专利名称：血管生成素与lim蛋白相互作用的分子结合域的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学范围，尤其是涉及血管生成素(Ang)与LIM蛋白相互作用的特定氨基酸序列。
背景技术：
血管新生，是诸如胚胎发生、创伤愈合、肿瘤组织生成等许多生理、病理变化的关键步骤。已发现的血管生成相关因子包括血管生成素、成纤维细胞生长因子家族、转移生长因子、血管内皮生长因子等。1985年，Fett JW等从无血清培养的人腺癌细胞系(HT-29)中首次分离并鉴定了一种蛋白因子，它具有显著的促进血管新生的功能，将其命名为血管生成素(Angiogenin，Ang)。尽管其最早从人直肠腺癌HT-29细胞系中分离得到，目前发现许多种细胞均能产生该蛋白因子。它在内皮细胞中血管生成素可诱导第二信使的应答，增强这些细胞在培养皿表面的粘附力。最新的研究表明，血管生成素参与卵巢中的形态学变化和血管新生。此外，它还具有一些非血管新生方面的功能，其中包括抑制中性粒细胞的脱粒作用；通过平滑肌细胞刺激胆固醇酯化；以及在肝脏中的一些非确定性作用(包括通常的自稳机制等)。随着其氨基酸序列的阐明，发现它与胰腺RNA酶具有较高的同源性，认为它属于有特殊生物学功能的RNA酶家族成员。
血管新生在人与动物肿瘤的发生和发展中起关键作用，鉴于血管生成素具有强烈的促进血管生成的作用，同时还由于其参与了多种相关的生理和病理过程，因此它的信号通路一直是各国学者关注的热点问题，但目前关于血管生成的受体和信号转导通路仍不明确。
发明内容
发明人通过酵母双杂交技术发现Ang与LIM蛋白(LIM这个首字母缩拼词来源于Lin-11、Is1-1和Mec3)。
LIM蛋白在结构上具有高度保守的双锌指基序，目前从结构特征上将其归为4类具有同源结构域；只存在LIM结构域；在C末端存在LIM结构域和存在各种不同相关功能的结构域。在利用酵母双杂交技术发现Ang与LIM蛋白具有相互作用后，发明人进一步将这一相互作用在哺乳动物细胞内进行了验证。
LIM蛋白含有的锌指结构提示其具有与DNA结合及发生相互作用的潜力，推测其功能可能在蛋白与DNA或蛋白与蛋白间的相互作用方面。
根据最近Ang的研究结果表明，通过核转位途径Ang进入细胞核内，并最终与DNA结合。
发明人发现Ang与LIM蛋白间存在相互作用，是否提示Ang与DNA的结合是通过LIM蛋白所介导的呢？他们之间的相互作用的特征及方式尚有待深入的探讨，这类研究的继续和深入将为阐明Ang在细胞中的转运和作用机制奠定基础。
发明人利用生物信息学模建了Ang的三维结构，并在其指导下构建了多个相关位点缺失的突变体，然后利用酵母双杂交技术分析了系列突变体与LIM相互作用的变化，发现了影响Ang与LIM相互作用的关键氨基酸序列，确定了该两种蛋白相互作用的分子结合域，即N端4-5位、中间65-68位以及C末端112-113位氨基酸对于与LIM蛋白的结合是必需的。
具体来说，本发明的目的之一是提供Ang与LIM蛋白相互作用的关键氨基酸序列…S4R5…H65R66E67N68…P112V113…。
本发明的另一个目的是揭示Ang与LIM蛋白的相互作用，并经此相互作用导致的生理和病理功能；揭示以Ang与LIM蛋白复合物作为靶标进行的血管新生抑制和肿瘤治疗策略。
这些结果对于研究Ang的信号通路，尤其是研究Ang在核内的聚体作用方式具有重要意义，也为今后利用阻断Ang与LIM蛋白相互作用介导的生物功能进行临床疾病的治疗奠定了基础，同时为以阻断血管新生为药靶的药物设计和应用创造了条件。
图1.诱饵蛋白质粒pAS2-1-Ang的酶切鉴定图谱1.pAS2-1；2.pAS2-1-Ang；3.核酸分子量标准；图2.pAS2-1-Ang的转录活性分析结果；
图3.7个阳性克隆β-半乳糖苷酶实验结果；图4.筛选出的AD质粒的酶切鉴定图谱1.DNA Maker； 2. 5#克隆； 3. 19#克隆； 4. 4#克隆；5. 4#-2克隆克隆； 6. 3#克隆； 7. 2#克隆； 8. 1#克隆；图5. 3#克隆的序列分析结果；图6.用抗-HA进行沉淀的Western结果1. 5#候选蛋白； 2. 3#候选蛋白(LIM)；3. 2#候选蛋白； 4. 1#候选蛋白；图7.诱饵蛋白载体pAS2-1-Ang-N的酶切鉴定图谱1.pAS2-1-Ang3-111；2.pAS2-1-Ang6-111-M；3.pAS2-1-Ang6-111；4.pAS2-1-Ang6-113；5.pAS2-1-Ang1-123-M；6.DL2000 Maker；7.pAS2-1-Ang6-123；8.pAS2-1-Ang1-111；9.pAS2-1-Ang3-113；10.pAS2-1-Ang3-113-M；图8.3#克隆共转化后的β-半乳糖苷酶活性检测。
具体实施例方式
下面结合附图具体说明本发明的技术方案1.实验材料1.1菌株酵母宿主菌Y190购自Clontech公司，E.coli DH5为中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所保存菌种。
1.2质粒对照质粒pCL1、pVA3-1、pTD1-1、pLAM5′-1、pACT2，含酵母转录因子的转录激活活性区(AD)、标签质粒pCMV-HA和pCMV-MYC均为clontech公司产品，pT-Ang为中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所构建。
1.3酶与生化试剂BamHI、EcoR I和T4 DNA连接酶、小提、大提质粒试剂盒购自美国Promega公司；YEASTMAKER Yeast Transformation system试剂盒及human fetal hepatic MATCHMAKER cDNA library，简称酵母cDNA文库均为clontech公司产品；3-AT购自Sigma公司。HA单克隆抗体和MYC单克隆抗体购自Clontech公司；
1.4培养基及主要试剂配制YPD培养基5gYPD粉末(Clontech公司)溶于100毫升去离子水中，121℃高压灭菌15分钟，室温保存。制平板时，每百毫升培养基加2克琼脂，4℃保存。
SD/-Leuminimal SD base(clontech)2.67g，--Leu DO Supplement0.074g溶于100毫升水中，制平板时，加2克琼脂。121℃高压灭菌15分钟，4℃保存。
SD/-Trpminimal SD base(clontech)2.67g，-Trp DO Supplement 0.074g溶于100毫升水中，制平板时，加2克琼脂。121℃高压灭菌15分钟，4℃保存。
SD/-Hisminimal SD base(clontech)2.67g，-His DO Supplement 0.074g溶于100毫升水中，制平板，再加2克琼脂。121℃高压灭菌15分钟，4℃保存。
SD/-Leu-Trp-Hisminimal SD base(clontech)2.67g，-Trp DOSupplement 0.074g溶于100毫升水，制平板，加2克琼脂。121℃灭菌15分钟，4℃保存。
10ml PEG/LiAc溶液配制8ml50％ PEG，10xTE1ml，10x LiAc1ml。Z buffer1L含Na2HPO4·7H2O 16.1g，Na2HPO4·H2O 5.50g，KCl 0.75g，MgSO4·7H2O 0.2461.5实验器材低温离心机，Beckman公司产品；超净台、恒温箱、恒温摇床等为国产。
2.实验方法及研究结果2.1诱饵蛋白质粒pAS2-1-Ang的构建及鉴定将酶切后所获Ang片段与pAS2-1进行连接，的连接产物，转化DH5，随机挑选菌落培养后，小提质粒并进行PCR和双酶切鉴定筛选阳性克隆(图1)。
将pAS2-1-Ang转入酵母宿主Y190中，同时作阳性和阴性对照以确保双杂交系统的正确性。结果表明，转化了质粒pAS-Ang的Y190在二缺和三缺平板上不能生长。从SD/-Trp平板上挑选生长良好的菌落作β-gal分析，菌落在8小时后不变蓝(图2)，提示构建的诱饵蛋白没有转录激活活性，因此可用于下一步筛选Ang的相互作用蛋白。
2.3大规模转化文库质粒及文库筛选进行大规模文库质粒共转后，在三缺培养基上共挑选150个菌落作β-半乳糖苷酶显色分析，获得22个阳性克隆，通过去除无效AD质粒后，挑选其中7个阳性克隆(即HIS、LacZ双阳性克隆，图3)，提取质粒转化大肠杆菌，经鉴定分析有两对条带大小非常一致，共选择6个克隆测序，测序结果又有一对重复，至此，我们共获得5个双阳性AD。
2.4从双阳性克隆中分离阳性AD质粒2.41去除无效AD质粒将筛选出的双阳性克隆，划线于SD/三缺(15mM 3AT)平板上，挑单克隆菌落接种于SD/三缺液体培养基，30℃培养，220rpm，当OD600值达到0.2～0.3时，加3AT至终浓度15mM，继续培养24小时；再转接到SD/三缺(15mM 3AT)液体培养基中，30℃培养，220rpm；当OD600值达到0.4～0.6时，重新划线于SD/三缺(15mM 3AT)平板上，挑单克隆菌落作β-半乳糖苷酶分析，保存显色反应阳性的克隆。
2.42从酵母中提取AD质粒，转化大肠杆菌将已去无效AD质粒的阳性克隆，接种于3ml SD/-Leu，30℃培养2～3天后，取2ml菌液，12000rpm，5分钟，弃上清，用残液重悬细胞，提取质粒。转化大肠杆菌DH5α后用promega公司产试剂盒提取质粒、保存菌种。
2.5鉴定筛选分离出的阳性AD质粒2.51酶切鉴定在AD文库质粒中，所有插入片段两端载体上均有提供鉴定用的Bgl II酶切位点。据此可以了解筛选出的阳性克隆中所插入的cDNA的长度，并与PCR结果比较，排除重复结果(图4)。
结果显示，1#质粒切下一个约1000bp片段；2#、质粒切下两个片段分别为700bp和1600bp左右的片段；3#质粒切下一约1400bp片段；4#和4-2#质粒切下一约1800bp片段；5#质粒切下一约1900bp片段；19#质粒切下一约1900bp片段，我们选择3#质粒进行核苷酸序列分析。
2.52筛出的AD质粒的序列分析鉴定后的3#阳性克隆质粒送交上海博亚生物公司测序分析，测序结果如下(图5)ATGATGAAGATACCCCACCAAACCCAAAAAAAGAGATCTCTATGGCTTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTAGCTTGGGTGGTCATATGGCCATGGAGGCCCCGGGGATCCGAATTCGCGGCCGCGTCGACCTGCTCTGCAATGACTGCTACTGCAGTGCGTTTTCCTCGCAGTGCTCCGCTTGTGGGGAGACTGTCATGCCTGGGTCCCGGAAGCTGGAATATGGAGGCCAGACATGGCATGAGCACTGCTTCCTGTGCAGTGGCTGTGAACAGCCACTGGGCTCCCGTTCTTTTGTGCCCGACAAGGGTGCTCACTACTGCGTGCCCTGCTATGAGAACAAGTTTGCTCCTCGCTGCGCCCGCTGCAGCAAGACGCTGACACAGGGTGGAGTGACATACCGTGATCAGCCGTGGCATCGAGAATGTCTGGTCTGTACCGGATGCCAGACGCCCCTGGCAGGGCAGCAGTTCACCTCCCGGGATGAAGATCCCTACTGTGTGGCCTGTTTTGGAGAACTCTTTGCACCTAAGTGCAGCAGCTTGCAAGCGCCCCATCGTAGGACTCGGTGGAGGCAAGTATGTGTCCTTTGAAGACCGACACTGGCACCACAACTGCTTCTCCTGCGCCCGCTGCTCTACCTCCCTGGTGGGGCCAAGGGCTTCGTTACCGGATGGAGACCAAAGTGCTTTTGCCAAGGGCTTGTAGCCAAGGCAAGGCCCCTAAGCCAAGGGCTTCTTGGGACCCCAAGCT2.6核酸序列分析和同源性检索测序结果通过INTERNET进行同源性分析，以美国国立生物信息中心(NCBI)的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)作为主要的检索工具，网址为http//www.ncbi.nlm.nih.gov。对比数据库主要有(1)NCBI的NR库包括Genbank，EMBL(European Molecular Biological Laboratory)、DDBJ(DNADatabase of Japan)以及PDB(Protein Database)所收录的所有非冗余(Non-Redundant)序列；(2)NCBI的EST库。检索主要采用的工具BLASTN。
3#克隆序列在nr数据库中的同源检索RID977366878-20918-16459Query＝(622letters)Databasent733,065 sequences；2,590,300,525 total lettersDistribution of 35 Blast Hitson the Query SequenceScoreESequences producing significant alignments (bits)Value Nref|NM 010213.1|Mus musculus four and a half LIM domai...8090.03gb|AF134772.1|AF134772Mus musculus LIM protein(Fhl3)...8090.03gb|AF133732.1|AF133732Homo sapiens LIM-only protein FH...4380.04ref|NM 004468.1|Homo sapiens four and a half LIM domai...7140.03gb|U60116.2|HSU60116Homo sapiens skeletal muscle LIM-p...7140.03gb|AF114382.1|AF114382Mus musculus four and half LIM d...416e-146 2>ref|NM 010213.1|Mus musculus four and a half LIM domains 3(Fhl3)，mRNALength＝1146Score＝809 bits(408)，Expect(3)＝0.0Identities＝411/412(99％)Strand＝Plus/Plus检索结果发现3#蛋白为LIM蛋白，LIM这个首字母缩拼词来源于Lin-11、Is1-1和Mec3。LIM蛋白在结构上具有高度保守的双锌指基序，目前从结构特征上将其归为4类具有同源结构域；只存在LIM结构域；在C末端存在LIM结构域和存在各种不同相关功能的结构域。
2.7Ang能与LIM蛋白相互作用在哺乳动物细胞中的验证2.7.1pCMV-HA-Ang和pCMV-MYC-LIM的构建及鉴定用Sfi I和Sal I分别双切pAS2-1-Ang和pCMV-HA，回收Ang片段和pCMV-HA，T4 DNA连接酶连接，转化DH5α，提取质粒后酶切挑选阳性克隆，酶切结果表明我们正确构建了pCMV-HA-Ang。
用Sfi I和Xho I分别对标签质粒和文库质粒进行双酶切，然后回收候选蛋白基因和标签质粒，连接后转化E.coli DH5α，提取质粒后筛选阳性克隆，并通过双酶切进行鉴定。结果表明，我们获得了正确的各种pCMV-MYC-LIM。
2.7.2免疫共沉淀和Western杂交结果为了能够较为充分地说明问题，我们同时采用了免疫共沉淀和杂交方法其一是用抗-HA抗体进行沉淀，用抗-MYC单克隆抗体进行杂交。LIM蛋白在实验中显示阳性结果(图6)。以上结果表明，LIM蛋白在COS-7细胞中与Ang有相互作用。综合这些结果，LIM蛋白不仅在酵母核内，而且在COS-7细胞中均与Ang有相互作用。
2.8 ANG系列突变体的设计和构建2.8.1分子模建方法及过程通过Internet网上蛋白质同源模建服务器对蛋白结构数据库进行扫描分析获得有价值的分子结构信息，血管生成素的X射线衍射晶体结构已获得，但由于在晶体结构测定过程中只获得了重原子的原子坐标，而对于氢原子及其侧链的原子结构还不能解析。我们利用SWISS MODEL的程序ProMod II和Gromos96力场对晶体结构进行了重新模建。在计算过程中保证主链走向固定，首先利用最陡下降方法优化200步，采用的参数为TFP43B1，收敛判据为2.5KJ/mol，进而利用共轭梯度法进行进一步的分子力学优化，优化步一般为300步，收敛判据为2.5kJ/mol。在分子模建的基础上，我们构建了9个ANG的突变体，分别以飘带与主链碳原子走向、二级结构以及三维结构叠合对理论模型进行了分析，结果表明可以用于分子结合域研究。
2.8.2 Ang突变体诱饵蛋白载体的构建及鉴定各种Ang突变体基因分别与pAS2-1连接，提取质粒后筛选阳性克隆，利用酶切的方法对构建的质粒进行鉴定。酶切结果表明我们获得了预期的Ang突变体诱饵蛋白载体(如图7所示)，它们分别是pAS2-1-Ang1-123-M、pAS2-1-Ang3-113-M、pAS2-1-Ang6-111-M、pAS2-1-Ang6-123、pAS2-1-Ang1-111、pAS2-1-Ang3-113、pAS2-1-Ang3-111、pAS2-1-Ang6-113和pAS2-1-Ang6-111(注M代表中间65～68位氨基酸缺失)。
2.9 Ang突变体与3#候选蛋白(LIM蛋白)相互作用的检测2.9.1 pAS2-1-ANG-Mut与3#文库质粒共转化Y190酵母宿主用小量转化法将pAS2-1-ANG-Mut与3#文库质粒(LIM)分别共转化至Y190细胞中。
2.9.2共转化后Y190在不同缺陷培养基上的的生长状况将共转化产物分别涂在SD/-Leu-Trp和SD/-His-Leu-Trp培养基上，30℃培养4～7天，观察菌落的生长情况。
2.9.3共转化后宿主Y190的β-半乳糖苷酶显色分析分别从各种不同的转化组平板上挑选生长状态良好的菌落，点于NC膜上，按照前面所述的方法进行β-半乳糖苷酶活性检测，同时以试剂盒中提供的阴性和阳性对照质粒作为质控。
LIM蛋白组突变体pAS2-1-Ang1-123-M(用A代表)、pAS2-1-Ang3-113-M(用B代表)、pAS2-1-Ang6-123(用C代表)、pAS2-1-Ang1-111(用D代表)、pAS2-1-Ang3-113(用E代表)、pAS2-1-Ang3-111(用F代表)和pAS2-1-Ang6-113(用G代表)和pAS2-1-Ang6-113(用H代表)共转化组变蓝；而突变体pAS2-1-Ang6-111-M(用I代表)共转化组不显色(图8)。结果表明3#候选蛋白组突变体Ang1-123-M、Ang3-113-M、Ang6-123、Ang1-111、Ang3-113、Ang3-111、Ang6-113、Ang6-111与3#候选蛋白仍存在相互作用；而突变体Ang6-111-M与3#候选蛋白间的相互作用消失。从所获的结果可以看出，Ang N端4-5位aa、中间65-68位aa以及C末端112-113位aa对于与LIM蛋白的结合是必需的。
权利要求
1.血管生成素Ang与LIM蛋白相互作用的分子结合域，其特征在于该结合域为Ang与LIM蛋白相互作用的关键氨基酸序列…S4R5…H65R66E67N68…P112V113…。
2.一种权利要求1所述血管生成素Ang与LIM蛋白相互作用的分子结合域，其特征在于以血管生成素Ang与LIM蛋白复合物为靶标的复合物在制备抑制血管新生和治疗肿瘤的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了血管生成素(Ang)与LIM蛋白相互作用的氨基酸序列，具体来说，该关键氨基酸序列为…S
文档编号A61P9/00GK1837241SQ20061000752
公开日2006年9月27日 申请日期2006年2月14日 优先权日2005年10月21日
发明者徐东刚, 邹民吉, 王嘉玺 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所