专利名称：一种海洋珍珠贝氨基甙及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的氨基甙，具体来说是涉及一种以海洋珍珠贝为原料得到的氨基甙，另外还涉及这种氨基甙的制备方法和用途。
背景技术：
氨基甙是由氨基酸分子和糖元部分组成的一类化合物。氨基甙被广泛用于抗生素、抗菌素、抗癌药、保健品中。目前为止人们主要是以动物、植物、真菌、细菌为原料，并采用特定的酶将原料水解，从而得到氨基甙。但是至今为止还没有从海洋珍珠贝中制得氨基甙的报道。
发明内容
本发明的目的在于以海洋珍珠贝为原料，得到一种新的氨基甙。另一目的是开发出这种氨基甙的制备方法。又一目的是开发出这种氨基甙的应用。
本发明以海洋珍珠贝为原料，通过超声波或液氮破细胞膜，酸解，仿胃液酶解，仿肠液酶解，溶剂萃取，离心分离等步骤，得到了一种相对分子质量范围为1300～33000的氨基甙，这种氨基甙具有抗病毒、抗动脉粥样硬化的作用，从而实现了本发明的目的。
本发明的海洋珍珠贝氨基甙，其特征是其相对分子质量范围为1300～33000，并由下述的重复结构片段构成，所述的重复结构片段由氨基酸序列为—GASRERCAKLSG—的小肽和硫酸软骨素B组成，其中硫酸软骨素B与氨基酸序列中的谷氨酸联结。
所述的硫酸软骨素B的结构见式(1)。
式(1)本发明的海洋珍珠贝氨基甙的制备方法，其特征是包括以下的步骤(1)将海洋珍珠贝粉碎后，破细胞膜，加入氟汰酸或乳酸，调节pH值至6.0～6.5，混合均匀后得酸解液；(2)酸解液经过仿胃液酶解，再经仿肠液酶解后，冷冻干燥得到可溶性粉末；
(3)将步骤(2)得到的粉末用水溶解，加入乙醇至其质量分数达55％～60％，然后取上清液，向上清液中加入乙醇至其质量分数达70％～75％，离心分离，取沉淀部分冷冻干燥得到产物。
步骤(1)所述的破细胞膜可以采用现有技术，例如采用超声波或液氮，超声波的频率是22～24KHz，步骤(2)所述的仿胃液酶解，是在每1000mL步骤(1)得到的酸解液中加入2.8～3.5g木瓜蛋白酶，然后调节pH值为7.0～7.5，酶解温度是45～50℃，酶解时间是6～8h。所述的仿肠液酶解是把胰蛋白酶，磷酸二氢钾，氯化钾，牛磺胆酸钠和磷酯酸胆碱与步骤(2)仿胃液酶解后的液体混合，使其中含有质量分数为3％～5％的胰蛋白酶，0.025～0.032mol/L磷酸二氢钾，0.01～0.03mol/L氯化钾，4～6mmol/L牛磺胆酸钠，1～2mmol/L磷酯酸胆碱；调节溶液的pH值到8.0～8.5，酶解温度是45～50℃，酶解时间是2～4h。
步骤(3)所述的离心分离为4000～6000r/min。
将上述制备方法得到的产物进行分子质量测定，利用高效液相凝胶渗透色谱法，以标准肽和硫酸软骨素为标准品。测试条件Waters Ultrahydrogel型凝胶柱，流动相0.1mol/LNaNO3。得出的相对分子质量分布范围为1324～32060。
本发明的的海洋珍珠贝氨基甙的小肽的氨基酸序列测定将衍生化的小肽溶于0.1％TFA(三氟乙酸)中，以CCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)为基质。结晶后，采用脉冲氮激光(337nm)作为离子解析电离源，以线性—延时引出模式，在BruckerBiflex III型MALDI-TOF质谱仪上进行分析，结果显示本产物的纯度完全满足测序要求。然后在Applied Biosystems Procise model 491N-端氨基酸测序仪上进行序列分析，循环终止于第12个氨基酸残基，并且小肽的氨基酸序列为GASRERCAKLSG。根据测序结果，计算小肽的分子质量为1432.56u。
本发明的的海洋珍珠贝氨基甙的糖基的结构分析红外光谱测定取1mg本发明产物，采用溴化钾压片法进行红外光谱测定。在1738.6cm-1处有一个强吸收峰，是羰基的伸缩振动，表明含有糖醛酸结构。
全水解及GC分析取6mg本发明产物，放入试管中，加入4mL的TFA(三氟乙酸)，用酒精喷灯高温封管。在110℃水解2小时，在40℃以下减压除去TFA，然后加入5mL甲醇蒸干，重复三次，尽量除去残留TFA。加入1mL水溶解得到的产物，用纤维素板层析。将薄层层析分析后溶出得到的样品加水至3mL，加入10mg的NaBH4在室温下还原2小时后用冰醋酸调节溶液的pH值至4～5之间，减压蒸干，重复三次，保证还原完全，真空干燥彻底除去水分得到固体粉末，然后加入2mL醋酐密封，在水浴中加热反应2小时，减压出去过量的醋酐，加入1mL的甲苯，蒸干，重复操作三次。将乙酰化后的产物用氯仿5mL溶解，加入5mL水，洗涤三次，将氯仿层干燥后浓缩，进行GC分析。GC分析证明，本发明的的海洋珍珠贝氨基甙中含有氨基半乳糖。
TLC分析证明样品含有糖醛酸，因此进行糖醛酸的还原反应。取薄层层析分析后得到的样品2mg进行糖残基组成的GC分析，证明为艾杜糖醛酸。
因此本发明的的海洋珍珠贝氨基甙的糖元的片段为艾杜糖醛酸与乙酰氨基半乳糖，即硫酸软骨素B。
本发明的海洋珍珠贝氨基甙具有抗病毒和抗动脉粥样硬化的作用，因此可以应用于抗病毒药物、抗动脉粥样硬化药物、滴眼液、可溶性珍珠粉(层粉)、化妆品、功能食品、药品和保健品等。
具体实施例方式
以下的实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1将1000g海洋珍珠贝粉碎后，用22KHz超声波破细胞膜，加蒸馏水2000mL混合均匀，使用1mol/L氟汰酸调节pH值至6.0，后得酸解液，取1000mL酸解液加入2.8g木瓜蛋白酶，然后用0.1mol/LNaOH溶液调节的pH值为7.5，酶解温度是50℃，酶解时间是6h，得到酶解液。取30g胰蛋白酶，0.025mol，磷酸二氢钾，0.01mol氯化钾，4mmol牛磺胆酸钠和1mmol磷酯酸胆碱，用少量水溶解后，加入上述得到的酶解液混匀并定容到1000mL，用O.1mol/LNaOH溶液调节溶液的pH值到8.0，酶解温度是45℃，酶解时间是2h，冷冻干燥得到可溶性粉末。
将上述得到的粉末用水溶解，加入纯乙醇使其乙醇终质量分数达60％，取上清液；向上清液中加入乙醇使其乙醇终质量分数达75％，5000r/min离心取沉淀部分，冷冻干燥得到产物。根据上述的分子质量测定，小肽的氨基酸序列测定和糖基的结构分析，证实其相对分子质量量范围为1300～33000，并由氨基酸序列为—GASRERCAKLSG—的小肽和硫酸软骨素B组成，其中硫酸软骨素B与氨基酸序列中的谷氨酸联结(由谷氨酸结构推理得出，因为序列中唯有谷氨酸拥有两个羧基，其中一个形成肽键后，另外一个易于形成甙健)。
实施例2将1000g海洋珍珠贝粉碎后，用24KHz超声波破细胞膜，加蒸馏水2000mL混合均匀，使用1mol/L乳酸调节pH值至6.5，后得酸解液，取1000mL酸解液加入3.5g木瓜蛋白酶，然后用0.1mol/LNaOH溶液调节的pH值为7.0，酶解温度是45℃，酶解时间是8小时，得到酶解液。取50g胰蛋白酶，0.032mol磷酸二氢钾，0.03mol氯化钾，6mmol牛磺胆酸钠和2mmol磷酯酸胆碱，用少量水溶解后，加入上述得到的酶解液混匀并定容到1000mL，用0.1mol/LNaOH溶液调节溶液的pH值到8.5，酶解温度50℃，酶解时间4h，冷冻干燥得到可溶性粉末。
将上述得到的粉末首先加入纯乙醇使其乙醇终质量分数达65％，取上清液；向上清液中加入乙醇使其乙醇终质量分数达75％，4500r/min离心取沉淀部分，冷冻干燥得到产物。根据上述的分子质量测定，小肽的氨基酸序列测定和糖基的结构分析，证实其相对分子质量范围为1300～33000，并由氨基酸序列为—GASRERCAKLSG—的小肽和硫酸软骨素B组成，其中硫酸软骨素B与氨基酸序列中的谷氨酸联结。
实施例3海洋珍珠贝氨基甙抗单纯疱疹病毒I型(HSV-I)的作用实验材料珍珠贝氨基甙用二甲基亚砜(DMSO)溶解后用2％DMEM(一种细胞培养基)配成1mmol/L浓度；阳性对照药物为无环鸟苷干粉(ACV)，批号0408012，由丽珠集团有限责任公司提供，称量用蒸馏水制成含量为1.0g/L的溶液，过滤除菌置4℃保存备用；细胞为兔肾细胞，由本实验室自制，取自2日龄乳兔(由广州中医药大学动物中心提供)；病毒株为I型疱疹病毒，由广州市儿童医院提供。
仪器CO2恒温培养箱(NAPCO)；倒置微生物显微镜(OLYMPUS CK40)。
药物毒性实验用细胞维持液将药液连续四倍稀释四个浓度，常量分别加入细胞已长成单层的96孔培养板中，置37℃、5％ CO2温箱培养，每日倒置显微镜下观察细胞形态，连续观察4d。每个浓度加入4孔细胞，同时设立正常细胞对照。细胞以不出现病变为药物的无毒浓度。
药物抗病毒实验对的抑制作用 细胞长成单层时加入不同浓度的药物，每浓度4孔，同时接种100 TCID50I型疱疹病毒，37℃、5％ CO2培养4d。当病毒对照病毒所致细胞病变(CPE)25％～75％时，判断结果。实验均设病毒对照组、药物组、细胞对照、ACV组。
实验结果(1)珍珠贝氨基甙在毒性浓度时，细胞萎缩、空泡或脱落；(2)珍珠贝氨基甙在0.129～0.515g/L能抑制病毒所致病变，其余药对HSV-I均无抑制作用。阳性药ACV组1.56mg/L时能完全抑制病毒所致病变(见表1)。
表1 海洋珍珠贝氨基甙对HSV-I的作用
实施例2海洋珍珠贝氨基甙对实验性高脂血症大鼠的血脂变化的影响实验动物取取标准实验SD大鼠，按规范投饲，按《新药药理研究指南》开展研究。
大鼠给药剂量实验药小、中、大剂量分别为1.5mg/kg、3.0mg/kg、6.0mg/kg，烟酸组为0.75g/kg。
方法取大鼠72只先在实验环境下给普通饲料喂养，观察7天，随机分为6组，分别为正常组、模型组、阳性药烟酸组、珍珠贝胶囊小、中、大剂量组，每组12只。分组后次日开始实验，除正常组给普通饲料喂养外，其余动物均给予高脂饲料喂养。连续饲养五周暂不给药。第七周开始开始灌胃给药，正常组及模型组给蒸馏水，其它组给予相应受试药物，每日给药一次，连续给药4周，每周称重一次。4周末大鼠禁食12小时后眼眶采血，离出血清，测定各项血脂指标，包括总胆固醇CHOL、甘油三酯TG、高密度酯蛋白HDL-C、低密度酯蛋白LDL-C，进行统计学处理，比较各组间差异。并计算各给药组血脂指标降低(升高)百分率。
结果见表2。模型组与正常组比较p＜0.01；药组与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。
表2 海洋珍珠氨基甙对实验性高脂血症大鼠的血脂变化的影响
权利要求
1.一种氨基甙，其特征是其相对分子质量范围为1300～33000，并由下述的重复结构片段构成，所述的重复结构片段由氨基酸序列为-GASRERCAKLSG-的小肽和硫酸软骨素B组成，其中硫酸软骨素B与氨基酸序列中的谷氨酸联结。
2.一种氨基甙的制备方法，其特征是包括以下的步骤(1)将海洋珍珠贝粉碎后，破细胞膜，加入氟汰酸或乳酸调节pH值至6.0～6.5，混合均匀后得酸解液；(2)酸解液经过仿胃液酶解，再经仿肠液酶解后，冷冻干燥得到可溶性粉末；(3)将步骤(2)得到的粉末用水溶解，加入乙醇至其质量分数达55％～60％，然后取上清液，向上清液中加入乙醇至其质量分数达70％～75％，离心分离，取沉淀部分冷冻干燥得到产物。
3.根据权利要求2的一种氨基甙的制备方法，其特征是步骤(2)所述的仿胃液酶解是在每1000mL步骤(1)得到的酸解液中加入2.8～3.5g木瓜蛋白酶，然后调节pH值为7.0～7.5，酶解温度是45～50℃，酶解时间是6～8h；所述的仿肠液酶解是把胰蛋白酶，磷酸二氢钾，氯化钾，牛磺胆酸钠和磷酯酸胆碱与步骤(2)仿胃液酶解后的液体混合，使其中含有质量分数为3％～5％的胰蛋白酶，0.025～0.032mol/L磷酸二氢钾，0.01～0.03mol/L氯化钾，4～6mmol/L牛磺胆酸钠，1～2mmol/L磷酯酸胆碱；调节溶液的pH值到8.0～8.5，酶解温度是45～50℃，酶解时间是2～4h；步骤(3)所述的离心分离为4000～6000r/min。
4.权利要求1的氨基甙在制备抗病毒药物和抗动脉粥样硬化药物和保健品中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种氨基甙及其制备方法和用途，其特征是其相对分子质量范围为1300～33000，并由下述的重复结构片段构成，所述的重复结构片段由氨基酸序列为－GASRERCAKLSG－的小肽和硫酸软骨素B组成，其中硫酸软骨素B与氨基酸序列中的谷氨酸联结。本发明氨基甙以海洋珍珠贝为原料，通过超声波或液氮破细胞膜，酸解，仿胃液酶解，仿肠液酶解，溶剂萃取，离心分离等步骤得到。本发明的海洋珍珠贝氨基甙具有抗病毒和抗动脉粥样硬化的作用，因此可以应用于抗病毒药物、抗动脉粥样硬化药物、滴眼液、可溶性珍珠粉(层粉)、化妆品、功能食品、药品和保健品等。
文档编号A61P9/00GK1916021SQ20061003727
公开日2007年2月21日 申请日期2006年8月25日 优先权日2006年8月25日
发明者张偲, 尹浩, 龙丽娟, 闻克威, 张士忠, 王世全, 王士奎 申请人:中国科学院南海海洋研究所