SjTGR蛋白中7Se标记的硒代半胱氨酸的含量明显高于只含有质粒SjTGRsec/pET-41a质粒细菌表达的SjTGR蛋白中7Se标记的硒代半胱氨酸的含量。图5所示。实施例7 =SjTGR硒蛋白的纯化
按实施例5的方法大量制备表达SjTGR硒蛋白的细菌，细菌裂解后将裂解物上清液过 0.45 μ m的过滤器过滤，用平衡缓冲液(50 mM磷酸钾，3 mM EDTA，pH 7. 5)稀释10倍。将 ADP-agrose凝胶装入到层析柱中，用5个柱体积平衡缓冲液平衡柱。再将稀释后的表达产物以0.5 mL/min的速度上样。用洗涤缓冲液(0.4 M磷酸钾，3mM EDTA，pH 7. 5)洗柱，直到A28tlnm的紫外吸收值不再降低为止。用50 mM磷酸钾缓冲液(含0. 5 M KCl，pH 7. 5)将重组蛋白从柱上洗脱下来。用超滤管浓缩洗脱下来的重组蛋白溶液，再用平衡缓冲液稀释一定的倍数后重新上一新的ADP-Agarose凝胶柱。用洗涤缓冲液(0.4 M磷酸钾缓冲液含3 mM EDTA，pH 7. 5)洗涤柱子直到A28tlnm紫外吸收值不再降低为止。再用洗脱缓冲液(50 mM磷酸钾，0 0.5 mM NADPH, 3 mM EDTA，pH 7. 5)进行特异性的洗脱，分管收集洗脱蛋白。每管洗脱液取20 PL进行12 % SDS-PAG电泳，电泳结束后，考马斯亮蓝染色30 min，再用脱色液脱色至背景清晰为止，观察获得重组SjTGR硒蛋白纯度。电泳结果显示获得的SjTGR硒蛋白为单一的蛋白条带，纯度高于95%。如图6所示。实施例8 重组SjTGR的硫氧还蛋白还原酶活性分析方法
硫氧还蛋白还原酶(TrxR)的活性硫氧还蛋白还原酶的活性是通过DTNB的还原反应和胰岛素的还原反应来测定的。DTNB 的还原
1)反应原理5-联硫代-双-2-硝基苯甲酸(DTNB)在还原物NADPH存在情况下，可被TrxR还原为5-巯基-2-硝基苯甲酸(TNB)，TNB在波长为412nm处有最大的吸收峰，发生酶 促还原反应后，反应体系在412nm的吸收值会增加。
权利要求
1.抑制日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR活性的抑制肽，其特征在于所述的抑制肽氨基酸序列分别为SEQ NO. 1 ；即 JIPDysl =WPHNWffPHFKVK ； SEQ NO. 2 ；即 JIPDys2 :LHAETRSAMHRT ； SEQ NO. 3 ；即 JIPDys3 :YTMPSLTLYAMG。
2.根据权利要求1所述SjTGR活性抑制肽，其特征在于该抑制肽的氨基酸序列演变而产生的其它具有抑制SjTGR活性的肽段。
3.按权利要求1、或2所述的SjTGR活性抑制肽的应用，其特征在于在制备治疗血吸虫病新药或治疗用药物靶向载体制备方面的应用。
全文摘要
日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR功能抑制肽及其应用，属于生物技术的分子生物学与生物化学等技术领域。本发明提供了抑制日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)活性的抑制肽，所述的抑制肽氨基酸序列分别为JIPDys1WPHNWWPHFKVK；JIPDys2LHAETRSAMHRT；JIPDys3YTMPSLTLYAMG；及所述的SjTGR活性抑制肽在制备治疗血吸虫病新药或治疗用药物靶向载体制备方面的应用。本发明筛选到的三条噬菌体展示肽对日本血吸虫生存必须蛋白分子-硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)的硫氧还蛋白还原酶、谷胱甘肽还原酶及谷氧还蛋白活性均具有抑制作用；为开发新的血吸虫病治疗药物奠定了良好的基础，对控制血吸虫病流行有重要的意义。
文档编号A61K47/42GK102336816SQ20111030148
公开日2012年2月1日 申请日期2011年10月9日 优先权日2011年10月9日
发明者余传信, 宋丽君, 梁幼生, 殷旭仁, 王玠, 钱春艳 申请人:江苏省血吸虫病防治研究所